Влияние криоконсервирования на функциональный статус стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией
Компонентом реконструктивной терапии аутоиммунных заболеваний (АИЗ) является применение криоконсервированного аутологичного костного мозга (КМ). Эффективность использования КМ определяется степенью сохранности его стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток (СКК и МСК). Данный факт определяет н...
Gespeichert in:
| Datum: | 2016 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2016
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/137386 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Влияние криоконсервирования на функциональный статус стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией / А.Н. Гольцев, Ю.А. Гаевская, Т.Г. Дубрава, Л.В. Останкова // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 1. — С. 63–72. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-137386 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1373862018-06-18T03:04:02Z Влияние криоконсервирования на функциональный статус стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией Гольцев, А.Н. Гаевская, Ю.А. Дубрава, Т.Г. Останкова, Л.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология Компонентом реконструктивной терапии аутоиммунных заболеваний (АИЗ) является применение криоконсервированного аутологичного костного мозга (КМ). Эффективность использования КМ определяется степенью сохранности его стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток (СКК и МСК). Данный факт определяет необходимость разработки оптимальных режимов криоконсервирования КМ доноров с АИЗ. В работе был оценен функциональный статус СКК и МСК костного мозга мышей с адъювантным артритом (АА), инициированным введением полного адъюванта Фрейнда. Костный мозг мышей линии СВА/Н на 14-е сутки АА (хроническая стадия) и КМ здоровых животных криоконсервировали под защитой диметилсульфоксида. Содержание СКК различной степени дифференцировки определяли методом селезеночного колониеобразования in vivo на 8-е (КОЕс-8) и 14-е (КОЕс-14) сутки. Функциональную активность МСК в КМ исследовали в условиях in vitro по содержанию колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕф). Установлен факт изменения функционального потенциала кроветворных предшественников КМ разного уровня дифференцировки (КОЕс-8, КОЕс-14) и их стромального микроокружения (КОЕф) в период клинической манифестации АА. Установлено, что после криоконсервирования клеток КМ животных с АА с 7% ДМСО функциональный потенциал КОЕс и КОЕф был аналогичным показателям КМ здоровых животных, криоконсервированного с 10% ДМСО. Компонентом реконструктивної терапії аутоімунних захворювань (АІЗ) є застосування кріоконсервованого аутологічного кісткового мозку (КМ). Ефективність використання КМ визначається ступенем збереженості його стовбурових кровотвірних і мезенхімальних клітин (СКК і МСК). Даний факт визначає необхідність розробки оптимальних режимів кріоконсервування КМ донорів із АІЗ. У роботі оцінено функціональний статус СКК і МСК кісткового мозку мишей із ад'ювантним артритом (АА), ініційованим введенням повного ад'юванта Фрейнда. Кістковий мозок мишей лінії СВА/Н на 14-у добу АА (хронічна стадія) і здорових тварин кріоконсервували під захистом диметилсульфоксиду. Вміст СКК різного ступеня диференціювання визначали методом селезінкового колонієутворювання in vivo на 8-у (КУОс-8) і 14-у (КУОс-14) добу. Функціональну активність МСК у КМ досліджували в умовах in vitro за вмістом колонієутворюючих одиниць фібробластів (КУОф). Встановлено факт зміни функціонального потенціалу кровотвірних попередників КМ різного рівня диференціювання (КУОс-8, КУОс-14) та їх стромального мікрооточення (КУОф) у період клінічної маніфестації АА. Встановлено, що після кріоконсервування клітин КМ тварин з АА під захистом 7% ДМСО функціональний потенціал КУОс і КУОф був аналогічним показникам КМ здорових тварин, кріоконсервованого з 10% ДМСО. The application of cryopreserved autologous bone marrow (BM) is the reconstructive therapy tool for autoimmune diseases (AIDs). The BM use efficiency is determined by preservation rate of its hematopoietic and mesenchymal stem cells (HSCs and MSCs, respectively). This fact determines the need to design the optimal cryopreservation regimens for the BM of AIDs donors. Here we assessed a functional status of bone marrow HSCs and MSCs of mice with adjuvant arthritis (AA), initiated by Freund's complete adjuvant administration. The bone marrow of CBA/H mice to day 14 of AA (chronic stage) and that of healthy animals were cryopreserved under dimethyl sulfoxide protection. The content of HSCs of various differentiation extent was determined by spleen colony formation in vivo to days 8 (CFU-S-8) and 14 (CFU-S-14). Functional activity of MSCs in BM was studied in vitro by the content of fibroblast colony forming units (CFU-F). There was established the fact of altering the functional potential of hematopoietic progenitor cells of BM of various differentiation levels (CFU-S-8, CFU-S-14) and their stromal microenvironment (CFU-F) during clinical manifestation of AA. After cryopreservation of AA animals' BM cells with 7% DMSO a functional potential of CFU-S and CFU-F was established to be similar to the healthy animals' BM, cryopreserved with 10% DMSO. The cryopreserved with the proposed regimen autologous BM may be used for a targeted recovery of lymphohemopoietic system in AA animals. 2016 Article Влияние криоконсервирования на функциональный статус стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией / А.Н. Гольцев, Ю.А. Гаевская, Т.Г. Дубрава, Л.В. Останкова // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 1. — С. 63–72. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/137386 615.014.41:611-013.395:616-092 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Гольцев, А.Н. Гаевская, Ю.А. Дубрава, Т.Г. Останкова, Л.В. Влияние криоконсервирования на функциональный статус стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Компонентом реконструктивной терапии аутоиммунных заболеваний (АИЗ) является применение
криоконсервированного аутологичного костного мозга (КМ). Эффективность использования КМ определяется степенью
сохранности его стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток (СКК и МСК). Данный факт определяет необходимость
разработки оптимальных режимов криоконсервирования КМ доноров с АИЗ. В работе был оценен функциональный статус
СКК и МСК костного мозга мышей с адъювантным артритом (АА), инициированным введением полного адъюванта Фрейнда.
