Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування
Вивчено вплив кріопротекторів диметилсульфоксиду (ДМСО), диметилацетаміду (ДМАЦ), 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), їх комбінацій і двох програм заморожування на морфофункціональні властивості тромбоцитів донорської крові людини на етапах кріоконсервування. Показано, що найвищі показники збереженості тромбо...
Gespeichert in:
| Datum: | 2006 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2006
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/137085 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування / А.М. Компанієць, О.В. Книш, Т.М. Гуріна, О.А. Богданчикова, С.Є. Овсянніков, М.Л. Погребняк // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 2. — С. 182-191. — Бібліогр.: 19 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-137085 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1370852018-06-17T03:03:56Z Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування Компанієць, А.М. Книш, О.В. Гуріна, Т.М. Богданчикова, О.А. Овсянніков, С.Є. Погребняк, М.Л. Криоконсервирование биообъектов Вивчено вплив кріопротекторів диметилсульфоксиду (ДМСО), диметилацетаміду (ДМАЦ), 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), їх комбінацій і двох програм заморожування на морфофункціональні властивості тромбоцитів донорської крові людини на етапах кріоконсервування. Показано, що найвищі показники збереженості тромбоцитів отримані при їх кріоконсервуванні з ДМСО та комбінацією кріопротекторів 1,2-ПД і ДМАЦ у кінцевій концентрації 0,7 М при заморожуванні за програмою зі зняттям переохолодження. Отримані результати свідчать про необхідність розробки багатокомпонентних кріозахисних середовищ для кріоконсервування тромбоцитів і перспективність дослідження спеціальних програм заморожування з контрольованою швидкістю проходження температурного інтервалу кристалізації. Исследовано влияние криопротекторов диметилсульфоксида (ДМСО), диметилацетамида (ДМАЦ), 1,2-пропандиола (1,2-ПД), их комбинаций и двух программ замораживания на морфофункциональные свойства тромбоцитов донорской крови человека на этапах криоконсервирования. Показано, что наиболее высокие показатели сохранности тромбоцитов получены при их криоконсервировании с ДМСО и комбинацией криопротекторов 1,2-ПД и ДМАЦ в конечной концентрации 0,7 М при замораживании по программе со снятием переохлаждения. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости разработки многокомпонентных криозащитных сред для криоконсервирования тромбоцитов и перспективности исследования специальных программ замораживания с контролируемой скоростью прохождения температурного интервала кристаллизации. There were studied the effects of dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethyl acetamide (DMAC), 1,2-propane diol (1,2-PD), their combination and two freezing programs on morphofunctional properties of human donor blood platelets at cryopreservation stages. The highest indices of platelet integrity were shown to be obtained at their cryopreservation with DMSO and when combining 1,2-PD with DMAC in 0.7 M final concentration during freezing according to the program with overcooling elimination. The results obtained testify to the necessity in elaborating the polycomponent cryoprotective media for platelet cryopreservation and perspectiveness in investigating special freezing programs with a controlled rate of passing through temperature interval of crystallisation. 2006 Article Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування / А.М. Компанієць, О.В. Книш, Т.М. Гуріна, О.А. Богданчикова, С.Є. Овсянніков, М.Л. Погребняк // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 2. — С. 182-191. — Бібліогр.: 19 назв. — укр. http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/137085 547.42:612.111.7 uk Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Криоконсервирование биообъектов Криоконсервирование биообъектов |
| spellingShingle |
Криоконсервирование биообъектов Криоконсервирование биообъектов Компанієць, А.М. Книш, О.В. Гуріна, Т.М. Богданчикова, О.А. Овсянніков, С.Є. Погребняк, М.Л. Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Вивчено вплив кріопротекторів диметилсульфоксиду (ДМСО), диметилацетаміду (ДМАЦ), 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), їх комбінацій і двох програм заморожування на морфофункціональні властивості тромбоцитів донорської крові людини на етапах кріоконсервування. Показано, що найвищі показники збереженості тромбоцитів отримані при їх кріоконсервуванні з ДМСО та комбінацією кріопротекторів 1,2-ПД і ДМАЦ у кінцевій концентрації 0,7 М при заморожуванні за програмою зі зняттям переохолодження. Отримані результати свідчать про необхідність розробки багатокомпонентних кріозахисних середовищ для кріоконсервування тромбоцитів і перспективність дослідження спеціальних програм заморожування з контрольованою швидкістю проходження температурного інтервалу кристалізації. |
| format |
Article |
| author |
Компанієць, А.М. Книш, О.В. Гуріна, Т.М. Богданчикова, О.А. Овсянніков, С.Є. Погребняк, М.Л. |
| author_facet |
Компанієць, А.М. Книш, О.В. Гуріна, Т.М. Богданчикова, О.А. Овсянніков, С.Є. Погребняк, М.Л. |
| author_sort |
Компанієць, А.М. |
| title |
Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування |
| title_short |
Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування |
| title_full |
Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування |
| title_fullStr |
Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування |
| title_full_unstemmed |
Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування |
| title_sort |
дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2006 |
| topic_facet |
Криоконсервирование биообъектов |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/137085 |
| citation_txt |
Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування / А.М. Компанієць, О.В. Книш, Т.М. Гуріна, О.А. Богданчикова, С.Є. Овсянніков, М.Л. Погребняк // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 2. — С. 182-191. — Бібліогр.: 19 назв. — укр. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT kompaníêcʹam doslídžennâmorfofunkcíonalʹnoízbereženostítrombocitívnaetapahkríokonservuvannâ AT knišov doslídžennâmorfofunkcíonalʹnoízbereženostítrombocitívnaetapahkríokonservuvannâ AT gurínatm doslídžennâmorfofunkcíonalʹnoízbereženostítrombocitívnaetapahkríokonservuvannâ AT bogdančikovaoa doslídžennâmorfofunkcíonalʹnoízbereženostítrombocitívnaetapahkríokonservuvannâ AT ovsânníkovsê doslídžennâmorfofunkcíonalʹnoízbereženostítrombocitívnaetapahkríokonservuvannâ AT pogrebnâkml doslídžennâmorfofunkcíonalʹnoízbereženostítrombocitívnaetapahkríokonservuvannâ |
| first_indexed |
2025-07-10T02:22:32Z |
| last_indexed |
2025-07-10T02:22:32Z |
| _version_ |
1837224852714422272 |
| fulltext |
182 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №2
УДК 547.42:612.111.7
А.М. КОМПАНІЄЦЬ1*, О.В. КНИШ1, Т.М. ГУРІНА1,
О.А. БОГДАНЧИКОВА1, С.Є.ОВСЯННІКОВ1, М.Л. ПОГРЕБНЯК2
Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на
етапах кріоконсервування
UDC 547.42:612.111.7
A.M. KOMPANIETS1*, O.V. KNYSH1, T.M. GURINA1,
O.A. BOGDANCHIKOVA1, S.E. OVSYANNIKOV1, M.L. POGREBNYAK2
Study of Morphofunctional Integrity of Platelets
at Cryopreservation Stages
Вивчено вплив кріопротекторів диметилсульфоксиду (ДМСО), диметилацетаміду (ДМАЦ), 1,2-пропандіолу (1,2-ПД), їх
комбінацій і двох програм заморожування на морфофункціональні властивості тромбоцитів донорської крові людини на
етапах кріоконсервування. Показано, що найвищі показники збереженості тромбоцитів отримані при їх кріоконсервуванні з
ДМСО та комбінацією кріопротекторів 1,2-ПД і ДМАЦ у кінцевій концентрації 0,7 М при заморожуванні за програмою зі
зняттям переохолодження. Отримані результати свідчать про необхідність розробки багатокомпонентних кріозахисних
середовищ для кріоконсервування тромбоцитів і перспективність дослідження спеціальних програм заморожування з
контрольованою швидкістю проходження температурного інтервалу кристалізації.
