Експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу

Розробка нових методологічних підходів, спрямованих на збереження потенційної фертильності під час планування цитотоксичної терапії у осіб допубертатного віку, є актуальним напрямком медико-біологічних досліджень. У роботі проведено порівняльну оцінку впливу експозиції у середовищах різного композ...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2017
Автори:	Волкова, Н.О., Юхта, М.С., Чернишенко, Л.Г., Степанюк, Л.В., Сокол, Л.В., Гольцев, А.М.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2017
Назва видання:	Проблемы криобиологии и криомедицины
Теми:	Теоретическая и экспериментальная криобиология
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138285
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу / Н.О. Волкова, М.С. Юхта, Л.Г. Чернишенко, Л.В. Степанюк, Л.В. Сокол, А.М. Гольцев // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2017. — Т. 27, № 3. — С. 203-218. — Бібліогр.: 30 назв. — укр., англ.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-138285
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1382852018-06-19T03:03:19Z Експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу Волкова, Н.О. Юхта, М.С. Чернишенко, Л.Г. Степанюк, Л.В. Сокол, Л.В. Гольцев, А.М. Теоретическая и экспериментальная криобиология Розробка нових методологічних підходів, спрямованих на збереження потенційної фертильності під час планування цитотоксичної терапії у осіб допубертатного віку, є актуальним напрямком медико-біологічних досліджень. У роботі проведено порівняльну оцінку впливу експозиції у середовищах різного композиційного складу на морфологічні па- раметри та метаболічну активність клітин звитих канальців сім’яників статевонезрілих щурів. Кріоконсервування тканин яєчка вимагає застосування відповідних протоколів, які забезпечують високі показники життєздатності та функціональної активності на тлі мінімізації пошкоджень трансплантаційного матеріалу. Встановлено, що 30-хвилинна експозиція зразків тканин у середовищах на основі розчину Хенкса та 50 г/л бичачого сироваткового альбуміну з додаванням 0,6 M диметил- сульфоксиду (ДМСО) або 0,7 M гліцерину не викликала ушкоджень сперматогенного епітелію та зниження метаболічної активності клітин (МТТ-тест та активність лактатдегідрогенази). Експозиція впродовж 45 та 60 хв у середовищах із додаванням 0,6 М ДМСО, 0,7 М гліцерину, 50 г/л поліетиленоксиду-400 та 0,1 М сахарози призводила до десквамації, появи безклітинних ділянок, зниження щільності клітин сперматогенного епітелію та їх метаболічної активності. Отримані дані можуть бути використані для обґрунтування та розробки ефективних методик кріоконсервування звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів. Разработка новых методологических подходов, направленных на сохранение потенциальной фертильности при планировании цитотоксической терапии у лиц допубертатного возраста, является актуальным направлением медико- биологических исследований. В работе проведена сравнительная оценка влияния экспозиции в средах различного ком- позиционного состава на морфологические параметры и метаболическую активность клеток извитых канальцев семенников неполовозрелых крыс. Криоконсервирование тканей яичка требует применения соответствующих протоколов, которые обеспечивают высокие показатели жизнеспособности и функциональной активности на фоне минимизации повреждений трансплантационного материала. Установлено, что 30-минутная экспозиция образцов ткани в криозащитных средах на основе раствора Хенкса и 50 г/л бычьего сывороточного альбумина с добавлением 0,6 M ДМСО или 0,7 M глицерина не приводила к повреждениям сперматогенного эпителия и снижению метаболической активности клеток (МТТ-тест и актив- ность лактатдегидрогеназы). Экспозиция в течение 45 и 60 мин в средах с добавлением 0,6 М ДМСО, 0,7 М глицерина, 50 г/л полиэтиленоксида-400 и 0,1 М сахарозы приводила к десквамации, появлению безклеточных участков, снижению плотности клеток сперматогенного эпителия и их метаболической активности. Полученные данные могут быть использованы для обос- нования и разработки эффективных методик криоконсервирования извитых канальцев семенников неполовозрелых крыс. The development of new methods aimed at preserving potential fertility before the cytotoxic therapy for individuals of pre-adulthood is an actual area of medical and biological research. The research compares the effect of exposure to media of different composition on morphological parameters and metabolic activity of cells of testicular convoluted tubules of sexually immature rats. Cryopreservation of testicular tissues requires the use of appropriate protocols, ensuring the high viability and functional activity at the background of minimization of damages in transplant material. It has been established that a 30-minute exposure of the tissue samples in media based on Hanks solution and 50 g/L bovine serum albumin supplemented with either 0.6 M DMSO or 0.7 M glycerol did not result in the damage of spermatogenic epithelium and to the decrease in metabolic activity of the cells (MTT test and lactate dehydrogenase activity). Exposure of the testicular convoluted tubules of immature rats during 45 and 60 min in cryoprotective media supplemented with 0.6 M DMSO, 0.7 M glycerol, 50 g/L polyethylene oxide with molecular weight 400 and 0.1 M sucrose led to the manifested desquamation, appearance of acellular areas, reduced density of spermatogenic epithelium cells and their metabolic activity. The findings could be used to substantiate and develop the effective techniques for cryopreservation of seminiferous tubules of immature rats. 2017 Article Експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу / Н.О. Волкова, М.С. Юхта, Л.Г. Чернишенко, Л.В. Степанюк, Л.В. Сокол, А.М. Гольцев // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2017. — Т. 27, № 3. — С. 203-218. — Бібліогр.: 30 назв. — укр., англ. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138285 612.617-084:615.014.41:539.21-022.532:546.59 uk Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология
spellingShingle	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Волкова, Н.О. Юхта, М.С. Чернишенко, Л.Г. Степанюк, Л.В. Сокол, Л.В. Гольцев, А.М. Експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу Проблемы криобиологии и криомедицины
description	Розробка нових методологічних підходів, спрямованих на збереження потенційної фертильності під час планування цитотоксичної терапії у осіб допубертатного віку, є актуальним напрямком медико-біологічних досліджень. У роботі проведено порівняльну оцінку впливу експозиції у середовищах різного композиційного складу на морфологічні па- раметри та метаболічну активність клітин звитих канальців сім’яників статевонезрілих щурів. Кріоконсервування тканин яєчка вимагає застосування відповідних протоколів, які забезпечують високі показники життєздатності та функціональної активності на тлі мінімізації пошкоджень трансплантаційного матеріалу. Встановлено, що 30-хвилинна експозиція зразків тканин у середовищах на основі розчину Хенкса та 50 г/л бичачого сироваткового альбуміну з додаванням 0,6 M диметил- сульфоксиду (ДМСО) або 0,7 M гліцерину не викликала ушкоджень сперматогенного епітелію та зниження метаболічної активності клітин (МТТ-тест та активність лактатдегідрогенази). Експозиція впродовж 45 та 60 хв у середовищах із додаванням 0,6 М ДМСО, 0,7 М гліцерину, 50 г/л поліетиленоксиду-400 та 0,1 М сахарози призводила до десквамації, появи безклітинних ділянок, зниження щільності клітин сперматогенного епітелію та їх метаболічної активності. Отримані дані можуть бути використані для обґрунтування та розробки ефективних методик кріоконсервування звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів.
format	Article
author	Волкова, Н.О. Юхта, М.С. Чернишенко, Л.Г. Степанюк, Л.В. Сокол, Л.В. Гольцев, А.М.
author_facet	Волкова, Н.О. Юхта, М.С. Чернишенко, Л.Г. Степанюк, Л.В. Сокол, Л.В. Гольцев, А.М.
author_sort	Волкова, Н.О.
title	Експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу
title_short	Експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу
title_full	Експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу
title_fullStr	Експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу
title_full_unstemmed	Експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу
title_sort	експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2017
topic_facet	Теоретическая и экспериментальная криобиология
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138285
citation_txt	Експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу / Н.О. Волкова, М.С. Юхта, Л.Г. Чернишенко, Л.В. Степанюк, Л.В. Сокол, А.М. Гольцев // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2017. — Т. 27, № 3. — С. 203-218. — Бібліогр.: 30 назв. — укр., англ.