Костный мозг мышей линии СВА/Н на 14-е сутки АА (хроническая стадия) и КМ здоровых животных криоконсервировали
под защитой диметилсульфоксида. Содержание СКК различной степени дифференцировки определяли методом
селезеночного колониеобразования in vivo на 8-е (КОЕс-8) и 14-е (КОЕс-14) сутки. Функциональную активность МСК в КМ
исследовали в условиях in vitro по содержанию колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕф). Установлен факт
изменения функционального потенциала кроветворных предшественников КМ разного уровня дифференцировки (КОЕс-8,
КОЕс-14) и их стромального микроокружения (КОЕф) в период клинической манифестации АА. Установлено, что после
криоконсервирования клеток КМ животных с АА с 7% ДМСО функциональный потенциал КОЕс и КОЕф был аналогичным
показателям КМ здоровых животных, криоконсервированного с 10% ДМСО. |
| format |
Article |
| author |
Гольцев, А.Н. Гаевская, Ю.А. Дубрава, Т.Г. Останкова, Л.В. |
| author_facet |
Гольцев, А.Н. Гаевская, Ю.А. Дубрава, Т.Г. Останкова, Л.В. |
| author_sort |
Гольцев, А.Н. |
| title |
Влияние криоконсервирования на функциональный статус стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией |
| title_short |
Влияние криоконсервирования на функциональный статус стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией |
| title_full |
Влияние криоконсервирования на функциональный статус стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией |
| title_fullStr |
Влияние криоконсервирования на функциональный статус стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией |
| title_full_unstemmed |
Влияние криоконсервирования на функциональный статус стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией |
| title_sort |
влияние криоконсервирования на функциональный статус стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2016 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/137386 |
| citation_txt |
Влияние криоконсервирования на функциональный статус стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией / А.Н. Гольцев, Ю.А. Гаевская, Т.Г. Дубрава, Л.В. Останкова // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 1. — С. 63–72. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT golʹcevan vliâniekriokonservirovaniânafunkcionalʹnyjstatusstvolovyhkrovetvornyhimezenhimalʹnyhkletokkostnogomozgaživotnyhsautoimmunnojpatologiej AT gaevskaâûa vliâniekriokonservirovaniânafunkcionalʹnyjstatusstvolovyhkrovetvornyhimezenhimalʹnyhkletokkostnogomozgaživotnyhsautoimmunnojpatologiej AT dubravatg vliâniekriokonservirovaniânafunkcionalʹnyjstatusstvolovyhkrovetvornyhimezenhimalʹnyhkletokkostnogomozgaživotnyhsautoimmunnojpatologiej AT ostankovalv vliâniekriokonservirovaniânafunkcionalʹnyjstatusstvolovyhkrovetvornyhimezenhimalʹnyhkletokkostnogomozgaživotnyhsautoimmunnojpatologiej |
| first_indexed |
2025-07-10T02:33:38Z |
| last_indexed |
2025-07-10T02:33:38Z |
| _version_ |
1837225552292872192 |
| fulltext |
УДК 615.014.41:611-013.395:616-092
А.Н. Гольцев, Ю.А. Гаевская*, Т.Г. Дубрава, Л.В. Останкова
Влияние криоконсервирования на функциональный статус
стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток костного
мозга животных с аутоиммунной патологией
UDC 615.014.41:611-013.395:616-092
A.N. Goltsev, Yu.A. Gayevskaya*, T.G. Dubrava, L.V. Ostankova
Effect of Cryopreservation on Functional Status
of Bone Marrow Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells
in Animals with Autoimmune Pathology
Реферат: Компонентом реконструктивной терапии аутоиммунных заболеваний (АИЗ) является применение
криоконсервированного аутологичного костного мозга (КМ). Эффективность использования КМ определяется степенью
сохранности его стволовых кроветворных и мезенхимальных клеток (СКК и МСК). Данный факт определяет необходимость
разработки оптимальных режимов криоконсервирования КМ доноров с АИЗ. В работе был оценен функциональный статус
СКК и МСК костного мозга мышей с адъювантным артритом (АА), инициированным введением полного адъюванта Фрейнда.
Костный мозг мышей линии СВА/Н на 14-е сутки АА (хроническая стадия) и КМ здоровых животных криоконсервировали
под защитой диметилсульфоксида. Содержание СКК различной степени дифференцировки определяли методом
селезеночного колониеобразования in vivo на 8-е (КОЕс-8) и 14-е (КОЕс-14) сутки. Функциональную активность МСК в КМ
исследовали в условиях in vitro по содержанию колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕф). Установлен факт
изменения функционального потенциала кроветворных предшественников КМ разного уровня дифференцировки (КОЕс-8,
КОЕс-14) и их стромального микроокружения (КОЕф) в период клинической манифестации АА. Установлено, что после
криоконсервирования клеток КМ животных с АА с 7% ДМСО функциональный потенциал КОЕс и КОЕф был аналогичным
показателям КМ здоровых животных, криоконсервированного с 10% ДМСО.
Ключевые слова: костный мозг, стволовые кроветворные клетки, стволовые мезенхимальные клетки, криокон-
сервирование, аутоиммунная патология.
Реферат: Компонентом реконструктивної терапії аутоімунних захворювань (АІЗ) є застосування кріоконсервованого
аутологічного кісткового мозку (КМ). Ефективність використання КМ визначається ступенем збереженості його стовбурових
кровотвірних і мезенхімальних клітин (СКК і МСК). Даний факт визначає необхідність розробки оптимальних режимів
кріоконсервування КМ донорів із АІЗ. У роботі оцінено функціональний статус СКК і МСК кісткового мозку мишей із ад'ювантним
артритом (АА), ініційованим введенням повного ад'юванта Фрейнда. Кістковий мозок мишей лінії СВА/Н на 14-у добу АА
(хронічна стадія) і здорових тварин кріоконсервували під захистом диметилсульфоксиду. Вміст СКК різного ступеня
диференціювання визначали методом селезінкового колонієутворювання in vivo на 8-у (КУОс-8) і 14-у (КУОс-14) добу.
Функціональну активність МСК у КМ досліджували в умовах in vitro за вмістом колонієутворюючих одиниць фібробластів
(КУОф). Встановлено факт зміни функціонального потенціалу кровотвірних попередників КМ різного рівня диференціювання
(КУОс-8, КУОс-14) та їх стромального мікрооточення (КУОф) у період клінічної маніфестації АА. Встановлено, що після
кріоконсервування клітин КМ тварин з АА під захистом 7% ДМСО функціональний потенціал КУОс і КУОф був аналогічним
показникам КМ здорових тварин, кріоконсервованого з 10% ДМСО.
Ключові слова: кістковий мозок, стовбурові кровотвірні клітини, стовбурові мезенхімальні клітини, кріоконсервування,
аутоімунна патологія.
Abstract: The application of cryopreserved autologous bone marrow (BM) is the reconstructive therapy tool for autoimmune
diseases (AIDs). The BM use efficiency is determined by preservation rate of its hematopoietic and mesenchymal stem cells (HSCs
and MSCs, respectively). This fact determines the need to design the optimal cryopreservation regimens for the BM of AIDs donors.
Here we assessed a functional status of bone marrow HSCs and MSCs of mice with adjuvant arthritis (AA), initiated by Freund's
complete adjuvant administration. The bone marrow of CBA/H mice to day 14 of AA (chronic stage) and that of healthy animals were
cryopreserved under dimethyl sulfoxide protection. The content of HSCs of various differentiation extent was determined by spleen
colony formation in vivo to days 8 (CFU-S-8) and 14 (CFU-S-14). Functional activity of MSCs in BM was studied in vitro by the content
of fibroblast colony forming units (CFU-F). There was established the fact of altering the functional potential of hematopoietic
progenitor cells of BM of various differentiation levels (CFU-S-8, CFU-S-14) and their stromal microenvironment (CFU-F) during clinical
manifestation of AA. After cryopreservation of AA animals' BM cells with 7% DMSO a functional potential of CFU-S and CFU-F was
established to be similar to the healthy animals' BM, cryopreserved with 10% DMSO. The cryopreserved with the proposed regimen
autologous BM may be used for a targeted recovery of lymphohemopoietic system in AA animals.
Key words: bone marrow, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, cryopreservation, autoimmune pathology.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61016;
тел.: (+38 057) 373-57-89, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: cryopato@gmail.com
*To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61016;
tel.:+380 57 3735789, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: cryopato@gmail.com
Department of Cryopatophysiology and Immunology, Institute
for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National
Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Отдел криопатофизиологии и иммунологии, Институт проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Поступила 29.09.2015
Принята в печать 09.02.2016
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2016. – Т. 26, №1. – С. 63–72.
© 2016 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received September, 29, 2015
Accepted February, 09, 2016
Probl. Cryobiol. Cryomed. 2016. 26(1): 63–72.
© 2015 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
оригинальное исследование research article
64 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
Аутоиммунные заболевания (АИЗ) среди пато-
логических состояний организма человека зани-
мают лидирующее место и представляют собой
не только серьезную медицинскую, но и социаль-
ную проблему. До настоящего времени не отрабо-
таны существующие методические подходы лече-
ния АИЗ. В основном для лечения АИЗ применяют
препараты, способные подавлять иммуновоспали-
тельный процесс и активность аутореактивных
Т-клеток (глюкокортикоиды, цитостатические и им-
муномодулирующие препараты, моноклональные
антитела и др). Все используемые лекарственные
препараты устраняют следствие, а не одну из ос-
новных причин возникновения и прогрессирования
АИЗ – нарушение механизмов, контролирующих
толерантность Т- и В-лимфоцитов к аутоантигенам.