Ключові слова: тромбоцити, кріоконсервування, кріопротектори.
Исследовано влияние криопротекторов диметилсульфоксида (ДМСО), диметилацетамида (ДМАЦ), 1,2-пропандиола
(1,2-ПД), их комбинаций и двух программ замораживания на морфофункциональные свойства тромбоцитов донорской крови
человека на этапах криоконсервирования. Показано, что наиболее высокие показатели сохранности тромбоцитов получены
при их криоконсервировании с ДМСО и комбинацией криопротекторов 1,2-ПД и ДМАЦ в конечной концентрации 0,7 М при
замораживании по программе со снятием переохлаждения. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости
разработки многокомпонентных криозащитных сред для криоконсервирования тромбоцитов и перспективности исследования
специальных программ замораживания с контролируемой скоростью прохождения температурного интервала кристаллизации.
Ключевые слова: тромбоциты, криоконсервирование, криопротекторы.
There were studied the effects of dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethyl acetamide (DMAC), 1,2-propane diol (1,2-PD), their
combination and two freezing programs on morphofunctional properties of human donor blood platelets at cryopreservation stages.
The highest indices of platelet integrity were shown to be obtained at their cryopreservation with DMSO and when combining 1,2-PD
with DMAC in 0.7 M final concentration during freezing according to the program with overcooling elimination. The results obtained
testify to the necessity in elaborating the polycomponent cryoprotective media for platelet cryopreservation and perspectiveness in
investigating special freezing programs with a controlled rate of passing through temperature interval of crystallisation.
Key-words: platelets, cryopreservation, cryoprotectants.
* Автор, якому необхідно надсилати кореспонденцію:
вул. Переяславська, 23, м. Харків, Україна 61015; тел.:+38 (057)
373-30-07, факс: +38 (057) 373-30-84, електронна пошта:
cryo@online.kharkov.ua
* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya
str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3007, fax: +380 57
373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
1Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
2Institute of Scintillation Materials of State Science and Technology
Concern ‘Institute of Solid Crystals’ of the National Academy of Sci-
ences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
1Інститут проблем кріобіології і кріомедицини
НАН України, м. Харків
2Інститут сцинтиляційних матеріалів НТК “Інститут
монокристалів” НАН України, м. Харків
У дослідженнях з кріоконсервування концен-
тратів тромбоцитів (КТ) для клінічної практики
актуальною задачею є вибір ефективного і неток-
сичного кріопротектора (КП). Аналіз літератури
показав, що найбільш перспективними КП при
заморожуванні КТ є диметилсульфоксид (ДМСО),
диметилацетамід (ДМАЦ) та 1,2-пропандіол
(1,2-ПД). ДМСО визнано “золотим стандартом”,
оскільки він забезпечує найвищий рівень збере-
женості тромбоцитів під час кріоконсервування
[18]. Але повна заборона використання ДМСО як
фармакологічного агента внаслідок відомої токсич-
ної дії потребує його повного видалення із клітин-
ної суспензії перед трансфузією, яке супрово-
Selecting an efficient and non-toxic cryoprotectant
(CP) is a current task in research on platelet concent-
rates (PC) cryopreservation for clinical practice.
Literature analysis has demonstrated dimethyl sul-
foxide (DMSO), dimethyl acetamide (DMAC) and
1,2-propanediol (1,2-PD) as the most perspective cryo-
protectants for PC freezing. DMSO was recognised
as the “gold standard” because of providing the highest
level of platelet integrity during cryopreservation [18].
But an absolute prohibition of DMSO application as
a pharmacological agent due to the known toxic effect
requires its complete removal out of cell suspension
prior to transfusion, accompanying with additional
losses and damages in cryopreserved platelets, redu-
183 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №2
джується додатковими втрата-ми і пошкодженням
кріоконсервованих тромбоцитів, знижує їх життє-
здатність і лікувальну ефективність [16]. ДМАЦ
менш токсичний, але його кріопротекторні власти-
вості вважаються нижчими, ніж ДМСО [2, 5].
Стосовно 1,2-ПД слід враховувати достатньо висо-
ку його ефективність при кріоконсервуванні
багатьох біологічних об’єктів та низьку токсич-
ність. Результати досліджень [6] свідчать про перс-
пективність 1,2-ПД при заморожуванні кров’яних
пластинок, але за даними інших авторів ця кріо-
захисна сполука має слабку кріозахисну дію по
відношенню до тромбоцитів [14].
Мета роботи – порівняльне дослідження впливу
кріопротекторів на морфофункціональні власти-
вості тромбоцитів; оцінка ефективності кріокон-
сервування КТ з обраними кріопротекторами та
при їх комбінації.
Матеріали та методи
Концентрати тромбоцитів одержували з окре-
мих доз донорської крові, яку заготовляли на
консерванті “Глюгіцир“, методом диференційова-
ного центрифугування з використанням рефри-
жераторної центрифуги та пластикових мішків
“Гемакон” і “Компопласт” [1]. До заморожування
КТ зберігали при 22±2°C протягом 18-24 год при
постійному перемішуванні на автоматичній
мішалці зі швидкістю 2 об/хв.
У роботі використовували ДМСО, 1,2-ПД та
ДМАЦ, які були очищені та ідентифіковані у ІПКіК
НАН України.
Агрегаційну здатність тромбоцитів визначали
фотометричним методом [14] за допомогою аналі-
затора “Colysagraph” (США) з графічною реєстра-
цією змін оптичної густини суспензії на самописці
“Endim 622.01” (Німеччина). Одержані показники
у присутності розчинів КП 0,1 М виражали у від-
сотках до показників агрегації зразка, у який
замість розчину КП вводили плазму – контроль А.
Після експозиції КТ з розчинами КП 0,7 і 1,4 М
протягом 15 і 30 хв при 22±2°С та наступного вида-
лення КП способом [12] результати виражали у
відсотках до контрольних показників зразків –
контроль Б, які піддавали процедурі видалення КП
паралельно з дослідними, але замість розчину КП
вводили аутологічну плазму. Індукторами агрегації
були розчини АДФ у кінцевій концентрації 200 µМ
(“Serva”) та колаген у кінцевій концентрації
20 мг/мл (“Технологія-СТАНДАРТ”, Білорусь).
Реакцію на гіпотонічний шок (РГШ) реєстру-
вали за допомогою аналізатора “Colysagraph”
(США) методом [14] після експозиції КТ з розчина-
ми КП та видалення останнього. Результати вира-
жали у відсотках до показників РГШ контролю Б.
Морфологію тромбоцитів досліджували за до-
помогою інвертованого люмінесцентного мікро-
cing their viability and therapeutic efficacy [16].
DMAC is less toxic, but its cryoprotective properties
are considered as lower if comparing with DMSO [2,
5]. As for 1,2-PD we should take into consideration
its quite high efficiency in cryopreservation of many
biological objects and low toxicity. Research results
[6] testify to the perspectiveness of 1,2-PD for blood
platelet freezing, but as detailed by other authors this
cryoprotective compound has a slight cryoprotective
effect in respect of platelets [14].
Research was aimed to a comparative study of
cryoprotectant effect on morphofunctional properties
of platelets; estimation of PC cryopreservation
efficiency with selected cryoprotectants and under
their combination.
Materials and methods
Platelet concentrates were procured from separate
doses of donor blood, prepared on “Glygicir” preser-
vative by the method of differentiated centrifugation
using cold centrifuge, “Hemacon” and “Kompoplast”
plastic bags [1]. Prior to cryopreservation PC were
stored at 22±2°C within 18-24 hrs at a constant mixing
by automatic stirrer with 2 rpm rate.
