Вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність

На сьогодні єдина ефективна технологія тривалого зберігання метаболіт-вмісних продуктів мікробного походження остаточно не розроблена. Інформація щодо переваг та доцільності застосування того чи того методу зберігання таких продуктів у наукових літературних джерелах відсутня. Визначення оптимальни...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2017
Автори:	Ісаєнко, О.Ю., Книш, О.В., Бабич, Є.М., Компанієць, А.М., Осецький, О.І., Полянська, В.П., Зачепило, С.В.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2017
Назва видання:	Проблемы криобиологии и криомедицины
Теми:	Теоретическая и экспериментальная криобиология
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138380
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність / О.Ю. Ісаєнко, О.В.Книш, Є.М. Бабич, А.М. Компанієць, О.І. Осецький, В.П. Полянська, С.В. Зачепило // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2017. — Т. 27, № 4. — С. 311–321. — Бібліогр.: 27 назв. — укр., англ.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-138380
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1383802018-06-19T03:07:20Z Вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність Ісаєнко, О.Ю. Книш, О.В. Бабич, Є.М. Компанієць, А.М. Осецький, О.І. Полянська, В.П. Зачепило, С.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология На сьогодні єдина ефективна технологія тривалого зберігання метаболіт-вмісних продуктів мікробного походження остаточно не розроблена. Інформація щодо переваг та доцільності застосування того чи того методу зберігання таких продуктів у наукових літературних джерелах відсутня. Визначення оптимальних умов дозволить уникати втрати біологічної активності метаболітів під час зберігання як на етапах наукових досліджень, так і на виробництві. У роботі отримували метаболіти шляхом відділення від продуцентів за допомогою центрифугування та фільтрації після культивування пробіотиків у рідкому поживному середовищі. Досліджено протимікробну активність фільтратів культуральних рідин пробіотиків із різними посівними дозами одразу після отримання та зберігання протягом 60 діб у рідкому стані за температури (4 ± 1)°С, у замороженому стані при (–23 ± 1)°С та в ліофілізованому стані за гіпотермічних умов ((4 ± 1)°С). Встановлено, що зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків у вищезазначених умовах не призводить до суттєвого зниження їхньої протимікробної активності. Отримані результати можуть бути використані під час створення комерційних препаратів метабіотиків. На сегодняшний день единственная эффективная технология длительного хранения метаболит-содержащих продуктов микробного происхождения окончательно не разработана. Информация о преимуществах и целесообразности применения того или иного метода хранения таких продуктов в научных литературных источниках отсутствует. Определение оптимальных условий хранения позволит избежать потери биологической активности метаболитов при хранении как на этапах научных исследований, так и на производстве. В работе получали метаболиты путем отделения от продуцентов с помощью центрифугирования и фильтрации после культивирования пробиотиков в жидкой питательной среде. Исследовали противомикробную активность фильтратов культуральных жидкостей пробиотиков с разными посевными дозами сразу после получения и хранения в течение 60 суток в жидком состоянии при температуре (4 ± 1)°С, в замороженном состоянии при (–23 ± 1)°С и в лиофилизированном состоянии в условиях гипотермии ((4 ± 1)°С). Установлено, что хранение фильтратов бульонных культур пробиотиков в вышеупомянутых условиях не приводит к существенному снижению или потере проти- вомикробной активности продуктов их метаболизма. Полученные результаты могут быть использованы при создании коммерческих препаратов метабиотиков. Nowadays there is no standard efficient technology for long-term storage of metabolite-containing products of microbial origin as well as no data about the advantages and expediency of using one or another method of storage for these products. Determining the optimal storage conditions will prevent the loss of biological activity of metabolites during storage both for scientific research and production. Metabolites were obtained by isolation from the producers by means of centrifugation and filtration after culturing probiotics in a liquid nutrient medium. We studied antimicrobial activity of filtrates of probiotic culture liquids with various inoculation doses right after obtaining and storage for 60 days in liquid, frozen and frozen-dried state at (4 ± 1)°C, (–23 ± 1)°C and under hypothermic conditions (4 ± 1)°C, respectively. The storage of probiotic broth culture filtrates under the mentioned above conditions did not result in a significant reduction of their antimicrobial activity. The obtained results can be used when developing commercial metabiotics. 2017 Article Вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність / О.Ю. Ісаєнко, О.В.Книш, Є.М. Бабич, А.М. Компанієць, О.І. Осецький, В.П. Полянська, С.В. Зачепило // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2017. — Т. 27, № 4. — С. 311–321. — Бібліогр.: 27 назв. — укр., англ. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138380 577.18.03/04:615.372 uk Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология
spellingShingle	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Ісаєнко, О.Ю. Книш, О.В. Бабич, Є.М. Компанієць, А.М. Осецький, О.І. Полянська, В.П. Зачепило, С.В. Вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність Проблемы криобиологии и криомедицины
description	На сьогодні єдина ефективна технологія тривалого зберігання метаболіт-вмісних продуктів мікробного походження остаточно не розроблена. Інформація щодо переваг та доцільності застосування того чи того методу зберігання таких продуктів у наукових літературних джерелах відсутня. Визначення оптимальних умов дозволить уникати втрати біологічної активності метаболітів під час зберігання як на етапах наукових досліджень, так і на виробництві. У роботі отримували метаболіти шляхом відділення від продуцентів за допомогою центрифугування та фільтрації після культивування пробіотиків у рідкому поживному середовищі. Досліджено протимікробну активність фільтратів культуральних рідин пробіотиків із різними посівними дозами одразу після отримання та зберігання протягом 60 діб у рідкому стані за температури (4 ± 1)°С, у замороженому стані при (–23 ± 1)°С та в ліофілізованому стані за гіпотермічних умов ((4 ± 1)°С). Встановлено, що зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків у вищезазначених умовах не призводить до суттєвого зниження їхньої протимікробної активності. Отримані результати можуть бути використані під час створення комерційних препаратів метабіотиків.
format	Article
author	Ісаєнко, О.Ю. Книш, О.В. Бабич, Є.М. Компанієць, А.М. Осецький, О.І. Полянська, В.П. Зачепило, С.В.
author_facet	Ісаєнко, О.Ю. Книш, О.В. Бабич, Є.М. Компанієць, А.М. Осецький, О.І. Полянська, В.П. Зачепило, С.В.
author_sort	Ісаєнко, О.Ю.
title	Вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність
title_short	Вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність
title_full	Вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність
title_fullStr	Вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність
title_full_unstemmed	Вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність
title_sort	вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2017
topic_facet	Теоретическая и экспериментальная криобиология
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138380
citation_txt	Вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність / О.Ю. Ісаєнко, О.В.Книш, Є.М. Бабич, А.М. Компанієць, О.І. Осецький, В.П. Полянська, С.В. Зачепило // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2017. — Т. 27, № 4. — С. 311–321. — Бібліогр.: 27 назв. — укр., англ.
