Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину як інструмента його дослідження
Очищення препаратів рекомбінантної субодиниці В (SbB) дифтерійного токсину (DT), синтезованої в цитоплазмі, периплазмі і нерозчинних тільцях включення клітин Escherichia coli, проведене за допомогою металоафінної хроматографії після руйнування бактеріальної ДНК та клітинної стінки ензимами, дало...
Збережено в:
| Дата: | 2017 |
|---|---|
| Автори: | , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Ukrainian |
| Опубліковано: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2017
|
| Назва видання: | Доповіді НАН України |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126418 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину як інструмента його дослідження / К.Ю. Манойлов, O.Б. Горбатюк, М.О. Усенко, О.Я. Шатурський, T.O. Борисова, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко // Доповіді Національної академії наук України. — 2017. — № 2. — С. 88-99. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-126418 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1264182017-11-24T03:03:07Z Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину як інструмента його дослідження Манойлов, К.Ю. Горбатюк, O.Б. Усенко, М.О. Шатурський, О.Я. Борисова, T.O. Колибо, Д.В. Комісаренко, С.В. Біохімія Очищення препаратів рекомбінантної субодиниці В (SbB) дифтерійного токсину (DT), синтезованої в цитоплазмі, периплазмі і нерозчинних тільцях включення клітин Escherichia coli, проведене за допомогою металоафінної хроматографії після руйнування бактеріальної ДНК та клітинної стінки ензимами, дало можливість позбутися домішок ендогенних пороформуючих протеїнів. Показано, що рекомбінантні похідні DT, SbB та CRM197 мають однакову спорідненість з рецепторами чутливих та резистентних до токсину клітин ліній Vero і L929 відповідно. Прикладання позитивного потенціалу з боку додавання SbВ (0,3 мкг/мл) до фосфатидилетаноламінвмісної бішарової мембрани у розчині 1 M KCl (pH 4,8) призводить до утворення потенціалозалежних іонних каналів з провідністю 20 пСм, як показано у класичних дослідженнях природного DT. За даними порівняльного аналізу, характеристики утворення і функціонування каналів DT найкраще відтворюються SbB, синтезованою в неактивній формі у вигляді тілець включення, та ренатурованою in vitro. Очистка препаратов рекомбинантной субъединицы В (SbB) дифтерийного токсина (DT), синтезированной в цитоплазме, периплазме и твердых тельцах включения клеток Escherichia coli, проведенная с помощью металлоаффинной хроматографии после разрушения бактериальной ДНК и клеточной стенки энзимами, позволила удалить примеси эндогенных пороформирующих белков. Показано, что рекомбинантные производные DT, SbB и CRM197 имеют одинаковое сродство с рецепторами чувствительных и резистентных к токсину клеток линий Vero і L929. Приложение положительного потенциала со стороны добавления SbВ (0,3 мкг/мл) к фосфатидилэтаноламинсодержащей бислойной мембране в растворе 1 M KCl (pH 4,8) приводит к образованию потенциалозависимых ионных каналов с проводимостью 20 пСм, как показано в классических исследованиях DT природного происхождения. Согласно данным сравнительного анализа, характерное для DT образование и функционирование каналов лучше воспроизводятся SbB, синтезированной в неактивной форме в виде телец включения, и ренатурированной in vitro. The purification of recombinant diphtheria toxin (DT) derivative, fragment or subunit B (SbB) synthesized in cytoplasm, periplasm, and solid inclusion bodies of E.coli, by metal-affinity chromatography following the enzymatic digestion of bacterial cell walls and DNA allowed us to avoid the contamination by endogenous poreforming proteins. The recombinant DT derivatives, SbB, and CRM197 are shown to bind the receptors of DTsusceptible cells Vero and non-susceptible cells L929 with equal affinity. The introduction of SbB (0.3 μg/ml) at positive voltages from the side of a phosphatidylethanolamine-containing bilayer membrane, where the derivative was added, results in the creation of potential-dependent ionic channels with the conductance of 20 pS in the bathing solution of 1M KCl buffered at pH 4.8 as had been shown in the classic studies of wild-type DT. The comparative analysis has shown that the channel-forming abilities of wild-type DT are best reproduced by SbB synthesized in the non-active form of inclusion bodies and renaturated in vitro. 2017 Article Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину як інструмента його дослідження / К.Ю. Манойлов, O.Б. Горбатюк, М.О. Усенко, О.Я. Шатурський, T.O. Борисова, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко // Доповіді Національної академії наук України. — 2017. — № 2. — С. 88-99. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. 1025-6415 DOI: doi.org/10.15407/dopovidi2017.02.088 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126418 577.352.4:577.2 uk Доповіді НАН України Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Біохімія Біохімія |
| spellingShingle |
Біохімія Біохімія Манойлов, К.Ю. Горбатюк, O.Б. Усенко, М.О. Шатурський, О.Я. Борисова, T.O. Колибо, Д.В. Комісаренко, С.В. Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину як інструмента його дослідження Доповіді НАН України |
| description |
Очищення препаратів рекомбінантної субодиниці В (SbB) дифтерійного токсину (DT), синтезованої в
цитоплазмі, периплазмі і нерозчинних тільцях включення клітин Escherichia coli, проведене за допомогою
металоафінної хроматографії після руйнування бактеріальної ДНК та клітинної стінки ензимами, дало
можливість позбутися домішок ендогенних пороформуючих протеїнів. Показано, що рекомбінантні
похідні DT, SbB та CRM197 мають однакову спорідненість з рецепторами чутливих та резистентних
до токсину клітин ліній Vero і L929 відповідно. Прикладання позитивного потенціалу з боку додавання
SbВ (0,3 мкг/мл) до фосфатидилетаноламінвмісної бішарової мембрани у розчині 1 M KCl (pH 4,8) призводить до утворення потенціалозалежних іонних каналів з провідністю 20 пСм, як показано у класичних
дослідженнях природного DT. За даними порівняльного аналізу, характеристики утворення і функціонування каналів DT найкраще відтворюються SbB, синтезованою в неактивній формі у вигляді тілець включення,
та ренатурованою in vitro. |
| format |
Article |
| author |
Манойлов, К.Ю. Горбатюк, O.Б. Усенко, М.О. Шатурський, О.Я. Борисова, T.O. Колибо, Д.В. Комісаренко, С.В. |
| author_facet |
Манойлов, К.Ю. Горбатюк, O.Б. Усенко, М.О. Шатурський, О.Я. Борисова, T.O. Колибо, Д.В. Комісаренко, С.В. |
| author_sort |
Манойлов, К.Ю. |
| title |
Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину як інструмента його дослідження |
