Влияние ПЭГ-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом эритроцитов
Исследовали влияние ПЭГ-1500 на способность дипиридамола ингибировать транспорт ионов Н⁺ в эритроцитах. Установили, что ингибитор не связывается в анионном канале теней эритроцитов в сульфатной среде, несмотря на то, что он обладает способностью блокировать вход ионов Н⁺ в клетки. Использование эрит...
Збережено в:
| Дата: | 2003 |
|---|---|
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2003
|
| Назва видання: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138472 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Влияние ПЭГ-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом эритроцитов / В.В. Рамазанов, Я.О. Нардид, О.А. Олейник, В.А. Бондаренко // Проблемы криобиологии. — 2003. — № 4. — С. 12–19. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-138472 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-1384722018-06-20T03:07:52Z Влияние ПЭГ-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом эритроцитов Рамазанов, В.В. Нардид, Я.О. Олейник, О.А. Бондаренко, В.А. Теоретическая и экспериментальная криобиология Исследовали влияние ПЭГ-1500 на способность дипиридамола ингибировать транспорт ионов Н⁺ в эритроцитах. Установили, что ингибитор не связывается в анионном канале теней эритроцитов в сульфатной среде, несмотря на то, что он обладает способностью блокировать вход ионов Н⁺ в клетки. Использование эритроцитов, нагруженных фторидом, позволило предположить, что ингибиторная способность дипиридамола в клетках в сульфатной среде определяется выходящим потоком хлорида при работе цикла Якобса-Стеварта и что транспорт ионов Н⁺ отражает не полный объем входящего сульфата. Блокирование дипиридамолом указанной фракции транспорта ионов Н⁺ и сульфата значительно снимается в присутствии ПЭГ-1500 за счет перераспределения ингибитора между мембраной и раствором криопротектора. Досліджували вплив ПЕГ-1500 на здатність діпірідамолу інгібувати транспорт іонів Н⁺ в еритроцитах. Встановили, що інгібітор не зв’язується в аніонному каналі тіней еритроцитів у сульфатному середовищі, незважаючи на його здатність блокувати вхід іонів Н⁺ у клітини. Використання еритроцитів, навантажених фторидом, дозволило припустити, що інгібіторна здатність діпірідамолу в клітинах у сульфатному середовищі визначається вихідним потоком хлориду при роботі циклу Якобса-Стеварта і що транспорт іонів Н⁺ відбиває не повний обсяг вхідного сульфату. Блокування діпірідамолом зазначеної фракції транспорту іонів Н⁺ і сульфату значно знімається в присутності ПЕГ-1500 за рахунок перерозподілу інгібітору між мембраною і розчином кріопротектора. The authors studied the effect of PEG-1500 on ability of dipyridamole to inhibit the H⁺ ions transport in erythrocytes. It was established that the inhibitor was not bound in anion channel of erythrocytes ghosts in sulfate medium, despite its ability to block the H⁺ ions entrance into cells. Using of fluoride loaded erythrocytes allowed to assume that dipyridamole’s inhibitory ability in cells placed to sulfate medium is controlled by chloride output flow during Jacobs-Stewart cycle functioning, and that proton transport does not reflect the whole amount of entering sulfate. Dipyridamole blockage of stated fraction of H⁺ ions transport was considerably withdrawn in PEG-1500 presense due to inhibitor’s redistribution from membrane to cryoprotectant solution. 2003 Article Влияние ПЭГ-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом эритроцитов / В.В. Рамазанов, Я.О. Нардид, О.А. Олейник, В.А. Бондаренко // Проблемы криобиологии. — 2003. — № 4. — С. 12–19. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138472 577.352.465: 612.111: 547.42/43 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Рамазанов, В.В. Нардид, Я.О. Олейник, О.А. Бондаренко, В.А. Влияние ПЭГ-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом эритроцитов Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Исследовали влияние ПЭГ-1500 на способность дипиридамола ингибировать транспорт ионов Н⁺ в эритроцитах. Установили, что ингибитор не связывается в анионном канале теней эритроцитов в сульфатной среде, несмотря на то, что он обладает способностью блокировать вход ионов Н⁺ в клетки. Использование эритроцитов, нагруженных фторидом, позволило предположить, что ингибиторная способность дипиридамола в клетках в сульфатной среде определяется выходящим потоком хлорида при работе цикла Якобса-Стеварта и что транспорт ионов Н⁺ отражает не полный объем входящего сульфата. Блокирование дипиридамолом указанной фракции транспорта ионов Н⁺ и сульфата значительно снимается в присутствии ПЭГ-1500 за счет перераспределения ингибитора между мембраной и раствором криопротектора. |
| format |
Article |
| author |
Рамазанов, В.В. Нардид, Я.О. Олейник, О.А. Бондаренко, В.А. |
| author_facet |
Рамазанов, В.В. Нардид, Я.О. Олейник, О.А. Бондаренко, В.А. |
| author_sort |
Рамазанов, В.В. |
| title |
Влияние ПЭГ-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом эритроцитов |
| title_short |
Влияние ПЭГ-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом эритроцитов |
| title_full |
Влияние ПЭГ-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом эритроцитов |
| title_fullStr |
Влияние ПЭГ-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом эритроцитов |
| title_full_unstemmed |
Влияние ПЭГ-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом эритроцитов |
| title_sort |
влияние пэг-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом эритроцитов |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2003 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/138472 |
| citation_txt |
Влияние ПЭГ-1500 на связывание дипиридамола с анионным каналом эритроцитов / В.В. Рамазанов, Я.О. Нардид, О.А. Олейник, В.А. Бондаренко // Проблемы криобиологии. — 2003. — № 4. — С. 12–19. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT ramazanovvv vliâniepég1500nasvâzyvaniedipiridamolasanionnymkanaloméritrocitov AT nardidâo vliâniepég1500nasvâzyvaniedipiridamolasanionnymkanaloméritrocitov AT olejnikoa vliâniepég1500nasvâzyvaniedipiridamolasanionnymkanaloméritrocitov AT bondarenkova vliâniepég1500nasvâzyvaniedipiridamolasanionnymkanaloméritrocitov |
| first_indexed |
2025-07-10T05:50:13Z |
| last_indexed |
2025-07-10T05:50:13Z |
| _version_ |
1837237926823460864 |
| fulltext |
12ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
УДК 577.352.465: 612.111: 547.42/43
Влияние ПЭГ-1500 на связывание дипиридамола с анионным
каналом эритроцитов
В.В. РАМАЗАНОВ, Я.О. НАРДИД, О.А. ОЛЕЙНИК, В.А. БОНДАРЕНКО
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Effect of PEG-1500 on Dipyridamole Binding
with Erythrocyte Anion Channel
RAMAZANOV V.V., NARDID YA.O., OLEJNIK O.A., BONDARENKO V.A.