series	Проблемы криобиологии и криомедицины
work_keys_str_mv	AT ísaênkooû vplivumovzberígannâfílʹtratívbulʹjonnihkulʹturprobíotikívnaíhnûprotimíkrobnuaktivnístʹ AT knišov vplivumovzberígannâfílʹtratívbulʹjonnihkulʹturprobíotikívnaíhnûprotimíkrobnuaktivnístʹ AT babičêm vplivumovzberígannâfílʹtratívbulʹjonnihkulʹturprobíotikívnaíhnûprotimíkrobnuaktivnístʹ AT kompaníêcʹam vplivumovzberígannâfílʹtratívbulʹjonnihkulʹturprobíotikívnaíhnûprotimíkrobnuaktivnístʹ AT osecʹkijoí vplivumovzberígannâfílʹtratívbulʹjonnihkulʹturprobíotikívnaíhnûprotimíkrobnuaktivnístʹ AT polânsʹkavp vplivumovzberígannâfílʹtratívbulʹjonnihkulʹturprobíotikívnaíhnûprotimíkrobnuaktivnístʹ AT začepilosv vplivumovzberígannâfílʹtratívbulʹjonnihkulʹturprobíotikívnaíhnûprotimíkrobnuaktivnístʹ
first_indexed	2025-07-10T05:41:26Z
last_indexed	2025-07-10T05:41:26Z
_version_	1837237368500781056
fulltext	УДК 577.18.03/04:615.372 О.Ю. Ісаєнко1, О.В.Книш1, Є.М. Бабич1, А.М. Компанієць2, О.І. Осецький2, В.П. Полянська3, С.В. Зачепило3 Вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність UDC 577.18.03/04:615.372 O.Yu. Isaienko1, O.V. Knysh1, Ye.M. Babych1, A.M. Kompaniets2, O.I. Osetsky2, V.P. Polianska3, S.V. Zachepylo3 Influence of Storage of Probiotic Broth Culture Filtrates on Their Antimicrobial Activity Реферат: На сьогодні єдина ефективна технологія тривалого зберігання метаболіт-вмісних продуктів мікробного походження остаточно не розроблена. Інформація щодо переваг та доцільності застосування того чи того методу зберігання таких продуктів у наукових літературних джерелах відсутня. Визначення оптимальних умов дозволить уникати втрати біологічної активності метаболітів під час зберігання як на етапах наукових досліджень, так і на виробництві. У роботі отримували метаболіти шляхом відділення від продуцентів за допомогою центрифугування та фільтрації після культивування пробіотиків у рідкому поживному середовищі. Досліджено протимікробну активність фільтратів культуральних рідин пробіотиків із різними посівними дозами одразу після отримання та зберігання протягом 60 діб у рідкому стані за температури (4 ± 1)°С, у замороженому стані при (–23 ± 1)°С та в ліофілізованому стані за гіпотермічних умов ((4 ± 1)°С). Встановлено, що зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків у вищезазначених умовах не призводить до суттєвого зниження їхньої протимікробної активності. Отримані результати можуть бути використані під час створення комерційних препаратів метабіотиків. Ключові слова: пробіотики, Lactobacillus rhamnosus GG, Saccharomyces boulardii, продукти метаболізму, протимікробна активність, заморожування, ліофілізація. Реферат: На сегодняшний день единственная эффективная технология длительного хранения метаболит-содержащих продуктов микробного происхождения окончательно не разработана. Информация о преимуществах и целесообразности применения того или иного метода хранения таких продуктов в научных литературных источниках отсутствует. Определение оптимальных условий хранения позволит избежать потери биологической активности метаболитов при хранении как на этапах научных исследований, так и на производстве. В работе получали метаболиты путем отделения от продуцентов с помощью центрифугирования и фильтрации после культивирования пробиотиков в жидкой питательной среде. Исследовали противомикробную активность фильтратов культуральных жидкостей пробиотиков с разными посевными дозами сразу после получения и хранения в течение 60 суток в жидком состоянии при температуре (4 ± 1)°С, в замороженном состоянии при (–23 ± 1)°С и в лиофилизированном состоянии в условиях гипотермии ((4 ± 1)°С). Установлено, что хранение фильтратов бульонных культур пробиотиков в вышеупомянутых условиях не приводит к существенному снижению или потере проти- вомикробной активности продуктов их метаболизма. Полученные результаты могут быть использованы при создании коммерческих препаратов метабиотиков. Ключевые слова: пробиотики, Lactobacillus rhamnosus GG, Saccharomyces boulardii, продукты метаболизма, противо- микробная активность, замораживание, лиофилизация. Abstract: Nowadays there is no standard efficient technology for long-term storage of metabolite-containing products of microbial origin as well as no data about the advantages and expediency of using one or another method of storage for these products. Determining the optimal storage conditions will prevent the loss of biological activity of metabolites during storage both for scientific research and production. Metabolites were obtained by isolation from the producers by means of centrifugation and filtration after culturing probiotics in a liquid nutrient medium. We studied antimicrobial activity of filtrates of probiotic culture liquids with various inoculation doses right after obtaining and storage for 60 days in liquid, frozen and frozen-dried state at (4 ± 1)°C, (–23 ± 1)°C and under hypothermic conditions (4 ± 1)°C, respectively. The storage of probiotic broth culture filtrates under the mentioned above conditions did not result in a significant reduction of their antimicrobial activity. The obtained results can be used when developing commercial metabiotics. Key words: probiotics, Lactobacillus rhamnosus GG, Saccharomyces boulardii, metabolic products, antimicrobial activity, freezing, freeze-drying. Автор, якому необхідно надсилати кореспонденцію: вул. Переяславська, 23, м. Харків, Україна 61016; тел.: (+38 057) 373-74-35, факс: (+38 057) 373-59-52, електронна пошта: journal@cryo.org.ua To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavska str., Kharkiv, Ukraine 61016; tel.:+380 57 3737435, fax: +380 57 373 5952, e-mail: journal@cryo.org.ua 1Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of the Na- tional Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kharkiv, Ukraine 2Laboratory of Cryoprotectants, Institute for Problems of Cryobio- logy and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, Ukraine 3Ukrainian Medical Stomatological Academy, Poltava, Ukraine 1ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова НАМН України», м. Харків, Україна 2Лабораторія кріопротекторів, Інститут проблем кріобіології і кріо- медицини НАН України, м. Харків 3Вищий державний навчальний заклад України «Українська ме- дична стоматологічна академія», м. Полтава, Україна Надійшла 13.09.2017 Прийнята до друку 09.10.2017 Received October, 13, 2017 Accepted November, 09, 2017 оригінальне дослідження research article Probl Cryobiol Cryomed 2017; 27(4): 311–321 https://doi.org/10.15407/cryo27.04.311 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0), which permits unrestricted reuse, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. © 2017 O.Yu. Isaienko et al., Published by the Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine 312 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 4, 2017 Одним із основних механізмів дії пробіотиків є антагоністична активність по відношенню до умов- но-патогенних та облігатно-патогенних мікроор- ганізмів. Вона реалізується завдяки здатності пробіо- тичних бактерій продукувати метаболіти – органічні кислоти, коротколанцюгові жирні кислоти, перекис водню, спирти та антибактеріальні речовини біл- ково-пептидної природи (лізоцим, бактеріоцини тощо) [8, 18, 21, 26]. Однак низький рівень вижи- вання (20–40%) екзогенних пробіотиків у шлунково- кишковому тракті пацієнта не дозволяє їм повною мірою реалізувати власний пробіотичний потенціал і обумовлює необхідність застосування додаткових засобів їхнього захисту – кислотостійких капсул або мікропористих носіїв (сорбентів) [5, 15, 20]. Крім того, одночасний прийом пробіотика та анти- біотика можливий тільки за наявності у пробіо- тичного мікроорганізму резистентності до призна- ченого антибактеріального препарату. У зв’язку з цим лікування пробіотичними препаратами на основі живих бактерій пов’язане з ризиком розпов- сюдження генів антибіотикорезистентності в мікро- біомі людини, що суперечить вимогам лікарської безпеки [25]. Всупереч поширеній думці про те, що лікування пробіотиками абсолютно безпечне, в наукових літературних джерелах повідомляється про випадки виникнення серйозних побічних ефек- тів внаслідок клітинної пробіотикотерапії [20]. Зас- тосування виключно метаболітів