| title_short |
Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину як інструмента його дослідження |
| title_full |
Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину як інструмента його дослідження |
| title_fullStr |
Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину як інструмента його дослідження |
| title_full_unstemmed |
Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину як інструмента його дослідження |
| title_sort |
характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці в дифтерійного токсину як інструмента його дослідження |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2017 |
| topic_facet |
Біохімія |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/126418 |
| citation_txt |
Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину як інструмента його дослідження / К.Ю. Манойлов, O.Б. Горбатюк, М.О. Усенко, О.Я. Шатурський, T.O. Борисова, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко // Доповіді Національної академії наук України. — 2017. — № 2. — С. 88-99. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
| series |
Доповіді НАН України |
| work_keys_str_mv |
AT manojlovkû harakterizacíâočiŝenoírekombínantnoísubodinicívdifteríjnogotoksinuâkínstrumentajogodoslídžennâ AT gorbatûkob harakterizacíâočiŝenoírekombínantnoísubodinicívdifteríjnogotoksinuâkínstrumentajogodoslídžennâ AT usenkomo harakterizacíâočiŝenoírekombínantnoísubodinicívdifteríjnogotoksinuâkínstrumentajogodoslídžennâ AT šatursʹkijoâ harakterizacíâočiŝenoírekombínantnoísubodinicívdifteríjnogotoksinuâkínstrumentajogodoslídžennâ AT borisovato harakterizacíâočiŝenoírekombínantnoísubodinicívdifteríjnogotoksinuâkínstrumentajogodoslídžennâ AT kolibodv harakterizacíâočiŝenoírekombínantnoísubodinicívdifteríjnogotoksinuâkínstrumentajogodoslídžennâ AT komísarenkosv harakterizacíâočiŝenoírekombínantnoísubodinicívdifteríjnogotoksinuâkínstrumentajogodoslídžennâ |
| first_indexed |
2025-07-09T04:57:26Z |
| last_indexed |
2025-07-09T04:57:26Z |
| _version_ |
1837143998985142272 |
| fulltext |
88 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. acad. nauk Ukr. 2017. № 2
ОПОВІДІ
НАЦІОНАЛЬНОЇ
АКАДЕМІЇ НАУК
УКРАЇНИ
© К.Ю. Манойлов, O.Б. Горбатюк, М.О. Усенко, О.Я. Шатурський,
T.O. Борисова, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко, 2017
Дифтерійний токсин (DT) є бактеріальним екзотоксином, який належить до групи ток синів
A—B типу. Відомо, що серед токсинів цієї групи DT був першим охарактеризованим пред-
ставником. Подібно до інших токсинів А–В типу, DT має характерний розподіл основних
функцій (каталітичної, рецепторної і канальної) між двома фрагментами (субодиницями)
А і В його молекули та діє із середини клітини шляхом інгібування синтезу протеїнів. Згід-
но з даними кристалографічного аналізу, молекула DT складається із трьох доменів склад-
ної вторинної структури: каталітичного домену С (субодиниця А), а також трансмембран-
ного та рецепторного доменів Т і R, що разом утворюють субодиницю В (SbB). Причому
каталітичний домен С субодиниці А здатний до інактивації фактору елонгації трансляції 2,
eEF-2 у цитоплазмі еукаріотичних клітин, рецепторний домен R відповідальний за зв’я-
БІОХІМІЯ
doi: https://doi.org/10.15407/dopovidi2017.02.088
УДК 577.352.4:577.2
К.Ю. Манойлов1, O.Б. Горбатюк2, 3, М.О. Усенко2, 3,
О.Я. Шатурський1, T.O. Борисова1, Д.В. Колибо1, С.В. Комісаренко1
1 Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ
2 Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ
3 ДУ “Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН України”, Київ
E-mail: manoilovmail@gmail.com; olegshatursky@biochem.kiev.ua
Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В
дифтерійного токсину як інструмента його дослідження
Представлено академіком НАН України С.В. Комісаренком
Очищення препаратів рекомбінантної субодиниці В (SbB) дифтерійного токсину (DT), синтезованої в
цитоплазмі, периплазмі і нерозчинних тільцях включення клітин Escherichia coli, проведене за допомогою
металоафінної хроматографії після руйнування бактеріальної ДНК та клітинної стінки ензимами, дало
можливість позбутися домішок ендогенних пороформуючих протеїнів. Показано, що рекомбінантні
похід ні DT, SbB та CRM197 мають однакову спорідненість з рецепторами чутливих та резистентних
до токсину клітин ліній Vero і L929 відповідно. Прикладання позитивного потенціалу з боку додавання
SbВ (0,3 мкг/мл) до фосфатидилетаноламінвмісної бішарової мембрани у розчині 1 M KCl (pH 4,8) при-
зводить до утворен ня потенціалозалежних іонних каналів з провідністю 20 пСм, як показано у класичних
дослідженнях природ ного DT. За даними порівняльного аналізу, характеристики утворення і функціону ван-
ня каналів DT найкраще відтворюються SbB, синтезованою в неактивній формі у вигляді тілець включен ня,
та ренатурованою in vitro.
Ключові слова: дифтерійний токсин, cубодиниця В, СRM197, бішарові ліпідні мембрани, іонні канали.
89ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2017. № 2
Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину ...
зування з рецепторами клітин-мішеней, а транслокаційний домен Т бере участь у транс пор-
туванні субодиниці А крізь клітинну мембрану в цитозоль і утворює в ній іонпровідні канали.
С-Кінцевий домен R складений у β-діжку, а проміжний між ним і N-кінцевим ка талітичним
доменом С домен Т — у α-спіралізований пучок. Незважаючи на відсутність ос таточних уяв-
лень щодо будови та функцій Т-домену DT, згідно з існуючими даними, можна стверджувати,
що дві із дев’яти α-спіралей відповідального за утворення іонного каналу DT Т-домену фор-
мують у ліпідному бішарі клітинної мембрани амфіпатичну структуру на зразок шпильки.
Вірогідно, що транслокація поліпептидного ланцюжка С-домену DT у цитоплазму може від-
буватися гідрофільною порожниною іонного каналу, вистеленою α-шпиль ками Т-домену.
Природний DT, його фрагменти і рекомбінантні похідні знаходять широке застосуван-
ня в наукових дослідженнях, молекулярній біотехнології і біомедицині (створенні вакцин,
проведенні протипухлинної терапії тощо). Крім цього, рекомбінантні похідні DT приверта-
ють увагу дослідників через відносну простоту і меншу вартість процедур отримання, ке-
рування змінами їхніх властивостей шляхом направленого мутагенезу або генетичного по-
єднання з іншими протеїнами. Шляхом синтезу рекомбінантних протеїнів у клітинах чу-
жорідних продуцентів, таких як Escherichia coli, а також подальших процедур очищення і
підготування проб можна змінювати притаманні природному аналогу властивості. Тому
синтез і очищення будь-якого рекомбінантного похідного потребує оптимізації для одер-
жання найбільш подібного до природного аналога рекомбінантного продукту.