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy
of Sciences of the Ukraine, Kharkov
Исследовали влияние ПЭГ-1500 на способность дипиридамола ингибировать транспорт ионов Н+ в эритроцитах. Установили,
что ингибитор не связывается в анионном канале теней эритроцитов в сульфатной среде, несмотря на то, что он обладает
способностью блокировать вход ионов Н+ в клетки. Использование эритроцитов, нагруженных фторидом, позволило
предположить, что ингибиторная способность дипиридамола в клетках в сульфатной среде определяется выходящим потоком
хлорида при работе цикла Якобса-Стеварта и что транспорт ионов Н+ отражает не полный объем входящего сульфата.
Блокирование дипиридамолом указанной фракции транспорта ионов Н+ и сульфата значительно снимается в присутствии
ПЭГ-1500 за счет перераспределения ингибитора между мембраной и раствором криопротектора.
Ключевые слова: эритроциты, анионный канал, ингибиторы транспорта, криопротекторы.
Досліджували вплив ПЕГ-1500 на здатність діпірідамолу інгібувати транспорт іонів Н+ в еритроцитах. Встановили, що
інгібітор не зв’язується в аніонному каналі тіней еритроцитів у сульфатному середовищі, незважаючи на його здатність
блокувати вхід іонів Н+ у клітини. Використання еритроцитів, навантажених фторидом, дозволило припустити, що інгібіторна
здатність діпірідамолу в клітинах у сульфатному середовищі визначається вихідним потоком хлориду при роботі циклу
Якобса-Стеварта і що транспорт іонів Н+ відбиває не повний обсяг вхідного сульфату. Блокування діпірідамолом зазначеної
фракції транспорту іонів Н+ і сульфату значно знімається в присутності ПЕГ-1500 за рахунок перерозподілу інгібітору між
мембраною і розчином кріопротектора.
Ключові слова: еритроцити, аніонний канал, інгібітори транспорту, кріопротектори.
The authors studied the effect of PEG-1500 on ability of dipyridamole to inhibit the H+ ions transport in erythrocytes. It was
established that the inhibitor was not bound in anion channel of erythrocytes ghosts in sulfate medium, despite its ability to block the
H+ ions entrance into cells. Using of fluoride loaded erythrocytes allowed to assume that dipyridamole’s inhibitory ability in cells
placed to sulfate medium is controlled by chloride output flow during Jacobs-Stewart cycle functioning, and that proton transport
does not reflect the whole amount of entering sulfate. Dipyridamole blockage of stated fraction of H+ ions transport was considerably
withdrawn in PEG-1500 presense due to inhibitor’s redistribution from membrane to cryoprotectant solution.
Key-words: erythrocytes, anion channel, posthypertonic lysis, cytoskeleton.
UDC 577.352.465: 612.111: 547.42/43
Водорастворимые полимеры ПЭГ нарушают
осмотический баланс между гидратационным
слоем поверхности мембраны и раствором,
вызывают дегидратацию полярных групп фосфо-
липидов, снижая диэлектрические константы
поверхности клетки и растворов и увеличивая
гидрофобность мембраны [7,9,10]. При этом
полимер создает стерический барьер, предотвра-
щая взаимодействие белков с поверхностью
липосом [8], а также снижая уровень включения
спиновых зондов в белки и мембраны [1].
Вследствие сорбирования ПЭГ-400 и ПЭГ-1500 на
поверхности белка происходит снижение подвиж-
ности нитроксильного радикала, ковалентно
связанного с молекулой альбумина. Отмечается
значительное вытеснение спинового зонда из
гидрофобных полостей макромолекулы. При этом
Адрес для корреспонденции: Рамазанов В.В., Институт проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины,ул. Переяславская,23,
г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38 (057) 772-00-71, факс: +38 (057)
772-00-84, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Address for correspondence: Ramazanov V.V., Institute for Problems
of Cryobiology&Cryomedicine of the Natl. Acad. Sci. of Ukraine,
23, Pereyaslavskaya str.,Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+38 (057)
7720071, fax: +38 (057) 7720084, e-mail:cryo@online.kharkov.ua
Water soluble polymers PEG break the osmotic
balance between membrane hydrate layer and solution,
provoke the dehydratation of phospholipids polar
groups, decrease the dielectric constants of cell surface
and solutions, increase the membrane hydrophobic
properties [7, 9, 10]. Polymer creates a steric barrier,
resulting in prevention of the proteins-liposomes
surface interaction [8] and in a decrease in the rate of
spin probes inclusion in proteins and membranes [1].