бактерій – біоло- гічно активних речовин, які забезпечують основні ефекти пробіотиків, дозволяє уникнути низки недо- ліків клітинної пробіотикотерапії та може розгля- датися не тільки як замісна терапія при дисбіозах. У деяких випадках метабіотики (пробіотичні пре- парати, які містять метаболіти пробіотиків) можуть стати альтернативою антибіотикам [3, 16, 17, 20, 24]. Зазвичай метаболіти отримують під час культи- вування пробіотика в рідкому поживному середо- вищі з наступним відділенням від продуцента культуральної рідини, який містить продукти обміну [4, 7, 13, 22]. Останні представляють собою біомо- лекули, які під впливом різних чинників можуть зазнавати структурних змін, що, у свою чергу, при- водить до змін біологічної активності. Очевидно, що під час дослідження зразків одразу після їх одержання спостерігатиметься мінімальна зміна біологічної активності метаболітів. Однак одразу після отримання зразків не завжди є можливість одночасного проведення різних видів досліджень або вивчення великої кількості зразків, які містять біологічно активні речовини. У таких випадках постає потреба у створенні оптимальних умов для збереження біологічно активного потенціалу про- дуктів метаболізму. Стабільність біологічної актив- ності продуктів метаболізму має велике значення також при виробництві метабіотиків, оскільки з One of the main mechanisms of probiotic effect is an antagonistic activity against the opportunistic and obligatory pathogenic microorganisms. It is imple- mented due to the capability of probiotic bacteria to produce the metabolites, i. e. organic acids, short-chain fatty acids, hydrogen peroxide, alcohols and antibac- terial substances of protein-peptide origin (lysozyme, bacteriocins, etc.) [6, 9, 11, 24]. Nevertheless, a low survival (20–40%) of exogenous probiotics in patient’s gastrointestinal tract does not allow them to fully im- plement their own probiotic potential and necessitates the use of additional means for their protection, such as the acid-resistant capsules or microporous carriers (sorbents) [19, 26, 27] In addition, a simultaneous administration of probiotic and antibiotic is only pos- sible if a probiotic microorganism is resistant to the prescribed antibacterial drug. In this context the the- rapy with the live bacteria-based probiotic drugs is associated with the risk of spreading of antibiotic resistance genes in human microbiome, contradicting to the medical safety requirements [8]. In contrast to the common belief that the therapy with probiotics is completely safe, there are the reports about the cases of severe side-effects due to cellular probiotic the- rapy [26]. Application of bacterial metabolites only, i. e. the biologically active substances, providing the main effects of probiotics, enables to mitigate cer- tain disadvantages of cell probiotic therapy and may be considered not only as the substitution therapy in dysbiosis. In some cases, the metabiotics (probiotic drugs, containing probiotic metabolites) may be the alternative to antibiotics [4, 7, 20, 23, 26]. Usually, the metabolites are obtained during pro- biotic culturing in a liquid nutrient medium with a subsequent isolation of culture liquid with the meta- bolic products from a producer [5, 10, 17, 21]. These include the biomolecules, which can be structurally changed under the effect of various factors, that, in turn, results in changes in biological activity. Obviou- sly, the assessment of specimens right after obtai- ning will show only the minimum change in biological activity of metabolites. However, a simultaneous performance of different researches or using a big number of specimens, containing biologically active substances, is not always possible just after specimen obtaining. In these cases, there is a need in creating the optimal conditions to preserve the biologically active potential of metabolic products. The stability of biological activity of metabolic products is of great importance in production of metabiotics as well, since they can be stored for a long time from the time of their obtaining up to the intake by a patient. No- wadays there is no standard technology for storage of the metabolites either for scientific research or for production of drugs containing the metabolites. The technology of metabolite obtaining mostly determi- проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 4, 2017 313 моменту отримання до вживання пацієнтом вони можуть підлягати тривалому зберіганню. Наразі відсутня єдина технологія зберігання метаболітів як на етапах наукових досліджень, так і при вироб- ництві препаратів на основі метаболітів. Здебіль- шого технологія отримання метаболітів визначає подальший спосіб зберігання. Якщо отримання продуктів метаболізму передбачає концентруван- ня фільтрату культуральної рідини пробіотика ліофільним висушуванням, то метаболіти збері- гають у сухому стані [4, 7]. В.А. Несчисляєв та Л.П. Чистохіна [22] пропонують зберігати ультра- фільтрати культуральних рідин після термічної стабілізації у рідкому стані. З метою забезпечення стабільних властивостей рідких метаболітних пробіотиків упродовж тривалого терміну до їхнього складу при виробництві вводять стабілізатори та консерванти [3]. Однак введення додаткових хімічних сполук до отриманих метаболітів на етапах наукових досліджень є неприйнятним, оскільки це може вплинути на результати. У такому разі вини- кає необхідність застосування інших способів збе- реження їхніх початкових властивостей. Порів- няльні дослідження впливу різних умов зберігання на біологічну активність продуктів метаболізму пробіотиків раніше не проводилися. Мета даної роботи – оцінка та порівняння проти- мікробного потенціалу фільтратів бульйонних куль- тур пробіотиків Lactobacillus rhamnosus GG та Saccharomyces boulardii за різних умов зберігання. Матеріали та методи У якості продуцентів метаболітів у роботі були використані гриби Saccharomyces boulardii з про- біотичного препарату «BULARDI®» («Schonen», Швейцарія) та пробіотичний штам Lactobacillus rhamnosus GG з симбіотику «PREEMA®» («Scho- nen»). Протимікробну активність метаболітів вив- чали на тест-культурах: циркулюючих штамах, які зберігаються в колекції мікроорганізмів лабо- раторії профілактики краплинних інфекцій (ДУ «ІМІ НАМН», Україна) та референс-штамах, отри- маних із Музею мікроорганізмів (ДУ «ІМІ НАМН») (Staphylococcus epidermidis №558, Staphylococcus aureus AТСС 25923, Corynebacterium xerosis №41, Corynebacterium diphtheriae gravis tox+ №11, Pseu- domonas aeruginosa AТСС 27853). Мікроорга- нізми вирощували на сприятливих для них поживних середовищах: 1%-й цукровий м’ясо-пептонний бульйон (цМПБ), м’ясо-пептонний агар (МПА), жовтково-сольовий агар (ЖСА), кров’яно-телури- товий агар (КТА) [23]. Синхронізацію культур здійс- нювали шляхом витримки в гіпотермічних умовах ((4 ± 1)°С) упродовж 30 хв [1]. Отримання метаболітів. Із добових культур пробіотичних штамів лактобактерій та сахаромі- nes the further way of their storage. If the obtaining of metabolic products involves the concentration of probiotic culture liquid filtrate by freeze-drying, then the metabolites will be stored in a dry state [5, 10]. V.A. Neschislyayev and L.P. Chistokhina [21] pro- posed to store the ultrafiltrates of culture filtrates after thermal stabilization in a liquid state. In order to pre- serve the properties of liquid metabolic probiotics for a long time, they are supplemented with stabilizers and preservatives during their production [4]. Howe- ver, the introduction of additional chemical compounds to the obtained metabolites for research purposes is unacceptable, since this may corrupt the obtained data. In this case, there is a need to use the other ways to preserve their initial properties. The effect of diffe- rent storage conditions on biological activity of meta- bolic products of probiotics have not been compa- ratively studied previously. This research was aimed to assess and compa- re an antimicrobial potential of broth culture filtrates of probiotics Lactobacillus rhamnosus GG and Sac- charomyces boulardii under different storage con- ditions. Materials and methods We used here the Saccharomyces boulardii iso- lated from the probiotic product