З огляду на зростаючу потребу у використанні рекомбінантних похідних DT з метою кра-
щого відтворення природних властивостей у проведеному дослідженні SbВ було синтезовано
в цитоплазмі, периплазмі та нерозчинних тільцях включення клітин Е. coli. Після цього шля-
хом порівняльного аналізу отриманих рекомбінантних протеїнів був відібраний такий, що
якнайкраще відтворював іонпровідні властивості природного DT та його здатність до
зв’язування DT-чутливими клітинами. Оскільки іонпровідні властивості та зв’я зування не-
токсичного рекомбінантного похідного DT, CRM197 з DT-чутливими клітина ми цілком від-
повідали таким, що були визначені для природного токсину [1], СRM197 був використаний
для порівняльного аналізу з рекомбінантною SbВ, отриманою в нашому дослідженні.
Посилання на публікації, в яких описано створення генетичних конструкцій для синте-
зу в цитоплазмі E. coli протеїнів EGFP-SbB (SbB, сполученої з зеленим флуоресцентним
протеїном EGFP) та CRM197 (нетоксичного точкового мутанта DT), містяться в роботі [1].
Створення генетичної конструкції для синтезу SbB описано в роботі [2]. Синтез і очищення
препарату СRM197, використаного для досліджень методом бішарових фосфоліпідних мем-
бран (БЛМ), проводили згідно з процедурами, описаними в попередній публікації [1]. Кон-
струкцію для синтезу SbB у периплазматичному просторі E. coli отримано шляхом вбудову-
вання нуклеотидної послідовності SbB із конструкції рЕТ-24a-SubunitB [2] для синтезу SbB
у цитоплазмі бак терії між рестрикційними сайтами BamHI та NcoI плазмідного вектора
pET-22b. Синтез SbB у всіх випадках проводили в клітинах E. coli штаму BL21 Rosetta (DE3),
індукуючи додаванням 1 мМ ізопропіл-β-D-1-тіогалактопіранозиду або за протоколом авто-
індукції [1]. Периплазматичну фракцію E. coli отримували за протоколом осмотичного шоку
за умов низької температури згідно з [3]. Для отримання продуктів синтезу в цитоплазмі
було проведено руйнування клітинних стінок і ДНК бактерій лізоцимом та ДНКазою I.
Ензиматичне руйнування клітин проводили за наявності 0,04 % дезоксихолату натрію.
90 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. acad. nauk Ukr. 2017. № 2
К.Ю. Манойлов, O.Б. Горбатюк, М.О. Усенко, О.Я. Шатурський, T.O. Борисова, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко
У процесі синтезу в цитоплазмі E. coli рекомбінантна SbВ утворювалася в двох формах:
розчинній (35—40 %) та нерозчинній у бактеріальних тільцях включення (60—65 %). Про-
теїн EGFP-SbB виявлявся головним чином у розчинній (> 95 %), а CRM197 — повністю в
нерозчинній фракції клітинного лізату. Очищення SbВ із розчинної та периплазматичної
фракцій проводили в нативних умовах за допомогою металоафінної хроматографії (IMAC)
з використанням Ni-NTA агарози. Рекомбінантні протеїни SbВ, EGFP-SbB та CRM197 ви-
діляли із відмитих тілець включення на Ni-NTA агарозі в денатуруючих умовах, викорис-
товуючи 6 М гуанідин гідрохлорид як хаотропний агент. Ренатурацію in vitro здійснювали
при послідовному зменшенні концентрації гуанідин гідрохлориду (6,00; 5,25; 4,5; 3,75; 3,00;
2,25; 1,5; 0,75 та 0 М). Елюцію рекомбінантних продуктів з Ni-NTA агарози проводили в гра-
дієнті імідазолу від 10 до 300 мМ. Фракції, які вміщували цільовий протеїн з найменшим
процентом домішок, було позбавлено від імідазолу шляхом діалізу та сконцентровано. Чи-
стоту та концентрацію цільових рекомбінантних протеїнів в отриманих пробах оцінювали
за допомогою методу ДСН-ПААГ.
Лінії клітин ссавців Vero та L929 були отримані з Клітинного банку ліній із тканин лю-
дини та тварин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Ка-
вецького НАН України. Як середовище для росту клітин використовували RPMI-1640 з
L-глутаміном та 10 % фетальної сироватки великої рогатої худоби, що вміщувало 100 мг/л
стрептоміцину, 10 000 од./л пеніциліну G та 250 мкг/л амфотерицину В. Клітини вирощу-
вали за умов 37 °С та 5 % концентрації СО2 у повітрі.
Визначення кінетичних параметрів конкурентної взаємодії протеїнів EGFP-SbB та
CRM197 з клітинами Vero і L929 проводили методом протокової цитометрії. Для цього клі-
тини інкубували за умов змінюваної концентрації CRM197 (від 0,5 до 4 мкМ) та сталої кон-
центрації EGFP-SbB, що була близькою до значення, за якого відбувалося повне насичення
лігандом усіх молекул відповідного рецептора на поверхні клітин. Близька до насичуючої
концентрація EGFP-SbB, середня для використаних клітинних ліній, була визначена екс-
периментально методом протокової цитометрії і становила 3 мкМ. Від’єднання клітин від
пластикових чашок Петрі проводили з використанням 30 мМ двонатрієвої солі етилендіа-
мінтетраоцтової кислоти. Кількість клітин у суспензії оцінювали за допомогою камери Го-
ряєва. Переведення клітин у інкубаційне середовище, яке містило EGFP-SbB та CRM197,
здійснювали шляхом осаджування центрифугуванням при 300 g та послідовного ресуспен-
дування. Для пригнічення процесів ендоцитозу в клітинах застосовували 0,02 % NaN3 та
інкубацію при 4 °С, а для запобігання неспецифічній сорбції протеїнів на клітинній по-
верхні — 1 % бичачий сироватковий альбумін (BSA). Визначення інтенсивності флуорес-
ценції клітин проводили на протоковому цитометрі Coulter Epics XL (“Beckman Coulter”,
США). Інтенсивність флуоресценції клітин вимірювали за каналом FL1 (довжина хвилі
збуджен ня — 488 нм).
Дослідження іонпровідних властивостей SbB і CRM197 проводили на пласкій БЛМ,
сформованій із розчину фосфатидилетаноламіну (ФЕA) та фосфатидилхоліну (ФХ) (Хар-
ківське ЗАТ “Біолек”, Україна) або тих самих ліпідів, виділених із яєчного жовтка і хрома-
тографічно очищених канд. біол. наук І.О. Трикаш у відділі нейрохімії Інституту біохімії
ім. О.В. Палладіна НАН України. Суміш ФЕA : ФХ розчиняли в n-гептані у співвідношенні
2 : 1 із загальною концентрацією ліпідів 20 мг/мл. Отриманий у результаті розчин ліпідів
91ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2017. № 2
Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину ...