DMSO, 1,2-PD and DMAC, purified and identified
at the Institute for Problems of Cryobiology and
Cryomedicine of the National Academy of Sciences
of Ukraine were used in the research.
Platelet ability to aggregate was determined using
the photometrical method [14] by means of “Colysa-
graph” analyzer (USA) with a graphic recording of
changes in suspension optical density with “Endim
622.01” recorder (Germany). The obtained indices at
the presence of 0.1 M CP solutions were expressed in
percentage to the aggregation indices of a sample,
where a plasm was introduced instead of CP solution:
control A. After PC exposure with 0.7 and 1.4 M CP
solutions for 15 and 30 min at 22± 2°C and following
CP removal as described in the paper [12], the results
were expressed in percentage to the control indices of
samples: control B, which underwent the procedure
of CP removal together with the studied ones, but an
autologous plasm was introduced instead of CP
solution. ADP solutions in 200 µM (“Serva”) and
collagen in 220 mg/ml final concentrations (“Tekhno-
logiya-STANDARD”, Byelorussia) served as aggrega-
tion inducers.
Hypotonic shock response (HSR) was recorded
with “Colysagraph” analyzer (USA) using the method,
detailed in the paper [14] after PC exposure with CP
solutions and removal of the latter. Results were ex-
pressed in percentage to the HSR indices of control B.
Platelet morphology was studied with inverted
luminescent microscope “Olympus IX74” (Japan).
Cytological preparations were prepared from platelets
suspension after their vital staining with acridine
orange (AO) using the method, described in the paper
184 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №2
скопа “Olympus IX74” (Японія). Цитологічні пре-
парати готували із суспензії тромбоцитів після їх
вітального забарвлення акридиновим оранжевим
(АО) за методом [3]. Збудження флуорохрому
викликали світлом ксенонової лампи при довжині
хвилі 450-490 нм, дослідження проводили при
500 нм з наступним збільшенням в бік червоної
області спектра. При спостереженні та фотогра-
фуванні об’єктів дослідження використовували
імерсійний об’єктив (×100). Для кількісного
аналізу морфологічного складу популяції тромбо-
цитів рахували кров’яні пластинки кожного виду:
гранулярні (неактивовані, активовані), деграну-
льовані, акридин-негативні, мікроформи, агрегати.
При кріоконсервуванні застосовували КП у
кінцевій концентрації 0,7 М та комбінацію ДМАЦ
і 1,2-ПД з кінцевою концентрацією кожного 0,35 М
(загальна 0,7 М) та 0,175 М (загальна 0,35 М).
Розчини КП на плазмі вводили в КТ у співвідно-
шенні 1:1 протягом 1 хв. Об’єм зразка становив
1,6 мл. Заморожування проводили одразу після
введення розчину КП в КТ за допомогою програм-
ного заморожувача “Cryoson” (Німеччина) у
кріоампулах “Nunc” (Німеччина) за програмами 1
та 2, які мали різну швидкість проходження
температурного інтервалу кристалізації кріозахис-
ного розчину. При заморожуванні за програмою 1
зразок охолоджували від 22±2°C до –35...–40°C зі
швидкістю 1°C/хв, після чого занурювали у рідкий
азот. Програму 2 виконували від 22±2°C до
температури кристалізації зі швидкістю 1°C/хв,
при температурі кристалізації проводили темпера-
турну ініціацію, далі зразок охолоджували зі швид-
кістю 1-2°C/хв до –35...–40°C та занурювали у
рідкий азот [11]. Ця програма забезпечує зняття
переохолодження у зразках при їх заморожуванні.
Зразки відігрівали на водяній бані при 37°C, одразу
оцінювали кількісну збереженість тромбоцитів за
методом [9].
Після центрифугування розморожених зразків
визначали ступінь пошкодження клітин за актив-
ністю у супернатанті цитозольних ферментів: лак-
тат-дегідрогенази (ЛДГ) [7] та глюкозо-6-фосфат-
дегідрогенази (Г6ФДГ) [8]. Контролем служили КТ
з максимальним виходом ферментів, що одержали
триразовим заморожуванням зразка без КП пря-
мим зануренням у рідкий азот з наступним
відігріванням при 37°С – термоциклювання (Т);
збагачена тромбоцитами плазма (ЗТП) та КТ до
заморожування. Морфофункціональну збереже-
ність кріоконсервованих тромбоцитів оцінювали
після видалення кріопротектора. Одержані показ-
ники виражали у відсотках до відповідних показ-
ників КТ до заморожування – контроль.
Статистичну обробку одержаних результатів
проводили за допомогою програми Microsoft Excel.
[3]. Fluorochrome excitation was induced by the xenon
lamp light at 450-490 mn wavelength, research was
done from 500 nm at the following increase towards
red region. For object monitoring and photography
the immersion lens (×100) were used. For a quantita-
tive analysis of morphological composition of platelet
population we calculated blood platelets of each type:
granular (non-activated, activated), degranulated,
acridine-negative, microforms, aggregates.
CP in 0.7 M final concentration and DMAC and
1,2-PD combination with final concentration of each
0.35 M (0.7 M total) and 0.175 M (0.35 M total) were
used at cryopreservation. CP solutions on plasm were
introduced into PC in 1:1 ratio for 1 min. Sample vo-
lume was 1.6 ml. Freezing was done right after intro-
ducing CP solution into PC using a programmable free-
zer “Cryoson” (Germany) into the “Nunc” cryovials
(Germany) according to the programs 1 and 2 with
different rate of passing through a temperature interval
of crystallisation in cryoprotective solution. When
freezing with the program 1 the sample was cooled
from 22±2°C down to –35…–40°C with 1°C/min rate
and immersed then into liquid nitrogen. Program 2
was accomplished from 22±2°C down to crystallisa-
tion temperature with 1°C/min rate, a temperature
initiation was done at crystallisation temperature, then
the sample was cooled with 1-2°C/min rate down to
–35…–40°C and immersed into liquid nitrogen [11].
This program provides the elimination of overcooling
in samples under their freezing. Samples were thawed
at water bath at 37°C with simultaneous estimation
of quantitative integrity of platelets by the method [9].
After centrifuging frozen-thawed samples a degree
of cell damage was determined according to the
activity in supernatant of cytosol enzymes: lactate
dehydro-genase (LDG) [7] and glucose-6-phosphate
dehydro-genase (G6PDG) [8]. The control was PC
with the maximum release of enzymes, obtained by a
three-fold freezing of the CP-free sample by a direct
immersion into liquid nitrogen with following thawing
at 37°C: thermocycling (T); platelet-rich plasm (PRP)
and PC prior to freezing. Morphofunctional integrity
of cryopreserved platelets was estimated after cryo-
protectant removal. The obtained indices were expres-
sed in percentage in respect of the corresponding PC
indices before freezing: the control. The results obtai-
ned were statistically processed with Microsoft Excel.
Results and discussion
An important condition to adequately estimate the
integrity of platelet morphofunctional peculiarities
under cryopreservation is a removal of cryoprotective
solution out of platelet suspension, which is done by
centrifuging, supernatant removal and resuspending
of precipitated cells in CP-free plasm. The result of
such CP removal is an additional damage of blood
185 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №2
Результати та обговорення
Важливою умовою адекватної оцінки збереже-
ності морфофункціональних властивостей тромбо-
цитів на етапах кріоконсервування є видалення
кріозахисного розчину із суспензії кров’яних
пластинок, яке здійснюють центрифугуванням,
видаленням супернатанту і ресуспендуванням
осаджених клітин у плазмі без КП. Результат
такого видалення КП – додаткове пошкодження
кров’яних пластинок [13,17]. Деякі автори пропо-
нують замінити центрифугування розведенням
клітин аутологічною плазмою до одержання низь-
ких кінцевих концентрацій КП. Так, автори роботи
[19] не виявили достовірних відмінностей між
показниками агрегації розведених тромбоцитів
(кінцева концентрація ДМСО 0,7-1%) і тими, що
відмивалися одноразово (кінцева концентрація
ДМСО 0,05%).