In consequence of PEG-400 and PEG-1500 sorption
on protein surface a decrease in motility of nitroxy
radical covalently associated with albumin molecule
occurs. There is noted a significant displacement of
spin probe from macromolecule hydrophobic areas.
In this case the preliminarily added cryoprotectant
prevents the penetration of hydrophobic probe into
protein molecule. Investigations on erythrocyte
13ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
предварительные добавки криопротекторов
препятствуют проникновению гидрофобного зонда
внутрь молекулы белка. Исследования на мембра-
нах эритроцитов также показали, что молекулы
ПЭГ вытесняют спиновые зонды из гидрофобных
областей поверхности мембраны [1]. Дипиридамол
блокирует транспорт хлорида, сульфата и фосфата
в мембранах эритроцитов, связываясь в депрото-
нированной незаряженной форме. При связывании
происходит нейтрализация положительного заряда
в канале доступа субстрата к транспортному сайту
хлоридным анионом, который способствует
встраиванию ингибитора в гидрофобный карман
[6]. Молекулы дипиридамола включаются внутрь
детергентных мицелл независимо от их заряда, что
указывает на высокую гидрофобность ингибитора
[2]. Таким образом, связывание дипиридамола в
анионном канале может служить моделью для
исследования влияния криопротекторов на
характер взаимодействия блокатора с транспорт-
ным белком.
Цель работы – исследование перераспреде-
ления дипиридамола с поверхности мембраны в
раствор, содержащий ПЭГ-1500.
Материалы и методы
В работе использовали соли: NaCl, NaF, Na2SO4
марки чда, ЭДТА и трис производства Calbiochem,
дипиридамол, ДИДС (4,4’ –диизотиоцианостиль-
бен-2,2’ –дисульфонат динатриевая соль) производ-
ства Sigma, ПЭГ-1500 производства Merck.
Эритроциты человека получали из донорской
крови 4-кратным отмыванием растворами,
содержащими: а) 0,15 моль/л NaCl, 10 ммоль/л трис
(рН 7.4), б) 0,15 моль/л NaF, 10 ммоль/л трис
(рН 7.4). Клетки (7%-й гематокрит) инкубировали
в указанных растворах трижды по 10 мин при 37°С.
Полученные хлорид- и фторидсодержащие
эритроциты использовали в экспериментах на рН-
метре, сопряженным с самописцем и термоста-
тируемой ячейкой с рН-электродом. Исследовали
обмен внутриклеточных анионов хлорида и
фторида на внеклеточный сульфат в эритроцитах,
внесенных в ячейку, содержащую 0,12 моль/л
Na2SO4. В данном случае происходят выход
хлорида и ионов водорода при работе цикла
Якобса-Стеварта (закисление) и обмен внутри-
клеточного хлорида на внеклеточный сульфат и ион
водорода (защелачивание) [11]. Константы
скорости входа ионов Н+ и процент ингибирования I
дипиридамолом вычисляли соответственно по
формулам :
K=ln10*( ∆ pH/ ∆ t);
I=(1-КДИП/ККОНТ)*100%,
membrane showed also that PEG molecules displaced
the spin probes out of hydrophobic areas of membrane
surface [1]. Dipyridamole, being bound in non-proton
uncharged form, blocks the chloride, sulfate and
phosphate transport in erythrocytes membrane. During
its binding the neutralisation of positive charge by
chloride anion occurs in channel of substrate access
transport site, and this promotes the inhibitor
incorporation into hydrophobic “pocket” [6]. Dipyrida-
mole molecules are incorporated into detergent micelles
independently from their charge, this points to a highly
expressed hydrophobic properties of inhibitor [2]. Thus,
binding of dipyridamole in anion channel can serve as
a model for investigation of cryoprotectant action to
the character of blocker-transport protein interaction.
The aim of this work was to study the rearrange-
ment of dipyridamole from membrane surface to PEG-
1500 containing solution.
Materials and methods
The following substances were used in the study:
NaCl, NaF, Na2SO4 (“pure for analysis” rate); EDTA,
tris (Calbiochem); dipyridamol, DIDS (4, 4’ –
diisotiocyanostilbene – 2, 2’ – disulphonate disodium
salt) (Sigma); PEG-1500 (Merck).
Human erythrocytes were derived from donor blood
by 4-fold washing with solutions, containing a) 0.15 M
NaCl, 10 mM tris (pH 7.4); b) 0.15 M NaF, 10 mM
tris (pH 7.4). The cells (7% hematocrit) were thrice
incubated in the given solutions during 10 min at 37°C.