Возможным подходом «реставрации» иммунной
системы больных с АИЗ, в частности, ревматоид-
ным артритом (РА), является аутологичная транс-
плантация клеток костного мозга (КМ) на фоне
высокодозовой химиотерапии [7, 10]. Обоснова-
нием для разработки такого методического под-
хода в клинике стали результаты эксперимен-
тальных исследований на модели адъювантного
артрита (АА). Более 25 лет назад S. Knaan-Shanzer
и соавт. [13] показали, что трансплантация как
аутологичного КМ животных с АА, так и синген-
ного КМ здоровых животных имела позитивный
лечебный эффект. Более того, была продемонстри-
рована генетическая стабильность стволовой
полипотентной клетки при АИЗ с формированием
аутореактивного клона иммунокомпетентных
лимфоцитов на более низком уровне ее дифферен-
цировки [13]. Поэтому существует мнение, что при
использовании иммуноаблативной терапии с после-
дующей трансплантацией КМ можно «радикально»
очистить иммунную систему организма от ауто-
реактивного клона Т-лимфоцитов [7]. Важным
аспектом терапевтической состоятельности транс-
плантируемого КМ является строго сбалансиро-
ванное соотношение субпопуляций стволовых
кроветворных (СКК) и мезенхимальных стволовых
клеток (МСК) [8, 14, 16]. В работе H.A. Papadaki
и соавт. [17] был описан дефект клоногенного
потенциала CD34+-клеток КМ пациентов с РА.
Кроме того, авторы установили снижение содержа-
ния этих клеток в коротко и длительно репопули-
рующих культурах. Отмечено, что одной из причин
нарушения функции СКК больных РА является
избыточная продукция стромальными клетками
КМ цитокина ФНО-α, который через собственный
рецептор может ингибировать кроветворение
[12, 17]. Кроме того известно, что на разных этапах
развития РА значительно изменяется уровень и
Autoimmune diseases (AIDs) are leading human
pathologies, being a serious problem both medical and
social. To date there is no standard methodological
approaches in AIDs therapy so far. Usually the therapy
of AIDs involves the preparations, capable of suppres-
sing an immune inflammation and autoreactive T-cells
activity (glucocorticoids, cytotoxic and immunomodu-
latory drugs, monoclonal antibodies, etc.). All the used
drugs eliminate only the consequences, not the main
reasons of AID onset and progress, one of which is a
disorder of the mechanisms that trigger T and B cell
tolerance to autoantigens. A possible approach of AIDs
patient immune system “restoration”, in particular those
with rheumatoid arthritis (RA), is an autologous
transplantation of bone marrow (BM) cells together
with a high-dose chemotherapy [3, 16]. The outcomes
of experimental studies conducted in adjuvant arthritis
(AA) model allowed to transfer this methodical
approach in clinic. More than 25 years ago, S. Knaan-
Shanzer et al. [10] demonstrated that transplantation
of both autologous BM of AA animals and syngeneic
BM of healthy animals had a positive therapeutic
effect. Moreover, it was shown that stem polypotent
cell during AIDs were genetically stable and formed
autoreactive clone of immune competent lymphocytes
at lower level of its differentiation [10]. Therefore, one
believed that using immune ablative therapy followed
by BM transplantation could result in a ‘drastic’
clearance of the immune system out of autoreactive T
lymphocyte clone [16]. An important aspect of thera-
peutic consistency of transplanted BM is a strict ratio
of subpopulations of hematopoietic and mesenchymal
stem cells (HSCs and MSCs, respectively) [11, 14,
20]. Papadaki H.A. et al. [15] described the defect of
clonogenic potential of CD34+ cells of BM in RA
patients. In addition, the authors established the
reduction of these cells in short- and long-repopulating
cultures. It was noted that one of the causes of HSCs
dysfunction in RA patients was an excessive production
of cytokine TNF-α occuring in BM stromal cells,
which might inhibit hemopoiesis through its own
receptor [9, 15]. Moreover, it is known that at different
stages of RA development the level of other MSCs-
produced cytokines, supporting growth of hemato-
poietic progenitors, significantly changes [14, 17]. As
reported by Mohanty S.T. et al. [13] a number of
fibroblast colony-forming units (CFU-F), including
MSCs, in murine BM during AA increased while
functional potential was reduced. Our findings testify
to a disordered inter-regulatory activity of lymphohe-
mopoietic system substrates in AIDs development.
The BM demand in clinical practice necessitates
its cryopreservation for further storage. The efficiency
of cryopreservation is known to be determined not only
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
65
других, продуцируемых МСК, цитокинов, которые
поддерживают рост гемопоэтических предшест-
венников [16, 18]. По данным S.T. Mohanty и соавт.
[15] при АА в КМ мышей количество колониеобра-
зующих единиц фибробластов (КОЕф), в состав
которых входят МСК, увеличивалось на фоне сни-
женного функционального потенциала. Полученные
результаты свидетельствуют о нарушении взаимо-
регулирующей активности субстратов лимфогемо-
поэтической системы в условиях развития АИЗ.
Для применения КМ в клинической практике
необходимо его криоконсервирование и хранение.
Известно, что эффективность криоконсервирова-
ния определяется не только физико-химическими
факторами, действующими на клетки в процессе
замораживания-отогрева, но и их исходным струк-
турно-функциональным состоянием [16, 18]. Так,
криочувствительность клеток КМ может зависеть
от уровня дифференцировки, стадии клеточного
цикла, степени экспрессии мембранных маркеров,
вида предобработки до криоконсервирования (цито-
статики, γ-облучение, прекультивирование) и т. д.
[4, 11]. Различия структурно-функциональных
характеристик клеток КМ здорового организма и
с патологией предопределяют разную их криола-
бильность [8, 17].
Вместе с тем получены убедительные данные
о том, что криоконсервирование может быть не
только успешным методом для долгосрочного хра-
нения биоматериала, но и фактором управления
внутренним состоянием биообъекта [1–3]. Так,
имеются свидетельства транзиторного изменения
уровня экспрессии генов, связанных с гемопоэти-
ческой и иммуномодулирующей активностью,
после воздействия определенных режимов крио-
консервирования на СКК и МСК фетальной печени
поздних сроков гестации, что придало материалу
новые функциональные свойства [3]. Очевидна
необходимость подбора режима криоконсервиро-
вания, способного приблизить функциональный
потенциал клеток КМ, измененного патологией, к
показателям здоровых животных.
На основании вышесказанного целью работы
было экспериментально обосновать выбор режима
криоконсервирования КМ животных с АА, способ-
ного «реставрировать» функциональный потенциал
стволовых кроветворных и мезенхимальных
клеток.
Материалы и методы
Все манипуляции выполнены в соответствии с
«Общими принципами экспериментов на живот-
ных», одобренными V Национальным конгрессом
по биоэтике (Киев, 2013) и согласованными с
by physical and chemical factors, affecting the cells
during freeze-thawing, but also by their initial structural
and functional state [14, 17]. For example, a cryo-
sensitivity of BM cells may depend on their differen-
tiation level, stage of cell cycle, expression rate of
membrane markers, type of pretreatment before
cryopreservation (cytostatics, γ-irradiation, re-culture)
etc. [2, 5]. Differences in structural and functional
characteristics of BM cells of a healthy organism and
that with pathology predetermine their various cryo-
lability [15, 20].