BULARDI® (Scho- nen, Switzerland) and the probiotic strain Lactoba- cillus rhamnosus GG from the symbiotic PREEMA® (Schonen) as metabolite producers. An anti-microbial activity of metabolites was studied in the test cultures, i. e. the circulating strains, stored in the microorga- nism collection of the laboratory for prevention of droplet infections (Mechnikov Institute of Microbio- logy and Immunology of the NAMS of Ukraine) and the reference strains, obtained from the Museum of Microorganisms (Mechnikov Institute of Microbio- logy and Immunology of the NAMS of Ukraine) (Staphylococcus epidermidis №558, Staphylo-coc- cus aureus ATSC 25923, Corynebacterium xerosis №41, Corynebacterium diphtheriae gravis tox+ №11, Pseudomonas aeruginosa ATSC 27853). Microor- ganisms were grown in favorable nutrient media, i. e. 1% sugar meat-peptone broth (sMPB), meat-peptone agar (MPA), yolk-salt agar (YSA), blood-telurite agar (BTA) [1]. The cultures were synchronized by exposure under hypothermic conditions ((4 ± 1)°C) for 30 min [2]. Metabolite obtaining. Cell suspensions with op- tical density of 1.0; 5.0; 10.0 McFarland standard were prepared from the daily cultures of probiotic strains of lactobacilli and Saccharomyces, then assessed with Densi-La-Meter (Lachema, Czech Republic) de- vice. The prepared suspensions were inoculated in 1% sMPB in 1:9 ratio. Probiotic microorganisms were cultured within 48 hrs at (37 ± 1)°С. Broth cultures 314 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 4, 2017 цетів готували суспензії клітин із оптичною густи- ною 1,0; 5,0; 10,0 одиниць за шкалою МакФарланда, яку вимірювали за допомогою приладу «Densi-La- Meter» («Lachema», Чехія). Приготовані суспензії інокулювали в 1%-й цМПБ у співвідношенні 1:9. Три- валість культивування пробіотичних мікроорганіз- мів складала 48 годин за температури (37 ± 1)°С. Бульйонні культури центрифугували при 1000g упродовж 30 хв. Супернатант фільтрували за допомо- гою стерильних мембранних фільтратів із діаметром пор 0,2 мкм («Владіпор», Росія). Зберігання метаболітів. Фільтрати бульйонних культур пробіотиків із посівною дозою 10 одиниць за шкалою МакФарланда (свіжовиділені) після дослідження їхньої протимікробної активності зберігали протягом 60 діб: у рідкому стані за тем- ператури (4 ± 1)°С (холодове зберігання); у замо- роженому стані при (–23 ± 1)°С (заморожені); у ліофілізованому стані за умов гіпотермії ((4 ± 1)°С) (ліофілізовані). Заморожування здійснювали пасивним охолод- женням зразків фільтратів у морозильній камері холодильника «Samsung RB29FSRNDSA» («Sam- sung», Південна Корея) до температури (–23 ± 1)°С. Ліофільне висушування дослідних зразків, поміще- них у пластикові флакони ємністю 20 мл, проводили на устаткуванні «УЗВ-10» виробництва СКТБ із ДВ ІПКіК НАН України. Флакони зі зразками охо- лоджували безпосередньо у сублімаційній камері у спеціальних алюмінієвих касетах. Процес ліофілі- зації починався при досягненні температури –20°С і тривав протягом 14–16 годин при середньому тиску в камері 102 Па. Залишкова вологість зразків не перевищувала 5%. Для забезпечення стериль- ності зразків флакони переміщували в пакувальний бокс під впливом ультрафіолетового випроміню- вання. Ліофільно висушені зразки зберігали у гер- метичних пластикових флаконах. Перед досліджен- ням протимікробної активності заморожені зразки розморожували на водяній бані за температури (37 ± 1)°С до повного відтавання. Регідратацію ліо- філізованих зразків проводили в асептичних умо- вах шляхом додавання дистильованої води протя- гом 10 хв, доводячи об'єм зразка до початкового значення. Фільтрати бульйонних культур пробіотиків із посівною дозою 1 (А) та 5 (В) одиниць за шкалою МакФарланда після дослідження їхньої протимік- робної активності зберігали протягом 60 діб у замороженому стані за температури (–23 ± 1)°С. Дослідження протимікробної активності метаболітів. Якісний метод. Дослідження про- водили у рідкому середовищі (фільтраті культу- ральної рідини пробіотика) одразу після отримання та зберігання у вищезазначених умовах упродовж 60 діб. Дослідні зразки отримували шляхом дода- were centrifuged at 1000g for 30 min. The superna- tant was filtered with the sterile membrane filters with 0.2 µm pore diameter (Vladipor, Russia). Metabolite storage. The filtrates of broth probiotic cultures with the inoculation dose of 10 McFarland standard (freshly isolated) after studying their antimic- robial activity were stored for 60 days in a liquid state at (4 ± 1)°C (cold storage); in a frozen state at (–23 ± 1)°C (frozen); in a frozen-dried state under hypothermia ((4 ±1)°C) (frozen-dried). Freezing was performed with a passive cooling of filtrated specimens in freezing chamber of refri- gerator Samsung RB29FSRNDSA (Samsung, South Korea) down to (–23 ± 1)°C. The experimental spe- cimens were placed into 20 ml plastic flasks and fro- zen-dried with the UZV-10 device, manufactured by the Special Designing and Technical Bureau with Experimental Unit at the Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the NAS of Uk- raine. Flasks with the specimens were cooled direc- tly in a sublimation chamber in the special alumi- num cassettes. The freeze-drying started when the temperature reached –20°C and lasted for 14–16 hrs at an average chamber pressure of 102 Pa. The residual humidity of specimens did not exceed 5%. To ensu- re the specimen sterility the flasks were transferred into the packaging box under ultraviolet radiation. The frozen-dried samples were stored in the sealed plas- tic flasks. Before analyzing the antimicrobial activity the frozen specimens were thawed in a water bath at (37 ± 1)°C up to a complete thawing. The frozen- dried specimens were rehydrated under aseptic con- ditions via supplementing with distilled water wi- thin 10 min, bringing the specimen volume up to its initial value. After studying antimicrobial activity the filtrates of broth probiotic cultures with inoculation dose of 1 (A) and 5 (B) McFarland standard were stored for 60 days in a frozen state at (–23 ± 1)°C. Study of antimicrobial activity of metabolites. Qualitative method. The research was carried out in a liquid medium (filtrate of probiotic culture liquid) right after obtaining and storage under the men- tioned above conditions for 60 days. The experimen- tal specimens were obtained via supplementing bac- terial suspensions of test cultures of 1.0 McFarland standard to the probiotic culture liquid filtrates in the 1:9 ratio. The control samples contained the cor- responding test culture and 1% sMPB. Experimental and control specimens were incubated at (37 ± 1)°C for 24 and 48 hrs. The medium turbidity testified to the test culture growth. In the case if the medium remained transparent, the following inoculation was carried out to a solid nutrient medium: MPA, YSA or BTA (depending on test culture). The presence of growth on a solid nutrient medium indicated a bacte- проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 4, 2017 315 вання бактеріальних суспензій тест-культур із оп- тичною густиною 1,0 за шкалою МакФарланда до фільтратів культуральних рідин пробіотиків у спів- відношенні 1:9. Контрольні зразки містили відпо- відну тест-культуру та 1% цМПБ. Дослідні та конт- рольні зразки інкубували за температури (37 ± 1)°С протягом 24 та 48 годин. Помутніння середовища свідчило про ріст тест-культури. У випадку, якщо середовище залишалося прозорим, висів із нього здійснювали на тверде поживне середовище – МПА, ЖСА або КТА (залежно від тест-культури). Наявність росту на твердому поживному середовищі свідчила про бактеріостатичний ефект фільтрату по відношенню до тест-культури, а його відсутність – про його бактерицидну дію. Кількісний метод. Протимікробну активність метаболітів оцінювали за показником кількості жит- тєздатних мікроорганізмів тест-штаму (КУО) в одиниці об’єму фільтратів після добової експозиції. Дослідні та контрольні зразки готували за допомо- гою якісного методу. Через 24 години експозиції з дослідних та контрольних зразків готували послі- довні розведення, з яких здійснювали висів 0,1 мл рідини на поверхню відповідного твердого пожив- ного середовища. Посіви культивували за темпера- тури (37 ± 1)°С. Через добу підраховували кількість колоній, які