Obtained chloride and fluoride containing erythrocytes
were used in experiments on pH-meter with a
thermostat cell and recorder. The intracellular chloride
and fluoride anions exchange for extracellular sulphate
in erythrocytes was studied in the cells, containing
0.12 M Na2SO4. In this case the efflux of chloride
and protons during Jacobs-Stewart cycle functioning
occurs (acidification) and intracellular chloride
exchanges for extracellular sulfate and proton
(alkalisation) [11]. Constants of H+ ions entering rate
and the percentage of dipyridamole inhibiting were
calculated with the following formula:
K=ln10*( ∆ pH/ ∆ t);
I=(1-Кdip/Кcont)*100%,
where Kdip and Kcont are the constants of H+ ions influx
rate in presence or absence of dipyridamole,
correspondingly. The erythrocytes (20% hematocrit)
were treated with DIDS of 50 µM concentration during
60 min at 37°C in medium, containing 0.15 M NaCl,
10 mM tris (pH 7.4), then they were 4-fold washed
(at 3000 rpm). With dipyridamole of 25, 50, 100, 200
µM concentration the cells (hematocrite of 2%) were
treated during 10 min in buffer-free medium, containing
0.15 M NaCl, and then sedimented without inhibitor
14ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
где КДИП и ККОНТ – константы скорости входа ионов
Н+ соответственно при наличии и отсутствии
дипиридамола. Эритроциты (20%-й гематокрит)
обрабатывали с ДИДС в концентрации 50 мкмоль/л,
60 мин при 37°С в среде, содержащей 0,15 моль/л
NaCl, 10 ммоль/л трис (рН 7.4), и отмывали 4 раза
(3000 об/мин). С дипиридамолом в концентрациях
25, 50, 100, 200 мкмоль/л клетки (2%-й гематокрит)
обрабатывали 10 мин в безбуферной среде,
содержащей 0,15 моль/л NaCl и осаждали без
отмывания ингибитора. Белые тени эритроцитов
получали лизисом клеток на ледяной бане в среде,
содержащей 1 ммоль/л ЭДТА, 5 ммоль/л трис (рН 8)
в течение 10 мин. Тени отмывали лизирующей
средой при 15000 об/мин 15 мин при 4°С до полного
удаления гемоглобина. Связывание дипиридамола
оценивали по степени его флуоресцентной поляри-
зации, которую тестировали при титровании
1мкмоль/л реагента тенями эритроцитов в
спектрометрической кювете спектрофлуориметра
Hitachi 2MPF. Величину поляризации флуоресцен-
ции вычисляли по формуле [3]:
P=(Vv –Lv*(VH/LH))/(Vv+Lv*(VH/LH)),
где Vv, Lv, LH, VH – интенсивности флуоресценции,
измеренные с поляризаторами при 0-0°; 0-90°;
90-90°; 90-0° соответственно.
Результаты и обсуждение
Эксперименты показали, что рост концентрации
дипиридамола вызывает ингибирование входа
протонов в эритроциты. Если экспериментальная
среда содержала дополнительно 15% ПЭГ-1500,
это приводило к снятию блокирующей способности
ингибитора (рис.1). Учитывая такой результат,
эритроциты были обработаны различными
концентрациями дипиридамола, чтобы молекулы
ингибитора изначально связались с мембраной. В
этом случае также отмечается блокирование
входа протонов в клетку, которое подавляется в
присутствии ПЭГ-1500, хотя и в меньшей степени
(рис. 2, а). Когда в ячейку дополнительно были
добавлены такие же концентрации дипиридамола,
как и при обработке эритроцитов, ингибирование
транспорта протонов усиливалось, однако влияние
ПЭГ-1500 на снижение блокирующей способности
дипиридамола сохранялось (рис. 2, б). В последнем
случае подавляющая способность ПЭГ-1500 на
ингибиторную силу дипиридамола была наименее
выраженной. Это понятно, так как блокатор был
предварительно связан с мембраной клетки и,
кроме того, находился в среде инкубации.
Полученные результаты указывают на то, что
ПЭГ-1500, во-первых, может препятствовать
контакту дипиридамола с мембраной и соответст-
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 50 100 150 200 250
1
2
Рис.1. Степень ингибирования дипиридамолом транс-
порта ионов Н+ в эритроциты в средах, содержащих:
1– 0,12 моль/л Na2SO4; 2 – 0,12 моль/л Na2SO4 + ПЭГ-1500
(15%).
Fig. 1. Dipyridamole inhibiting rate for H+ ion transport
into erythrocytes in media, containing 1– 0,12 mol/l Na2SO4;
2 – 0,12 mol/l Na2SO4 + PEG-1500 (15%).
Дипиридамол, мкмоль/л
Dipyridamole, µmol/l
И
нг
иб
ир
ов
ан
ие
,
%
In
hi
bi
tio
n,
%
washing-out. Erythrocyte ghosts were obtained by cell
lysis on ice bath in the medium, containing 1mM EDTA,
5 mM tris (pH 8) during 10 min. The ghosts were
washed by lysing medium at 15000 rpm during 15 min
at 4°C upto a total hemoglobin removal. Dipyridamole
binding was evaluated by its fluorescent polarisation,
tested by titering of 1mcM of reagent by erythrocytes
ghosts in spectrometrical well of Hitachi 2MPF spectro-
fluorimeter. The fluorescence polarisation rate was
calculated by the following formula [3]:
P=(Vv –Lv*(VH/LH))/(Vv+Lv*(VH/LH)),
where Vv, Lv, LH, VH are fluorescence intensities,
measured with polarisators at 0-0°; 0-90°; 90-90°;
90-0°, correspondingly.