Nevertheless, there are the convincing data that
the cryopreservation might be not only a successful
tool for long-term storage of biological material, but
also the factor of controlling an internal state of
biological object [6–8]. In particular, there is an evi-
dence of a transient change in the expression level of
genes, associated with hematopoietic and immune
modulatory activity after the effect of certain cryopre-
servation regimens on HSCs and MSCs of late gestation
fetal liver, providing the material with new functional
properties [8]. Thus there is an evident need of selec-
ting the cryopreservation regimen, which would be able
to approach the functional potential of pathologically
changed BM cells to the indices of healthy animals.
Due to the mentioned above, our research was
aimed to experimentally substantiate the selection of
cryopreservation regimen for AA animal BM, able to
“restore” a functional potential of hematopoietic and
mesenchymal stem cells.
Materials and methods
All the manipulations with animals were carried-
out in accordance with the General Principles of Expe-
riments in Animals, approved by the 5th National Cong-
ress in Bioethics (Kyiv, 2013) and consistent with the
statements of the European Convention for the Protec-
tion of Vertebrate Animals used for Experimental and
other Scientific Purposes (Strasbourg, 1986). The
experiments were performed in 4-month-old male
CBA/N mice weighing 20–22 g, kept under the standard
animal house conditions at the Institute for Problems
of Cryobiology and Cryomedicine of NAS of Ukraine
(Kharkiv). We divided the animals into following groups:
group 1 comprised healthy mice (n = 10), and group 2
had the animals with AA (n = 10). The adjuvant
arthritis was induced in mice by subplantar administra-
tion of 0.1 ml complete Freund’s adjuvant (Sigma-
Aldrich, USA) [12]. The inflammation intensity was
assessed to day 14 of AA development by the integral
index of clinical manifestation of pathology: arthritis
index, which represented a ratio of circumferences of
experimental and control ankle joints. In healthy
animals the arthritis index was assumed as 1.
66 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
Derivation of bone marrow suspension. To derive
BM suspension the animals were decapitated under
light ether anesthesia. The BM cells were washed out
with syringe from femurs using medium 199 (Institute
of Poliomyelitis and Viral Encephalitis, Russia) supple-
mented with 10% embryonic calf serum (BioloT,
Russia) and 2% sodium citrate (Weifang Ensign, China)
(hereinafter the handling medium). The cell suspension
was derived by repeated passage through the needles
of decreasing diameter (0.9–0.4 mm) with the following
passing through a nylon filter. The number of nucleated
cells in BM suspension were counted in Goryaev’s
chamber.
Cryopreservation of bone marrow cells. A solu-
tion for BM cryopreservation was prepared with the
handling medium supplemented with 14 or 20% dime-
thyl sulfoxide (DMSO) (Arterium, Ukraine). Solution
for cryopreservation was dropwise added in 1:1 ratio
at 4°C (final cryoprotectant concentration was 7 and
10%) to the obtained with handling medium BM cell
suspensions. The cells were exposed in cryopreserved
solution for 10 min at the same temperature.
BM cells of 6.0×106 cells/ml concentration were
cryopreserved using the programmed freezer (Cryoson,
Germany) in 1.8 ml plastic vials (Nunc, Germany):
cooled with the rate of 1 deg/min down to –40°C and
then immersed into liquid nitrogen [6]. The samples
were thawed in 38...40°C water bath for 40–50
seconds until disappearance of a solid phase. The cells
were washed of DMSO by slow addition of double
volume of handling medium with the following
centrifugation (200g, 10 min).
Assessment of the functional capacity of BM
hematopoietic stem cells in vivo. The BM content
of hematopoietic progenitor cells, producing colony-
forming units in the spleen of lethally irradiated mice
(CFU-S) was determined by the method of J.E. Till
and E.A. McCulloch [19]. Fresh or cryopreserved BM
cell suspensions in dose of 1×105 cells/mouse in 0.2 ml
handling medium were injected into the tail vein of mice
recipients irradiated using RUM-17 device (Mosrent-
gen, Russia) in 8 Gy dose. The irradiation conditions
were as follows: dose rate of 38.6 R/min, 220 kV tube
voltage; 10 mA current intensity, 1 mm Cu + 1 mm Al
filters; 50 cm focus-dorsal distance. The animals were
irradiated in a plexiglass box with individual cells. After
irradiation, the experimental animals were treated with
Enroksil antibiotic (KRKA, Slovenia) and had whey
as food additive for two weeks. The contents of
CFU-S was determined by the number of colonies for-
med in the spleen of lethally irradiated recipients to
the 8th (CFU-S-8) and 14th (CFU-S-14) days after
administration of BM suspensions. To assess the distri-
bution in BM of CFU-S of various differentiation level
положениями «Европейской конвенции о защите
позвоночных животных, используемых для
экспериментальных и других научных целей»
(Страсбург, 1986). Эксперименты были проведены
на 4-месячных мышах-самцах линии СВА/Н
массой 20–22 г, содержащихся в стандартных
условиях вивария Института проблем криобио-
логии и криомедицины НАН Украины (Харьков).
Животные были разделены на группы: 1 – здоровые
мыши (n = 10) и 2 – животные с АА (n = 10).
Адъювантный артрит индуцировали у мышей суб-
плантарным введением 0,1 мл полного адъюванта
Фрейнда («Sigma-Aldrich», США) [5]. Интенсив-
ность воспалительного процесса оценивали на 14-е
сутки развития АА по интегральному показателю
клинической манифестации патологии – индексу
артрита, который представляет собой отношение
окружности опытного голеностопного сустава к
контрольному. У здоровых животных индекс арт-
рита был принят за единицу.
Получение суспензии костного мозга. Для
получения суспензии КМ животных декапитиро-
вали под легким эфирным наркозом. Клетки КМ
вымывали шприцем из бедренных костей сре-
дой 199 (Институт полиомиелита и вирусных энце-
фалитов, Россия) с добавлением 10%-й эмбрио-
нальной телячьей сыворотки («БиолоТ», Россия)
и 2% цитрата натрия («Weifang Ensign», Китай)
(далее в тексте – рабочая среда). Суспензию
клеток получали путем многократного пропускания
через иглы уменьшающегося диаметра (0,9–0,4
мм) с дальнейшим очищением через капроновый
фильтр. Количество ядросодержащих клеток в
суспензии КМ подсчитывали в камере Горяева.
Криоконсервирование клеток костного мозга.
Раствор для криоконсервирования КМ готовили на
рабочей среде с добавлением 14 или 20% диметил-
сульфоксида (ДМСО) («Arterium», Украина). К по-
лученным на рабочей среде суспензиям клеток КМ
по каплям добавляли раствор для криоконсервиро-
вания в соотношении 1:1 при 4°С (конечная кон-
центрация криопротектора составляла 7 и 10%).
Экспозицию клеток в криоконсервирующем раст-
воре проводили в течение 10 мин при той же
температуре.
Клетки КМ с концентрацией 6,0×106 кл/мл
криоконсервировали на программном заморажи-
вателе («Cryoson», Германия) в полиэтиленовых
ампулах объемом 1,8 мл («Nunc», Германия):
охлаждали со скоростью 1 град/мин до –40°С с
последующим погружением ампул в жидкий азот
[1]. Образцы отогревали на водяной бане при тем-
пературе 38...40°С в течение 40–50 с до исчезнове-
ния твердой фазы. Клетки отмывали от ДМСО
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
67
медленным добавлением двукратного объема
рабочей среды с последующим центрифугиро-
ванием (200g, 10 мин).