series	Проблемы криобиологии и криомедицины
work_keys_str_mv	AT volkovano ekspozicíâzvitihkanalʹcívsímânikívstatevonezrílihŝurívukríozahisnihseredoviŝahríznogokompozicíjnogoskladu AT ûhtams ekspozicíâzvitihkanalʹcívsímânikívstatevonezrílihŝurívukríozahisnihseredoviŝahríznogokompozicíjnogoskladu AT černišenkolg ekspozicíâzvitihkanalʹcívsímânikívstatevonezrílihŝurívukríozahisnihseredoviŝahríznogokompozicíjnogoskladu AT stepanûklv ekspozicíâzvitihkanalʹcívsímânikívstatevonezrílihŝurívukríozahisnihseredoviŝahríznogokompozicíjnogoskladu AT sokollv ekspozicíâzvitihkanalʹcívsímânikívstatevonezrílihŝurívukríozahisnihseredoviŝahríznogokompozicíjnogoskladu AT golʹcevam ekspozicíâzvitihkanalʹcívsímânikívstatevonezrílihŝurívukríozahisnihseredoviŝahríznogokompozicíjnogoskladu
first_indexed	2025-07-10T02:49:06Z
last_indexed	2025-07-10T02:49:06Z
_version_	1837226522733182976
fulltext	УДК 612.617-084:615.014.41:539.21-022.532:546.59 Н.О. Волкова, М.С. Юхта, Л.Г. Чернишенко, Л.В. Степанюк, Л.В. Сокол, А.М. Гольцев Експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу UDC 612.617-084:615.014.41:539.21-022.532:546.59 N.O. Volkova, M.S. Yukhta, L.G. Chernyshenko, L.V. Stepanyuk, L.V. Sokol, A.M. Goltsev Exposure of Seminiferous Tubules of Immature Rats to Cryoprotective Media of Various Compositions Реферат: Розробка нових методологічних підходів, спрямованих на збереження потенційної фертильності під час планування цитотоксичної терапії у осіб допубертатного віку, є актуальним напрямком медико-біологічних досліджень. У роботі проведено порівняльну оцінку впливу експозиції у середовищах різного композиційного складу на морфологічні па- раметри та метаболічну активність клітин звитих канальців сім’яників статевонезрілих щурів. Кріоконсервування тканин яєчка вимагає застосування відповідних протоколів, які забезпечують високі показники життєздатності та функціональної активності на тлі мінімізації пошкоджень трансплантаційного матеріалу. Встановлено, що 30-хвилинна експозиція зразків тканин у середовищах на основі розчину Хенкса та 50 г/л бичачого сироваткового альбуміну з додаванням 0,6 M диметил- сульфоксиду (ДМСО) або 0,7 M гліцерину не викликала ушкоджень сперматогенного епітелію та зниження метаболічної активності клітин (МТТ-тест та активність лактатдегідрогенази). Експозиція впродовж 45 та 60 хв у середовищах із додаванням 0,6 М ДМСО, 0,7 М гліцерину, 50 г/л поліетиленоксиду-400 та 0,1 М сахарози призводила до десквамації, появи безклітинних ділянок, зниження щільності клітин сперматогенного епітелію та їх метаболічної активності. Отримані дані можуть бути використані для обґрунтування та розробки ефективних методик кріоконсервування звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів. Ключові слова: звиті канальця сім'яників, статевонезрілі щури, диметилсульфоксид, гліцерин, поліетиленоксид, сахароза, бичачий сироватковий альбумін. Реферат: Разработка новых методологических подходов, направленных на сохранение потенциальной фертильности при планировании цитотоксической терапии у лиц допубертатного возраста, является актуальным направлением медико- биологических исследований. В работе проведена сравнительная оценка влияния экспозиции в средах различного ком- позиционного состава на морфологические параметры и метаболическую активность клеток извитых канальцев семенников неполовозрелых крыс. Криоконсервирование тканей яичка требует применения соответствующих протоколов, которые обеспечивают высокие показатели жизнеспособности и функциональной активности на фоне минимизации повреждений трансплантационного материала. Установлено, что 30-минутная экспозиция образцов ткани в криозащитных средах на основе раствора Хенкса и 50 г/л бычьего сывороточного альбумина с добавлением 0,6 M ДМСО или 0,7 M глицерина не приводила к повреждениям сперматогенного эпителия и снижению метаболической активности клеток (МТТ-тест и актив- ность лактатдегидрогеназы). Экспозиция в течение 45 и 60 мин в средах с добавлением 0,6 М ДМСО, 0,7 М глицерина, 50 г/л полиэтиленоксида-400 и 0,1 М сахарозы приводила к десквамации, появлению безклеточных участков, снижению плотности клеток сперматогенного эпителия и их метаболической активности. Полученные данные могут быть использованы для обос- нования и разработки эффективных методик криоконсервирования извитых канальцев семенников неполовозрелых крыс. Ключевые слова: извитые канальца семенников, неполовозрелые крысы, диметилсульфоксид, глицерин, полиэти- леноксид, сахароза, бычий сывороточный альбумин. Abstract: The development of new methods aimed at preserving potential fertility before the cytotoxic therapy for individuals of pre-adulthood is an actual area of medical and biological research. The research compares the effect of exposure to media of different composition on morphological parameters and metabolic activity of cells of testicular convoluted tubules of sexually immature rats. Cryopreservation of testicular tissues requires the use of appropriate protocols, ensuring the high viability and functional activity at the background of minimization of damages in transplant material. It has been established that a 30-minute exposure of the tissue samples in media based on Hanks solution and 50 g/L bovine serum albumin supplemented with either 0.6 M DMSO or 0.7 M glycerol did not result in the damage of spermatogenic epithelium and to the decrease in metabolic activity of the cells (MTT test and lactate dehydrogenase activity). Exposure of the testicular convoluted tubules of immature rats during 45 and 60 min in cryoprotective media supplemented with 0.6 M DMSO, 0.7 M glycerol, 50 g/L polyethylene oxide with molecular weight 400 and 0.1 M sucrose led to the manifested desquamation, appearance of acellular areas, reduced density of spermatogenic epithelium cells and their metabolic activity. The findings could be used to substantiate and develop the effective techniques for cryopreservation of seminiferous tubu- les of immature rats. Key words: seminiferous tubules, immature rats, dimethyl sulfoxide, glycerol, polyethylene oxide, bovine serum albumin. Автор, якому необхідно надсилати кореспонденцію: вул. Переяславська, 23, м. Харків, Україна 61016; тел.: (+38 057) 373-74-35, факс: (+38 057) 373-59-52, електронна пошта: volkovana781@gmail.com To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavska str., Kharkiv, Ukraine 61016; tel.:+380 57 373 7435, fax: +380 57 373 5952, e-mail: volkovana781@gmail.com Department of Cryopathophysiology and Immunology, Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Aca- demy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, Ukraine Відділ кріопатофізіології та імунології, Інститут проблем кріобіо- логії і кріомедицини НАН України, м. Харків Надійшла 15.05.2017 Прийнята до друку 30.05.2017 Received May, 15, 2017 Accepted May, 30, 2017 оригінальне дослідження research article Probl Cryobiol Cryomed 2017; 27(3): 203–218 https://doi.org/10.15407/cryo27.03.203 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0), which permits unrestricted reuse, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. © 2017 N.O. Volkova et al., Published by the Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine 204 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 Із розвитком біотехнологій та більш глибоким розумінням механізмів регенерації біологічних тканин в останні роки вченими всього світу розроб- ляються підходи до застосування клітинних та тка- нинних технологій у репродуктивній медицині, андрології та гінекології. Зусилля медиків у цій галузі спрямовані, перш за все, на подолання без- пліддя, лікування онкологічних захворювань стате- вих залоз у чоловіків і жінок, пренатальну корекцію аномалій розвитку плода за допомогою тканинних, клітинних і генних технологій [12, 25, 29]. Безсумнівним підтвердженням прогресу клініч- ної онкології є збільшення показника виживання хворих на злоякісні новоутворення всіх типів і нозологій. Значна кількість онкологічних пацієнтів, які пройшли протипухлинне лікування, – це особи допубертатного віку, які розраховують на високу тривалість і якість життя [2]. Наразі кріоконсер- вування сперми та окремих сперматозоїдів досить успішно проводиться з метою збереження фер- тильності у чоловіків [28]. Однак даний підхід не може бути застосований для пацієнтів допубер- татного віку, у яких сперматогенез ще не розви- нений, а в еякуляті відсутні сперматозоїди. У зв’язку з цим перед клініцистами постає непросте завдання, яке полягає у розробці нових методологічних під- ходів, спрямованих на збереження потенційної фер- тильності під час планування цитотоксичної терапії у осіб даної вікової групи. Вирішенням цієї проблеми може стати кріоконсервування тканин яєчка [8], тому актуальною є розробка протоколів, які здатні забезпечити високі показники функціональної ак- тивності та життєздатності на тлі мінімізації пош- коджень трансплантаційного матеріалу. Існують два варіанти кріоконсервування тести- кулярної тканини: у вигляді суспензії герміногенних клітин або фрагментів звитих сім’яних канальців. Після розморожування суспензії герміногенних клітин можлива її аутотрансплантація шляхом ін’єкції у тканину сім’яників для заселення звитих канальців здоровою популяцією сперматогенних клітин [2, 19]. У разі кріоконсервування цілих звитих канальців можливе проведення трансплантації біоптату для ініціації сперматогенезу. Отримані таким чином сперматозоїди можуть бути викорис- тані для запліднення за допомогою інтрацито- плазмічної ін’єкції сперми [14]. Крім того, дослід- никами активно розглядається можливість індукції сперматогенезу in vitro, у тому числі з викорис- танням деконсервованого матеріалу, але ця техно- логія знаходиться поки на стадії розробки. Слід зазначити, що під час кріоконсервування тканин яєчка, отриманих від пацієнтів допубертат- ного віку, коли повноцінний сперматогенез ще не сформувався, основним завданням є не тільки фі- зичне збереження сперматогоній і клітин Сертолі, The development of biotechnology and a better understanding of the mechanisms of regeneration of biological tissues allowed the scholars all over the world to develop the approaches to apply the cell and tissue based therapies in reproductive medicine, andrology and gynecology. The efforts of physicians in this field are aimed, above all, at overcoming infertility, trea- ting cancer diseases of the sexual glands in men and women, as well as prenatal correction of fetal abnor- malities by means of tissue, cell and gene based techno- logies [8, 23, 29]. Definite evidence of the progress of clinical onco- logy is an increased survival of patients with malignant neoplasms of all types and nosologies. A significant number of oncology patients undergoing antitumor treatment are those of a pre-adulthood, hoping for a long active life [5]. Currently cryopreservation of sperm and individual spermatozoa is very successful to maintain fertility in men [28]. However, this approach can not be used for patients of prepubertal age, because their spermatogenesis is not yet developed, and there are no spermatozoa in ejaculate. In this regard, the clinicians face a difficult task, which is to develop new methodological approaches aimed at preserving the potential fertility during planning of cytotoxic therapy in individuals of this age group. Cryopreservation of testicular tissues could solve this problem [3], there- fore the development of appropriate protocols is needed, which will provide high levels of functional activity and viability together with minimal transplan- tation impairments. There are two options to cryopreserve a testicular tissue: either as a suspension of germinal cells or as the fragments of convoluted spermatic tubules. After thawing the suspension of germinal cells, it can be autotransplanted by injection into testicular tissue to populate the convoluted tubules with a healthy popula- tion of spermatogenous cells [5, 15]. If whole convo- luted tubules are cryopreserved, the biopsy material may be transplanted to initiate spermatogenesis. The- reby obtained spermatozoa can be used for fertilization by means of intracytoplasmic sperm injection [10]. In addition, researchers are actively considering the possi- bility of in vitro induction of spermatogenesis, including the application of frozen-thawed material, but this technology is still under development. It should be noted that during cryopreservation of testicular tissue obtained from the pre-pubertal patients with non-active spermatogenesis, the main task is not only physical preservation of spermatogonia and Ser- toli cells, but also keeping a proper contact in between, as it plays an important role in further maturation of the spermatogenic epithelium cells. Therefore cryopre- servation of testicular tissue as convoluted tubules is considered as a promising method to preserve testicular tissue for its further autotransplantation and restoration проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 205 а й повноцінних контактів між ними, оскільки вони відіграють важливу роль у наступному дозріванні клітин сперматогенного епітелію. Тому кріоконсер- вування тканин яєчка у вигляді звитих канальців вважається перспективним методом збереження тестикулярної тканини з метою подальшої її ауто- трансплантації та відновлення репродуктивної функ- ції [2]. У роботі V. Keros і співавт. [18] показано, що в зразках тестикулярної тканини, кріоконсервованих під захистом 0,6 М диметилсульфоксиду (ДМСО), відсутні порушення зв’язку сперматогоній із базаль- ною мембраною та сусідніми клітинами у порів- нянні зі свіжо ізольованою тканиною. F. Izadyar і співавт. [15] у якості кріозахисного середовища та- кож використовували ДМСО, але у концентрації 10%. Це забезпечувало збереження морфологіч- них показників і функціональної активності спер- матогоній при низькотемпературному зберіганні. Однак, незважаючи на те, що ДМСО властива більш виражена цитотоксична дія, деякі автори [18] відмі- чають, що його застосування у якості кріопротек- тора (у концентрації 0,7 моль/л) дозволяє зберегти структуру тканини яєчка (особливо сперматогоніїв) краще, ніж використання 1,2-пропандіолу або глі- церину. Не зважаючи на оптимістичні результати кріо- консервування тестикулярної тканини, розробка та вдосконалення протоколів низькотемпературного консервування залишаються актуальними напрям- ками. Слід враховувати, що при виготовленні кріоза- хисних середовищ на основі ДМСО необхідно знижу- вати його концентрацію та скорочувати загальний час експозиції. Одним із перших етапів розробки протоколів кріоконсервування тканин є визначення впливу експозиції у кріозахисних середовищах на їх морфологічні та функціональні параметри. На сьогодні гліцерин і ДМСО вважаються класичними кріопротекторами, які використовуються ще з сере- дини минулого століття [10]. З того часу до практики кріоконсервування було введено багато інших ендо- та екзоцелюлярних кріопротекторів (метанол, про- пандіол, етиленгліколь, диметиловий ацетальдегід, сахароза, декстран, полівінілпіролідон, гідрокси- етилкрохмаль, ПЕО-400 тощо). Незважаючи на кріозахисний потенціал цих речовин, вони мають ряд побічних ефектів, основним із яких є цитоток- сичність. Толерантність тканин до несприятливих умов кріоконсервування обмежена і залежить від типу тканини та її початкового стану. При цьому додавання кріопротекторів до середовищ у різних концентраціях, а також оптимізація часу експозиції можуть знизити їх токсичний вплив на тканину. Мета роботи – визначення морфологічних змін та метаболічної активності звитих канальців сім’я- ників статевонезрілих щурів залежно від концент- рації кріопротекторів (ДМСО, гліцерину, ПЕО-400 of reproductive function [5]. V. Keros et al. [14] repor- ted about the absence of the disorders in binding the spermatogonia with basal membrane and adjacent cells compared to freshly isolated tissue in the samples of testicular tissue cryopreserved under protection of 0.6 M dimethylsulfoxide (DMSO). F. Izadyar et al. [11] also used DMSO as a cryoprotective medium, but at 10% concentration, which ensured the preservation of morphological parameters and functional activity of the spermatogonia during their low-temperature storage. However, despite the fact that DMSO has a more pronounced cytotoxic effect, some authors [14] noted that its use as a cryoprotective agent (at a con- centration of 0.7 mol/L) allows the tissue structure of the testis (especially spermatogonia) to be preserved better than using 1,2-propane diol or glycerol. Despite the optimistic results of cryopreservation of testicular tissue the development and improvement of low-temperature preservation protocols is still rele- vant trend. It is believed that when preparing the cryo- protective media based on DMSO its concentration should be reduced as well as its overall exposure time has to be decreased. One of the first stages of deve- loping the cryopreservation protocols for tissues is to determine the effect of exposure to cryoprotective media on their morphological and functional parameters. Today DMSO and glycerol are considered to be classic cryoprotective agents used since the last midcentury [6]. Since that time numerous endo- and exocellular cryoprotectants (methanol, propane diol, ethylene glycol, dimethyl acetaldehyde, sucrose, dextran, polyvinyl- pyrrolidone, hydroxyethyl, PEO-400, etc.) were also introduced into the practice of cryopreservation. In spite a cryoprotective potential of these agents, they have a number of side effects, the main of which is cytotoxicity. Tolerance of tissues to adverse conditions of cryopreservation is restricted and depends on the type of tissue and its original state. Herewith the addition of cryoprotectants to the media at various concentrations and exposure time optimization can reduce their toxic effects on a tissue. In connection with the above, the research purpose was to determine morphological parameters and meta- bolic activity of convoluted tubules of immature rat testes depending on the concentrations of cryopro- tectants (DMSO, glycerol, PEO-400 and sucrose) and the time of exposure to cryoprotective solution based on Hanks solution and 50 g/L of bovine serum albumin (BSA). Materials and methods The experiments were carried out in accordance with the General Principles of Experiments in Animals, approved by the 6th National Congress in Bioethics (Kyiv, 2016) and with the statements of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals 206 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 та сахарози), а також часу їх експозиції у кріоза- хисних розчинах на основі розчину Хенкса та 50 г/л бичачого сироваткового альбуміну. Матеріали та методи Експерименти проводили згідно з «Загальни- ми принципами експериментів на тваринах», схва- леними VI Національним конгресом із біоетики (Київ, 2016) та узгодженими з положеннями «Євро- пейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1986). Роботу виконували на 50 безпорідних білих ста- тевонезрілих щурах-самцях масою (50 ± 15) г віком 7–8 тижнів. Звиті канальця отримували з обох сі- м’яників щурів механічним шляхом та поміщали у розчин Хенкса («ПанЕко», Росія). У дослідженнях використовували навіски звитих сім’яних канальців ex tempore масою (75 ± 5) мг. Токсичний вплив кріопротекторів визначали у середовищах із додаванням: ДМСО («ПанЕко») у кінцевих концентраціях 0,6; 1,2; 1,8 та 2,4 М; гліцерину («Dow Chemical», Німеччина) у кінцевих концентраціях 0,7; 1,4; 2,1 та 2,8 М; ПЕО-400 у кінцевих концентраціях 50, 100, 150 та 200 г/л; сахарози («ПанЕко») у кінцевих концентраціях 0,1; 0,5; 1,0 та 1,5 М. Термін експозиції звитих канальців сім’яників щурів у кріозахисних середовищах скла- дав 30 хв за температури 4°С [17]. Базуючись на результатах підбору найменш ток- сичних концентрацій досліджуваних кріопротек- торів, визначали вплив часу експозиції на морфо- функціональні показники звитих канальців сім’я- ників щурів. Використовували кріопротектори у наступних кінцевих концентраціях: середовище 1 – 0,6 М ДМСО; середовище 2 – 0,7 М гліцерину; середовище 3 – 50 г/л ПЕО-400; середовище 4 – 0,1 М сахарози. Контролем було середовище без додавання кріопротекторів. Експозиція звитих канальців сім’я- ників щурів складала 15, 30, 45 і 60 хв (4°С). Кріозахисні середовища виготовляли ex tempore на основі розчину Хенкса з додаванням 50 г/л би- чачого сироваткового альбуміну (БСА) та відпо- відної концентрації кріопротектора. Після експозиції в усіх середовищах видаляли кріопротектори зі зразків шляхом трьохетапної зміни середовища кріоконсервування на розчин Хенкса. Показник життєздатності клітин визначали після гомогенізації зразків за методом суправітального забарвлювання трипановим синім [4]. Для гістологічних досліджень виготовляли пара- фінові зрізи звитих канальців товщиною 7 мкм, які фарбували гематоксиліном і еозином. Мікрозйомку препаратів здійснювали з використанням мікрос- копа «Carl Zeiss Axio Observer Z1» («Carl Zeiss», Ні- меччина). У подальшому ці зображення