наносили на отвір діаметром 0,15 мм у дельриновому стаканчику з робочим об’ємом 1 мл
(Warner Instruments, Inc., СШA). Формування ліпідного бішару спостерігали візуально у
відображеному світлі за допомогою бінокулярного мікроскопа. Ємність мембрани компен-
сували за допомогою пристрою, вбудованого в підсилювач струму ВВА-02 (Eastern Scientific,
LLC, CША). Оточуючий мембрану водно-сольовий розчин містив 10 мМ трис-НСl (pH 6,0
або 4,8) і задану кількість хлоридів калію або натрію. Провідність мембрани вимірювали за
допомогою електродів (Warner Instruments, Inc., СШA), занурених у розчин 2 М КСl з ага-
ровими містками. Різниця потенціалів прикладалася до мембрани від джерела напруги, вбу-
дованого в підсилювач струму, що давало можливість отримувати постійну напругу у про-
міжку між –150 та 150 мВ. Прикладену до мембрани напругу контролювали за допомогою
цифрового вольтметра. Трансмембранний струм реєстрували підсилювачем струму і фільт-
рували записи струму при смузі пропускання 0,1 кГц. Запис мікро- та макроскопічного стру-
мів здійснювали за допомогою аналого-цифрового перетворювача ADA-1210 (Eastern Scien-
tific, LLC, CША), сполученого з комп’ютером і підсилювачем струму за допомогою спеці-
ального програмного забезпечення (Cole-Palmer Instrument Company, США).
Селективність іонпровідних каналів SbB та CRM197 вимірювали в 10-кратному гра-
дієнті концентрації хлориду калію або натрію (1 М хлорид металу з боку прикладання по-
тенціалу і 0,1 М хлорид того ж металу з протилежного боку мембрани) при pH 6,0 та 4,8 з
обох боків модифікованої БЛМ. Потенціал Нернста визначали за зміщенням сталого су-
марного струму через модифіковану БЛМ при мембранному потенціалі 0 мВ до і після ут-
ворення 10-кратного градієнта концентрації хлориду металу. Селективність каналів SbB
розраховували за рівнянням Гольдмана—Ходжкіна—Хакслі відповідно знаку і абсолютній
величині потенціалу (потенціал Нернста), який треба було прикласти в умовах 10-кратного
градієнта концентрації омиваючої мембрану солі для відновлення нульового струму, виз-
наченого при однаковій концентрації хлориду металу (1 М) з обох боків мембрани.
Більшість експериментів, за винятком тих, що потребували змін температури водно-
сольового оточення в експериментах з клітинами проводили при кімнатній температурі
(20—24 °С).
На основі даних проточної цитометрії були визначені залежності середньої інтенсив-
ності флуоресценції клітин, забарвлених насичуючою концентрацією EGFP-SbB, від кон-
центрації протеїну CRM197 (дані не показані). Отримані залежності були типовими для
конкурентної взаємодії двох лігандів з одним рецептором [4], згідно з якими, інтенсивність
флуоресценції клітин обох ліній зменшувалася зі збільшенням концентрації протеїну
CRM197. Вірогідно, що протеїн CRM197 конкурентно витісняє EGFP-SbB із комплексу з
рецептором токсину на клітинній поверхні, чим підтверджується специфічність зв’язування
обох клітинних ліній з протеїнами EGFP-SbB та CRM197. З огляду на те, що рецептор DT
має лише один сайт зв’язування з токсином, на основі експериментальних кривих за до-
помогою пакета програм Origin Pro 9 було обраховано величину IC50 для конкурентного
витіснення EGFP-SbB протеїном CRM197. Для клітин Vero величина IC50 становила 1,35
мкМ (R2 = 0,975, стандартна похибка становить 0,146), а для клітин L929 — 1,59 мкМ
(R2 = 0,956, стандартна похибка 0,107).
Відомо, що клітини лінії Vero чутливі до дії DT, а клітини L929 резистентні. Вважають,
що така резистентність обумовлена відмінами амінокислотного складу рецепторів DТ да-
92 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. acad. nauk Ukr. 2017. № 2
К.Ю. Манойлов, O.Б. Горбатюк, М.О. Усенко, О.Я. Шатурський, T.O. Борисова, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко
них клітин [5]. Таким чином, отримані результати дають непряме підтвердження того, що
синтезовані клітинами E. coli рекомбінантні похідні DТ, такі як SbB і CRM197, мають од-
накову спорідненість з рецепторами чутливих та резистентних до токсину клітин, причому
взаємодія з рецепторами має високоспецифічний характер.
Введення препарату SbB, очищеного після синтезу в цитоплазмі, периплазмі та нероз-
чинних тільцях включення, з боку прикладання позитивного потенціалу до БЛМ у розчин
1 М КСl при рН 4,8 з того ж боку мембрани викликало безперешкодне, характерне для утво-
рення іонних каналів стрибкоподібне зростання трансмембранного струму (рис. 1, 2). Пік
найбільш вірогідної провідності поодиноких каналів, утворених в БЛМ препаратами SbB
всіх типів, становив близько 20 пСм при потенціалі 60 мВ, що відповідало мікроскопічному
трансмембранному струму 1,2 пА і збігалося з провідністю каналів CRM197, визначеною в
попередньому дослідженні [1] (див. рис 1, вставка, рис. 2, вставка). Значного росту транс-
мембранного струму не спостерігалося, коли за тих самих умов вбудовування потенціал з
боку додавання SbB змінювали на негативний або при рН середовища 6,0 і вище (див. рис.
1, 2 верхня траса). Подібна потенціало- і рН-залежність утворення іонних каналів у ФЕА-
Рис. 1. Поодинокі канали SbB, синтезованої в цитоплазмі E. coli. На вставці знизу зображено всеточкову
гістограму провідностей поодиноких каналів, одержану після обробки запису трансмембранного струму
зліва. Провідності поодиноких каналів розраховано за піками гаусіанів, прикладених до кожного з піків
гістограми. На записах трансмембранного струму безперервною лінією позначено нульовий струм. По-
тенціали прикладалися з боку БЛМ, протилежного тому, з якого знаходилася SbB. Модифікована мемб-
рана знаходилася в розчині 1 М КСl. Значення рН відповідають тим, що існували з боку додавання SbB.
У відділенні комірки з БЛМ, до якої протеїн не додавався, рН 6,0 залишався незмінним у всіх експери-
ментах. Кінцева концентрація протеїну в комірці становила 0,3 мкг/мл
93ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2017. № 2
Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину ...