Results and discussion
It was shown in the experiments that a rise in
dipyridamole concentration results in inhibition of proton
influx into erythrocytes. The blocking ability of inhibitor
was withdrawn, if the medium additionally contained
15% PEG-1500 (Fig. 1). Taking this result into account,
the erythrocytes were treated by various concen-
trations of dipyridamol, to provide a preliminary binding
of inhibitor and membrane. In this case we also
observed the blockage of proton influx to the cells,
being suppressed in PEG-1500 presence, but in lesser
extent (Fig. 2a). At extra adding into the well the same
dipyridamole concentrations, as those for erythrocytes
15ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 50 100 150 200
1
2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 50 100 150 200
1
2
Рис. 2. Влияние ПЭГ-1500 на способность дипиридамола ингибировать транспорт ионов Н+ в эритроциты: а –
предварительно обработанные дипиридамолом; б – предварительно обработанные дипиридамолом, ингибитор
дополнительно добавлялся в экспериментальную среду. 1 – 0,12 моль/л Na2SO4; 2 – 0,12 моль/л Na2SO4 + ПЭГ-1500
(15%).
Fig. 2. PEG-1500 effect to dipydamole inhibiting activity for H+ ions transport into erythrocytes a – preliminarily treated
with dipyridamole; b – preliminarily treated with dipyridamole, and additionaly with presense of inhibitor in experimental
medium. 1 – 0,12 mol/l of Na2SO4; 2 – 0,12 mol/l of Na2SO4 + PEG-1500 (15%).
Дипиридамол, мкмоль/л
Dipyridamole, µmol/l
И
нг
иб
ир
ов
ан
ие
,
%
In
hi
bi
tio
n,
%
Дипиридамол, мкмоль/л
Dipyridamole, µmol/l
И
нг
иб
ир
ов
ан
ие
,
%
In
hi
bi
tio
n,
%
венно входу ингибитора в анионный канал; во-
вторых, может происходить перераспределение
связанного ингибитора в раствор криопротектора.
Для того чтобы уточнить такие предположения,
для оценки связывания дипиридамола исследовали
поляризацию его флуоресценции [3] в присутствии
белых теней, полученных из контрольных эритро-
цитов, и эритроцитов, обработанных ДИДС,
который в отличие от дипиридамола является
необратимым ингибитором транспортной системы
и ковалентно связывается в анионном канале,
снижая сродство хлорида к транспортному сайту
[4,5]. Исследование показало, что степень
поляризации ингибитора выше в среде с NaCl, чем
в среде с Na2SO4 (рис.3). При этом ингибитор
анионного канала ДИДС и ПЭГ-1500 блокируют
рост поляризации флуоресценции в 0,15 моль/л
NaCl, но не в 0,12 моль/л Na2SO4. Это свидетельст-
вует о том, что рост поляризации флуоресценции в
хлориде натрия определяется связыванием
дипиридамола в анионном канале, тогда как
меньшая степень поляризации в сульфате натрия
характеризуется, видимо, эффектом рассеивания
мембран (солюбилизация мембран додецил-
сульфатом натрия на 50% снижает поляризацию
флуоресценции, данные не представлены). Таким
образом, эксперименты по изучению влияния
ДИДС и ПЭГ-1500 на поляризацию флуоресценции
дипиридамола показывают, что в сульфатной среде
в сравнении с хлоридной связывание дипиридамола
в анионном канале мембран эритроцитов не
treatment, the inhibition of proton transport was
increased, but the PEG-1500 effect on dipyridamol
inhibition action was kept (Fig. 2b). In latter case the
suppressing effect of PEG-1500 to dipyridamole
inhibition was the least expressed. It is obvious, since
the blocker was preliminarily bound with cell membrane
and additionally present in incubation medium.
Obtained results show that, firstly, PEG-1500 can
prevent the dipyridamole contact with membrane, and,
correspondingly, the inhibitor entrance to anion channel;
secondly, there is a possibility of rearrangement of
bound inhibitor into cryoprotectant solution. To check
such supposition, we have evaluated the dipyridamole
binding by studying its polarisation fluorescence [3] in
presence of ghosts, derived from control erythrocytes
and from the cells, treated with DIDS. In contrast to
dipyridamole DIDS is an irreversible inhibitor of
transport system and binds covalently in anion channel,
decreasing the chloride affinity to a transport site [4,
5]. It is shown in our investigation that inhibitor
polarisation rate is higher in NaCl containing medium,
comparing to that with Na2SO4 (Fig. 3). In this case
the anion channel inhibitor DIDS and PEG-1500 block
the rise in fluorescence polarisation in 0.15 M NaCl,
but not in 0.12 M Na2SO4. This testifies to the fact,
that rise in fluorescence polarisation in sodium chloride
is determined by dipyridamole binding in anion channel,
whereas lesser polarisation rate in sodium sulfate is
determined apparently by membrane scattering effect
(membrane solubilisation by sodium dodecyl sulfate
decreases the fluorescence polarisation for 50%, data
a a б b
16ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 100 200 300 400 500
1
2
Белок, мкг/мл
Protein, µg/ml
П
ол
яр
из
ац
ия
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
Fl
uo
re
sc
en
ce
p
ol
ar
is
at
io
n
происходит. Тем не менее эксперименты по
исследованию блокирования входа протонов в
клетки указывают на обратное. С одной стороны,
транспорт ионов Н+ в сульфатной среде, который
сопровождает вход сульфата [11], блокируется
дипиридамолом (см. рис. 1), с другой – замена во
внеклеточной среде хлорида на сульфат снимает
как связывание дипиридамола в анионном канале
(рис. 3, 4), так и блокирование данным ингибитором
транспорта сульфата [6]. Спектрофлуориметричес-
кие результаты можно объяснить с учетом данных
[6], что дипиридамол не связывается в анионном
канале в сульфатной среде и что для его связы-
вания необходимы анионы хлорида. Однако
блокирование дипиридамолом входа ионов Н+ в
сульфатной среде свидетельствует об обратном
(см. рис. 1). Таким данным есть объяснение, если
предположить, что вход ионов Н+, тестируемый
рН-электродом, выявляет некоторую долю общего
транспорта, чувствительную к дипиридамолу в
сульфатной среде, но не выявляемую в экспери-
ментах с радиоактивным сульфатом [6]. В
предполагаемом случае связывание дипиридамола
в канале может катализироваться хлоридом,
который выходит при работе цикла Якобса-
Стеварта в эритроцитах, внесенных в сульфатную
среду. Этот выброс хлорида сопровождается
быстрым закислением суспензии клеток, а
последующее защелачивание отражает обмен
хлорида на внеклеточный сульфат и протон [11].