Ми розробили і використали новий спосіб
максимального видалення кріопротекторів із сус-
пензії тромбоцитів, який не чинить пошкоджуючої
дії [12]. Застосування цього способу дозволило
отримати більш вірогідну інформацію стосовно
впливу факторів кріоконсервування на морфофунк-
ціональний стан тромбоцитів. Присутність у сус-
пензії клітин досліджуваних КП при концентрації
0,1 М (0,76-0,87%) має інгібуючий вплив на агре-
гацію тромбоцитів (таблиця). Найбільш виражене
пригнічення даної функції спостерігається в при-
сутності ДМАЦ. Достовірних відмінностей між
ступенем пригнічення АДФ- і колаген-індукованої
агрегації під впливом ДМСО та 1,2-ПД не вияв-
лено. Показники АДФ і колаген-індукованої агре-
гації тромбоцитів після експозиції з ДМСО 0,7 та
1,4 М, а також після його видалення достовірно
не відрізнялися від показників агрегації конт-
ПKдиВ
PC
%,ФДАаняiцагергА
%,noitagerggaPDA
%,iнегалоканяiцагергА
%,noitagergganegalloC
ПKьтсiнтусирП
М1,0
M1.0foecneserP
PC
iцизопскеялсiП ї ПKяннеладиват
PCfolavomerdnaoterusopxeretfA ПKьтсiнтусирП
М1,0
M1.0foecneserP
PC
iцизопскеялсiП ї ПKяннеладиват
PCfolavomerdnaoterusopxeretfA
М7,0
M7.0
М4,1
M4.1
М7,0
M7.0
М4,1
M4.1
ОСМД
OSMD 6,01±9,06 * 6,01±2,98 #9±8,28 6,01±3,56 * 7,9±83,98 3,01±5,08
#
2,1 - ДП
2,1 - DP 2,31±3,65 * 5,41±501
# #3,61±211 5,9±76,85 * 8,21±7,701 # 8,21±611 **
ЦАМД
CAMD 3,01±9,21 * 3,01±38
# 9,9±8,47 ** 3,51±69,11 * 2,11±3,97 # 01±6,17 **
Вплив розчинів КП на агрегаційну здатність тромбоцитів
CP solutions effect on aggregation ability of platelets
Примітки: * – відмінності статистично достовірні відносно показників контролю А, прийнятого за 100%, р<0,05;
** – відмінності статистично достовірні відносно показників контролю Б, прийнятого за 100%, р<0,05;
# – тенденція до підвищення або зниження показників у порівнянні з контролем Б, р<0,1.
Notes: * – differences are statistically significant in respect of the control indices A, assumed as 100%, p<0.05
** – differences are statistically significant in respect of the control indices B, assumed as 100%, p<0.05
# – tendency to increase or decrease in indices in comparison with the control B, p<0.1.
platelets [13, 17]. Some authors propose to change
centrifugation for cell dilution with autologous plasm
up to obtaining the low final CP concentration. Thus,
the authors of paper [19] did not reveal any statistically
significant differences between aggregation indices of
diluted platelets (0.7-1% DMSO final concentration)
and those, being once washed (0.05% DMSO final
concentration).
We have developed and used a new way for
maximum removal of cryoprotectant out of platelet
suspension with no damaging effect [12]. This way
application enabled to obtain more statistically signi-
ficant information about the effect of cryopreser-
vation factors on platelet morphofunctional state. The
presence in cell suspension of studied CP in 0.1 M
concentration (0.76-0.87%) has an inhibiting effect
on platelet aggregation (Table). The most manifested
suppression of this function is observed at DMAC
presence. No statistically significant differences bet-
ween the suppression degree of ADP- and collagen-
induced aggregation under DMSO and 1,2-PD effect
were revealed. Indices of ATP and collagen-induced
aggregation of platelets after exposure with 0.7 and
1.4 M DMSO, as well as after its removal did not
statistically and significantly differ from those of
aggregation in control samples. The tendency to
augmentation and a statistically significant increase
in a degree of aggregative response to the introduction
of inducers after exposure and removal of 0.7 and
1.4 M 1,2-PD was observed. Platelet exposure to 0.7
and 1.4 M DMAC solutions, as well as its removal
resulted in a visible suppression of aggregative
response, induced by agonists.
After cryopreservation the statistically significant
highest level in preserving aggregation to ADP was
provided by applying DMAC and its combination with
186 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №2
рольних зразків. Спостерігалися тенденція до під-
вищення та достовірне підвищення ступеня
агрегаційної відповіді на введення індукторів
після експозиції та видалення 1,2-ПД 0,7 та 1,4 М.
Результатом експозиції тромбоцитів з розчинами
ДМАЦ 0,7 і 1,4 М, а також його видалення є
помітне пригнічення агрегаційної відповіді, яка
індукована агоністами.
Після кріоконсервування достовірно найвищий
рівень збереженості агрегації на АДФ забезпечили
використання ДМАЦ та його комбінація з 1,2-ПД
(рис.1). Результатом заморожування з ДМСО та
1,2-ПД був однаковий ступінь збереженості
агрегації на АДФ. За ефективністю забезпечення
збереженості колаген-індукованої агрегації тром-
боцитів кріопротектори та їх комбінації можна
розташувати у порядку зростання: 1,2-ПД 0,7 М <
(ПД+ДМАЦ) 0,7М < (ПД+ДМАЦ) 0,35 М <
ДМАЦ 0,7 М < ДМСО 0,7 М. Достовірних відмін-
ностей між агрегаційною здатністю тромбоцитів,
заморожених за двома програмами, не виявлено,
але спостерігається тенденція до підвищення збе-
реженості вказаної функції при застосуванні про-
грами 2.
Здатність тромбоцитів до компенсації після
збільшення початкового об’єму у гіпотонічному се-
редовищі (тобто РГШ) потребує структурно-функ-
ціональної цілісності і добре корелює з відновлен-
ням in vivo після трансфузії. В результаті проведе-
них досліджень ми прийшли до висновку, що
обрані кріопротектори у концентрації 0,7 М не
впливають на здатність кров’яних пластинок до
відновлення об’єму у РГШ. При підвищенні кон-
центрації кріопротекторів у розчинах до 1,4 М
спостерігається тенденція до зменшення показни-
ків РГШ, особливо для ДМАЦ.
Кріоконсервування призводить до значного
порушення осморегуляторних властивостей
кров’яних пластинок. Найвищий рівень збере-
женості РГШ отримано при кріоконсервуванні
тромбоцитів з ДМСО та при комбінації ДМАЦ і
1,2-ПД із загальною кінцевою концентрацією
0,7 М (рис.2). При комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД у
кінцевій концентрації 0,35 М та 1,2-ПД у кінцевій
концентрації 0,7 М результати кріоконсервування
за даним тестом виявилися вірогідно нижчими. За
показниками попередніх досліджень встановлено,
що більш високий рівень збереженості морфо-
функціональних властивостей тромбоцитів спос-
терігався при використанні менших концентрацій
1,2-ПД – 0,35 М [6]. Але в даній роботі ми приво-
димо результати використання однієї кінцевої
концентрації кріопротекторів – 0,7 М. Враховуючи
те, що серед досліджуваних кріопротекторів
найбільша проникність по відношенню до мемб-
рани тромбоцитів властива 1,2-ПД, останній
Рис. 1. Агрегаційна здатність тромбоцитів після
кріоконсервування за програмою 2: стовпчики –
колаген-агрегація; лінія – АДФ-агрегація; 1 – ДМСО
0,7 М; 2 – ДМАЦ 0,7 М; 3 – 1,2-ПД 0,7 М; 4 – 1,2-ПД +
ДМАЦ 0,7 М; 5 – 1,2-ПД + ДМАЦ 0,35 М. Відмінності
статистично достовірні відносно показників після
кріоконсервування: * – з ДМСО та 1,2-ПД, р<0,05; # –
з 1,2-ПД, ДМАЦ та при їх комбінації, р<0,05.