вмісний БЛМ була показана раніше для CRM197 [1] і природного DT [6]. На підставі одер-
жаних результатів можна зробити висновок, що втрата SbB і CRM197 початкової цитоток-
сичності DT не позначилася на здатності рекомбінантних похідних до специфічного
зв’язування з клітинами-мішенями, подальшій інтерналізації та утворенні іонних каналів,
що може свідчити про відсутність будь-яких змін у структурі їхніх Т- та R-доменів. Треба
відзначити, що відсутність значного збільшення провідності, індукованої SbB при рН 6,0,
не означала втрату здатності похідного до адсорбції на поверхні БЛМ. На користь цього
припущення свідчить те, що попередня інкубація SbB, як і у випадку з CRM197 і DT, про-
тягом 5—10 хв у комірці з мембраною при негативному потенціалі (−40 мВ) і рН 6,0 з боку
додавання токсину або його похідних значно підвищувала їхню здатність до збільшення
трансмембранного струму у разі подальшого зниження рН до 4,8 та зміни мембранного
потенціалу на позитивний. Отже, при негативному потенціалі і рН 6,0 токсин і обидва йо-
го похідні краще адсорбуються на поверхні мембрани, тоді як зниження рН у разі пози-
тивного потенціалу сприяє переходу зв’язаних з мембраною каналів у відкритий стан. Ос-
Рис. 2. Поодинокі канали SbB, синтезованої у нерозчинних тільцях включення E. coli. На вставці знизу по-
казано гістограму розподілу провідностей поодиноких каналів, отриману на 70 окремих подіях. Без пе рер в-
ною лінією позначено нульовий струм. Потенціали прикладалися з боку БЛМ, протилежного то му, з яко г о
знаходилася SbB. Модифікована мембрана знаходилася в розчині 1 М КСl. Значення рН від по ві дають тим,
що існували з боку додавання SbB. У відділенні комірки з БЛМ, до якої протеїн не дода вався, рН 6,0 за-
лишався незмінним у всіх експериментах. Кінцева концентрація протеїну в комірці становила 0,3 мкг/мл
94 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. acad. nauk Ukr. 2017. № 2
К.Ю. Манойлов, O.Б. Горбатюк, М.О. Усенко, О.Я. Шатурський, T.O. Борисова, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко
танні умови цілком відповідають тим, які існують усередині ендосом або на будь-яких ді-
лянках плазматичної мембрани, де локально зосереджена велика кількість протонів, що
сприяє закисленню.
Збільшення макроскопічного струму, який відбувався за умов переходу зв’язаних з
мембраною каналів у відкритий стан, включав у себе від десятків до сотень струмів через
поодинокі канали, згодом досягав насичення і виходив на плато або був зупинений про-
миванням комірки з мембраною водно-сольовим розчином без SbB. З усіх використаних
препаратів SbB лише той, що був очищений із тілець включення E.coli, практично не від-
різнявся від CRM197 [1] та DT [6] за швидкістю, рН- і потенціалозалежністю каналоутво-
рення (див. рис. 2). Натомість, препарати SbB, отримані із цитоплазми і периплазми E.coli,
відрізнялися значно повільнішим утворенням поодиноких каналів та порушеннями рН- і
потенціалозалежності каналоутворення, визначеними для SbB із тілець включення, CRM197
та природного токсину (див. рис. 1). Можливо, відмінності каналоутворення, визначені для
SbB, синтезованої у гідрофільне середовище, пов’язані зі змінами процесів фолдингу/рефол-
дингу, характерних для синтезованих у нерозчинних тільцях включення SbB і CRM197.
Рис. 3. Провідість, потенціалозалежність і селективність іонних каналів CRM197 (на панелях зліва) та
SbB, синтезованої в твердих тільцях включення E. coli (на панелях справа). Безперервною лінією позна-
чено нульовий струм. Штриховою лінією і подвійною стрілкою позначено потенціал Нернста. Стрілкою
униз позначено перемішування розчину. Напругу прикладали з боку БЛМ, протилежного тому, з якого
додавали протеїн. Значення рН і концентрації КСl відповідають тим, що існували з боку додавання про-
теїнів після заміни розчину 1 М КСl (рН 6,0). У відділенні комірки з БЛМ, до якої протеїн не додавався,
1 М КСl (рН 6,0) залишався незмінним у всіх експериментах. На верхній панелі зліва кінцева концентра-
ція CRM197 у комірці становила 3 мкг/мл, для усіх інших випадків — 0,3 мкг/мл
95ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2017. № 2
Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину ...
Залежність стаціонарного струму, утвореного незмінною кількістю каналів SbB в мем-
брані, від знака мембранного потенціалу визначали після досягнення сталої провідності
модифікованої БЛМ. Подібно до результатів попередніх досліджень [1, 6] стаціонарний
макроскопічний струм, індукований SbB, збільшувався після прикладання негативного
потенціалу (–40, –60 мВ) з боку вбудовування рекомбінантного похідного в мембрану. На-
томість, зі зміною знака потенціалу на позитивний (40, 60 мВ) трансмембранний струм по-
ступово зменшувався до початкового рівня сталого струму, досягнутого після завершення
вбудовування каналів SbB в мембрану. Співвідношення найбільшого і найменшого стру-
мів незмінною кількістю каналів SbB, досягнуте приблизно за півхвилини після послі-
довного прикладання негативного та позитивного потенціалів, дорівнює 3–4 одиницям і
не змінюється для SbB, отриманої з усіх використаних джерел синтезу (рис. 3). Те ж саме
співвідношення, визначене раніше для DT, становило 4,28 [1, 6]. Використана в роботі ре-
комбінантна SbB, як і інші іонпровідні похідні DT [1, 7], вміщують частовживаний у мета-
лоафінній хроматографії полігістидиновий таг, який може взаємодіяти з контамінантними
домішками двовалентних катіонів водного середовища. Згідно з даними попередніх дослі-
джень, зв’язування полігістидинового тагу з двовалентними катіонами збільшує ста ціо нар-
ний струм через канали, утворені рекомбінантними похідними в закритому стані [1, 7]. Тому
можна припустити, що незначне зменшення співвідношення сталих струмів каналами SbB
у відкритому стані (при негативному потенціалі з боку вбудовування) і закритому стані
(при позитивному потенціалі з боку вбудовування), порівняно з каналами DT [6], відбува-
ється за рахунок збільшення струму через канал SbB та інших похідних з полігістидиновим
тагом [1, 7] у закритому стані. Причиною збільшення струму каналами SbB у закритому
стані може бути взаємодія контамінантних домішок двовалентних іонів у водно-сольовому
розчині 1 М КСl або 1 М NaCl з невидаленим полігістидиновим тагом, зв’язаним із залиш-
ком С-кінцевого серину R-домену в позиції 535. Виражена потенціалозалежність стаціонар-
ного транспорту іонів каналами SbB, DT та CRM197, згідно з якою струм при негативному
потенціалі з боку вбудовування в 3—4 рази перевищує такий при позитивному потенціалі з
того ж боку мембрани, свідчить про однакову орієнтацію переважної більшості каналів DT
та його іонпровідних рекомбінантних похідних у мембрані. Орієнтоване вбудовування іон-
провідної ділянки може бути важливим у процесі інтоксикації, оскільки за таких умов ката-
літичний домен С опиняється назовні ендосоми [8].