Взаимодействие дипиридамола с анионным
каналом эритроцитов в сульфатной среде, опосре-
дованное выходящим хлоридом, будет происходить
по тому же механизму, что и в хлоридной среде
[6] – нейтрализация хлоридным анионом положи-
тельного заряда в субстратном канале приводит к
открыванию гидрофобного кармана и встраиванию
в него блокатора. Учитывая такое предположение,
клетки насыщали фторидом, который слабее, чем
хлорид, инициирует связывание дипиридамола в
анионном канале эритроцитов [6]. На рис.5
представлены результаты по ингибированию
дипиридамолом входа ионов Н+ в эритроциты,
содержащие различные анионы. Как и предпо-
лагалось, замена внутриклеточного хлорида на
фторид приводит к снижению ингибиторной
способности дипиридамола, что согласуется с
данными [6]. Дипиридамол в отличие от ДИДС
классифицируют как ингибитор анионного канала,
который блокирует каналы доступа анионов к
транспортному сайту [5]. Как было отмечено выше,
его связывание опосредуется взаимодействием с
гидрофобным участком канала [6]. Исследование
локализации молекул дипиридамола в мицеллах
детергента показало, что поляризованная часть
молекулы находится в полярной зоне, а неполярные
Рис. 3. Рост уровня поляризации флуоресценции
дипиридамола при титровании белыми тенями эритро-
цитов в средах, содержащих: 1 – 0,15 моль/л NaCl, 10
ммоль/л трис(рН 7,4); 2 – 0,12 моль/л Na2SO4 , 10 ммоль/л
трис(рН 7,4).
Fig. 3. Rise in the dipyridamole fluorescence polarisation
rate when titering the erythrocyte ghost in media, contain-
ing 0.15 mol/l NaCl, 10 mmol/l tris (рН 7.4) (1); 0.12 mol/l
Na2SO4, 10 mmol/l tris (рН 7.4).
are not presented). Thus, the experiments on
investigation of DIDS and PEG-1500 effect on
dipyridamole’s fluorescence polarisation show that no
binding of dipyridamole in erythrocytes membrane anion
channel occurs in sulfate medium comparing with the
chloride one. Nevertheless, the experiments on the
studying of blocking the proton influx into cells point to
the contrary one. On one hand, the H+ ions transport
in sulfate medium, accompanying the sulfate influx [11],
is blocked by dipyridamole (see Fig. 1). On other hand
the change of chloride for sulfate in extracellular
medium eliminate both the dipyridamole binding in anion
channel (Fig. 3, 4) and the blocking of sulfate transport
by this inhibitor [6]. Spectro-fluorometrical data (Fig.
3, 4) could be interpreted taking into account the fact,
that dipyridamole does not bind in anion channel in
sulfate medium, and this phenomenon is possible in
presence of chloride anions [6].
When supposing the dipyridamole binding in the
channel could be chloride catalysed, resulted from the
Jacobs-Stewart cycle functioning in the erythrocytes,
placed into sulphate medium. This outcome of chloride
is accompanied by a fast acidification of cell suspension,
and the following alkalisation reflects the chloride
exchange for extracellular sulfate and proton [11].
Dipyridamole and erythrocytes anion channel
interaction in sulfate medium, mediated by chloride
outcome, will proceed by the same mechanism, as for
17ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
заместители пронизывают гидрофобное ядро
мицеллы. Даже в системе с положительно
заряженными мицеллами при низком рН, когда
отталкивание между протонированными молеку-
лами дипиридамола и положительно заряженными
0
0,05
0,1
0,15
0 100 200 300 400 500
1
2
0
0,05
0,1
0,15
0 100 200 300 400 500
1
2
Белок, мкг/мл
Protein, µg/ml
Белок, мкг/мл
Protein, µg/ml
П
ол
яр
из
ац
ия
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
Fl
uo
re
sc
en
ce
p
ol
ar
is
at
io
n
Рис. 4. Влияние ДИДС и ПЭГ-1500 на рост уровня поляризации флуоресценции дипиридамола при титровании
белыми тенями эритроцитов; эритроциты обработаны ДИДС перед выделением белых теней: а – 1 – 0.15 моль/л
NaCl, 10 ммоль/л трис(рН7.4); 2 – 0,12 моль/л Na2SO4, 10 ммоль/л трис (рН 7.4). б – 1 – 0.15 моль/л NaCl, 10 ммоль/л
трис(рН 7.4) +ПЭГ-1500(15%), 2 – 0,12 моль/л Na2SO4 , 10 ммоль/л трис(рН7.4)+ПЭГ-1500(15%).