виросли, та визначали кількість КУО в одиниці об’єму дослідного матеріалу, яку виражали в десятковому логарифмі КУО/мл. Усі експерименти проводили в чотирьох пов- торах. Визначали середні значення отриманих по- казників та їх стандартні похибки. Значущість різ- ниці між отриманими показниками визначали за допомогою критерію Стьюдента. Статистичну об- робку результатів досліджень здійснювали з вико- ристанням програмного пакету «Microsoft Excel 2010» («Microsoft», США). Результати та обговорення На першому етапі експериментальної роботи вивчали вплив умов зберігання фільтратів бульйон- них культур пробіотиків із посівною дозою 10,0 оди- ниць за шкалою МакФарланда на їхню протимік- робну активність із застосуванням якісного методу оцінки. Обрана посівна доза пробіотиків забезпечує високу протимікробну активність фільтратів, що обумовлено накопиченням у культуральному сере- довищі метаболітів із протимікробною дією у дос- татньо високій концентрації [9, 10]. Як показали результати досліджень, фільтрати 48-годинних бульйонних культур лактобактерій одразу після отримання виявляють бактерицидну дію по відношенню до усіх обраних тест-культур (табл. 1). Дослідження протимікробної активності фільтратів, які перенесли зберігання у гіпотермічних умовах, замороженому та ліофілізованому стані, riostatic effect of the filtrate against the test culture, and its total absence evidenced an antibacterial effect. Quantitative method. An antimicrobial activity of metabolites was assessed by the index of viable micro- organism number of test strain (CFUs) per unit volume of filtrates after daily exposure. Experimental and control specimens were prepared using the qualitative method. After a 24-hour exposure the studied and control speci- mens were successively diluted, and 0.1 ml of liquid was inoculated to the surface of corresponding solid nutrient medium. The seeded samples were cultured at (37 ± 1)°C. One day later we calculated the number of grown colonies and determined the number of CFUs per unit volume of the studied material, expressed as the common logarithm of CFUs/ml. All the experiments were repeated 4 times. The mean values of the obtained indices and their stan- dard errors were determined. The significance of dif- ference between the obtained indices was determined using the Student’s t-test. The results were statisti- cally processed with the Microsoft Excel 2010 soft- ware (Microsoft, USA). Results and discussion At the first stage of research we studied the effect of storage conditions of broth probiotic culture filtrates with inoculation dose of 10.0 McFarland standard on their antimicrobial activity using the qualitative method for estimation. The selected inoculation dose for probiotics provided a high antimicrobial activity of filt- rates due to accumulation in the culture medium of metabolites with antimicrobial effect in quite a high concentration [13, 14]. Our findings demonstrated the filtrates of 28-hour broth cultures of lactobacilli as manifesting an antibac- terial effect against all the selected test cultures right after obtaining (Table 1). The study of antimicrobial activity of the filtrates, stored under hypothermic condi- tions, in frozen and frozen-dried states demonstrated the preservation of their antibacterial activity at the level of filtrate activity prior to storage. Filtrates of 48-hour broth cultures of Saccharo- myces right after obtaining demonstrated a bacterios- tatic effect on staphylococcal test cultures during 24- and 48-hour exposures (Table 2). The growth of the Pseudomonas aeruginosa culture was suppressed during the first 24 hrs of exposure in freshly isola- ted filtrate, being absent 48 hrs post exposure. An antibacterial effect of filtrates against the corynebacteria was observed both 24 and 48 hrs post exposures. We established the fact that the storage under hypothermic conditions, freezing and freeze-drying had no effect on the nature of antimicrobial activity of broth culture filt- rates of Saccharomyces against the selected test cultures. The findings of the first research stage suggested the metabolic products, associated with an antimicrobial 316 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 4, 2017 показало збереженість їхньої бактерицидної актив- ності на рівні активності фільтратів до зберігання. Фільтрати 48-годинних бульйонних культур сахароміцетів одразу після отримання виявляють бактеріостатичну дію на тест-культури стафілоко- ків протягом 24 та 48 годинної експозиції (табл. 2). Ріст культури Рseudomonas aeruginosa пригні- чується протягом перших 24 годин витримки у свіжовиділеному фільтраті та відсутній після 48-годинної експозиції. Бактерицидний ефект фільтратів по відношенню до коринебактерій спос- терігається як через 24, так і після 48 годин експо- зиції. У результаті досліджень встановлено, що зберігання за гіпотермічних умов, заморожування та ліофілізація не впливають на характер проти- мікробної активності фільтратів бульйонних куль- тур сахароміцетів по відношенню до обраних тест- культур. Отримані на першому етапі досліджень резуль- тати свідать про те, що продукти метаболізму, з якими пов’язують протимікробну активність куль- туральної рідини пробіотиків, добре переносять хо- лодове зберігання, заморожування-відтавання та ліофільне висушування. Підтвердження такої думки Таблиця 1. Вплив фільтратів 48-годинних бульйонних культур Lactobacillus rhamnosus GG, які зберігалися за різних умов, на життєздатність тест-культур стафілококів, коринебактерій та синьогнійної палички Table 1. Effect of 48-hour broth culture filtrates of Lactobacillus rhamnosus GG, stored under different conditions on staphylococci, corynebacteria and Pseudomonas aeruginosa test culture viability Примітки: «+» – ріст культури у рідкому і на твердому поживних середовищах; «–» – присутній бактерицидний ефект. Note: «+» – culture growth in liquid and solid nutrient media; «–» – antibacterial effect. activity of culture probiotic liquid, to tolerate well a cold storage, freeze-thawing and freeze-drying. This idea was confirmed earlier by other researchers. For exam- ple, proteins and peptides may be successfully stored in frozen and frozen-dried states when keeping the certain technological parameters (temperature and time regimens for each stage of freeze-drying, freezing, freeze-thawing, the minimum temperature of freezing, medium composition, specimen volume etc.) [3, 16, 18, 22]. So, quite a high level of antimicrobial potential of the studied filtrates, stored under different condi- tions, might result from a successful combination of the optimal rate of freeze-thawing, cryoprotective properties of freezing medium and low cryolabilty of biomolecu- les with antimicrobial activity. However, the antimicro- bial effect of filtrates was associated not only with the substances of protein-peptide origin. The findings of the first stage might be correctly interpreted only if only considering the changes in biochemical composi- tion of specimens during storage. Of note is the fact, that the data of the first stage could be also explained by an insufficient sensitivity of the qualitative method of evaluation, i. e. impossibility of revealing the slight differences between the antimicrobial potential of the ирутьлук-тсеТ serutluctseT ,їіцизопскесаЧ анидог rh,emiterusopxE рутьлукхиннойьлубитартьліФ GGsusonmahrsullicabotcaL setartliferutluchtorB fo GGsusonmahrsullicabotcaL БПМц BPMs інелідивожівС итартьліф ylhserF detalosi оговодолохялсіП яннагіребз egarotsdlocretfA яннавужоромазялсіП gnizeerfretfA інавозіліфоіЛ итартьліф deird-ezeerF succocolyhpatS sidimredipe 42 – – – – + 84 – – – – + succocolyhpatS suerua 42 – – – – + 84 – – – – + muiretcabenyroC sisorex 42 – – – – + 84 – – – – + muiretcabenyroC eairehthpid 42 – – – – + 84 – – – – + sanomoduesP asonigurea 42 – – – – + 84 – – – – + проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 4, 2017 317 можна знайти у роботах інших дослідників. Білки та пептиди за умови дотримання певних техноло- гічних параметрів (температурні та часові режими кожного етапу ліофілізації, заморожування, розмо- рожування, мінімальна температура заморожування, склад середовища, об’єм зразка тощо) успішно зберігають