Fig. 1. Aggregative ability of platelets after cryopreservation
according to the program 2: columns represent collagen-
aggregation; line represents ADP-aggregation; 1 – 0.7 M
DMSO; 2 – 0.7 M DMAC; 3 – 0.7 M 1,2-PD; 4 – 0.7 M
1,2-PD + DMAC; 5 – 0.35 M 1,2-PD+DMAC. Differences
are statistically significant in respect of indices after
cryopreservation: * – using DMSO and 1,2-PD, p<0.05;
# – using 1,2-PD, DMAC and at their combination, p<0.05.
0
20
40
60
80
100
120
*
* *
#
Контроль А
Control A
1 2 3 4 5
Аг
ре
га
ці
я,
%
Ag
gr
eg
at
io
n,
%
1,2-PD (Fig. 1). Freezing with DMSO and 1.2-PD re-
sulted in an equal preservation extent of aggregation
to ADP. By the efficiency of providing the preservation
for collagen-induced platelet aggregation the cryopro-
tectants and their combinations can be placed in an
increasing order: 0.7 M 1,2-PD < 0.7 M (PD +
DMAC) < 0.35 M (PD + DMAC) < 0.7 M DMAC <
0.7 M DMSO. Any statistically significant differences
between aggregative ability of platelets, frozen by two
programs were not revealed, but the tendency to the
augmentation in the mentioned function preservation
when applying program 2 is observed.
Platelet ability to compensation after increasing an
initial volume in hypotonic medium (i.e. HSR) needs
a structural and functional integrity and correlates well
with in vivo recovery after transfusion. As a result of
investigations performed we concluded that the
selected cryoprotectants under 0.7 M concentration
did not affect the platelet ability to volume recovery
in HSR. With an increase in cryoprotectant concen-
tration up to 1.4 M in solutions the tendency to a
decrease in HSR indices, especially for DMAC is
observed.
Cryopreservation results in a significant disorder
in osmoregulative properties of blood platelets. The
highest level of HSR integrity was obtained during
187 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №2
повинен мати найменш виражений осмотичний
вплив на клітини. Можна зробити припущення, що
більш низькі показники РГШ при заморожуванні
з 1,2-ПД 0,7 М обумовлені його токсичністю за тих
концентрацій, які досягаються в процесі заморо-
жування. Високі показники відновлення тромбо-
цитів після кріоконсервування з комбінацією 1,2-
ПД та ДМАЦ підтверджують правильність нашого
припущення. Ми вважаємо, що застосування
комбінації КП дозволило досягти підвищення збе-
реженості тромбоцитів за рахунок зменшення ток-
сичного впливу кожного з них при загальній
концентрації 0,7 М у кріозахисному розчині.
Вихід каталітичних білків в екзоцелюлярне
середовище – показник порушення проникності
плазматичних мембран та клітинних пошкоджень.
Порівнюючи активність ЛДГ та Г6ФДГ, визначену
в плазмі одразу після виділення КТ і перед кріо-
консервуванням (рис. 3), вважаємо, що процеси
виділення та зберігання КТ протягом 18-24 год
супроводжуються помітним збільшенням пошко-
дженості клітин. Експозиція КТ з ДМСО та 1,2-ПД
0,7 М протягом 15 хв істотно не впливає на
активність вищезазначених ферментів у плазмі, в
0
20
40
60
80
100
120
*
#
*
Контроль Б
Control B
1 2 3 4 5
Рис. 2. Ступінь РГШ після кріоконсервування за
програмами 1 ( ), 2 ( ): 1 – ДМСО 0,7 М; 2 – ДМАЦ
0,7 М; 3 – 1,2-ПД 0,7 М; 4 – 1,2-ПД + ДМАЦ 0,7 М; 5 –
1,2-ПД + ДМАЦ 0,35 М. Відмінності статистично
достовірні відносно показників після кріоконсер-
вування: * – з ДМАЦ та 1,2-ПД та їх комбінації, р<0,05;
# – з ДМСО, ДМАЦ та при комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД,
р<0,05.
Fig. 2. HSR degree after cryopreservation according to the
programs 1 ( ), 2 ( ): 1 – 0.7 M DMSO; 2 – 0.7 M DMAC;
3 – 0.7 M 1,2-PD; 4 – 0.7 M 1,2-PD + DMAC; 5 – 0.35 M
1,2-PD+DMAC. Differences are statistically significant in
respect of indices after cryopreservation: * – using DMAC,
1.2-PD and at their combination, p<0.05; # – using DMSO,
DMAC and at DMAC and 1,2-PD combination, p<0.05.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
*
*
*
*
#
*
10
10,5
T
T
1 2 3 4 5ЗТП
PRP
КТ
PC
Ак
ти
вн
іс
ть
Г
6Ф
ДГ
, у
.о
.
G
6P
D
G
a
ct
iv
ity
, r
el
at
iv
e
un
its
Рис. 3. Вплив кріоконсервування за програмами 1 ( ),
2 ( ) на рівень пошкодження тромбоцитів, визначений
за активністю цитозольних ферментів у середовищі
кріоконсервування: : 1 – ДМСО 0,7 М; 2 – ДМАЦ 0,7 М;
3 – 1,2-ПД 0,7 М; 4 – 1,2-ПД + ДМАЦ 0,7 М; 5 –
1,2-ПД + ДМАЦ 0,35 М; * – відмінності статистично
достовірні відносно показників після кріоконсервування
за програмою 1, р<0,05;** – відмінності статистично
достовірні відносно показників ЗТП, р<0,05.
Fig. 3. Effect of cryopreservation according to the programs
1 ( ) and 2 ( ) at the level of platelet damage determined
by the activity of cytosol enzymes in cryopreservation
medium: 1 – 0.7 M DMSO; 2 – 0.7 M DMAC; 3 – 0.7 M
1,2-PD; 4 – 0.7 M 1,2-PD + DMAC; 5 – 0.35 M 1,2-PD +
DMAC; * – differences are statistically significant in respect
of indices after cryopreservation by the program 1, p<0.05;
# – differences are statistically significant in respect of PRP
indices, p<0.05.
Ві
дн
ов
ле
нн
я
об
’є
м
у,
%
Vo
lu
m
e
re
co
ve
ry
, %
platelet cryopreservation with DMSO and at DMAC
and 1,2-PD combination in 0.7 M final concentration
(Fig .2). When combining DMAC with 1,2-PD in 0.35
and 0.7 M final concentrations, correspondingly, the
cryopreservation results according to this test occurred
to be statistically and significantly lower. By the
indices of previous research a higher level of integrity
of platelet morphofunctional properties was establi-
shed to be observed in applying lower concentrations
of 1,2-PD: 0.35 M [6]. However in this work we de-
monstrate the results of applying one final concent-
ration of cryoprotectants: 0.7 M. Taking into account
the fact that among the studied cryoprotectants the
highest penetration in respect of platelet membranes
is inherent to 1,2-PD, the latter should have less
manifested osmotic effect on cells. We can speculate
that lower indices of HSR at freezing with 0.7 M 1,2-
PD are stipulated by its toxicity in those concen-
trations, achieved during freezing. High indices of
platelet recovery after cryopreservation with 1,2-PD
and DMAC combination are confirmed by our correct
supposition. We consider the application of CP com-
bination as enabling to achieve the augmentation of
platelet preservation due to a reduction of toxic effect
188 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №2
той час як експозиція КТ з ДМАЦ призводить до
суттєвого зменшення їх активності.