Оценка функционального потенциала ство-
ловых кроветворных клеток КМ in vivo. Содер-
жание в КМ кроветворных предшественников,
формирующих колониеобразующие единицы в
селезенке летально облученных мышей (КОЕс),
определяли по методу J.E. Till и E.A. McCulloch
[20]. Нативные и криоконсервированные клеточ-
ные суспензии КМ в дозе 1×105 кл/мышь в 0,2 мл
рабочей среды вводили в хвостовую вену облучен-
ным на установке «РУМ-17» («Мосрентген», Рос-
сия) в дозе 8 Гр мышам-реципиентам. Условия
облучения: мощность дозы – 38,6 Р/мин, напряже-
ние на трубке – 220 кВ; сила тока – 10 мА, фильт-
ры – 1 мм Cu + 1мм Al; фокусно-дорзальное
расстояние – 50 см. Животных облучали в коробке
из оргстекла с индивидуальными ячейками. После
облучения экспериментальные животные в тече-
ние двух недель получали антибиотик «Энроксил»
(«КRКА», Словения) и молочную сыворотку. Со-
держание КОЕс определяли по количеству колоний,
образованных в селезенках летально облученных
реципиентов на 8-е (КОЕс-8) и 14-е (КОЕс-14)
сутки после введения суспензий КМ. Для оценки
распределения в КМ КОЕс разной степени диффе-
ренцировки (более дифференцированными являют-
ся КОЕс-8, менее – КОЕс-14 [14]) использовали
индекс дифференцировки (ИД), представляющий
собой отношение количества КОЕс-14 к КОЕс-8.
Оценка функционального потенциала мезен-
химальных стволовых клеток КМ. Содержание
в КМ колониеобразующих единиц фибробластов
(КОЕф), которое по данным S. Hirohata [12] корре-
лирует с содержанием МСК, определяли при
культивировании КМ in vitro с плотностью эксплан-
тации 1×104 кл/см2 в присутствии облученных
(5 Гр) фидерных клеток КМ (2×105 кл/см2) морской
свинки [6]. Культивирование проводили в СО2-
инкубаторе при 37°С в стеклянных чашках Петри
(d = 3 см, «Anumbra», Чехия) в течение 14 суток в
среде «Iscov’s» («Sigma», США) c добавлением
10%-й эмбриональной телячьей сыворотки. На
14-е сутки определяли количество колоний, содер-
жащих не менее 50 клеток, с помощью светового
микроскопа «МИКМЕД-2» («ЛОМО», Россия) и
инвертированного микроскопа «Axiovert 40С»
(«Zeiss», Германия).
Полученные данные статистически обраба-
тывали по методу Стьюдента с применением ком-
пьютерной программы «Exсel» («Microsoft»,
США). Данные приводили в виде среднего значе-
ния ± стандартное отклонение. Различия считали
статистически значимыми при p < 0,05.
(CFU-S-8 were more differentiated, and CFU-S-14
were less differentiated [11]) an index of differentiation
(ID) was used, which was the ratio of CFU-S-14 and
CFU-S-8 concentrations.
Assessment of the functional capacity of BM
mesenchymal stem cells. The BM content of colony
forming units of fibroblasts (CFU-F) which according
to S. Hirohata [9] correlated with the content of MSCs
was determined by BM culturing in vitro with
explantation density of 1×104 cells/cm2 with irradiated
(5 Gy) BM feeder cells (2×105 cells/cm2) of guinea
pig [4]. The culturing was performed in CO2 incubator
at 37°C on a glass Petri dish (d = 3 cm, Anumbra,
Czech Republic) for 14 days in Iscov’s medium (Sigma,
USA) supplemented with 10% embryonic calf serum.
To the 14th day, the number of colonies of at least 50
cells was determined with light microscope
MIKMED-2 (LOMO, Russia) and inverted micro-
scope Axiovert 40C (Carl Zeiss, Germany).
The obtained data were statistically processed with
Student’s method using Excel software (Microsoft,
USA). The data were presented as the mean ±
standard deviation. Differences were considered as
statistically significant at p <0.05.
Results and discussion
Swelling of joints is one of the clinical signs of AA
development, the severity of which was evaluated by
arthritis index [20]. To the 14th day after administration
of Freund’s adjuvant, this index was 1.6 times higher
than the control (1.0), that indicated development of
AA.
Assessment of the functional state of BM stem
cells in animals with AA showed the significant
differences in colony-forming activity of CFU-S-8 and
CFU-S-14 if compared with those in healthy animals
(Fig. 1A). A significant decrease (2.5 times, p < 0.05)
in the number of CFU-S-8 formed colonies was
accompanied by 1.3 times increase in the content of
CFU-S-14 formed colonies, which caused the rise of
ID if compared with the control ((3.65 ± 0.19) and
(1.0 ± 0.05), respectively, p<0.05). Established in our
research redistribution in subpopulations of CFU-S with
various differentiation level which accompanied AA
development could be the evidence of changes in
structural and functional characteristics. For example,
in our previous studies we have shown that AA
resulted in a lack of the most differentiated hemato-
poietic progenitor cells (colony-forming units of granulo-
monocytopoiesis in BM) that could be a possible reason
for increased content of more potent CFU-S-14 [6,
20]. Such redistribution of hematopoietic progenitor
cells in BM might arise from developing inflamma-
tion in an organism. Indeed, AA development is
accompanied with a significant change in cytokine
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
Здоровые животные
Healthy animals
АА
Ко
ли
че
ст
во
К
О
Еф
(к
ол
он
ий
),
аб
с.
е
д.
N
um
be
r o
f C
FU
-F
(c
ol
on
ie
s)
, a
bs
. u
ni
ts *
0
5
10
15
20
25
Здоровые животные
Healthy animals
АА
Ко
ли
че
ст
во
К
О
Ес
(к
ол
он
ий
),
аб
с.
е
д.
N
um
be
r o
f C
FU
-S
c
ol
on
ie
s,
a
bs
. u
ni
ts
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
И
Д,
у
сл
.е
д.
ID
, a
rb
. u
ni
ts
*
*
68 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
profile in an organism [15, 17, 18], and haematopoietic
system quickly responds to that. According to
S.P. Sivalingam et al. [17] the patients with AA have
increased levels of IL-6, IL-8 interleukins and granu-
locyte-macrophage colony stimulating factor. It is
known that IL-6 stimulates differentiation of pluripotent
HSCs, including high-proliferating CFU-S-14, and IL-8
controls the formation, chemotaxis and activation of
neutrophils, being the main cell substrate of leukocyto-
sis at AA. Moreover, HSCs interact closely with MSCs
[1, 14]. It is important that the increasing in content of
more potent CFU-S (CFU-S-14) in BM of mice with
AA correlated with the rise (in 1.4 times) of CFU-F
content in BM of healthy animals (1.56 ± 0.13 and
1.12 ± 0.10, respectively, p < 0.05) (Fig. 1, B). It is
possible that regulatory mediators produced by MSCs
are more capable of stimulating the growth of more
potent HSCs and/or inhibit the function of CFU-S-8.
It is known that a change in the structural and
functional characteristics of BM cells affects their
resistance to cryopreservation factors [2, 6, 8]. Our
assessment showed that cryoresistance of bone mar-
row HSCs and MSCs in healthy animals and animals
with AA was different.
As shown in Fig. 2, A, a freezing regimen with
10% DMSO provided the highest preservation of
functional potential of CFU-S-8 and CFU-S-14 of
healthy animals’ BM (67.50 ± 0.84 and 88.00 ± 6.16,
respectively) with some increase of ID (1.30 ± 0.08).
Response to cryopreservation of CFU-S from animals
Результаты и обсуждение
Одним из клинических признаков развития АА
является отек суставов, тяжесть которого оценива-
ли по индексу артрита [8]. На 14-е сутки после
введения адъюванта Фрейнда этот показатель в
1,6 раза превышал контрольный (1,0), что свиде-
тельствовало о развитии АА.
Результаты оценки функционального состояния
стволовых элементов КМ животных с АА показа-
ли существенные отличия колониеобразующей
активности КОЕс-8 и КОЕс-14 по сравнению с
таковыми у здоровых животных (рис.1, А).