використо- Used for Experimental and Other Scientific Purpo- ses (Strasbourg, 1986). The work was performed in 50 outbred white, sexually immature male rats of (50 ± 15) g weight and aged 7–8 weeks. Convoluted tubules were obtained mechanically from both testes of rats and placed into a Hanks solution (PanEco, Russia). The ex tempore suspensions of (75 ± 5) mg of convoluted seminiberous tubules cells were used in the studies. Toxic effect of cryoprotectants was assessed in the media containing DMSO (PanEco) at final con- centrations of 0.6; 1.2; 1.8 and 2.4 M; glycerol (Dow Chemical, Germany) at final concentrations of 0.7; 1.4; 2.1 and 2.8 M; polyethylene oxide with mole- cular weight of 400 (PEO-400) at final concentra- tions of 50, 100, 150 and 200 g/L; sucrose (PanEco) at final concentrations of 0.1; 0.5; 1.0 and 1.5 M. The exposure time of convoluted tubule tissues of rats in cryoprotective media was 30 min at a temperature of 4°C [13]. Proceeding from the selection of the least toxic con- centrations for the investigated cryoprotectants, the effect of exposure time on the morphofunctional cha- racteristics of the testicular convoluted tubule tissues of rats was determined. For this aim the cryopro- tectants were used at the following final concentrations: medium 1 – 0.6 M DMSO; medium 2 – 0.7 M glycerol; medium 3 – 50 g/L PEO-400; medium 4 – 0.1 M sucrose. The control was the medium without the cryo- protectants added. Exposure of testicular convoluted tubules of rats was 15, 30, 45 and 60 min at a tempe- rature of 4°C. Cryoprotective media were prepared ex tempore using Hanks solution supplemented with 50 g/L BSA as the base and the corresponding cryoprotectant con- centration. After exposure to all the media, the cryopro- tectants were removed from the samples by three-step change of cryopreservation medium to Hanks solution. The cell viability was examined by means of supra- vital staining using Trypan blue after homogenizing the samples [18]. For histological studies, the paraffin sections were made of convoluted tubules of 7 µm thickness, which were stained with hemotoxylin and eosin. Microscopy of the preparations was performed using a microsco- pe Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Germany). Subse- quently, these images were used to evaluate the his- tological structure of convoluted tubule tissues of rat testes using the Axiovision v. 4.8 (Carl Zeiss), in par- ticular, the average density of spermatogenic epithelium cells was determined with the method of G.G. Avtan- dilov [2] by counting the number of nuclei per unit of the section area with the subsequent recalculation to 1 mm2. Metabolic activity of the samples of rat testes con- voluted tubules was assessed by total activity of lactate проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 207 вували для оцінки гістологічної структури звитих ка- нальців сім’яників щурів за допомогою програмного забезпечення «Axiovision v. 4.8» («Carl Zeiss»), зок- рема визначали середню щільність клітин сперма- тогенного епітелію за методом Г.Г. Автанділова [1] шляхом підрахунку кількості ядер на одиниці площі зрізу з наступним перерахунком на 1 мм2. Метаболічну активність зразків звитих каналь- ців сім’яників щурів оцінювали за загальною актив- ністю лактатдегідрогенази (ЛДГ) та за допомогою МТТ-тесту («Fluka», Німеччина). Активність ЛДГ у зразках звитих канальців сім’яників щурів на зазначених термінах експозиції у середовищах кріоконсервування вимірювали за допомогою тест- наборів реактивів («Філіст-Діагностика», Україна) з використанням методу запуску реакції зразком. Для проведення тесту зразки готували зі шматочків тканин, які гомогенізували, фільтрували, центри- фугували (1 000 g протягом 10 хв) та відбирали супернатант. До 20 мкл супернатанта додавали 1 мл монореактиву, перемішували та через 1 хв зчитували змінення екстинції з інтервалом 1 хв про- тягом 3 хв по відношенню до дистильованої води при довжині хвилі 365 нм на фотоелектрокалори- метрі «КФК-2» (ЗОМЗ, Росія). Відомо, що принцип МТТ-тесту заснований на здатності дегідрогеназ живих клітин відновлювати 3-(-4,5-диметилтіазоліл-2)-2,5-дифенілтетразолій бромистий у блакитні кристали формазану, які нерозчиняються у воді [22]. Для проведення МТТ- тесту кожен зразок переносили в 1 мл середовища Хенкса, до якого вносили по 0,5 мл розчину МТТ (5 мг/мл). Через 3 години інкубації (5% СО2, 37°С) утворений формазан розчиняли шляхом ресуспен- дування зразка у ДМСО до повного його знебарв- лювання. Від осаду, який утворився в результаті преципітації білків у ДМСО, звільнялися шляхом 10-хвилинного центрифугування при 1 000 g. Оптичну щільність розчину формазану в супернатанті вимі- рювали на фотоелектрокалориметрі «КФК-2» при довжині хвилі 540 нм проти холостої проби – культу- рального середовища без клітин. Аналіз даних проводили з використанням пакетів програм «Excel» («Microsoft», США) та «Statistika 8» («StatSoft», США). Для визначення статистичної значущості відмінностей безперервних величин при міжгруповому порівнянні залежно від параметрів розподілу застосовували t-критерій Стьюдента або U-критерій Манна-Уїтні, при множинних (більше двох) порівняннях – методи one-way ANOVA або Kruskal-Wallis ANOVA. Результати та обговорення На першому етапі роботи було проведено підбір найменш токсичних концентрацій досліджуваних кріопротекторів для звитих канальців сім’яників dehydrogenase (LDH) and by MTT test (Fluka, Germany). LDH activity in the samples of the rat testes convoluted tubules in these terms of expo- sure to cryopreservation media was measured using test kits reagents (Felicit Diagnostika, Ukraine) by means of reaction triggering by the sample. For the test we prepared the samples from pieces of tis- sue which were homogenized, filtered, centrifuged (1,000 g for 10 min) and then the supernatant was studied. One milliliter of monoreagent was added to 20 ml supernatant and stirred, one minute later the extinction change was recorded at 1 min intervals for 3 min with respect to distilled water at 365 nm wave- length with photoelectrocalorimeter KFK-2 (ZOMZ, Russia). It is known that the MTT test is based on the ability of dehydrogenases in living cells to restore 3-(-4,5- dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide to blue crystals of formazan, which are insoluble in water [20]. For the MTT test, each sample was trans- ferred to 1 ml Hanks medium, to which 0.5 ml of MTT solution (5 mg/ml) was added. After 3 hrs of incubation (5% CO2, 37°C), the formed formazan was dissolved by re-suspending the sample in DMSO until it was completely discolored. The sediment, which was formed as a result of precipitation of proteins in DMSO, was disposed by 10-minute centrifugation at 1,000 g. The optical density of formazan solution in supernatant was measured with a photoelectrocalorimeter KFK-2 at 540 nm wavelength against a blank sample i. e. culture medium without cells. Data were analyzed using Excel (Microsoft, USA) and Statistics 8 (StatSoft, USA) software. To deter- mine the statistical significance of the differences in continuous variables when comparing between the groups, depending on the distribution parameters, the t-criterion of the Student or the Mann-Whitney U-criterion were used, with multiple (more than two) comparisons one-way ANOVA or Kruskal-Wallis ANOVA tests. Results and discussion At the first stage of the research the least toxic concentrations of the investigated cryoprotectants for the convoluted tubule of the testes of immature rats were selected. It has been established, that at the 30- min exposure, the best viability of cells in the Trypan blue exclusion test was found using 0.7 M glycerol and 50 g/L PEO-400 (Fig. 1). At the same time, the decrease in viability for the control was 13.2% and 14.0%, respectively. In the case of using 0.6 M DMSO, the cell viability of convoluted tubules of testes in rats was 18.4% compared to the control. With an in- crease in the concentration of cryoprotectants, the percentage of viable cells after a 30-min exposure was likely to decline in all the cases. 208 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 статевонезрілих щурів. Встановлено, що після 30-хвилинної експозиції найкращі показники жит- тєздатності клітин за тестом виключення трипа- нового синього були при використанні 0,7 М гліце- рину і 50 г/л ПЕО-400 (рис. 1). При цьому зни- ження показника життєздатності щодо контролю складало 13,2 і 14,0% відповідно. У разі застосу- вання 0,6 М ДМСО зниження показника життє- здатності клітин звитих канальців сім’яників щурів складало 18,4% порівняно з контролем. Зі збіль- шенням концентрації кріопротекторів відсоток жит- тєздатних клітин після 30-хвилинної експозиції вірогідно знижувався в усіх випадках. Цитотоксичний вплив властивий як ендоце- люлярним, так і екзоцелюлярним кріопротекто- рам, а його ступінь залежить від типу, концентра- ції, часу та температури експозиції, а також від характеристик самого біооб’єкта. З літературних Cytotoxic effect is inherent to both endocellular and exocellular cryoprotectants, and its degree depends on the type, concentration, exposure time and temperature, as well as the features of biological objects. From the published reports it is known that DMSO toxicity is associated with protein denaturation and destabiliza- tion of phospholipid bilayer [9, 12, 14], as well as with the possible caspase activation and apoptosis [1, 4, 30]. Toxic effects of glycerol depends on equilibration period and is manifested in a change of permeabi- lity of cell membranes, concentration of osmiophilic granules in nucleus, pinocytosis, appearance of cisterns and vacuoles in cytoplasm, damage of mitochondria and endoplasmic reticulum dehydration [7, 19]. Polye- thylene oxide due to the presence of low fractions par- tially penetrates into the cells and the remains are adsorbed on the cell membrane, leading to a cell dehyd- ration [24]. Like other non-penetrating protective agents, Ж ит тє зд ат ні ст ь кл іти н, % Vi ab ilit y of c el ls , % Концентрація, % Concentration, % Концентрація, % Concentration, % Концентрація, % Concentration, % Рис. 1. Життєздатність клітин сім'яників щурів після 30-хвилинної експозиції у середовищах із додаванням кріопротекторів: A – ДМСО; B – гліцерину; C – ПЕО-400; D – сахарози; * – різниця статистично значуща відносно попередньої концентрації (р < 0,05; n = 5). Fig. 1. Viability of rat testes cells after the 30-min exposure in cryoprotective media supplemented