Підвищення активності цитозольних ферментів
у кріозахисному середовищі є ознакою їх виходу з
клітин внаслідок кріопошкодження і може вико-
ристовуватися в комплексній оцінці морфофунк-
ціональної збереженості клітин після кріоконсер-
вування. Заморожування з усіма досліджуваними
кріопротекторами та при їх комбінації призводить
до вірогідно більшого зростання активності фер-
ментів після кріоконсервування за програмою 1,
ніж за програмою 2 (рис. 3). За даним тестом вста-
новленно, що заморожування з ДМСО більш
ефективне, ніж з 1,2-ПД. Рівень активності цито-
зольних ферментів після кріоконсервування з
ДМАЦ та при його комбінації з 1,2-ПД у загаль-
ній кінцевій концентрації 0,7 М виявився найниж-
чим. При дослідженні впливу кріопротекторів
безпосередньо на активність ЛДГ та Г6ФДГ ми
виявили, що ДМАЦ її пригнічує. Враховуючи це,
вважаємо некоректним порівняння результатів
кріоконсервування КТ з ДМАЦ та результатів їх
заморожування в присутності ДМСО та 1,2-ПД,
оскільки вони не впливають на активність фермен-
тів. Метод оцінки рівня пошкодження клітин за
активністю у супернатанті цитозольних ферментів
виявляється коректним у порівнянні ефективності
програм заморожування при використанні одного
кріопротектора в різних концентраціях або при
порівнянні ефективності заморожування з різними
КП, які не впливають на активність досліджуваних
ферментів.
Характерний показник функціональної актив-
ності тромбоцитів – здатність до акумуляції орга-
нічних катіонів. Особливо перспективним для вив-
чення цїєї здатності вважається застосування
флуоресцентних похідних акридину, які можуть
накопичуватися у гранулярному апараті тромбо-
цитів і виводитися разом з вмістом гранул у
оточуюче середовище при секреції, під час реакції
вивільнення у результаті активації або пошко-
дження кров’яних пластинок [3]. Встановлено, що
здатність до накопичення АО достатньо стабільна
і не змінюється протягом 3-х діб зберігання КТ при
температурі 22±2°C, але при більш тривалому
зберіганні КТ (до 9 діб) і зниженні температури
суспензії до 0-4°C вона зменшується [4, 10]. Ми
дослідили вплив процесів виділення і зберігання
КТ, експозиції КТ з КП та заморожування, відігрі-
вання, видалення КП на вказану властивість
кров’яних пластинок.
В цитологічних препаратах, які одержані зі ЗТП
(рис. 4), співвідношення морфологічних типів
тромбоцитів таке, як у здорової людини [3].
Цитологічна картина препаратів, виготовлених з
for each of them at 0.7 M total concentra-tion in
cryoprotective solution.
Release of catalytic proteins into exocellular
medium is the index of disorder in plasmatic
membrane permeability and cell damages. If compa-
ring the activity of LDG and G6PDG, determined in
plasm right after PC isolation and prior to cryo-
preservation (Fig. 3) we consider the process of PC
isolation and preservation within 18-24 hrs to be
accompanied by a visible augmentation of cell damage.
PC exposure with DMSO and 0.7 M 1,2-PD for 15 min
does not significantly affect the activity of mentioned
above enzymes in plasm, meanwhile the PC exposure
with DMAC results in a considerable reduction of their
activity.
Augmentation of cytosol enzyme activity in
cryoprotective medium is the sign of their release out
of cells due to cryodamage and can be used in a
combined assessment of cell morphofunctional
integrity after cryopreservation. Freezing with all
studied cryoprotectants and under their combination
results in statistically and significantly greater increase
in enzyme activity after cryopreservation according
to the program 1, if comparing with program 2 (Fig. 3).
With this test freezing with DMSO was established
to be more efficient than with 1,2-PD. The level of
cytosol enzyme activity after cryopreservation with
DMAC and at its combination with 1.2-PD in 0.7 M
total final concentration occurred to be the lowest.
When investigating the effect of cryoprotectants
directly on LDG and G6PDG activity we revealed
DMAC as suppressing it. Taking this fact into account,
we consider as incorrect to compare the results of PC
cryopreservation with DMAC and those for their
freezing with DMSO and 1,2-PD, since they do not
affect the enzyme activity. The estimation method for
the level of cell damage by the activity in a supernatant
of cytosol enzymes occurs to be correct if to compare
with the efficiency of freezing programs when ap-
plying one cryoprotectant under different concen-
trations or in comparison with freezing efficiency with
different CP, which do not affect the activity of the
studied enzymes.
A typical feature of platelet functional activity is
the ability to accumulate organic cations. Of special
perspective for studying this capability one considers
the application of fluorescent derivatives of acridine,
which can be accumulated in granular apparatus of
platelets and released together with granular content
into surrounding medium during secretion, at a release
response as a result of platelet activation or damage
[3]. The capability to accumulate AO was established
to be quite a stable and unchanging within 3 days of
PC storage at 22±2°C, but it reduced under more
prolonged storage (up to 9 days) and a suspension
189 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №2
КТ, який перед заморожуванням зберігався
18-24 год при 22±2°С, характеризувалася більш
високим вмістом активованих та дегранульованих
форм тромбоцитів і меншою кількістю гранул у
них. Подібні зміни спостерігалися після експозиції
КТ з розчинами КП та видалення останніх.
Морфологічне дослідження зразків після замо-
рожування-відігрівання і видалення КП виявило
наявність об’єктів, що не включають флуорохром
АО (акридин-негативні), але за формою нагадують
тромбоцити в стані активації (з псевдоподіями,
деформовані). Вміст таких морфологічних форм
був найбільшим після кріоконсервування з
розчинами ДМАЦ та 1,2-ПД 0,7 М (відповідно
53±6 та 49±8%) (рис. 5). Результат кріоконсер-
вування з ДМСО – поява біля 30% акридин-
негативних тромбоцитів, а з комбінаціями ДМАЦ
і 1,2-ПД у кінцевій концентрації кожного 0,35 та
0,175 М (відповідно 36±7 та 43±4%). Решту клітин
становили гранулярні активовані та дегранульовані
тромбоцити. Найбільший відсоток гранулярних
клітин спостерігали після кріоконсервування з
ДМСО (29%) та при комбінації ДМАЦ і 1,2-ПД у
загальній кінцевій концентрації 0,7 та 0,35 М
(відповідно 28 і 25%). Цитологічна картина зразку
КТ, який був заморожений без кріопротектора
прямим зануренням у рідкий азот, представлена
на рис. 6. Більше двох третин формених елементів
складають акридин-негативні тромбоцити, а реш-
ту – дегранульовані тромбоцити та їх мікроформи.
Слід підкреслити, що для експериментальних
досліджень використовували КТ, які зберігалися
після виділення протягом 18-24 год через необхід-
ність проведення у повному обсязі досліджень на
наявність у крові збудників трансмісивних інфек-
цій. Таке зберігання впливало на показники
0
20
40
60
80
100
120
Ко
ли
че
ст
во
т
ро
мб
оц
ит
ов
, %
Pl
at
el
et
a
m
ou
nt
, %
Контроль
Control
1 2 3 4 5
Рис. 5. Кількісна збереженість та морфологічний склад
тромбоцитів після кріоконсервування за програмою 2:
– гранульовані тромбоцити; – дегранульовані; –
акридин-негативні; 1 – ДМСО 0,7 М; 2 – ДМАЦ 0,7 М;
3 – 1,2-ПД 0,7 М; 4 – 1,2-ПД + ДМАЦ 0,7 М; 5 – 1,2-ПД +
ДМАЦ 0,35 М.