Значительное уменьшение (в 2,5 раза, р < 0,05)
количества колоний, формируемых КОЕс-8,
сопровождалось увеличением в 1,3 раза содержа-
ния колоний, формируемых КОЕс-14, что вызывало
увеличение ИД по сравнению с контролем (3,65 ±
0,19 и 1,0 ± 0,05 соответственно, р < 0,05). Установ-
ленное в нашей работе перераспределение субпо-
пуляционного состава КОЕс разной степени
дифференцировки при развитии АА может быть
только свидетельством изменения структурно-
функциональных характеристик. Например, в на-
ших предыдущих исследованиях было показано,
что при АА недостаток наиболее дифференциро-
ванных кроветворных предшественников – коло-
ниеобразующих единиц грануломоноцитопоэза в
КМ является возможной причиной увеличения
содержания более потентных КОЕс-14 [1, 8]. Такое
перераспределение кроветворных предшествен-
A B
Рис. 1. Количество колоний, формируемых КОЕс (А) и КОЕф (B), КМ здоровых животных и с АА: – КОЕс-8; –
КОЕс-14, – индекс дифференцировки (ИД) КОЕс (КОЕс-14/КОЕс-8); * – различия статистически значимы по
сравнению с показателями здоровых животных (р < 0,05).
Fig. 1. The number of colonies formed by CFU-S (A) and CFU-F (B), BM of healthy animals and those with AA: –
CFU-S-8; –CFU-S-14; – index of differentiation (ID) of CFU-S (CFU-S-14/CFU-S-8); * – differences are statistically
significant if compared with indices of healthy animals (p < 0.05).
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
69
ников в КМ может быть следствием развивающе-
гося в организме воспалительного процесса.
Действительно, при развитии АА существенно
изменяется цитокиновый профиль организма [17–
19], на что быстро реагирует гемопоэтическая
система. Согласно данным S.P. Sivalingam и
соавт. [18] у пациентов с РА повышен уровень ин-
терлейкинов ИЛ-6, ИЛ-8 и гранулоцитарно-макро-
фагального колониестимулирующего фактора.
Известно, что ИЛ-6 является стимулятором диф-
ференцировки полипотентных СКК, к которым
можно отнести высокопролиферирующие КОЕс-14,
а ИЛ-8 контролирует формирование, хемотаксис
и активацию нейтрофилов основного клеточного
субстрата лейкоцитоза при АА. Кроме того, СКК
находятся в тесном взаимодействии с МСК [9, 16].
Важен тот факт, что повышение содержания более
потентных КОЕс (КОЕс-14) в КМ мышей с АА
коррелировало с увеличением (в 1,4 раза) содер-
жания КОЕф в КМ здоровых животных (1,56 ± 0,13
и 1,12 ± 0,10 соответственно, р < 0,05) (рис. 1, В).
Возможно, что продуцируемые МСК регуляторные
медиаторы в большей степени способны стимули-
ровать рост более потентных СКК и/или ингиби-
ровать функцию КОЕс-8.
Известно, что изменение структурных и функ-
циональных характеристик клеток КМ влияет на
их устойчивость к воздействию факторов криокон-
сервирования [1, 3, 4]. Результаты проведенной
нами оценки криоустойчивости СКК и МСК
костного мозга здоровых животных и животных с
АА различны.
Как видно из рис. 2, А, режим замораживания с
10% ДМСО обеспечивал наибольшую сохранность
функционального потенциала КОЕс-8 и КОЕс-14
КМ здоровых животных (67,50 ± 0,84 и 88,00 ± 6,16
соответственно) с некоторым повышением ИД
(1,30 ± 0,08). Ответ на криоконсервирование КОЕс
животных с АА зависел от используемой концент-
рации криопротектора. При замораживании с
10%-м раствором ДМСО показатели сохранности
обоих видов КОЕс и ИД были наиболее близки к
нативному КМ животных с АА, т. е. с существен-
ным повышением ИД. Уменьшение концентрации
ДМСО до 7% обеспечивало максимально сбалан-
сированное соотношение обеих субпопуляций
КОЕс костного мозга животных с АА и сохранение
высокой их колониеобразующей функции (около
60% КОЕс-8 и 70% КОЕс-14) по сравнению с
нативным КМ здоровых животных.
Очевидно, что после криоконсервирования даже
КМ здоровых животных показатели колониеобра-
зующей активности обоих типов КОЕс изменялись,
что соответствует полученным ранее результатам
[4, 11]. При этом минимальные отклонения иссле-
Концентрация ДМСО, %
DMSO concentration, %
Рис. 2. Количество колоний, формируемых КОЕс (А) и
КОЕф (В) криоконсервированного КМ здоровых живот-
ных и с АА: – КОЕс-8; – КОЕс-14, – ИД. За 100%
принято количество колоний, формируемых нативным
КМ здоровых животных; ИД нативного КМ здоровых
животных принят за единицу. Различия статистически
значимы (р < 0,05) по сравнению с: * – КОЕс-8 КМ
здоровых животных, криоконсервированного с 10%
ДМСО; # – КОЕс-14 КМ здоровых животных, криоконсер-
вированного с 10% ДМСО.
Fig. 2. The number of colonies formed by CFU-S (A) and
CFU-F (B) of cryopreserved BM of healthy animals and
those with AA: – CFU-S-8; –CFU-S-14; – ID. The
number of colonies formed by native BM of healthy animals
was assumed as 100%; ID of native BM of healthy animals
was assumed as 1. Differences are statistically significant
(p < 0.05) if compared with: * – BM CFU-S-8 of healthy
animals cryopreserved with 10% DMSO; # – BM CFU-S-14
of healthy animals cryopreserved with 10% DMSO.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
7 10 АА 7 10
Ко
ли
че
ст
во
К
О
Еф
, %
о
т
ко
нт
ро
ля
C
FU
-F
c
on
te
nt
, %
o
f c
on
tro
l
Здоровые
животные
Healthy animals
АА
*
0
20
40
60
80
100
120
140
160
7 10 АА 7 10
Ко
ли
че
ст
во
К
О
Ес
, %
о
т
ко
нт
ро
ля
C
FU
-S
c
on
te
nt
, %
o
f c
on
tro
l
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
И
Д,
у
сл
. е
д.
ID
, a
rb
. u
ni
ts
Здоровые
животные
Healthy animals
АА
* # *
Концентрация ДМСО, %
DMSO concentration, %
A
B
70 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
дуемых показателей от контроля были получены
при использовании 10%-го раствора ДМСО. Ре-
зультаты криоконсервирования для КОЕс КМ
животных с АА были неодинаковыми и зависели
от уровня их дифференцировки. Так, все применяе-
мые концентрации криопротектора в разной степени
ингибировали колониеобразующий потенциал
КОЕс-14 по сравнению с нативным КМ животных
с АА. В то же время активность КОЕс-8 при ис-
пользовании 7%-го раствора ДМСО даже повыша-
лась. Важно, что при использовании такой
концентрации криопротектора реализовывался
эффект «реставрации» колониеобразующего
потенциала КМ, модифицированного патологией,
т. е. «гармонизировались» показатели СКК.
Что касается пула МСК, а именно КОЕф
(рис. 2, B), то максимальная их сохранность в КМ
здоровых мышей была получена после использова-
ния 10%-го ДМСО. В КМ животных с АА криокон-
сервирование обеспечивало сохранность КОЕф от
30 до 40% независимо от концентрации криопро-
тектора.