Дослідження селективності каналів SbB, синтезованих у цитоплазмі, периплазмі і не-
розчинних тільцях включення, показали, що за умов меншого закислення оточуючого мемб-
рану середовища (рН 6,0) у більшості випадків потенціал Нернста змінювався в межах від
–30 до –40 мВ (див. рис. 3), що свідчить про утворення каналами SbB переважної, хоча і не
ідеальної селективності до катіонів, порівняно з іонами хлору. В окремих випадках потен-
ціал Нернста досягав значень від –55 до –58 мВ, що відповідає утворенню ідеального катіон-
селективного струму. Згідно з існуючими уявленнями про селективність іонних каналів,
можна припустити, що причиною описаних вище змін відносної проникності модифікова-
ної SbB мембрани за умов слабкого закислення середовища (рН 6,0) від 5—10 іонів калію
або натрію на 1 іон хлору до 39 катіонів на 1 аніон в ідеальному випадку є утворення отво-
рів пор різного розміру. На отворах пор меншого розміру проникність для катіонів може
зростати через зменшення відстані між карбоксильними групами негативно зарядженого
96 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. acad. nauk Ukr. 2017. № 2
К.Ю. Манойлов, O.Б. Горбатюк, М.О. Усенко, О.Я. Шатурський, T.O. Борисова, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко
сайта канальної порожнини, що збільшує потужність утвореного ними електричного поля
і силу, з якою це поле притягує катіони із оточуючого модифіковану мембрану середовища
в канал. Відповідно, збільшення розміру отворів пор сприяє послабленню електричного
поля, утвореного іоногенними угрупованнями каналу, і внаслідок цього зменшенню ви бір-
ковості каналу до катіонів [9]. Подібні перетворення також можуть відбуватися з по зитивно
зарядженими аміногрупами амфіпатичних α-шпильок, які вистеляють порожнину аніон-
селективних каналів, що підтверджується змінами відносної проникності модифікованих
каналами DТ БЛМ від 7 іонів хлору на 1 катіон до 29 іонів хлору на катіон за умов більшо го
закислення (рН 3,5 з обох боків БЛМ) [10]. У нашому дослідженні симетричне зниженя рН
з обох боків мембрани до 4,8 також викликало зміну знака і величини потенціалу Нернста,
який в умовах 10-кратного градієнта концентрації оточуючого модифіковану БЛМ водно-
сольового розчину КСl не перевищував 10 мВ (відносна проникність РCl–/РK+ = 1,62) (див.
рис. 3). Отриманий результат свідчить про зміну переважної катіонної селективності кана-
лів SbB на слабку аніонну за умов більшого закислення водно-сольового середовища, що
відповідає таким усередині клітини. Оскільки подібна заміна катіонної селективності на
аніонну також показана для DT [10], можна припустити, що її причиною є відносно невисо-
ка ізоелектрична точка DT та його іонпровідних рекомбінантних похідних (pI 5,8—6,0)
[11,12]. Згідно з цим припущенням, збільшення кількості негативно заряджених гідро-
ксильних груп в оточуючому мембрану середовищі за умов меншого закислення (рН 6,0)
буде нейтралізувати локальний позитивний заряд аміногруп, що дає перевагу негативно за-
рядженим карбоксильним угрупованням α-шпильок канальної порожнини і сприяє пере-
важній вибірковості каналу до катіонів. Натомість, за умов більшого закислення (рН 4,8)
відбувається локальне протонування негативно заряджених карбоксильних груп, що дає
перевагу позитивному заряду, який генерується аміногрупами білків і сприяє заміні каті-
онної селективності каналу на аніонну. Перевага позитивного заряду на поверхні молекул
DT та його рекомбінантних іонпровідних похідних CRM197 і SBb за умов більшого закис-
лення (pH 4,8) і прикладання позитивного потенціалу з боку додавання протеїнів до БЛМ
також полегшує вбудовування попередньо сформованого на поверхні мембрани (при нега-
тивному потенціалі і рН 6,0) іонпровідного олігомеру.
Вірогідно, що формування катіон-селективного каналу DT відбувається в плазматич-
ній мембрані DT-чутливої клітини після взаємодії R-домену з мембранним рецептором.
Після цього поєднуються дві протилежно направлені сили, які одночасно діють на плаз-
матичну мембрану: затягуюча усередину клітини сила, що виникає внаслідок клітинного
ендоцитозу, індукованого взаємодією R-домену DT з мембранним рецептором, та зміна
осмотичного тиску, що виникає через перевагу вхідного струму Na+ в клітину над вихідним
струмом К+ катіон-селективним каналом DT і сприяє розбуханню ураженої клітини [10,
13]. Подальшому розриву плазматичної мембрани, що передує утворенню ендосом, може
сприяти значне збільшення розмірів іонпровідних пор DT внаслідок концентрування роз-
чинної форми токсину навколо збагачених на DT-рецептори ділянок плазматичної мемб-
рани. На користь останнього припущення свідчить подвоєння провідності поодиноких
каналів рекомбінантних похідних SbB (див. рис. 1, вставка, 2, вставка), CRM197 [1], B45 і
CRM45 [14], утворених при концентраціях 0,3—0,5 мкг/мл та щонайменше 30—50-кратне
збільшення провідностей поодиноких каналів CRM197 (див. рис. 3) і SbB (дані не показа-
97ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2017. № 2
Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину ...