Fig. 5. Quantitative integrity and morphological composi-
tion of platelets after cryopreservation according to the prog-
ram 2: – granulated; – degranulated; – acridine-
negative; 1 – 0.7 M DMSO; 2 – 0.7 M DMAC; 3 – 0.7 M
1,2-PD; 4 – 0.7 M 1,2-PD + DMAC; 5 – 0.35 M
1,2-PD+DMAC.
Рис. 4. Цитологічна картина препарату КТ зі ЗТП: 1 –
неактивований гранулярний тромбоцит. Барвник – АО.
×100.
Fig. 4. Cytological picture of PCs preparation from PRP:
1 – non-activated granulative platelet. AO staining, ×100.
temperature decrease down to 0-4°C [4, 10]. We have
investigated the effect of PCs isolation and storage,
their exposure with CP, freezing, thawing, CP removal
on the mentioned property of platelets.
In cytological preparations, procured from PRP
(Fig. 4) the ratio of morphological types of platelets
is the same as for a healthy patient [3]. Cytological
picture of preparations, derived from PCs, stored for
18-24 hrs at 22±2°C before freezing, is characterised
by higher content of activated and degranulated forms
of platelets and lower amount of granules in it. Similar
changes were noted after PC exposure with CP
solutions and removing the latter.
Morphological study of samples after freeze-
thawing and CP removal has revealed the presence of
objects, not comprising fluorochrome AO (acridine-
negative), but on their shape resembling the platelets
in activated state (with pseudopodia, deformed). The
content of such morphological forms was the highest
after cryopreservation with DMAC and 0.7 M 1,2-PD
(53±6 and 49±8%, correspondingly). Cryopreser-
vation with DMSO resulted in appearance of about
30% acridine-negative platelets, but with DMAC and
1,2-PD combination in 0.35 and 0.175 M final
concentration of each it was 36±7 and 43±4%,
correspondingly. The rest of cells were granular
activated and degranulated platelets. The highest
percentage of granular cells was observed after
cryopreservation with DMSO (29%) and when
190 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №2
морфофункціональних властивостей кров’яних
пластинок. Як свідчать одержані в роботі резуль-
тати експериментальних досліджень, кріоконсер-
вування таких КТ дозволяє отримати прийнятний
рівень їх збереженості.
Висновки
На підставі комплексу критеріїв оцінки морфо-
функціональних властивостей тромбоцитів
проведено порівняльне дослідження кріозахисної
ефективності КП (ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД) та при
їх комбінації на етапах кріоконсервування.
Показано, що найвищі показники збереженості
тромбоцитів отримані при їх кріоконсервуванні з
ДМСО та комбінації 1,2-ПД і ДМАЦ у кінцевій
концентрації 0,7 М. Експериментальні дані свід-
чать про перспективність використання комбі-
націй КП, зокрема ДМАЦ і 1,2-ПД, при розробці
складу кріозахисного середовища для кріоконсер-
вування тромбоцитів.
Удосконаленння програми заморожування за
рахунок зняття переохолодження суспензії тромбо-
цитів у кріозахисних розчинах дозволяє підвищити
збереженість кріоконсервованих кров’яних плас-
тинок за більшістю показників морфофункціо-
нальної повноцінності незалежно від типу вико-
ристаних КП та їх комбінації. Контрольоване замо-
рожування суспензії тромбоцитів у температур-
ному інтервалі кристалізації особливо важливе при
зменшенні концентрації кріопротекторів.
Рис. 6. Цитологічна картина препарату КТ після
занурення у рідкий азот без кріопротектора: 1 –
активований тромбоцит; 2 – дегранульований тромбо-
цит; 3 – мікроформа тромбоцита; 4 – акридин-негативні
тромбоцити. ×100.
Fig. 6. Cytological picture of PC preparation after
immersing into liquid nitrogen without cryoprotectant: 1 –
activated platelet; 2 – degranulated platelet; 3 – platelet
microform; 4 – acridine-negative platelets. ×100.
Література
Аграненко В.А., Компаниец А.М., Балезина Л.В. и др.
Выделение концентратов тромбоцитов из ЛТС донорской
крови и их консервирование // Гематология и транс-
фузиология.– 1991. – №3. – С. 29-32.
Азовская С.А., Суханов Ю.С., Жуковская Н.Л., Конопли-
на Л.А. Сравнительное изучение криопротекторных
свойств диметилацетамида и диметилсульфоксида при
хранении тромбоцитов в условиях умеренно низких
combining DMAC and 1,2-PD in total final concen-
tration of 0.7 and 0.35 M (28 and 25% correspon-
dingly). Cytological picture of PCs sample, frozen
without cryoprotectant by a direct immersion into
liquid nitrogen is shown in Fig. 6. More than two thirds
of formed elements are acridine-negative platelets and
the rest ones are degranulated platelets and their
microforms.
Of note is that for experimental research we used
PCs, stored after isolation within 18-24 hrs due to the
necessity to study blood for transmissive infections.
This storage affected the indices of morphofunctional
properties of blood platelets. As testified by the results
obtained in the research, the cryopreservation of such
PC enables obtaining their integrity appropriate level.
Conclusions
Basing on a complex of criteria for estimating
morphofunctional properties of platelets we have
carried-out a comparative study of cryoprotective
efficiency of CPs (DMSO, DMAC, 1,2-PD) and when
combining them under cryopreservation stages.
The highest indices of platelet preservation were
shown to be obtained at their cryopreservation with
DMSO and 1,2-PD and DMAC combination in 0.7 M
final concentration. Experimental data testify to the
perspectiveness of applying CP combination, espe-
cially DMAC and 1,2-PD when elaborating the
composition of cryoprotective medium for platelet
cryopreservation.
Improvement of freezing program due to the
overcooling elimination of platelet suspension in
cryoprotective media enables to increase the preser-
vation rate of cryopreserved platelets according to the
majority of the indices of morphofunctional integrity,
independently on a type of used CPs and their
combination. Controlled freezing of platelet suspen-
sion in temperature interval of crystallisation is of
special importance when reducing cryoprotectant
concentration.
References
Agranenko V.A., Kompaniets A.M., Balezina L.V. et al. Isolation
of platelet concentrates from donor blood LTS and their
preservation // Gematologiya i transfuziologiya.– 1991.– N3.–
P. 29-32.
1.
2.
1.
191 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №2
температур // Пробл. гематологии и переливания крови.–
1989.– №12.– С. 18-21.
Деменко В.Д., Ладная Л.Д., Лебединец В.В., Крупенко Н.Е.
Метод люминесцентной микроскопии тромбоцитов в
диагностике гемостатических нарушений у пациентов с
церебральным атеросклерозом // Врачебное дело.– 1990.–
№4.– С. 63-66.
Козлов В.К. Лизосомоподобные α-гранулы тромбоцитов:
выявление при обработке акридиновым оранжевым, неко-
торые свойства и преобразования в ходе реакции гемокоа-
гуляции // Цитология.– 1975.– Т. XVII, №7.– С. 762-767.
Компаниец А.М. Консервирование концентратов тромбо-
цитов и их лечебная эффективность: Автореф. дис. ... докт.
мед. наук.– М., 1992.– 52 с.
Компаниец А.М., Николенко А.В., Луговой В.И. Криокон-
сервирование тромбоцитов с веществами полиолов // Тез.
ІІ Международной конференции по криобиологии.–
Харьков, 1992.– С. 86.