Установлено, что «оптимальными» для сохра-
нения функционального потенциала КОЕс и КОЕф
КМ здоровых животных и с АА оказались различ-
ные условия криоконсервирования. Так, для
криоконсервирования КМ здоровых животных
использовали 10% ДМСО, а животных с АА – 7%
ДМСО. Для КМ животных с АА выбранный ре-
жим позволяет приблизить к физиологическому
соотношение клеток стволового компартмента раз-
ной степени дифференцировки. Во многом избира-
тельный эффект факторов криоконсервирования на
разные субпопуляции КОЕс костного мозга здоро-
вых доноров и с АА окончательно не изучен. За
последнее время накоплены экспериментальные
данные, свидетельствующие об изменении уровня
экспрессии некоторых генов в СКК и МСК после
криоконсервирования [2, 3], что может влиять на
восприятие регуляторных сигналов кроветворного
микроокружения рецепторным аппаратом СКК [11]
и искажать их колониеобразующего потенциала.
К тому же клетки самого микроокружения (как
показано на примере КОЕф) претерпевают не
менее выраженные изменения как при развитии
АА, так и после криоконсервирования.
Таким образом, полученные результаты под-
тверждают факт зависимости сохранности функ-
циональной активности СКК и МСК от их исход-
ного состояния и условий криоконсервирования.
Выводы
1. Установлен факт изменения функционального
потенциала кроветворных предшественников
with AA depended on the concentration of used
cryoprotectant. Following freeze-thawing with 10%
DMSO the integrity indices of both types of CFU-S
and ID were closest to the fresh BM of animals with
AA, i. e. with a significant increase of ID. Reduction
of DMSO concentration down to 7% provided the
maximum balanced ratio of both CFU-S subpopulations
of animal bone marrow with AA and preservation of
their high colony-forming function (about 60% of
CFU-S-8 and 70% of CFU-S-14) if compared with
native BM of healthy animals.
It was obvious that even after cryopreservation of
BM from healthy animals the indices of colony-forming
activity of both CFU-S types were changed, that
corresponded to the previous results [2, 5]. Herewith,
minimum deviations of the studied indices from the
control were obtained when using 10% DMSO. The
outcomes of cryopreservation for CFU-S of the animals
BM with AA were unequal and depended on their
differentiation level. In particular, all the used cryo-
protectant concentrations variously inhibited colony-
forming potential of CFU-S-14 if compared with non-
frozen-thawed BM of animals with AA. At the same
time, CFU-S-8 activity even increased in case of using
7% DMSO. It is important that using of 7% DMSO
caused the effect of “restoration” of colony-forming
potential of pathologically modified BM, i. e. HSCs
indices were “harmonized”.
In regard to MSCs pool, especially CFU-F (Fig. 2B),
their maximum preservation in BM of healthy mice
was obtained after using 10% DMSO. In BM of
animals with AA cryopreservation provided the
preservation of 30 to 40% CFU-F, irrespective of
cryoprotectant concentration.
It was found that preservation of the functional
capacity of CFU-S and CFU-F of healthy animal BM
and those with AA required different “optimal”
conditions of cryopreservation. For example, 10%
DMSO was the best for BM cryopreservation of
healthy animals, while 7% DMSO for animals with
AA. For BM of animals with AA a selected regimen
allowed the ratio of stem cells of various differentiation
level to approach the physiological value. Generally
speaking, selective effect of cryopreservation factors
on different subpopulations of CFU-S of healthy
donors’ bone marrow and those with AA is not
completely studied. There are recent experimental data
testifying to the change in expression level of some
genes in HSCs and MSCs after cryopreservation [7,
8], which can affect the perception of regulatory signals
of hematopoietic microenvironment with receptor
apparatus of HSCs [5] and result to a distortion of
their colony-forming potential. Moreover, microenvi-
ronment cells (as shown in CFU-F) undergo the
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
71
КМ разного уровня дифференцировки (КОЕс-8,
КОЕс-14) и их стромального микроокружения
(КОЕф) в период клинической манифестации АА.
2. Экспериментально обоснован выбор режима
криоконсервирования КМ животных с АА, способ-
ного «реставрировать» функциональный потенциал
клеток стволового компартмента. Установлено,
что после криоконсервирования клеток КМ живот-
ных с АА с 7% ДМСО функциональный потенциал
КОЕс и КОЕф был аналогичным показателям КМ
здоровых животных, криоконсервированного с 10%
ДМСО.
Коллектив авторов выражает благодарность за
выполнение работ по криоконсервированию клеток
костного мозга cт. н. с. отдела долгосрочного хранения
биологических объектов при низких температурах и
криомикробиологии д. б. н. Т. М. Гуриной.
changes of the same range both at AA development
and after cryopreservation.
Thus, the obtained results confirm the preservation
of functional activity of HSCs and MSCs to be
depending on their initial state and cryopreservation
conditions.
Conclusions
1. There was established the fact of changed
functional capacity in BM hematopoietic progenitor
cells of various differentiation level (CFU-S-8, CFU-
S-14) and their stromal microenvironment (CFU-F)
during the AA clinical manifestation.
2. There was experimentally proven the selection
of regimen for cryopreservation of BM from animals
with AA, which was capable to “restore” functional
potential of stem cells. It was found that cryopreser-
vation of BM cells from animals with AA using 7%
DMSO resulted in the approaching of functional
potential of CFU-S and CFU-F to the indices of healthy
animals’ BM cells, cryopreserved with 10% DMSO.
The authors aknowledge Dr. T.M. Gurina, Senior
Research Fellow of the Department of Long-Term Storage
of Biological Objects Under Low Temperatures and
Cryomicrobiology for the assistance in cryopreservation
of bone marrow cells.
Литература
1. Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Козлова Ю.А. и др. Влияние
различных режимов криоконсервирования на сохран-
ность стволовых кроветворных клеток костного мозга
животных с аутоиммунными заболеваниями. Ч. 1. Оценка
in vitro функционального статуса кроветворных пред-
шественников криоконсервированного костного мозга //
Проблемы криобиологии. – 2005. – Т. 15, №4. – С. 614–621.
2. Гольцев А.М., Луценко О.Д., Ямпольська Е.Е. та ін. Почат-
ковий стан – фактор, який визначає кріолабільність
стовбурових клітин: Зб. тез III з’їзду Укр. товариства
клітинної біології з міжнарод. участю. – Ялта, 2012. – С. 114.
3. Гольцев А.Н., Останкова Л.В., Дубрава Т.Г. и др. Крио-
консервирование как фактор модификации структурно-
функционального состояния и механизма реализации
лечебного эффекта клеток стволового компартмента в
условиях развития патологий аутоиммунного генеза //
Актуальные проблемы криобиологии и криомедицины /
Под. ред. А.Н. Гольцева. – Харьков, 2012. – 767 с.
4. Дубрава Т.Г. Эффективность криоконсервирования крове-
творных клеток в зависимости от их исходных свойств:
Автореф. дис. …канд. биол. наук. – Харьков, 1986. – 25 с.
5. Міщенко О.Я., Котвіцька А.А. Фармакологічна ефективність
емульсії анальбену на моделі ад'ювантного артриту у щу-
рів // Вісник фармації. – 2001. – №3. – С.124–125.
6. Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С. Индукция костной ткани
и остеогенные клетки-предшественники. – М.: Медицина,
1973. – 223 с.
7. Шевченко Ю.Л., Новик A.A., Кузнецов А.Н. и др. Высоко-
дозная иммуносупрессивная терапия с аутологичной
трансплантацией кроветворных стволовых клеток при
рассеянном склерозе: международный и отечественный
опыт // Международ. неврологический журнал. – 2012. –
Т. 47, №1. – С. 145–150.
8. Ямпольская Е.Е., Гаевская Ю.А., Дубрава Т.Г., Гольцев А.Н.
Оценка гемопоэтического статуса животных с адъювант-
ным артритом до и после введения криоконсервирован-
ных клеток фетальной печени // Криотерапия как
инновационный метод в клинической практике: Cб.