у замороженому та ліофілізованому стані [2, 12, 14, 27]. Тобто, достатньо високий рівень протимікробного потенціалу досліджених нами фільтратів, які зберігалися за різних умов, може бути результатом вдалого поєднання оптимальної швидкості заморожування та відтавання, кріозахис- них властивостей середовища заморожування та низької кріолабільності біомолекул із протимік- робною активністю. Проте протимікробна дія фільт- ратів пов’язана не тільки з речовинами білково- пептидної природи. Правильне трактування отрима- них на першому етапі результатів можливе тільки з урахуванням змін біохімічного складу зразків під час зберігання. Необхідно відмітити, що результати першого етапу досліджень можна пояснити також недостатньою чутливістю якісного методу оцінки, який не дає можливості виявити незначні відмін- ності між величиною протимікробного потенціалу досліджених фільтратів на тлі їхньої високої проти- Таблиця 2. Вплив фільтратів 48-годинних бульйонних культур Saccharomyces boulardii, які зберігалися за різних умов, на життєздатність тест-культур стафілококів, коринебактерій та синьогнійної палички Table 2. Effect of 48-hour broth culture filtrates of Saccharomyces boulardii, stored under different conditions on staphylococci, corynebacteria and Pseudomonas aeruginosa test culture viability Примітки: «+» – ріст культури у рідкому і на твердому поживних середовищах присутній; «±» – присутній бактеріостатичний ефект; «–» – присутній бактерицидний ефект. Note: «+» – culture growth in liquid and solid nutrient media; «±» – bacteriostatic effect; «–» – antibacterial effect. studied filtrates at the background of their high antimic- robial activity due to the selected inoculation dose of probiotics. We are planning to perform further experi- ments using more sensitive research methods and studying biochemical changes, which accompany the filtrate storage under different conditions. We consider the storage in a frozen state to be the most suitable method among the used ones to be applied in future scientific researches. In contrast to the storage under hypothermic conditions ((4 ± 1)°C), this method enables minimizing the damage of biomolecules by reactive oxygen species and highly reactive compounds of radical nature and preserving them in a functionally active state [12]. Freezing is simpler technological process, consuming less time, and does not require special high- value equipment, unlike freeze-drying. Therefore, at the next stage of our research we studied the effect of storage of probiotic broth culture filtrates right in a frozen state on their antimicrobial properties. Taking into account the fact that when applying the probiotic inoculation dose of 10.0 McFarland standard, no diffe- rence between an antimicrobial activity of freshly iso- lated filtrates and those, stored in a frozen state, was obtained, we decided to reduce the inoculation dose of probiotic. We assumed the use of a lower inoculation ирутьлук-тсеТ serutluctseT саЧ ,їіцизопске анидог erusopxE rh,emit рутьлукхиннойьлубитартьліФ iidraluobsecymorahccaS B fosetartliferutluchtor iidraluobsecymorahccaS БПМц BPMsінелідивожівС итартьліф detalosiylhserF оговодолохялсіП яннагіребз egarotsdlocretfA ялсіП яннавужоромаз gnizeerfretfA інавозіліфоіЛ итартьліф deird-ezeerF succocolyhpatS sidimredipe 42 ± ± ± ± + 84 ± ± ± ± + succocolyhpatS suerua 42 ± ± ± ± + 84 ± ± ± ± + muiretcabenyroC sisorex 42 – – – – + 84 – – – – + muiretcabenyroC eairehthpid 42 – – – – + 84 – – – – + sanomoduesP asonigurea 42 ± ± ± ± + 84 – – – – + 318 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 4, 2017 ною активністю свіжовиділених фільтратів та тих, які зберігалися у замороженому стані, було ви- рішено зменшити посівну дозу пробіотика. Ми припускаємо, що застосування меншої посівної дози забезпечить накопичення метаболітів у куль- туральному середовищі у меншій концентрації, а отже, нижчу початкову протимікробну активність фільтратів і вищу ймовірність виявлення її мож- ливих змін у результаті зберігання. Під час ви- бору посівних доз ми орієнтувалися на роботи інших авторів [11, 19]. Для оцінки протимікроб- ної активності фільтратів, отриманих із засто- суванням зазначених посівних доз, було обрано кількісний метод, за допомогою якого можливо виявити зниження протимікробного потенціалу фільтратів у результаті зберігання в замороже- ному стані. Таблиця 3. Протимікробна активність фільтратів 48-годинних бульйонних культур Lactobacillus rhamnosus GG із посівною дозою 1 (A) та 5 (В) одиниць за шкалою МакФарланда до та після заморожування Table 3. Antimicrobial activity of 48-hour broth culture filtrates of Lactobacillus rhamnosus GG with inoculation dose of 1 (A) and 5 (B) McFarland standard prior to and after freezing Примітки: протимікробна активність фільтратів, визначена кількісним методом: «–» – відсутність росту мікроорганізмів; * – відмінності статистично значущі відносно показників до заморожування; p < 0,05. Note: an antimicrobial activity of filtrates was determined by quantitative method: «–» – no microorganism growth; * – differences are statistically significant as compared to indices before freezing; p < 0.05. мікробної активності завдяки обраній посівній дозі пробіоти- ків. У подальшому планується проведення аналогічних експе- риментів із використанням більш чутливих методів дослідження та вивченням біохімічних змін, які супроводжують зберігання фільтратів за різних умов. Серед застосованих у роботі способів найбільш прийнятним для подальшого використання на етапах наукових досліджень ми вважаємо зберігання у заморо- женому стані. На відміну від збе- рігання в гіпотермічних умовах ((4 ± 1)°C) цей спосіб дозволяє звести до мінімуму пошкоджен- ня біомолекул активними фор- мами кисню і високореактив- ними сполуками радикальної природи та зберегти їх у функціо- нально активному стані [6]. У порівнянні з ліофілізацією, замо- рожування – це більш простий технологічний процес, який не потребує багато часу і задіяння спеціального високовартісного обладнання. Тому наступним етапом нашої роботи стало вив- чення впливу зберігання фільт- ратів бульйонних культур про- біотиків саме у замороженому стані на їхні протимікробні влас- тивості. Зважаючи на те, що при застосуванні посівної дози про- біотиків 10,0 одиниць за шка- лою МакФарланда, ми не отри- мали різниці між протимікроб- dose would ensure the accumulation of metabolites in a culture medium at a lower concentration, and hence a lower initial antimicrobial activity of filtrates and a higher probability to reveal its possible changes due to storage. When selecting the inoculation doses we followed the investigations of other authors [15, 25]. In order to evaluate an antimicrobial activity of the filtrates, obtained with applying the mentioned ino- culation doses, we selected a quantitative method to reveal the reduction of antimicrobial potential of filtrates as a result of storage in a frozen state. Thus, the next stage in our research was to study the storage effect of probiotic broth culture filtrates with inoculation doses of 1.0 (A) and 5.0 (B) McFarland standard in a frozen state at (–23 ± 1)°C on their anti- microbial properties against the test cultures after daily exposure using quantitative method of evaluation. Ac- ирутьлук-тсеТ serutluctseT саЧ ,їіцизопске анидог erusopxE rh,emit рутьлукхиннойьлубитартьліФ GGsusonmahrsullicabotcaL setartliferutluchtorB fo GGsusonmahrsullicabotcaL БПМц BPMs яннавужоромазод gnizeerfotroirp яннавужоромазялсіп gniwaht-ezeerfretfa A B A B лм/ОУK,gl lm/sUFCgl succocolyhpatS sidimredipe 42 50,0±7,5 – 10,0±9,5 – 20,0±9,9 succocolyhpatS suerua 42 1,0±2,6 – 50,0±6,6 – 30,0±8,9 muiretcabenyroC sisorex 42 – – – – 40,0±6,9 muiretcabenyroC eairehthpid 42 – – – – 40,0±7,9 sanomoduesP asonigurea 42 – – – – 80,0±8,9 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 4, 2017 319 МакФарланда мають бактеріостатичну дію на ста- філококи. Кількісні показники життєздатності тест- культур стафілококів після добової експозиції у розморожених фільтратах А є значуще вищими, ніж у свіжовиділених фільтратах А, але знаходяться у межах одного порядку. Бактерицидна активність фільтратів бульйонних культур сахароміцетів по відношенню до корине- бактерій після