with: A – DMSO; B – glycerol; C – PEO-400; D – sucrose; * – the difference is statistically significant if compared with the previous concentration (р < 0.05; n = 5). Ж ит тє зд ат ні ст ь кл іти н, % Vi ab ilit y of c el ls , % Ж ит тє зд ат ні ст ь кл іти н, % Vi ab ilit y of c el ls , % Ж ит тє зд ат ні ст ь кл іти н, % Vi ab ilit y of c el ls , % Концентрація, % Concentration, % 0 20 40 60 80 0,6 1,2 1,8 2,4 0 20 40 60 80 0,7 1,4 2,1 2,8 0 20 40 60 80 50 100 150 200 0 20 40 60 80 0,1 0,5 1 1,5 C D A B * * * * * * * * проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 209 джерел відомо, що токсичність ДМСО пов’язана з денатурацією білків і дестабілізацією фосфолі- підного бішару [13, 16, 18], а також із можливістю активації каспаз та індукції апоптозу [7, 9, 30]. Ток- сична дія гліцерину залежить від еквілібраційного періоду та проявляється в зміні проникності мемб- ран клітин, концентрації осміофільних гранул у ядрі, піноцитозі, появі цистерн та вакуолей у цитоплазмі, ушкодженні мітохондрій та зневодненні ендоплаз- матичного ретикулуму [11, 21]. Поліетиленоксид завдяки наявності низькомолекулярних фракцій частково проникає у клітини, а залишок адсорбуєть- ся на клітинній мембрані, що призводить до дегід- ратації клітин [5]. Сахароза, як і інші непроникаючі протектори, у високих концентраціях створює гі- пертонічне середовище, що спричиняє клітинну дегідратацію [24]. Гістологічне дослідження показало, що власна оболонка кожного канальця була представлена шаром міоїдних клітин і волокнами сполучної тка- нини. Всередині власної оболонки, відокремленої базальною мембраною, розташовувався спермато- генний епітелій. На кожній ділянці звитого канальця уздовж базальної мембрани знаходилися округлі клітини з гіперхромним ядром і тонким обідком ци- топлазми – сперматогонії, над якими розташовува- лися кілька рядів сперматоцитів – клітин із великим ядром і широким обідком цитоплазми (рис. 2). Після експозиції в середовищі 1 (рис. 3) звиті канальця сім’яників щурів розташовувалися вільно, з нерівномірним розподілом ділянок інтерстицію між ними. На всіх термінах спостереження в складі сперматогенного шару визначалися клітини з гіпер- хромним ядром і різко еозинофільною цитоплазмою, що може бути пов’язано з розвитком у них некро- тичних змін. Крім того, вже через 15 хв експозиції у середовищі 1 зрідка виявлялися невеликі безклі- тинні ділянки сперматогенного епітелію (рис. 3, А), частота і розповсюдженість яких збільшувалися з подовженням часу експозиції (рис. 3, В–D). Місцями спостерігалася десквамація сперматогенного епі- телію у просвіт канальців. Після експозиції у середовищі 2 (рис. 4) звиті сім’яні канальця нещільно прилягали один до одного, мали округлу форму та нечіткі контури. Ді- лянки інтерстицію між канальцями практично були відсутні та розташовувалися вільно і нерівномірно. Сперматогенний епітелій зберігав зв’язок із базаль- ною мембраною, проте товщина епітеліального шару була нерівномірною, а його межа – нечіткою. Через 15 хв експозиції статеві клітини втрачали організацію всередині сперматогенного шару та відшаровувалися в просвіт канальця (рис. 4, А). На 45-й хвилині спостереження в більшій частині зви- тих сім’яних канальців спостерігали осередки нек- розу сперматоцитів (рис. 4, C). sucrose in high concentrations creates a hypertonic medium, causing a cell dehydration [22]. Histological study showed that the own membrane of each tubule was represented by a layer of myoid cells and connective tissue fibers. Inside of its own membrane, separated by a basal one, there is a sper- matogenic epithelium. On each section of convolu- ted tubule along a basal membrane, the rounded cells with a hyperchromic nucleus and a thin rim of cyto- plasm, i. e. spermatogonia, over which there were several rows of spermatocytes, the cells with a large nuclues and a wide rim of cytoplasm (Fig. 2) were ob- served. After exposure to medium 1 (Fig. 3) the convoluted tubules of rat testes were freely located with uneven distribution of interstitium sites between them. At all the observation terms in the composition of sperma- togenic layer there were found the cells with hyper- chromic nucleus and well-marked eosinophilic cyto- plasm, that may be associated with the development of necrotic changes in them. In addition, after 15 min exposure in medium 1 there were occasionally observed small areas of acellular spermatogenic epithelium (Fig. 3A), the incidence and prevalence of those were increased with a rise in exposure time (Fig. 3B–D). Somewhere the desquamation of spermatogenic epithe- lium in a lumen of the tubules was observed. After exposure to medium 2 (Fig. 4), convoluted seminiferous tubules cells were loosely adjoining each other, and had a rounded shape and dim contours. The sites of interstitium between the tubules were very seldom and located freely and unevenly. The sperma- togonal epithelium was not exfoliated from the basal Рис. 2. Звиті канальця сім'яників статевонезрілих щурів після 30-хвилинної експозиції у розчині Хенкса з додаванням 50 г/л бичачого сироваткового альбуміну. Забарвлювання гематоксиліном та еозином. Fig. 2. Convoluted tubules of testes in immature rats after 30-min exposure in Hanks solution supplemented with 50 g/L of bovine serum albumin. Hematoxylin and eosin staining. 210 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 У разі використання середовища 3 (рис. 5) звиті сім’яні канальця мали чіткі округлі контури. Біль- шість клітин сперматогенного епітелію на ранніх термінах спостереження зберігали зональність та зв'язок із базальною мембраною. На 30-й хвилині спостереження місцями виявлялися невеликі осередки некрозу з явищами десквамації сперма- тогенного епітелію (рис. 5, А). Подовження часу експозиції до 45 хв призводило до появи окремих канальців із тотальним некрозом (рис. 5, B). Після 15-хвилинної експозиції у середовищі 4 (рис. 6, А) виявлено хаотичне розташування стате- вих клітин усередині сперматогенного шару на тлі розволокнення та дезорганізації базальної мемб- рани. Описані зміни підтверджують розвиток нек- розу статевого епітелію. Межа між шарами в спер- матогенному епітелію була нечіткою. Зі збіль- шенням часу експозиції поступово зменшувалася загальна кількість клітин (рис. 6, В, C). На більш пізніх термінах спостереження виявлялися канальця з практично тотальним некрозом сперматогенного епітелію (рис. 6, D). membrane, but the thickness of the epithelial layer was uneven and its fringe was vague. After 15 mi- nutes of exposure, the cells lost their organization within the spermatogenic layer and disintegrated into the lumen of the tubule (Fig. 4A). At minute 45 of observation in the majority of the convoluted sper- matic tubules the foci of necrosis of spermatocytes were observed (Fig. 4C). When medium 3 was used (Fig. 5), the seminiferous tubules had clear rounded contours. Most cells of sper- matogenic epithelium in the earliest terms of obser- vation retained zonation and contact with the basal membrane. At the minute 30 of observation, small areas of necrosis with desquamation of spermatogenic epi- thelium appeared (Fig. 5A). Prolongation of the expo- sure time up to 45 min resulted in the appearance of individual tubules with total necrosis (Fig. 5B). After a 15-minute exposure to medium 4 (Fig. 6A), the chaotic location of the germ cells inside the sperma- togenic layer was observed on the background of fusion and disorganization of the basal membrane. The descri- bed changes evidenced the development of necrosis Рис. 3. Звиті сім'яні канальця статевонезрілих щурів після експозиції у середовищі 1 (0,6М ДМСО): А – 15 хв; B – 30 хв; C – 45 хв; D – 60 хв. Забарвлювання гематоксиліном та еозином. Fig. 3. Convoluted tubules of testes in immature rats after exposure in the medium 1 (0.6 M of DMSO): A – 15 min; B – 30 min; C – 45 min; D – 60 min. Hematoxylin and eosin staining. A B DC проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 211 Щільність розташування клітин сперматоген- ного епітелію була більш чутливою до експозиції у досліджуваних кріозахисних середовищах. Так, у всіх середовищах, окрім середовища 3, зі збіль- шенням часу експозиції щільність розташування клітин сперматогенного епітелію значуще змен- шувалася (рис. 7) та залежала від складу кріоза- хисного середовища. Найбільш низькі показники на кінець експозиції (60 хв) були отримані в разі застосування ДМСО, при цьому щільність роз- ташування клітин сперматогенного епітелію зна- чуще знижувалася (у 2 рази) порівняно з показ- ником на початку експерименту. Найменш токсич- ний вплив на клітини сперматогенного епітелію згідно з цим показником мало середовище з дода- ванням ПЕО-400, при цьому досліджуваний по- казник не змінювався. Під час 30-хвилинної експо- зиції звитих канальців у середовищі 2 значущого зменшення щільності клітин сперматогенного епі- телію не було, а після 60-хвилинної експозиції цей показник становив 29,5% відносно 15-ї хвилини спостереження. of the epithelium. The boundary between layers in the spermatogenic epithelium was unclear. As the exposure time increased, the total number of cells gradually de- creased (Fig. 6B,C). At later stages of the observation the tubules with almost total necrosis of the sperma- togenic epithelium appeared (Fig. 6D) The density of spermatogenic epithelium cells arran- gement was more sensitive to exposure in the cryo- preservation media under study. Thus, in all the media except medium 3, with increasing an exposure time the density of spermatogenic epithelium cells signi- ficantly decreased (Fig. 7), also the extent of reduction depended on the composition of cryoprotective medium. The lowest values at the end of the exposure (60 min) were obtained with DMSO, the density of sperma- togenic epithelium cells was significantly reduced (two times) compared with the values at the beginning of the experiment. The least toxic effects on the cells of spermatogenic epithelium according to this index was the medium supplemented with PEO-400, with an average index of spermatogenic epithelium cell den- sity was not significantly reduced. During the 30-min Рис. 4. Звиті сім’яні канальця статевонезрілих щурів після експозиції у середовищі 2 (0,7 М гліцерин): А – 15 хв; B – 30 хв; C – 45 хв; D – 60 хв. Забарвлювання гематоксиліном та еозином. Fig. 4. Convoluted tubules of testes in immature rats after exposure in the medium 2 (0.7 M of glycerol): A – 15 min; B – 30 min; C – 45 min; D – 60 min. Hematoxylin and eosin staining. A B DC 212 