Лемешко В.В., Нікітченко Ю.В., Троянова В.Н. Особливості
ішемічного пошкодження мембран та активація пере-
кисного окислення ліпідів у міокарді щурів різного віку //
Укр. біохімічний журнал.– 1989.– №2.– С. 98-105.
Родионова В.Л., Никитченко Ю.В., Чуб Н.Н., Черепанов В.В.
Сукцинатдегидрогеназная и глюкозо-6-фосфатдегидро-
геназная активность спермы человека на этапах низкотем-
пературного консервирования // Пробл. криобиологии.–
2005.– Т. 15, №2.– С. 207-211.
Ронин В.С. Способ окраски тромбоцитов для подсчета в
счетной камере // Лабораторное дело.– 1983.– №1.–
С. 61-62.
Трунилина Н.Н., Мурина М.А., Рощупкин Д.И. и др.
Исследование начальной агрегации и аккумуляции
акридинового оранжевого в тромбоцитах при хранении
тромбоцитарного концентрата с использованием гипо-
хлорида натрия // Гематология и трансфузиология.– 2000.–
№5.– С.17-19.
Пат. № 4523 Україна. МПК7 А0N 1/02. Спосіб кріоконсерву-
вання суспензії клітин ембріональної нервової тканини /
В.І. Грищенко, А.М. Гольцев, Т.М. Гуріна, Н.М.Бабенко.
Заявлено 24.05.04; Опубл. 17.01.05. – Бюл. №1.
Пат. № 15014 Україна. МПК8 А0N 1/02. Спосіб видалення
кріопротектора із суспензії тромбоцитів / В.І. Грищенко,
А.М. Компанієць, О.В. Книш. Заявлено 18.11.2005; Опубл.
15.06.06. – Бюл. № 6.
Arnaud F.G., Hunt Ch.J., Pegg D.E. Some effects of propane-
1,2-diol on human platelets // Cryobiology.– 1990.– Vol. 27,
N2.– P. 119-129.
Arnaud F.G., Pegg D.E. Cryopreservation of human platelets
with propane-1,2-diol // Cryobiology.– 1990.– Vol. 27, N2. –
P. 130-136.
Balint B., Paunovic D., Vucetic D. at al. Controlled-rate versus
uncontrolled-rate freezing as predictors for platelet
cryopreservation efficacy // Transfusion.– 2006.– Vol. 46, N2.–
P. 230-235.
Baythoon H., Tuddenham E.G.D., Hutton R.A. Morphological
and functional disturbances of platelets induced by
cryopreservation // J. Clin. Patol.– 1982.– Vol. 35, N3.–
P. 870-874.
Lehuu B., Curtis-Prior P.B. Effects of dimethyl sulfoxide
(DMSO) on aggregation of human blood platelets // J. Pharm.
Pharmacol.– 1987.– Vol. 39, N1.– P. 62-63.
Reid T.J., Gao D. Symposium on cryopreservation of human
platelets: an overview. Held on the 35th Annual Meeting of
the Society for Cryobiology, Pittsburgh, Pennsylvania, July 16,
1998 // Cryobiology. – 1999. – Vol. 38, N3.– P. 177-179.
Shepherd K.M., Sage R.E., Barber S., O’Brien E. Platelet
cryopreservation. In vitro aggregation studies // Cryobiology.–
1984.– Vol. 21, N4.– P. 39-43.
Надійшла 20.12.2005
Azovskaya S.A., Sukhanov Yu.S., Zhukovskaya N.L.,
Konoplina L.A. A comparative study of cryoprotective
properties of dimethyl acetamide and dimethyl sulfoxide at
platelet storage under conditions of moderately low
temperatures // Problemy gematologii i perelivaniya krovi.–
1989.– N12.– P. 18-21.
Demenko V.D., Ladnaya L.D., Lebedinets V.V., Krupenko N.E.
Method of luminescent microscopy for platelets in diagnosis
of hemostatic disorders in patients with cerebral athero-
sclerosis // Vrachebnoe delo.– 1990.– N4.– P. 56-66.
Kozlov V.K. Lysosome-like structures of platelets: revealing a
treatment with acridine orange, some properties and
rearrangements during hemocoagulation reaction // Tsito-
logia.– 1975.– Vol. XVII, N7.– P. 762-767.
Kompaniets A.M. Preservation of platelet concentrations and
their therapeutic efficiency: Author’s abstract of thesis of doctor
of med. sciences.– Moscow, 1992.– 52 p.
Kompaniets A.M., Nikolenko A.V., Lugovoy V.I. Platelet
cryopreservation with polyol substances // Abstracts of 2nd
International Conference on Cryobiology.– Kharkov, 1992.–
P. 86.
Lemeshko V.V., Nikitchenko Yu.V., Troyanova V.N. Pecu-
liarities of ischemic injuries in membranes and activation of
lipid peroxidation in myocardium of rats of different age //
Ukr. Biokhim. Zhurnal.– 1989.– N2.– P. 98-105.
Rodionova V.L., Nikitchenko Yu.V., Chub N.N., Cherepa-
nov V.V. Succinate-dehydrogenase and glucose-6-phosphate
dehydrogenase activities of human sperm at low temperature
preservation stages // Problems of Cryobiology.– 2005.– N2.–
P. 207-211.
Ronin V.S. Way for platelet staining to be counted in counting
chamber // Lab. delo.– 1983.– N1.– P. 61-62.
Tronulina N.N., Murina M.A., Roschupkin D.I. et al. Study of
initial aggregation and accumulation of acridine orange in
platelets during platelet concentrate storage with sodium
hypochloride // Gematologiya i transfuziologiya.– 2000.– N5.–
P. 17-19.
Patent N 4523 Ukraine. IPC7 AON 1/02. Way for cryopreser-
vation of cell suspension of embryonic nerve tissue /
V.I. Grischenko, A.N. Goltsev, T.M. Gurina, N.M. Babenko.
Applied 24.05.05; Published 17.01.05.– Bull.1.
Patent N 15014 Ukraine. IPC8 AON 1/02. Way for cryopro-
tectant removal out of platelet suspension / V.I. Grischenko,
A.M. Kompaniets, O.V. Knysh. Applied 18.11.2005; Published
15.06.06. Bull. N6.
Arnaud F.G., Hunt Ch.J., Pegg D.E. Some effects of propane-
1,2-diol on human platelets // Cryobiology.– 1990.– Vol. 27,
N2.– P. 119-129.
Arnaud F.G., Pegg D.E. Cryopreservation of human platelets
with propane-1,2-diol // Cryobiology.– 1990.– Vol. 27, N2. –
P. 130-136.
Balint B., Paunovic D., Vucetic D. at al. Controlled-rate versus
uncontrolled-rate freezing as predictors for platelet
cryopreservation efficacy // Transfusion.– 2006.– Vol. 46, N2.–
P. 230-235.
Baythoon H., Tuddenham E.G.D., Hutton R.A. Morphological
and functional disturbances of platelets induced by
cryopreservation // J. Clin. Patol.– 1982.– Vol. 35, N3.–
P. 870-874.
Lehuu B., Curtis-Prior P.B. Effects of dimethyl sulfoxide
(DMSO) on aggregation of human blood platelets // J. Pharm.
Pharmacol.– 1987.– Vol. 39, N1.– P. 62-63.
Reid T.J., Gao D. Symposium on cryopreservation of human
platelets: an overview. Held on the 35th Annual Meeting of
the Society for Cryobiology, Pittsburgh, Pennsylvania, July 16,
1998 // Cryobiology. – 1999. – Vol. 38, N3.– P. 177-179.
Shepherd K.M., Sage R.E., Barber S., O’Brien E. Platelet
cryopreservation. In vitro aggregation studies // Cryobiology.–
1984.– Vol. 21, N4.– P. 39-43.
Accepted in 20.12.2005
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
|