Fig. 4. Rise in the dipyridamole fluorescence polarisation rate when titering the erythrocyte ghost; erythrocytes were
preliminarily treated with DIDS before ghosts obtaining in the media, containing a – 1 – 0.15 mol/l NaCl, 10 mmol/l tris (рН
7.4); 2 – 0.12 mol/l Na2SO4, 10 mmol/l tris (рН 7.4); b – 1 – 0.15 mol/l NaCl, 10 mmol/l tris (рН 7.4) +PEG-1500 (15%), 2 – 0,12
mol/l Na2SO4 , 10 mmol/l tris (рН 7.4)+PEG-1500(15%).
П
ол
яр
из
ац
ия
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
Fl
uo
re
sc
en
ce
p
ol
ar
is
at
io
n
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 10 20 30 40 50
1
2
the chloride medium [6], i.e. neutralisation of a positive
charge by chloride anion in substrate channel leads to
the opening of hydrophobic “pocket” and incorporation
of blocking agent into it. Taking this fact into account,
the cells were loaded with fluoride, which initiates the
dipyridamole binding in erythrocyte anion channel in
lesser extent comparing to chloride. Fig. 5 shows the
results on inhibitor action of dipyridamole on H+ ions
influx into erythrocytes, containing various anions. As
supposed, the change of intracellular chloride for
fluoride leads to decrease in inhibitor action of
dipyridamole, that is in concordance with the data of
paper [6]. In contrast to DIDS dipyridamole is classified
as an anion channel inhibitor, which blocks the channels
of anion access to transport site [5]. As it was stated
above, its binding is mediated by interaction with
channel hydrophobic site [6]. Investigation of
dipyridamole molecule localisation in detergent micelles
showed that molecule’s polarised part was in polar
zone, and non-polar substitutes transpierce the micelle
hydrophobic nucleus. Even in the system with positively
charged micelles at low pH, where the repulsion
between protonated dipyridamole molecules and
positively charged micelles surfaces decreases the
dissociation constant in 100 times, it localises inside
the micelles [2]. This points to a highly expressed
hydrophobic properties of dipyridamole molecule. PEGs
are known to be in concurrence with phospholipid polar
heads in membranes for water binding, as well as to
have a structuring effect to water layer around
Рис.5. Ингибирование дипиридамолом транспорта
ионов Н+ при замене внутриклеточного хлорида на
фторид: 1 – нормальные хлоридсодержащие эритро-
циты; 2 – эритроциты, нагруженные фторидом.
Fig. 5. Dipyridamole inhibition of H+ ion transport at the
exchange of intracellular chloride for fluoride: 1 – normal
chloride containing erythrocytes; 2 – fluoride loaded eryth-
rocytes.
Дипиридамол, мкмоль/л
Dipyridamole, µmol/l
И
нг
иб
ир
ов
ан
ие
,
%
In
hi
bi
tio
n,
%
a a б b
18ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
polymers [7]. Changes in solvating properties of water
affect the dielectric constants of PEG solutions and
membrane surface [10]. All this can lead to the
exclusion of hydrophobic probes from proteins
microenvironment and membrane [1]. In addition, the
changes in dielectric properties of incubation medium
will result in dipyridamole’s rearrangement between
membrane and solution, as well as in prevention of its
entering to membrane.
Conclusions
The obtained results allow to assume that H+ ions
transport into erythrocytes, placed into sulphate
medium, reflects only the part of intracellular chloride
and extracellular sulphate exchange. Inhibition of this
exchange share by dipyridamole is determined by
presence of chloride anions in intracellular medium.
PEG-1500 suppresses the dipyridamole binding in
membrane anion channel and decreases the blocking
ability of this inhibitor to H+ ions transport into
erythrocytes. This polymer action is associated with
the rearrangement of dipyridamole between membrane
and solution.
поверхностями мицелл снижает константу диссо-
циации в 100 раз, все равно он локализуется внутри
мицелл [2]. Это указывает на высокую гидрофоб-
ность молекулы дипиридамола. Известно, что ПЭГ
конкурируют с полярными головками фосфоли-
пидов в мембранах за связывание воды, оказыва-
ют структурирующее действие на слой воды,
прилегающий к полимеру [7]. Изменение сольва-
тационных свойств воды приводит к изменению
диэлектрических констант растворов ПЭГ и
мембранной поверхности [10]. Все это может
способствовать вытеснению гидрофобных зондов
из поверхностей белка и мембраны [1], а изме-
нение диэлектрических свойств среды инкубации –
перераспределению дипиридамола между мем-
браной и раствором и препятствовать поступлению
его в мембрану.