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 Результати дослідження впливу кріозахисних середовищ на активність ЛДГ наведено на рис. 8. Експозиція протягом 15 або 30 хв у всіх застосова- них кріозахисних середовищах не призводила до значущих змін показника активності ЛДГ у порів- нянні з контролем (середовище Хенкса + 50 г/л БСА). При експозиції протягом 45 хв спостерігали тенденцію до зниження дослідженого показника в усіх середовищах, а саме: у 1 та 2 – на 47,2 та 48,1% відповідно; 3 – на 24,3%; 4 – на 30,2% у порівнянні з попереднім строком (30 хв). Після 60- хвилинної експозиції тканин в усіх середовищах спостерігали зниження активності ЛДГ більше ніж у 2 рази у порівнянні з відповідними показника- ми на 15-й хвилині. Таким чином, подовження ча- су експозиції тканин більше 30 хв призводило до суттєвих змін активності ЛДГ, що, ймовірно, свід- чить про пригнічення метаболічних процесів у клі- тинах. За результатами МТТ-тесту (рис. 9) встановлено, що 15-хвилинна експозиція у кріозахисних сере- exposure of convoluted tubules in medium 2 no signi- ficant reduction of spermatogenic epithelium cell density was found, and after 60-min exposure this index made only 29.5% to minute 15 of observation. The results of the study of the influence of cryopro- tective media on the LDH activity are shown in Fig. 8. Exposure either for 15 or 30 min in all cryopreservation media tested did not lead to strong changes in LDH activity if compared to the control (Hanks + 50 g/L BSA) as well as between the investigated media. During exposure for 45 min there was a tendency to a decrease in the investigated index in all the media, namely: 1 and 2 – by 47.2 and 48.1% respectively; 3 – by 24.3%; 4 – by 30.2% compared to the previous exposure period (30 min). At 60-min exposure of tissues in all investi- gated media, we observed lowering of index by more than 2 times if compared to the corresponding values at minute 15. Thus, an increase in the tissue exposure time of more than 30 minutes resulted in significant changes in LDH activity, which probably indicated the damage to metabolic processes in the cells. Рис. 5. Звиті сім'яні канальця статевонезрілих щурів після експозиції у середовищі 3 (50 г/л ПЕО-400): А – 15 хв; B – 30 хв; C – 45 хв; D – 60 хв. Забарвлення гематоксиліном та еозином. Fig. 5. Convoluted tubules of testes in immature rats after exposure in the medium 3 (50 g/L of PEO-400): A – 15 min; B – 30 min; C – 45 min; D – 60 min. Hematoxylin and eosin staining. A B DC проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 213 довищах не призводила до значущих змін показ- ника метаболічної активності у порівнянні з конт- ролем та кріозахисними середовищами. Під час експозиції протягом 30 хв спостерігали тенденцію до зниження дослідженого показника в усіх розгля- нутих випадках у порівнянні з попереднім строком (15 хв), а саме: контроль (середовище Хенкса + 50 г/л БСА) – на 11,2%, середовище 1 – на 12,4%; сере- довище 2 – на 10,2%; середовище 3 – на 15,1%; середовище 4 – на 13,5%. Після 45-хвилинної експо- зиції тканин метаболічна активність в усіх розгляну- тих випадках була зниженою порівняно з попереднім строком спостереження (30 хв), а саме: контроль – на 13,1%; середовище 1 – на 14,2%; середовище 2 – на 14,8%; середовище 3 – на 15,6%; середовище 4 – на 13,1%. Збільшення часу експозиції тканин до 60 хв не призводило до змін досліджуваного показ- ника у порівнянні з попереднім строком спостере- ження (45 хв). Отже, експозиція тканин понад 30 хв призводила до зниження метаболічної активності клітин в усіх середовищах, зокрема в контролі. The results of the MTT test (Fig. 9) indicate that the 15-min exposure in studied cryopreservation me- dia did not lead to a significant change in metabolic activity if compared to the control and between the investigated cryoprotective agents. During the expo- sure for 30 min there was a tendency to a decrease in the investigated index for all considered cases if com- pared to 15-min exposure, namely: control (Hanks + 50 g/L BSA) – by 11.2%, medium 1 – 12.4%; medium 2 – 10.2%; medium 3 – by 15.1%; medium 4 – by 13.5%. At 45-min exposure of the tissue the investigated index in all considered cases was lower if compared to the previous observation term (30 min), namely: control – by 13.1%; medium 1 – by 14.2%; medium 2 – by 14.8%; medium 3 – by 15.6%; medium 4 – by 13.1%. An increase in the tissue exposure time of up to 60 mi- nutes did not lead to changes in the investigated in- dex compared with the previous observation period (45 min). Consequently, the tissue exposure of more than 30 min led to a decrease in the metabolic activity of cells in all investigated media, including the control. Рис. 6. Звиті сім'яні канальця статевонезрілих щурів після експозиції у середовищі 4 (0,1 М сахароза): А – 15 хв; B – 30 хв; C – 45 хв; D – 60 хв. Забарвлювання гематоксиліном та еозином. Fig. 6. Convoluted tubules of testes in immature rats after exposure in the medium 4 (0.1 M of sucrose): A – 15 min; B – 30 min; C – 45 min; D – 60 min. Hematoxylin and eosin staining. A B DC 214 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 The data obtained by the MTT test for 60 min are consistent with the results of measurements of LDH activity at the same time of exposure, which indicates the inhibition of metabolic processes in cells due to the exposure duration. In the present work the effect of exposure in media of different composition on morphological parameters and metabolic activity of the cells of convoluted tubules of immature rat testes was comparatively assessed. It was found that 30-min exposure of tissue samples to Hanks and 50 g/L bovine serum albumin with either 0.6 M dimethyl sulfoxide (DMSO) or 0.7 M glycerol did not impair the spermatogenic epithelium and de- crease the metabolic activity of the cells (MTT test and LDH activity). Previously it was reported [17, 21, 27], that cryopreservation of testicular tissue fragments if compared with cell suspension resulted in preserva- tion of a larger percentage of spermatogonial stem cells in total population. This effect was associated with negative effects of proteolytic enzymes during enzy- matic treatment of testicular tissue, minimizing the space around the germinal cells due to their associa- tion between each other, Sertoli cells, basal membrane and peritubular myoid cells, as well as the presence of type IV collagen in basal membrane of tubules, which also may perform an additional cryoprotective function. більшого відсотку сперматогенних стовбурових клітин у загальній популяції [20, 23, 27]. Цей ефект пов’язаний із негативним впливом протеолітич- них ферментів при ферментативній обробці тес- тикулярної тканини, мінімізацією простору навко- ло гермінативних клітин завдяки їх асоціації між собою, клітинами Сертолі, базальною мембраною та перитубулярними міоїдними клітинами, а також із наявністю колагену IV типу в базальній мембрані канальців, що також може виконувати додаткову кріопротекторну функцію. Як відомо, процес низькотемпературного кон- сервування біооб’єктів складається з кількох ета- пів: виділення, експозиція у кріозахисному середо- вищі, заморожування, зберігання при низьких температурах та розморожування. На усіх етапах біологічний об’єкт піддається впливу пошкод- жуючих факторів. На дослідженому в нашій ро- боті одному з перших етапів кріоконсервування – експозиції тканини з кріозахисними середовища- ми – найбільш вагомими параметрами, які можуть спричинити пошкоджуючу дію, є тривалість об- робки, температура, тип та концентрація кріопро- тектора. У нашій роботі було досліджено вплив різних кінцевих концентрацій ДМСО, гліцерину, ПЕО-400 і сахарози, а також часу експозиції у кріозахисних Щ іл ьн іс ть к лі ти н, × 10 3 /м м 2 C el l d en si ty , ×1 03 /m m 2 Термін спостереження, хв Observation time, min Рис. 7. Середня щільність розташування клітин сперматогенного епіте- лію після експозиції у кріозахисних середовищах у динаміці: 1 – , 2 – , 3 – , 4 – ; * – різниця статистично значуща до попереднього терміну спостереження; # – різниця статистично значуща відносно 15-хви- линної експозиції у відповідному кріозахисному середовищі (р < 0,05; n = 5). Fig. 7. Average density of location of spermatogenic epithelium cells after exposure in cryoprotective media in dynamics: 1 – , 2 – , 3 – , 4 – ; * – the difference is statistically significant in accordance with the previous observation period; # – the difference is statistically significant relative to 15-min exposure in applicable cryoprotective medium (р < 0.05; n = 5). Отримані нами дані за МТТ-тес- том на 60-й хвилині узгоджу- ються з результатами вимірю- вання активності ЛДГ на тому ж строку , що свідчить про пригні- чення метаболічних процесів у клітинах, обумовлених тривалістю експозиції. У представленій роботі прове- дено порівняльну оцінку впливу експозиції у середовищах різного композиційного складу на морфо- логічні параметри та метаболічну активність клітин звитих канальців сім’яників статевонезрілих щурів. Встановлено, що 30-хвилинна екс- позиція зразків тканин у середо- вищах на основі розчину Хенкса та 50 г/л бичачого сироваткового альбуміну з додаванням 0,6 M ДМСО або 0,7 M гліцерину не викликала ушкоджень сперма- тогенного епітелію та зниження метаболічної активності клітин (МТТ-тест та активність ЛДГ). Ра- ніше було показано, що кріокон- сервування фрагментів тканин яєчка у порівнянні зі суспензією клітин призводить до збереження 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 30 45 60 # # , # , # , # , # # # 3 4 1 2 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 215 розчинах (на основі розчину Хенкса та 50 г/л БСА) на життєздатність клітин звитих канальців сім’я- ників статевонезрілих щурів та їх морфологічні па- раметри. За результатами дослідження оптималь- ними на етапі експозиції звитих сім’яних канальців статевонезрілих щурів можна вважати наступні концентрації кріопротекторів: ДМСО – 0,6 М; глі- церин – 0,7 М; ПЕО-400 – 50 г/л; сахароза – 0,1 М. При 30-хвилинній експозиції звитих канальців сім’я- ників щурів у середовищах із використанням заз- начених концентрацій кріопротекторів показники життєздатності клітин за тестом виключення три- панового синього зберігалися на рівні 65–69% в усіх досліджених випадках. Збільшення кінцевої кон- центрації кріопротекторів негативно впливало на життєздатність клітин. Дослідження тривалості експозиції у середови- щах показало, що використання середовищ на основі розчину Хенкса