ні), досягнуте при концентрації 3 мкг/мл. Зміна четвертинної будови іонпровідного оліго-
меру DT від тетрамеру з провідністю 20 пСм до значно більших структур з провідністю
600—1000 пСм дає підставу припустити існування двох різних типів токсичної дії, пов’яза-
них з утворенням катіон-селективних каналів DT у плазматичній мембрані DT-чутливих
клітин. Спочатку відбувається індуковане тетрамером DT зниження мембранного градієнта
іонів натрію, що змінює потенціал спокою клітини [13]. Після цього збільшення розміру
іонпровідних пор може сприяти локальним розривам мембрани, необхідним для утворен-
ня ендосом і лізису ураженої клітини внаслідок виходу її життєво необхідних складових
порами великого розміру. В ендосомах цитотоксичність DT здійснюється шляхом транс-
локації каталітичного С-домену аніон-селективними каналами DT в цитоплазму. Концент-
ра ційно-залежні перетворення четвертинної будови також можуть відбуватись з іншими
α-по роформуючими токсинами, у яких іонпровідний домен сформований амфіпатичними
α-шпильками. Так, наприклад, іонпровідний катіон-селективний тетрамер гемолізину мор-
ської актинії Radianthus macrodactilus, RTX-А з діаметром пори 10—11 Å, утворений у плаз-
матичній мембрані еритроцита, не здатний до вивільнення гемоглобіну, розмір молекули
якого становить близько 67 Å. Натомість, підвищення концентрації токсину призводить до
значного збільшення провідності і, відповідно, отворів пор RTX-А, що може стати причи-
ною лізису еритроцита внаслідок втрати гемоглобіну [15].
Таким чином, отримані нами результати підтверджують можливість існування катіон-
селективного каналу DT за умов слабкого закислення водно-сольового середовища, що від-
повідає умовам утворення каналів DT у плазматичній мембрані клітин-мішеней. Причому
концентрування DT навколо збагачених на рецептори ділянок плазматичної мембрани мо-
же призводити до значного збільшення розміру отворів його пор, що сприятиме ендоцитозу
і може стати причиною лізису клітини внаслідок вивільнення її водорозчинних складових.
Шляхом порівняльного аналізу показано, що характеристики утворення каналів DT най-
більше відповідають таким для іонпровідних рекомбінантних похідних, що були отримані
ренатурацією в умовах in vitro із тілець включення E.coli. Непрямим методом показано спе-
цифічність взаємодії SbB та CRM197 з рецепторами чутливих і резистентних до DT клітин,
а також однакову афінність даних протеїнів до рецепторів чутливих і резистентних видів.
Автори висловлюють глибоку вдячність Dr. A.N. Chanturiya із фірми Eastern Scientific
LLC, Rockville, США за допомогу, надану у встановленні обладнання для вимірювання іонпро-
відних властивостей БЛМ і обробці результатів з використанням спеціального програмного
забезпечення.
Всеточкова гістограма розподілу провідностей поодиноких каналів побудована канд. біол.
наук Л.О. Касаткіною з відділу нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
з використанням спеціального програмного забезпечення.
ЦИТОВАНА ЛІТЕРАТУРА
1. Манойлов К.Ю., Горбатюк O.Б., Усенко М.О., Шатурський О.Я., Борисова T.O., Колибо Д.В. Охарактери-
зування очищеного рекомбінантного протеїну CRM197 як інструмента дослідження дифтерійного токси ну.
Допов. Нац. акад. наук Укр. 2016. № 9. С. 124–133. doi: https://doi.org/10.15407/dopovi di 2016.09.124.
2. Кабернюк А.А., Олійник О.С., Редчук Т. А., Романюк С. І., Колибо Д.В., Комісаренко С.В. Клонування
генів рекомбінантних субодиниць дифтерійного токсину Corynebacterium diphtheriae та їх експресія в
клітинах Esherichia coli. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2008. № 3. С. 160—166.
98 ISSN 1025-6415. Dopov. Nac. acad. nauk Ukr. 2017. № 2
К.Ю. Манойлов, O.Б. Горбатюк, М.О. Усенко, О.Я. Шатурський, T.O. Борисова, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко
3. Glover D.M., Hames B.D. DNA Cloning: A Practical Approach. Vol. 2: Expression Systems. Oxford: Oxford
Univ. Press, 1999. 276 p.
4. Mather S. J. Current Directions in Radiopharmaceutical Research and Development. Dordrecht: Springer,
1996. 240 p.
5. Abraham J.A., Damm D., Bajardi A., Miller J., Klagsbrun M., Ezekowitz R.A. Heparin-binding EGF-like
growth factor: characterization of rat and mouse cDNA clones, protein domain conservation across species,
and transcript expression in tissues. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. 190. P. 125—133.
6. Donovan J.J., Simon M.I., Draper R.K., Montal M. Diphtheria toxin forms transmembrane channels in pla-
nar lipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. 78, № 1. P. 172—176.
7. Senzel L., Huynh P.D., Jakes K.S., Collier R.J., Finkelstein A. The diphtheria toxin channel-forming T do-
main translocates its own NH2-terminal region across planar bilayers. J. Gen. Physiol. 1998. 112. P. 317—324.
8. Kagan B.L., Reich K.A., Collier R.J. Orientation of the diphtheria toxin channel in lipid bilayers. Biophys. J.
1984. 45. P. 102—104.
9. Shatursky O.Ya., Kasatkina L.A., Rodik R.V., Cherenok S.O., Shkrabak A.A.,Veklich T.O., Borisova T.A.,
Koste rin S.O., Kalchenko V.I. Anion carrier formation by calix[4]arene-bis-hydroxymethylphosphonic
acid in bilayer membranes. Org. Biomol. Chem. 2014. 12. P. 9811—9821.
10. Hосh D.H., Romero-Mira M., Ehrlich B.E., Finkelstein A., DasGupta B.R., Simpson L.L. Channels formed
by botulinum, tetanus, and diphtheria toxins in planar lipid bilayers: relevance to translocation of proteins
ac ross membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. 82. P. 1692—1696.
11. Proia R. L., Wray S. K., Hart D. A., Eidels L. Characterization and affinity labeling of the cationic phospha-
te-binding (nucleotide-binding) peptide located in the receptor-binding region of the B-fragment of dip-
htheria toxin. J. Biol. Chem. 1980. 255. P. 12025—12033.
12. Духовлинов И.В., Федорова Е.А., Богомолова Е.Г., Добровольская О.А., Черняева Е.Н., Аль-Шехадат
Р.И., Симбирцев А.С. Получение рекомбинантного белка CRM197 в клетках E. coli. Инфекция и имму-
нитет. 2015. 5, № 1. C. 37—44.
13. Papini E., Sandoná D., Rappuoli R., Montecucco C. On the membrane translocation of diphtheria toxin: at
low pH the toxin induces ion channels on сells. EMBO J. 1988. 7. P. 3353—3359.
14. Misler S. Diphtheria toxin fragment channels in lipid bilayer membranes. Biophys. J. 1984. 45. P. 107—109.
15. Чантурия А.Н. Шатурский О.Я., Лишко В.К., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Взаимодействие
токсина морской актинии Radianthus macrodactylus с бислойными фосфолипидными мембранами.
Биол. мембраны. 1990. 7. С. 763—769.