научных работ / Под ред. О.А. Панченко. – К.: Изд-во
КБИЦ, 2013. – С. 80–87.
References
1. Deans R.J., Moseley A.B. Mesenchymal stem cells: Biology
and potential clinical uses. Exp Hematol 2000; 28(8): 875–
884.
2. Dubrava T.G. Efficiency of hematopoietic cell cryopreservation
depending on their initial properties [Authors abstract of
doctoral thesis]. Kharkov; 1986.
3. Farge D., Labopin M., Tyndall A. et al. Autologous hematopoietic
stem cell transplantation for autoimmune diseases: an obser-
vational study on 12 years' experience from the European
group for blood and marrow transplantation working party on
autoimmune diseases. Haematologica 2010; 95(2): 284–292.
4. Friedenstein A.Y., Lalykina K.S. Induction of bone tissue and
osteogenic progenitors. Moscow: Meditsina; 1973: 223 p.
5. Goltsev A.N., Babenko N.N., Dubrava T.G. et al. Modification of
the state of bone marrow hematopoietic cells after cryopre-
servation. Int J Refrigeration 2006; 29(3): 358–367.
6. Goltsev A.N., Dubrava Т.G., Коzlоvа Yu.А. et al. Effect of dif-
ferent cryopreservation regimens on integrity of bone marrow
stem hemopoietic cells in animals with autoimmune diseases.
Part 1. Problems of Cryobiology 2005: 15(4): 614–621.
7. Goltsev A.N., Lutsenko E.D., Yampolska K.Ye. et al. Initial state –
factor determining cryolability of stem cells. Proceeding of the
3rd Meeting of Ukrainian Society for Cell Biology; Yalta, 2012:
p. 114.
8. Goltsev A.N., Ostankova L.V., Dubrava T.G. et al. Cryopre-
servation as a factor modifying the structural and functional
state and mechanism of implementation of the therapeutic
effect of stem cell compartment in conditions of development
of autoimmune pathologies genesis. In: Goltsev A.N., editor.
72 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
9. Deans R.J., Moseley A.B. Mesenchymal stem cells: biology
and potential clinical uses // Exp. Hematol. – 2000. – Vol. 28,
№8. – P. 875–884.
10.Farge D., Labopin M., Tyndall A. et al. Autologous hematopoietic
stem cell transplantation for autoimmune diseases: an obser-
vational study on 12 years’ experience from the European
group for blood and marrow transplantation working party on
autoimmune diseases // Haematologica. – 2010. – Vol. 95,
№2. – P. 284–292.
11.Goltsev A.N., Babenko N.N., Dubrava T.G. et al. Modification
of the state of bone marrow hemopoietic cells after cryopre-
servation // Int J Refreg. – 2006. – Vol. 29, №3. – P. 358–367.
12.Hirohata S. Role of bone marrow in the pathogenesis of rheu-
matoid arthritis // Challenges in Rheumatology / Ed. by
M. Harjacek. – Rijeka, Croatia, 2011. – P. 27–36.
13.Knaan-Shanzer S., Houben P., Kinwel-Bohre E.P. et al.
Remission induction of adjuvant arthritis in rats by total body
irradiation and autologous bone marrow transplantation // Bone
Marrow Transplant. – 1991. – Vol. 8, №5. – P. 333–338.
14.Lord B.I., Woolford L.B. Proliferation of spleen colony forming
units (CFU-S8, CFU-S13) and cells with marrow repopulating
ability // Stem Cells. – 1993. – Vol.11, №3. – P. 212–217.
15. Mohanty S.T., Kottam L., Gambardella A. et al. Alterations in
the self-renewal and differentiation ability of bone marrow
mesenchymal stem cells in a mouse model of rheumatoid
arthritis // Arthritis Res. Ther. – 2010. – Vol. 12, №4. – R149.
16.Morrison S.J., Scadden D.T. The bone marrow niche for haema-
topoietic stem cells // Nature. – 2014. – Vol. 505, №7483. –
P. 327–334.
17.Papadaki H.A., Kritikos H.D., Gemetzi C. et al. Bone marrow
progenitor cell reserve and function and stromal cell function
are defective in rheumatoid arthritis: evidence for a tumor
necrosis factor alpha-mediated effect // Blood. – 2002. –
Vol. 99, №5. – P. 1610–1619.
18.Sivalingam S.P., Thumboo J., Vasoo S. et al. In vivo pro– and
anti–inflammatory cytokines in normal and patients with
rheumatoid arthritis // Ann. Acad. Med. Singapore. – 2007. –
Vol. 36, №2. – P. 96–99.
19.Tanabe M., Ochi T., Tomita T. et al. Remarkable elevation of
interleukin 6 and interleukin 8 levels in the bone marrow serum
of patients with rheumatoid arthritis // J. Rheumatol. – 1994. –
Vol. 21, №5. – P. 830–835.
20.Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation
sensitivity of normal mouse bone marrow cells // Rad. Res. –
1961. – Vol.14, №12. – P. 213–222.
Current problems of cryobiology and cryomedicine; Kharkov,
2012: 551–563.
9. Hirohata S. Role of bone marrow in the pathogenesis of
rheumatoid arthritis. In: Harjacek M., editor. Challenges in
Rheumatology. Rijeka, Croatia, 2011: p. 27–36.
10.Knaan-Shanzer S., Houben P., Kinwel-Bohre EP. et al.
Remission induction of adjuvant arthritis in rats by total body
irradiation and autologous bone marrow transplantation. Bone
Marrow Transplant 1991; 8(5): 333–338.
11.Lord B.I., Woolford L.B. Proliferation of spleen colony forming
units (CFU-S8, CFU-S13) and cells with marrow repopulating
ability. Stem cells 1993; 11(3): 212–217.
12.Mishchenko O.Ya., Kotvits'ka A.A. Farmokolohichna effective-
ness emulsion analbenu adyuvantnoho on the model of arthritis
in rats. Visnyk Farmatsii 2001; (3): 124–125.
13.Mohanty S.T., Kottam L., Gambardella A. et al. Alterations in
the self–renewal and differentiation ability of bone marrow
mesenchymal stem cells in a mouse model of rheumatoid
arthritis. Arthritis Res Ther 2010; 12(4): R149.
14.Morrison S.J., Scadden D.T. The bone marrow niche for haema-
topoietic stem cells. Nature 2014; 505(7483): 327–334.
15.Papadaki H.A., Kritikos H.D., Gemetzi C. et al. Bone marrow
progenitor cell reserve and function and stromal cell function
are defective in rheumatoid arthritis: evidence for a tumor
necrosis factor alpha-mediated effect. Blood 2002; 99(5):
1610–1619.
16.Shevchenko Y.L., Novik A.A., Kuznetsov A.N. et al. High-
dose immunosuppressive therapy with autologous hemato-
poietic stem cell transplantation in multiple sclerosis: inter-
national and domestic experience. International Neurological
Journal 2012; 47(1): 145–150.
17.Sivalingam S.P., Thumboo J., Vasoo S. et al. In vivo pro- and
anti-inflammatory cytokines in normal and patients with rheuma-
toid arthritis. Ann Acad Med Singapore 2007; 36(2): 96–99.
18.Tanabe M., Ochi T., Tomita T. et al. Remarkable elevation of
interleukin 6 and interleukin 8 levels in the bone marrow serum
of patients with rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1994; 21(5):
830–835.
19.Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation
sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res
1961; 14: 213–222.
20.Yampolskaya K.Ye., Gayevskaya Yu.A., Dubrava T.G., Golt-
sev A.N. Assessment of hematopoietic status of animals with
adjuvant arthritis before and after the introduction of cryopre-
served fetal liver cells.In: Panchenko O.A., editor. Cryotherapy
as an innovative method in clinical. Kiev: KBITS, 2013: 80–87.
|