та 50 г/л БСА з додаванням 0,6 М ДМСО або 0,7 М гліцерину не призводи- ло до ушкоджень сперматогенного епітелію при тривалості експозиції не більше 30 хв. За даними гістологічних досліджень подовження часу екс- позиції викликало ушкодження тканин звитих канальців сім’яників, а саме: десквамацію, появу безклітинних ділянок та зменшення щільності клі- тин сперматогенного епітелію. Слід зазначити, що Low-temperature preservation of biological objects is known to consist of several stages: selection, expo- sure in cryoprotective medium, freezing, storage at low temperatures and thawing. At all the stages biolo- gical object is exposed to harmful factors. In this research we considered one of the first stages of cryopreserva- tion, i. e. exposure of tissue to cryoprotective media. The most crucial factors which are capable of damaging the tissue are as follows: treatment duration, temperature, type and concentration of cryoprotective agent. We investigated the effect of different final con- centrations of DMSO, glycerol, PEO-400 and sucrose and the time of exposure to cryoprotective solutions (based on Hanks solution and 50 g/L BSA) on viability of the cells of convoluted tubules of immature rats’ testes and their morphological parameters. According to the findings the following concentrations of cryo- protectants can be considered as optimal at the exposure stage of convoluted seminiferous tubules of sexually immature rats: DMSO – 0.6 M; glycerol – 0.7 M; PEO- 400 – 50 g/L; sucrose – 0.1 M. At 30-min exposure of the convoluted tubules of rat testes in the media using the indicated concentrations of cryoprotectants, the viability of cells in the trypan blue exclusion test was maintained at 65–69% for all the investigated options. An increase in the final concentration of cryoprotec- tants negatively affected cell viability. Ак ти вн іс ть Л ДГ , М од /л LD H a ct iv ity , m U /L Термін спостереження, хв Observation time, min Рис. 8. Динаміка активності лактатдегідрогенази у клітинах звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів при експозиції у кріозахисних середовищах: контроль – , 1 – , 2 – , 3 – , 4 – . Суцільна лінія – показник інтактного контролю; * – різниця значуща відносно відповід- ного контролю (р < 0,05; n = 5). Fig. 8. Dynamics of activity of lactate dehydrogenase in the cells of convo- luted tubules of testes in immature rats under exposure in cryopreservation media: control – , 1 – , 2 – , 3 – , 4 – . Solid line shows the level of intact control; * – the difference is significant relative to the corresponding control (р < 0.05; n = 5). використання середовищ на осно- ві розчину Хенкса та 50 г/л бича- чого сироваткового альбуміну з додаванням 50 г/л ПЕО-400 або 0,1 М сахарози також негативно впливало на досліджені гістоло- гічні параметри та зі збільшенням часу експозиції до 45 хв призво- дило до тотального некрозу спер- матогенного епітелію. Не дивля- чись на різний принцип дії дос- ліджених кріопротекторів (ДМСО та гліцерин є ендоцелюлярними, а ПЕО-400 та сахароза – екзоцелю- лярними), ми отримали однаковий негативний ефект на термінах екс- позиції, які перевищували 30 хв. Можна припустити, що такі резуль- тати пов’язані з різною швидкістю проникнення кріопротекторів у тканини. Так, відомо, що ДМСО насичує клітини підшлункової за- лози за 10–15 хв, а гліцерин – за 180 хв [26]. Було показано [3], що збільшення ступеня дегідратації та часу знаходження гепатоцитів у зневодненому стані підвищує ризик їх пошкодження в резуль- таті осмотичного шоку. Зниження 0 10 20 30 40 50 60 70 15 30 45 60 3 41 2 * * * * 216 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 рівня життєздатності 8-клітинних ембріонів ми- ші при подовженні часу еквілібрації у середовищі заморожування до 3 хв, на думку деяких авторів [6], обумовлено збільшенням тривалості пере- бування ембріонів у зневодненому стані під дією високих концентрацій компонентів середовища заморожування. Це призводить до порушень за- гальної інтегральної цілісності та взаємодій внут- рішньоклітинних структур. Таким чином, швид- кість насичення біооб’єкта кріопротектором, а от- же, і токсична дія останнього залежать не тільки від структурної організації самого об’єкта, але й від вихідних характеристик застосованого кріо- протектора Виявлені під час гістоморфометричного дослід- ження зміни узгоджувалися із даними, отрима- ними під час вивченні метаболічної активності. Було показано, що збільшення часу експозиції тканин більше ніж 30 хв у всіх досліджуваних середовищах, у тому числі й у контрольних зраз- ках, призводило до зниження метаболічної ак- тивності клітин за МТТ-тестом та активності ЛДГ. Це, ймовірно, свідчило про початок розвитку некротичних процесів у тканині, обумовлених тривалістю експозиції. Таким чином, результа- ти представленої роботи можуть бути викорис- тані у наступних дослідженнях та під час роз- робки ефективних протоколів кріоконсервуван- ня звитих канальців сім’яників статевонезрілих щурів. Study of the exposure time in the investigated media showed that the use of media based on Hanks solution and 50 g/L BSA supplemented with either 0.6 M DMSO or 0.7 M glycerol did not cause damage to the spermatogenic epithelium with an exposure duration of not longer than 30 min. An increase in the exposure time resulted in injury to the tissues of the convoluted tubule of the testes according to histological studies, namely, desquamation, the appearance of cell-free areas, and reduced cell density of the spermatogenic epithelium. It should be noted that the use of the me- dia based on Hanks solution and 50 g/L bovine se- rum albumin supplemented with 50 g/L PEO-400 or 0.1 M sucrose also negatively affected the histological parameters studied and with an increase in exposure time of up to 45 min led to an appearance of total necrosis of the spermatogenic epithelium. Despite the different principle of the action of the investigated cryoprotectants (endocellular DMSO and glycerol, and exocellular PEO-400 and sucrose), we obtained the same negative effect at exposure terms, which ex- ceeded 30 min. It can be assumed that these results are related to different rates of penetration of cryo- protectants into a tissue. So, DMSO is known to sa- turate pancreatic cells for 10–15 minutes, and glycerol did for 180 min [25]. It was shown [16] that increasing the dehydration rate and the time of staying the hepa- tocytes in a dehydrated state enhanced the risk of their damage as a result of osmotic shock. Some authors [26] reported that the decrease in viability of 8-cell mouse О пт ич на щ іл ьн іс ть , у м . о д. Ab so rb an ce , ar b. u ni ts Рис. 9. Метаболічна активність (оптична щільність розчину формазану в МТТ-тесті) клітин звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів при експозиції у кріозахисних середовищах: контроль – , 1 – , 2 – , 3 – , 4 – . Суцільна лінія – показник інтактного контролю. Fig. 9. Metabolic activity (absorbance of formazan solution in MTT-test) of convoluted tubules of testes in immature rats under exposure in cryopro- tective media: control – , 1 – , 2 – , 3 – , 4 – . Solid line is an indicator of intact control. Термін спостереження, хв Observation time, min embryos with an increase in the equili- bration time in a freezing medium of up to 3 min was due to a rise in dura- tion of the embryos’ staying in a de- hydrated state under the influence of high concentrations of the components of the freezing medium, which led to disorders in integrity and interactions of intracellular structures. Thus, the rate of bioobject saturation by cryo- protectant, and, consequently, the toxic effect of the latter, depended not only on structural organization of the object itself, but also on initial characteristics of the applied cryoprotectant. The observed histomorphometric changes were consistent with the data obtained during investigation of me- tabolic activity. It has been shown that an increase in tissue exposure time longer than 30 min in all the studied media, including the control samples, led to a decrease in metabolic activity of cells by MTT test and LDH activity, which probably indicated the begin- ning of the development of necrosis 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 0,045 0,05 15 30 45 60 3 41 2 processes in tissues due to the duration of the expo- sure. Thus, the results of the presented research could be taken as a basis for subsequent studies and du- ring the development of effective cryopreservation protocols for convoluted tubule tissues of the sexually immature rats. Conclusions Use of cryoprotective media solution based on Hanks and 50 g/L of bovine serum albumin supple- mented with 0.6 M DMSO or 0.7 M glycerol did not result in the changes in spermatogenic epithelium cell density and their metabolic activity during exposure of convoluted tubules of rats for not longer than 30 min. Exposure of the tissue of convoluted tubules of immature rat testes within 45 and 60 min to cryopro- tective media based on Hanks solution and 50 g/L BSA supplemented with 0.6 M DMSO, 0.7 M glycerol, 50 g/L PEO-400 and 0.1 M sucrose led to desquamation, emergence of necrosis areas, significant reduction in spermatogenic epithelium cell density and their meta- bolic activity. The data could be used to investigate and develop effective methods to cryopreserve the convoluted tubules of the immature rat testes. Висновки Використання кріозахисних середовищ на основі розчину Хенкса та 50 г/л бичачого сироваткового альбуміну з додаванням 0,6 М ДМСО або 0,7 М гліцерину не призводить до змін щільності клі- тин сперматогенного епітелію та їх метаболічної активності під час експозиції звитих канальців сі- м’яників щурів не більше ніж 30 хвилин. Експозиція впродовж 45 та 60 хв тканин звитих канальців сім’яників статевонезрілих щурів у кріо- захисних середовищах із використанням розчину Хенкса та 50 г/л БСА з додаванням 0,6 М ДМСО, 0,7 М гліцерину, 50 г/л ПЕО-400 та 0,1 М сахарози призводила до явищ десквамації, появи ділянок некрозу, значущого зниження щільності клітин спер- матогенного епітелію та їх метаболічної активності. Отримані дані можуть бути використані для обґрунтування та розробки ефективних методик кріоконсервування звитих канальців сім’яників ста- тевонезрілих щурів. Література 1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия: Руководство. – М.: Медицина, 1990. – 384 с. 2. Быстрова О.В., Калугина А.С., Цыбатова Е.