Надійшло до редакції 03.10.2016
REFERENCES
1. Manoilov, K. Yu., Gorbatiuk, O. B., Usenko, M. O., Schatursky, O. Ya., Borisova, T. O., Kolybo, D. V. (2016). Do pov.
Nac. acad. nauk Ukr. No 9, pp. 124-133 (in Ukr ai nian). https://doi.org/10.15407/dopovidi2016.09.124
2. Kaberniuk, A. A., Oliinyk, O. S., Redchuk, T. A., Romaniuk, S. I., Kolybo, D. V., Komisarenko, S. V. (2008).
Dopov. Nac. acad. nauk Ukr. No 3, pp. 160-166 (in Ukrainian).
3. Glover, D. M., Hames, B. D. (1999). DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. 2, Expression Systems, Oxford:
Oxford Univ. Press,
4. Mather, S. J. (1996). Current Directions in Radiopharmaceutical Research and Development, Dordrecht: Springer.
5. Abraham, J. A., Damm, D., Bajardi, A., Miller, J., Klagsbrun, M., Ezekowitz, R. A. (1993). Biochem. Biophys.
Res. Commun., 190, pp.125-133.
6. Donovan, J. J., Simon, M. I., Draper, R. K., Montal, M. (1981). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, No 1, pp. 172-176.
7. Senzel, L., Huynh, P. D., Jakes, K. S., Collier, R. J., Finkelstein, A. (1998). J. Gen. Physiol., 112, pp. 317-324.
8. Kagan, B. L., Reich, K. A., Collier, R. J. (1984). Biophys J., 45, pp. 102-104.
9. Shatursky, O. Ya., Kasatkina, L. A., Rodik, R. V., Cherenok, S. O., Shkrabak, A. A., Veklich, T. O., Borisova, T.
A., Kosterin, S. O., Kalchenko, V. I. (2014). Org. Biomol. Chem., 12, pp. 9811-9821.
10. Hoch, D. H., Romero-Mira, M., Ehrlich, B. E., Finkelstein, A., DasGupta, B. R., Simpson, L. L. (1985). Proc.
Natl. Acad. Sci. USA., 82, pp. 1692-1696.
11. Proia, R. L., Wray, S. K., Hart, D. A., Eidels, L. (1980). J. Biol. Chem., 255, pp. 12025-12033.
99ISSN 1025-6415. Допов. Нац. акад. наук Укр. 2017. № 2
Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину ...
12. Dukhovlinov, I. V., Fedorova, E. A., Bogomolova, E. G., Dobrovolskaya, O. A., Chernyaeva, E. N., Al-
Shekhadat, R. I., Simbirtsev, A. S. (2015). Rus. J. Infection and Immunity, 5, No 1, pp. 37-44 (in Russian).
13. Papini, E., Sandoná, D., Rappuoli, R., Montecucco, C. (1988). EMBO J., 7, pp. 3353-3359.
14. Misler, S. (1984). Biophys J., 45, pp. 107-109.
15. Chanturia, A. N., Shatursky, O. Ya., Lishko, V. K., Monastyrnaya, M. M., Kozlovskaya, E. P. (1990). Biol.
Membrany, 7, pp. 763-769 (in Russian).
Received 03.10.2016
К.Ю. Манойлов1, O.Б. Горбатюк2, 3, М.О. Усенко2, 3, О.Я. Шатурский1,
T.А. Борисова1, Д.В. Колибо1, С.В. Комисаренко1
1 Институт биохимии им. О.В. Палладина НАН Украины, Киев
2 Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев
3 ГУ “Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины”, Киев
E-mail: manoilovmail@gmail.com; olegshatursky@biochem.kiev.ua
ХАРАКТЕРИСТИКА ОЧИЩЕННОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ В
ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА КАК ИНСТРУМЕНТА ЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Очистка препаратов рекомбинантной субъединицы В (SbB) дифтерийного токсина (DT), синтезирован-
ной в цитоплазме, периплазме и твердых тельцах включения клеток Escherichia coli, проведенная с помо-
щью металлоаффинной хроматографии после разрушения бактериальной ДНК и клеточной стенки энзи-
мами, позволила удалить примеси эндогенных пороформирующих белков. Показано, что рекомбинантные
производные DT, SbB и CRM197 имеют одинаковое сродство с рецепторами чувствительных и резистент-
ных к токсину клеток линий Vero і L929. Приложение положительного потенциала со стороны добавления
SbВ (0,3 мкг/мл) к фосфатидилэтаноламинсодержащей бислойной мембране в растворе 1 M KCl (pH 4,8)
приводит к образованию потенциалозависимых ионных каналов с проводимостью 20 пСм, как показано в
классических исследованиях DT природного происхождения. Согласно данным сравнительного анализа,
характерное для DT образование и функционирование каналов лучше воспроизводятся SbB, синтезиро-
ванной в неактивной форме в виде телец включения, и ренатурированной in vitro.
Ключевые слова: дифтерийный токсин, субъединица В, CRM197, бислойные липидные мембраны, ионные
каналы.
K.Yu. Manoilov1, O.B. Gorbatiuk2,3, M.O. Usenko2, 3, O.Ya. Shatursky1,
T.A. Borisova1, D.V. Kolibo1, S.V. Komisarenko1
1 Palladin Institute of Biochemistry of the NAS of Ukraine, Kiev
2 Institute of Molecular Biology and Genetics of the NAS of Ukraine, Kiev
3 State Institute of Genetic and Regenerative Medicine of the NAMS of Ukraine, Kiev
E-mail: manoilovmail@gmail.com; olegshatursky@biochem.kiev.ua
THE CHARACTERIZATION OF PURIFIED RECOMBINANT FRAGMENT B
AS A TOOL TO STUDY DIPHTHERIA TOXIN
The purification of recombinant diphtheria toxin (DT) derivative, fragment or subunit B (SbB) synthesized in
cytoplasm, periplasm, and solid inclusion bodies of E.coli, by metal-affinity chromatography following the enzy-
matic digestion of bacterial cell walls and DNA allowed us to avoid the contamination by endogenous pore-
forming proteins. The recombinant DT derivatives, SbB, and CRM197 are shown to bind the receptors of DT-
susceptible cells Vero and non-susceptible cells L929 with equal affinity. The introduction of SbB (0.3 μg/ml) at
positive voltages from the side of a phosphatidylethanolamine-containing bilayer membrane, where the deriva-
tive was added, results in the creation of potential-dependent ionic channels with the conductance of 20 pS in the
bathing solution of 1M KCl buffered at pH 4.8 as had been shown in the classic studies of wild-type DT. The
comparative analysis has shown that the channel-forming abilities of wild-type DT are best reproduced by SbB
synthesized in the non-active form of inclusion bodies and renaturated in vitro.
Keywords: diphtheria toxin, fragment B, CRM197, bilayer lipid membranes, ionic channels.
|