заморожування-розморожування зберігається незалежно від посівної дози (табл. 4). Бактеріостатична дія метаболітів сахароміцетів по відношенню до стафілококів та синьогнійної па- лички при застосуванні обох посівних доз після перенесеного заморожування також зберігається. Показники життєздатності тест-культур стафіло- коків і псевдомонад після експозиції у розморо- жених фільтратах сахароміцетів А і В є значуще вищими у порівнянні з відповідними показниками після експозиції у свіжовиділених фільтратах. Однак cording to the findings presented in Table 3, the freshly isolated and frozen-thawed filtrates of lactobacilli broth cultures, obtained using both inoculation doses, demonstrated an antibacterial activity against coryne- bacteria and Pseudomonas aeruginosa. Antibacterial effect of lactobacilli filtrate against staphylococci was observed (both prior to and after freezing) only when applying the inoculation dose 5 (B) McFarland stan- dard. The filtrates with inoculation dose 1.0 (A) McFar- land standard had a bacteriostatic effect on Staphylo- cocci. Quantitative indices of staphylococcal test culture viability after daily exposure in frozen-thawed filt- rates A were significantly higher vs. freshly-isolated filtrates A, but were within the same order. An antibacterial activity of broth cultures filtrates of Saccharomyces against the corynebacteria after freeze-thawing was kept regardless of inoculation dose (Tabl. 4). Bacteriostatic effect of Saccharomyces metabolites against Staphylococci and Pseudomonas Таблиця 4. Протимікробна активність фільтратів 48-годинних бульйонних культур Saccharomyces boulardi з посівною дозою 1 (A) та 5 (В) одиниць за шкалою МакФарланда до та після заморожування Table 4. Antimicrobial activity of 48-hour broth culture filtrates of Saccharomyces boulardii with inoculation dose of 1 (A) and 5 (B) McFarland standard prior to and after freezing Примітки: Протимікробна активність фільтратів, визначена кількісним методом: «–» – відсутність росту мікроорганізмів; * – відмінності статистично значущі відносно показників до заморожування; p < 0,05. Note: An antimicrobial activity of filtrates was determined by quantitative method: «–» – no micro- organism growth; * – differences are statistically significant as compared to indices before freez- ing; p < 0.05. Таким чином, наступ- ним етапом нашої робо- ти стало вивчення впливу зберігання фільтратів буль- йонних культур пробіо- тиків із посівними дозами 1,0 (А) та 5,0 (В) одиниць за шкалою МакФарланда в замороженому стані за температури (–23 ± 1)°С на їхні протимікробні влас- тивості по відношенню до тест-культур після добо- вої експозиції з застосу- ванням кількісного методу оцінки. Згідно з результа- тами, представленими у табл. 3, свіжовиділені та розморожені фільтрати бульйонних культур лак- тобактерій, отримані з ви- користанням обох посів- них доз, виявляють бак- терицидну активність по відношенню до корине- бактерій та синьогнійної палички. Бактерицидна дія фільтратів лактобактерій по відношенню до стафі- лококів спостерігається (як до, так і після заморо- жування) тільки під час застосування посівної до- зи 5 одиниць (В) за шка- лою МакФарланда. Фільт- рати з посівною дозою 1,0 одиниць (А) за шкалою ирутьлук-тсеТ serutluctseT саЧ ,їіцизопске анидог erusopxE rh,emit рутьлукхиннойьлубитартьліФ iidraluobsecymorahccaS setartliferutluchtorB fo iidraluobsecymorahccaS БПМц BPMsяннавужоромазод gnizeerfotroirp яннавужоромазялсіп gniwaht-ezeerfretfa A B A B лм/ОУK,gl lm/sUFCgl succocolyhpatS sidimredipe 42 20,0±9,7 90,0±3,7 1,0±1,8 70,0±5,7 20,0±9,9 succocolyhpatS suerua 42 20,0±9,7 90,0±3,7 1,0±1,8 70,0±5,7 20,0±9,9 muiretcabenyroC sisorex 42 – – – – 40,0±6,9 muiretcabenyroC eairehthpid 42 – – – – 40,0±7,9 sanomoduesP asonigurea 42 20,0±7,7 1,0±5,7 10,0±9,7 10,0±8,7 80,0±8,9 320 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 4, 2017 Література 1. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с за- данными свойствами. – М.: Медицина, 1992. – С. 29–59. 2. Блынская Е.В., Тишков С.В., Алексеев К.В. Технологические подходы к совершенствованию процесса лиофилизации бел- ковых и пептидных лекарственных препаратов // Российс- кий биотерапевтический журнал. – 2017. – Т. 6, №1. – С. 6–11. 3. Бондаренко В.М. Метаболитные пробиотики: механизмы терапевтического эффекта при микроэкологических нару- шениях // Consilium Medicum. – 2005. – Т. 6, №6. – С. 437–443. 4. Бузолева Л.С., Сомов Г.П., Бурцева Т.И. Сравнительный анализ качественного и количественного состава амино- кислот и органических кислот, продуцируемых в культу- ральную жидкость Yersinia pseudotuberculosis при разных температурах // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2006. – №S3. – С. 12–16. 5. Высеканцев И.П., Бабинец О.М., Марценюк В.Ф. и др. Кор- рекция популяций ценобионтов Bifidobacterium spp. и Lac- tobacillus spp. у мышей с экспериментальным дисбиозом кишечника после терапии иммобилизованными на энтеро- сорбентах пробиотиками, хранившимися при –80 и –196°С // Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2015. – Т. 25, №3. – С. 267–286. 6. Грищенко В.И., Геродес А.Г., Никитченко Ю.В. Влияние низкотемпературного хранения на перекисное окисление липидов и антиоксидантную активность фолликулярной жидкости человека // Проблемы криобиологии. – 1998. – №4. – С. 44–47. 7. Ермоленко Е.И., Черныш А.Ю., Марцинковская И.В. и др. Влияние пробиотических энтерококков на рост Strepto- coccus agalactiae // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2007. – №5. – С. 73–77. 8. Ершова И.Б., Гаврыш Л.И., Кунегина Е.Н., Мочалова А.А. Значение лактобактерий в организме человека и тактика правильного выбора эубиотиков // Новости медицины и фармации. – 2007. – №17. – С. 20–21. 9. Ісаєнко О.Ю., Книш О.В., Бабич Є.М. та ін. Вплив продуктів метаболізму Lactobacillus rhamnosus GG на тест-культури стафілококів та коринебактерій // Вісник проблем біології і медицини. – 2017. – Вип. 2, №136. – С. 246–251. 10.Ісаєнко О.Ю., Книш О.В., Бабич Є.М. та ін. Протимікробна активність продуктів метаболізму Saccharomyces boulardii відносно тест-культур стафілококів і коринебактерій // Фармакологія та лікарська токсикологія. – 2017. – Т. 54, №3. – С. 50–55. References 1. Atlas R.M. Handbook of microbiological media. 4th ed. London New York: Boca Raton: CRC Press; 2010. 2. Basnakyan I.A. Cultivation of microorganisms with specified properties. Moscow: Meditsina; 1992. 3. Blynskaya E.V., Tishkov S.V., Alekseev K.V. Technological approaches to improving the process lyophilization of protein and peptide drugs. Russian Journal of Biotherapy 2017; 16(1): 6–11. 4. Bondarenko V.M. Metabolite probiotics: mechanisms of therapeutic effect in microecological disorders. Consilium Medicum 2005; 7(6): 437–443. 5. Buzoleva L.S., Somov G.P., Burtseva T.I. Comparative analysis of qualitative and quantitative composition of the amino and organic acids produced into cultural medium by Yersinia pseu- dotuberculosis at different temperatures. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology 2006; (S3): 12–16. 6. Chicherin I.Yu., Pogorelsky I.P., Lundovskikh I.A. Antibacterial activity and composition of supernatant of native culture Lac- tobacillus plantarum 8Р–А3. Zhurnal Mezhdunarodnoj Meditsiny 2013; 1(2): 131–139. 7. Cotter P., Ross R., Hill C. Bacteriocins – a viable alternative to antibiotics. Nat Rev Microbiol 2013; 11(2): 95–105. 8. Courvalin P. Antibiotic resistance: the pros and cons of probiotics. Dig Liver Dis 2006; 38(2): 61–65. 9. De Vuyst L, Leroy F. Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications. J Mol Microbiol Biotechnol 2007; 13(4): 194–199. 10.Ermolenko E.I., Chernish A.Yu., Martsinkovskaya I.V. et al. Influence of probiotic enterococci on the growth of Streptococcus agalactiae. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immu- nobiology 2007; (5): 73–77. 11.Ershova I.B., Gavrysh L.I., Kunegina E.N., Mochalova A.A. The significance of lactobacilli in the human body and the tactics of the correct choice of eubiotics. Novosti Meditsiny Farmatsii 2007; 17: 20–21. 