Выводы
Полученные результаты позволяют предпо-
ложить, что транспорт ионов Н+ в эритроциты,
внесенные в сульфатную среду, отражает только
часть объема обмена внутриклеточного хлорида
на внеклеточный сульфат. Ингибирование этой
доли обмена дипиридамолом определяется
присутствием анионов хлорида во внутриклеточной
среде. ПЭГ-1500 подавляет связывание дипири-
дамола в анионном канале мембран и снижает
блокирующую способность данного ингибитора на
транспорт ионов Н+ в эритроциты. Это действие
полимера связано с перераспределением дипирида-
мола между мембраной и раствором.
Литература
Моисеев В.А., Зинченко В.Д., Нардид О.А. О некоторых
молекулярных механизмах криозащиты биологических
объектов // Физико-химические процессы в криобиоло-
гических системах.– Харьков, 1991.– C.78-92.
Borissevitch I.E., Borges C.P.F.,Yushmanov V.E.,Tabak M.
Localization of dipyridamole molecules in ionic micelles: effect
of micelle and drug charges // Biochim. Biophys. Acta.– 1995.–
Vol.1238.– P. 57-62.
Davio S.R., Low F.S. Characterization of the calorimetric C
transition of the human erythrocyte membrane // Biochemistry.–
1982.– Vol.21.– P. 3585-3593.
Falke J.J., Chan S.I. Molecular mechanisms of band 3
inhibitors.1.Transport site inhibitors // Biochemistry.– 1986.–
Vol.25.– P. 7888-7894.
Falke J.J., Chan S.I. Molecular mechanisms of band 3
inhibitors. 2. Channel blockers // Biochemistry.– 1986.–
Vol.25.– P. 7895-7898.
Legrum B., Passow H. Inhibition of inorganic anion transport
across the human red blood cell membrane by chloride-
dependent association of dipyridamole with a stilbene
disulfonate binding site on the band 3 protein // Biochim.
Biophys.Acta.– 1989.– Vol.979, N2.– P. 193-207.
Lehtonen J.Y., Kinnunen P.K. Poly(ethylene glycol)-induced
and temperature-dependent phase separation in fluid binary
phospholipid membranes // Biophys. J.– 1995.– Vol.68.– P. 525-535.
References
Moyiseev V.A., Zinchenko V.D., Nardid O.A. Some molecular
mechanisms in cryoprotection of biological objects //
Physicochemical processes in cryobiological systems.–
Kharkov, 1991.– P. 78-92.
Borissevitch I.E., Borges C.P.F.,Yushmanov V.E.,Tabak M.
Localization of dipyridamole molecules in ionic micelles: effect
of micelle and drug charges // Biochim. Biophys. Acta.– 1995.–
Vol.1238.– P. 57-62.
Davio S.R., Low F.S. Characterization of the calorimetric C
transition of the human erythrocyte membrane // Biochemistry.–
1982.– Vol.21.– P. 3585-3593.
Falke J.J., Chan S.I. Molecular mechanisms of band 3
inhibitors.1.Transport site inhibitors // Biochemistry.– 1986.–
Vol.25.– P. 7888-7894.
Falke J.J., Chan S.I. Molecular mechanisms of band 3
inhibitors. 2. Channel blockers // Biochemistry.– 1986.–
Vol.25.– P. 7895-7898.
Legrum B., Passow H. Inhibition of inorganic anion transport
across the human red blood cell membrane by chloride-
dependent association of dipyridamole with a stilbene
disulfonate binding site on the band 3 protein // Biochim.
Biophys.Acta.– 1989.– Vol.979, N2.– P. 193-207.
Lehtonen J.Y., Kinnunen P.K. Poly(ethylene glycol)-induced
and temperature-dependent phase separation in fluid binary
phospholipid membranes // Biophys. J.– 1995.– Vol.68.– P. 525-535.
Moribe K., Maruyama K., Iwatsuru M. Estimation of surface
state of poly(ethylene glycol)-coated liposomes using an
aqueous two-phase partitioning technique // Chem. Pharm.
Bull. (Tokyo).– 1997.– Vol.45.– P. 1683-1687.
Neu B., Armstrong J.K., Fisher T.C., Meiselman H.J. Surface
characterization of poly(ethylene glycol) coated human red
blood cells by particle electrophoresis // Biorheology.– 2003.–
Vol.40.– P. 477-487.
Ohki S., Arnold K. Surface dielectric constant, surface
hydrophobicity and membrane fusion // J.Membr. Biol.– 1990.–
Vol.114.– P. 195-203.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
19ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2003, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2003, №4
Moribe K., Maruyama K., Iwatsuru M. Estimation of surface
state of poly(ethylene glycol)-coated liposomes using an
aqueous two-phase partitioning technique // Chem. Pharm.
Bull. (Tokyo).– 1997.– Vol.45.– P. 1683-1687.
Neu B., Armstrong J.K., Fisher T.C., Meiselman H.J. Surface
characterization of poly(ethylene glycol) coated human red
blood cells by particle electrophoresis // Biorheology.– 2003.–
Vol.40.– P. 477-487.
Ohki S., Arnold K. Surface dielectric constant, surface
hydrophobicity and membrane fusion // J. Membr. Biol.–
1990.– Vol.114.– P. 195-203.
Romano L., Passow H. Characterization of anion transport
system in trout red blood cell // Am. J. Physiol.– 1984.–
Vol.246.– P. 330-338.
Поступила 04.11.2003
8.
9.
10.
11.
11. Romano L., Passow H. Characterization of anion transport
system in trout red blood cell // Am. J. Physiol.– 1984.–
Vol.246.– P. 330-338.
Accepted in 04.11.2003
|