В. и др. Способы восстановления фертильности у онкологических больных // Практ. онкология. – 2009. – Т. 10, №4. – С. 245–253. 3. Кулешова Л.Г., Гордиенко Е.А., Коваленко И.Ф. Проницае- мость плазматических мембран гепатоцитов крысы для молекул воды в неизотонической среде электролитов // Біофізичний вісник. – 2002. – Т. 11, №2.– С. 39–42. 4. Методи клінічних та експериментальних досліджень в медицині / За ред. І.П. Кайдашева. – Полтава, 2003. – 320 с. 5. Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы. – К.: Наук. думка, 1978. – 204 c. 6. Смольянинова Е.И., Хроменкова О.Б., Жерноклев Г.В., Пишко О.В. Влияние эквилибрации в среде заморажива- ния на осмотическую устойчивость и жизнеспособность 8-клеточных эмбрионов мыши // Проблемы криобиоло- гии. – 2004. – №1. – С. 3–11. 7. Aliakbari F., Yazdekhasti H., Abbasi M. et al. Advances in cryopreservation of spermatogonial stem cells and restoration of male fertility // Microsc. Res. Tech. – 2016. – Vol. 79, №2. – P. 122–129. 8. Baert Y., Braye A., Struijk R.B. et al. Cryopreservation of testicular tissue before long-term testicular cell culture does not alter in vitro cell // Fertil. Steril. – 2015. – Vol. 104, №5. – P. 1244–1252. 9. Baust J.M., Vogel M.J., Van Buskirk R., Baust J.G. A molecular basis of cryopreservation failure and its modulation to improve cell survival // Cell Transplant. – 2001. – Vol. 10, №7. – P. 561– 571. 10.Day J.G., Stacey G.N. Cryopreservation and freeze-drying pro- tocols. – Totowa, New Jersey: Humana Press, 2007. – 365 р. 11.Dooley D.C., Law P., Schork P., Meryman H.T. Glycerolization of the human neutrophil for cryopreservation: osmotic respon- se of the cell // Exp. Hematol. – 1982. – Vol. 10. – P. 423e434. 12.Easley C., Simerly C., Schatten G. Stem cell therapeutic possibilities: future therapeutic options for male-factor and female-factor infertility? // Reprod. Biomed. Online. – 2013. – Vol. 27, №1. – P. 75–80. References 1. Aliakbari F., Yazdekhasti H., Abbasi M. et al. Advances in cryopreservation of spermatogonial stem cells and restoration of male fertility. Microsc Res Tech 2016; 79(2): 122–129. 2. Avtandilov G.G. Medical morphometry: Manual. Moscow: Me- ditsina; 1990. 3. Baert Y., Braye A., Struijk R.B. et al. Cryopreservation of testicular tissue before long-term testicular cell culture does not alter in vitro cell. Fertil Steril 2015; 104(5): 1244–1252. 4. Baust J.M., Vogel M.J., Van Buskirk R., Baust J.G. A molecular basis of cryopreservation failure and its modulation to improve cell survival. Cell Transplant 2001; 10(7): 561–571. 5. Bystrova O.V., Kalugina A.S., Tsybatova E.V. et al. Methods for recovering fertility in cancer patients. Prakt Onkologiya 2009; 10(4): 245–253. 6. Day J.G., Stacey G.N. Cryopreservation and freeze-drying protocols. – Totowa, New Jersey: Humanna Press; 2007. 7. Dooley D.C., Law P., Schork P., Meryman H.T. Glycerolization of the human neutrophil for cryopreservation: osmotic response of the cell. Exp Hematol 1982; 10: 423e434. 8. Easley C., Simerly C., Schatten G. Stem cell therapeutic possibilities: future therapeutic options for male-factor and female-factor infertility? Reprod Biomed Online 2013; 27(1): 75–80. 9. Fleming K.K., Hubel A. Cryopreservation of hematopoietic and non-hematopoietic stem cells. Transfus Apher Sci 2006; 34(3): 309–315. 10.Ginsburg E.S., Yanushpolsky E.H., Jackson K.V. In vitro fertiliza- tion for cancer patients and survivors. Fertil Steril 2001; 75(4): 705–710. 11.Izadyar F., Matthijs-Rijsenbilt J.J., den Ouden K. et al. Development of a cryopreservation protocol for type A spermatogonia. J Androl 2002; 23(4): 537–545. 12.Izadyar F., Spierenberg G.T., Creemers L.B. et al. Isolation and purification of type A spermatogonia from the bovine testis. Re- production 2002; 124(1): 85–94. проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017 217 13.Fleming K.K., Hubel A. Cryopreservation of hematopoietic and non-hematopoietic stem cells // Transfus. Apher. Sci. – 2006. – Vol. 34, №3. – P. 309–315. 14.Ginsburg E.S., Yanushpolsky E.H., Jackson K.V. In vitro fertilization for cancer patients and survivors // Fertil. Steril. – 2001. – Vol. 75, №4. – Р. 705–710. 15.Izadyar F., Matthijs-Rijsenbilt J.J., den Ouden K. et al. Deve- lopment of a cryopreservation protocol for type A sperma- togonia // J. Androl. – 2002. – Vol. 23, №4. – P. 537–545. 16.Izadyar F., Spierenberg G.T., Creemers L.B. et al. Isolation and purification of type A spermatogonia from the bovine testis // Reproduction. – 2002. – Vol. 124, №1. – P. 85–94. 17.Keros V., Hultenby K., Borgstrom B. et al. Methods of cryopre- servation of testicular tissue with viable spermatogonia in pre- pubertal boys undergoing gonadotoxic cancer treatment // Hum. Reprod. – 2007. – Vol. 22, №5. – P. 1384–1395. 18.Keros V., Rosenlund B., Hultenby K. et al. Optimizing cryopre- servation of human testicular tissue: comparison of protocols with glycerol, propanediol and dimethylsulphoxide as cryopro- tectants // Hum. Reprod. – 2005. – Vol. 20, №6 – P. 1676–1687. 19.Kim K.J., Lee Y.A., Kim B.J. et al. Cryopreservation of puta- tive pre-pubertal bovine spermatogonial stem cells by slow freezing // Cryobiology. – 2015. – Vol. 70, №2. – P. 175–183. 20.Lee Y.A., Kim Y.H., Ha S.J. et al. Cryopreservation of porcine spermatogonial stem cells by slow-freezing testis tissue in trehalose1 // Journal of Animal Science. – 2014. – Vol. 92, №3. – Р. 984–995. 21.Moss A.C., Higgins A.Z. Investigating the potential for cryo- preservation of human granulocytes with concentrated gly- cerol // Cryobiology. – 2016. – Vol. 72, №3. – P. 290–293. 22.Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Methods. – 1983. – Vol. 65, №1–2. – P. 55–63. 23.Onofre J., Baert Y., Faes K., Goossens E. Cryopreservation of testicular tissue or testicular cell suspensions: a pivotal step in fertility preservation // Human Reproduction Update. – 2016. – Vol. 22, №6. – P. 744–761. 24.Pelufo V., Lopez Armengol M.F., Malcotti V. et al. Effects of glycerol and sugar mixing temperature on the morphologic and functional integrity of cryopreserved ram sperm // Therio- genology. – 2015. – Vol. 83, №1. – P. 144–151. 25.Poirot C., Schubert B. Fertility preservation in prepubertal children // Bull. Cancer. – 2011. – Vol. 98, №5. – P. 489–499. 26.Rajotte R.V. Islet cryopreservation protocols // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1999 – Vol. 875, №1. – P. 200–207. 27.Unni S., Kasiviswanathan S., D’Souza S. et al. Efficient cryo- preservation of testicular tissue: effect of age, sample state, and concentration of cryoprotectant. Fertil Steril. – 2012. – Vol. 97. – P. 200–8.e201. 28.Volkova N.A., Pavlovich E.V., Gapon A.A., Nikolov O.T. Effects of millimeter-wave electromagnetic exposure on the morpho- logy and function of human cryopreserved spermatozoa // Bull. Exp. Biol. Med. – 2014. – Vol. 157, №5. – P. 574–576. 29.Volkova N.А., Yukhta M.S., Yurchuk Т.А. et al. Multipotent mesenchymal stromal cells of bone marrow in therapy of chronic inflammation of the murine ovaries // Biotechnologia Acta. – 2014. – Vol. 7, №5. – P. 35–42. 30.Zhang J.M., Li L.X., Yang Y.X. et al. Is caspase inhibition a valid therapeutic strategy in cryopreservation of ovarian tissue? // J. Assist. Reprod. – 2009. – Vol. 26, №7. – P. 415– 420. 13.Keros V., Hultenby K., Borgstrom B. et al. Methods of cryopre- servation of testicular tissue with viable spermatogonia in pre- pubertal boys undergoing gonadotoxic cancer treatment. Hum Reprod 2007; 22(5): 1384–1395. 14.Keros V., Rosenlund B., Hultenby K. et al. Optimizing cryopreser- vation of human testicular tissue: comparison of protocols with glycerol, propanediol and dimethylsulphoxide as cryoprotectants. Hum Reprod 2005; 20(6): 1676–1687. 15.Kim K.J., Lee Y.A., Kim B.J. et al. Cryopreservation of putative pre-pubertal bovine spermatogonial stem cells by slow freezing. Cryobiology 2015; 70(2): 175–183. 16.Kuleshova L.G., Gordienko E.A., Kovalenko I.F. Permeability of plasma membranes of rat hepatocytes for water molecules in a non-isotonic medium of electrolytes. Biophysical Bulletin 2002; 11(2): 39–42. 17.Lee Y.A., Kim Y.H., Ha S.J. et al. Cryopreservation of porcine spermatogonial stem cells by slow-freezing testis tissue in trehalose1. J Anim Sci 2014; 92(3): 984–995. 18.Methods of clinical and experimental research in medicine / Ed. I.P. Kaidasheva. Poltava; 2003. 19.Moss A.C., Higgins A.Z. Investigating the potential for cryopreser- vation of human granulocytes with concentrated glycerol. Cryo- biology 2016; 72(3): 290–293. 20.Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65(1–2): 55–63. 21.Onofre J., Baert Y., Faes K., Goossens E. Cryopreservation of testicular tissue or testicular cell suspensions: a pivotal step in fertility preservation. Hum Reprod Update 2016; 22(6): 744–761. 22.Pelufo V., Lopez Armengol M.F., Malcotti V. et al. Effects of glycerol and sugar mixing temperature on the morphologic and functional integrity of cryopreserved ram sperm. Theriogenology 2015; 83(1): 144–151. 23.Poirot C., Schubert B. Fertility preservation in prepubertal children. Bull Cancer 2011; 98(5): 489–499. 24.Pushkar N.S., Shrago M.I., Belous A.M., Kalugin Yu.V. Cryopro- tectors. Kyiv: Naukova Dumka; 1978. 25.Rajotte R.V. Islet cryopreservation protocols. Ann N Y Acad Sci 1999; 875(1): 200–207. 26.Smolyaninova E.I., Khromenkova O.B., Zhernoklev G.V., Pish- ko O.V. Effect of equilibration in the freezing environment on osmotic stability and viability of mouse 8-cell embryos. Probl Cryobiol 2004; 1: 3–11. 27.Unni S., Kasiviswanathan S., D'Souza S. et al. Efficient cryopre- servation of testicular tissue: effect of age, sample state, and concentration of cryoprotectant. Fertil Steril 2012; 97: 200-8.e201. 28.Volkova N.A., Pavlovich E.V., Gapon A.A., Nikolov O.T. Effects of millimeter-wave electromagnetic exposure on the morphology and function of human cryopreserved spermatozoa. Bull Exp Biol Med 2014; 157(5): 574–576. 29.Volkova N.А., Yukhta M.S., Yurchuk Т.А. et al. Multipotent mesenchymal stromal cells of bone marrow in therapy of chronic inflammation of the murine ovaries. Biotechnologia Acta 2014; 7(5): 35–42. 30.Zhang J.M., Li L.X., Yang Y.X. et al. Is caspase inhibition a valid therapeutic strategy in cryopreservation of ovarian tissue? J Assist Reprod 2009; 26(7): 415–420. 218 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 3, 2017

Експозиція звитих канальців сім'яників статевонезрілих щурів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу

Репозитарії

Схожі ресурси