12.Grischenko V.I., Gerodes A.G., Nikitchenko Yu.V. Effect of various methods of low temperature storage on antioxidative activity of human follicular fluid. Probl Cryobiol 1998; (4): 44–47. важливим є те, що різниця між кількісними показ- никами життєздатності тест-культур після експо- зиції у свіжовиділених та розморожених фільтратах є невеликою: вона становить значно менше, ніж один порядок. Висновки Отримані результати свідчать про те, що до- сліджені способи зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків упродовж обраного інтервалу часу не мають значного впливу на протимікробні властивості продуктів їхнього метаболізму. Тому за необхідності та наявності відповідного техніч- ного оснащення будь-який із вищезазначених спо- собів зберігання фільтратів може бути застосо- ваний без ризику суттєвого зниження або втрати ними протимікробної активності. aeruginosa when applying both inoculation doses post freezing was also preserved. The viability indices of staphylococcal and pseudomonad test cultures after exposure in frozen-thawed filtrates of Saccharomyces A and B were significantly higher as compared to the corresponding indices after exposure in freshly-isolated filtrates. Nevertheless, of importance was the fact that the difference between quantitative indices of test culture viability after exposure in freshly-isolated and frozen-thawed filtrates was low, i. e. much lower than one order. Conclusions Our findings testified to the fact that the studied storage methods for the probiotic broth culture filtrates during the selected time interval had no significant effect on antimicrobial properties of their metabolic products. So, any of the mentioned above ways for filtrate storage may be used with no risk of signifi- cant decrease or loss by them of antimicrobial acti- vity, if necessary and where an appropriate technical equipment is available. проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 27, №/issue 4, 2017 321 11.Коротких О.О, Калініченко С.В. Оцінка цитотоксичної дії екзометаболітів Lactobacillus plantarum in vitro. Вісник проблем біології і медицини. – 2016. – Вип. 1, Т. 2, №127. – С. 158–161. 12.Лукоянова О.Л., Боровик Т.Э, Беляева И.А. и др. Влияние замораживания и длительности хранения сцеженного груд- ного молока на его пищевую, биологическую ценность и микробиологическую безопасность // Вопросы современ- ной педиатрии. – 2011. – Т. 10, №1. – С. 29–33. 13.Молохова Е.И., Сорокина Ю.В. Разработки отечественных метаболитных пробиотиков и их стандартизация // Си- бирский медицинский журнал. – 2011. – Т. 26, №1. – С. 29– 33. 14.Нардид О.А. Влияние низких температур на белковые системы // Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2014. – Т. 24, №2. – С. 83–101. 15.Несчисляев В.А., Столбова М.Г., Мокин П.А., Бондарев В.П. Разработка и исследование капсулированной лекарствен- ной формы пробиотика на основе иммобилизованных би- фидобактерий // Биопрепараты. Профилактика. Диагнос- тика. Лечение. – 2013. – №2(46). – С. 35–38. 16.Несчисляев В.А., Мокин П.А., Федорова Т.В. К вопросу разработки высокоэффективных метаболитных пробио- тиков: Материалы 8-й Междунар. науч.-практ. конф. «Актуальные направления научных исследований: от теории к практике», Чебоксары, 2016 // Сиб. мед. журн. – 2016. – №2–1(8). – С. 15–17. 17.Плоскирева А.А., Горелов А.В. Место метаболитных пробио- тиков в практике клинициста // РМЖ. – 2014. – Т. 22, №3. – С. 232–236. 18.Соловьева И.В., Точилина А.Г., Новикова Н.А. и др. Изуче- ние биологических свойств новых штаммов рода Lacto- bacillus // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Ло- бачевского. – 2010. – №2. – С. 462–468. 19.Тимохина Т.Х., Марков А.А., Паромова Я.И. и др. Способ получения экзометаболитов бифидобактерий с высокой антимикробной активностью // Медицинская наука и обра- зование Урала. – 2016. – Т. 17, №2(86). – С. 152–154. 20.Урсова Н. И. Актуальные и нерешенные проблемы про- биотикотерапии // Лечащий врач. – 2013. – №8. – С.60–65. 21.Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А. и др. Антибактериальная активность и состав надосадочной жид- кости нативной культуры Lactobacillus plantarum 8Р–А3 // Журн. междунар. медицины. – 2013. – №1(2). – С. 131–139. 22.Пат. 2224018, РФ, МПК C12N1/20, A61K35/74, C12N1/20, C12R1:25C12N1/20, A61K35/74, C12N1/20, C12R1:25. Способ по- лучения биологического стимулятора [Электронный ресурс] / В.А. Несчисляев, Л.П. Чистохина (РФ); заявитель и патентооб- ладатель ФГУП «НПО по медицинским иммунологическим препаратам «Микроген» (RU).– № 2001131538/13; заявл. 21.11.2001; опубл. 20.02.2004. – Режим доступа: www.fips.ru. 23.Atlas R. M. Handbook of Microbiological Media. – 4th edition. – London New York: Boca Raton: CRC Press, 2010. – 2040 p. 24.Cotter P., Ross R., Hill C. Bacteriocins – a viable alternative to antibiotics // Nat. Rev. Microbiol. – 2013. – Vol. 11, №2. – P. 95–105. 25.Courvalin P. Antibiotic resistance: the pros and cons of pro- biotics // Dig. Liver Dis. – 2006. – Vol. 38, suppl. 2. – Р. 261–265. 26.De Vuyst L., Leroy F. Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications // J. Mol. Micro- biol. Biotechnol. – 2007. – Vol. 13, №4. – P. 194–199. 27.Pikal M.J. Freeze-drying of proteins. In: Formulation and Delivery of Proteins and Peptides. Eds. J.L. Cleland and R. Langer // ACS Symposium Series. 567: 120–133 (1994). 13.Іsaenko O.Yu., Knysh O.V., Babych E.M. et. al. The influence of metabolic products of Lactobacillus rhamnosus GG on the test culture of staphylococci and corynebacteria. Bulletin of Problems Biology and Medicine 2017; 2(136): 246–251. 14.Isayenko O.Yu., Knysh O.V., Babych E.M. etc. Antimicrobial activity of metabolites of Saccharomyces boulardii against test cultures of Staphylococci and Corynebacteria. Pharmacology and Drug Toxicology 2017; 54 (3): 50–55. 15.Korotkykh O.O., Kalinichenko S.V. Evaluation of the exometabolites cytotoxic effect of Lactobacillus plantarum in vitro. Bulletin of Problems Biology and Medicine 2016; 2 (127): 158–162. 16.Lukoyanova O.L., Borovik T.E., Belyayeva I.A. et al. Influence of freezing and prolonged storage of expressed breast milk on its nutritive, biological values and microbiological safety. Voprosy Sovremennoi Pediatrii 2011; 10(1): 29–33. 17.Molokhova E.I., Sorokina Yu.V. Working out domestic metabolic probiotic and their standardization. Sibirsky Meditsinsky Journal 2011; 26; 1(1): 29–33. 18.Nardid O.A. Effect of low temperatures on protein systems. Probl Cryobiol Cryomed 2014; 24(2): 83–101. 19.Neschislyaev V.A., Stolbova M.G., Mokin P.A., Bondarev V.P. Development of probiotic capsule dosage form with immobilized bifidobacteria. Biopreparations Prevention Diagnosis Treatment 2013; 2(46): 35–38. 20.Neschislyaev V.A., Mokin P.A., Fedorova T.V. et. al. On the issue of development of highly effective metabolic probiotics. Actual areas (directions) of scientific research: from theory to practice 2016; 2: 15–17. 21.Neschislyayev V.A., Chistokhina L.P., inventors. Scientific and Production Association for Immunological Preparations "Microgen", assignee. Method of obtaining a biological stimulator. RU Patent 2001131538/13; 2004 Febr20. 22.Pikal M.J. Freeze-drying of proteins. In: Cleland J.L., Langer R, editors. Formulation and delivery of proteins and peptides. ACS Symposium Series 567; 1994. p. 120–133. 23.Ploskireva A.A., Gorelov A.V. Place of metabolic probiotics in the practice of a clinician. Russkij Meditsinskij Zhurnal 2014; 22 (3): 232–236. 24.Solovyeva I.V., Tochilina A.G., Novikova N.A. et. al. Study of biological properties of new Lactobacillus strains. Vestnik of Lobachevsky University of Nizhni Novgorod 2010; 2: 462–468. 25.Timokhina T.Kh., Markov A.А., Paromova Ya.I. et al. The way of receiving of bifidobacteria exometabolites with high antimic- robe activity. Meditsinskaya Nauka Obrazovaniye Urala 2016; 17: 2(86): 152–154. 26.Ursova N.I. Topical and unsolved issues of probiotic therapy. Lechaschii Vrach 2013; 8: 60–65. 27.Vysekantsev I.P., Babinets O.M., Martsenyuk V.F. et. al. Correction of Bifidobacterium spp. and Lactobacillus spp. Populations in mice with experimental intestinal dysbiosis after therapy with enterosorbent-immobilized probiotics stored at –80 and –196°C. Probl Cryobiol Cryomed 2015; 25(3): 267–286.

Вплив умов зберігання фільтратів бульйонних культур пробіотиків на їхню протимікробну активність

Репозитарії

Схожі ресурси