Состояние гена gata2 в стволовых кроветворных клетках реципиентов с болезнью «трансплантат против хозяина», индуцированной аллогенным криоконсервированным материалом

Существенной проблемой трансплантации гистонесовместимого костного мозга (КМ) является развитие иммунного конфликта, который клинически манифестируется в виде болезни «трансплантат против хозяина» (БТПХ). На модели экспериментально индуцированной БТПХ изучено состояние кроветворной системы животны...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Datum:	2015
Hauptverfasser:	Гольцев, А.Н., Дубрава, Т.Г., Гаевская, Ю.А., Луценко, Е.Д., Останков, М.В.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2015
Schriftenreihe:	Проблемы криобиологии и криомедицины
Schlagworte:	Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология
Online Zugang:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/140000
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Состояние гена gata2 в стволовых кроветворных клетках реципиентов с болезнью «трансплантат против хозяина», индуцированной аллогенным криоконсервированным материалом / А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Ю.А. Гаевская, Е.Д. Луценко, М.В. Останков // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2015. — Т. 25, № 1. — С. 67–75. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-140000
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1400002018-06-22T03:03:02Z Состояние гена gata2 в стволовых кроветворных клетках реципиентов с болезнью «трансплантат против хозяина», индуцированной аллогенным криоконсервированным материалом Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Гаевская, Ю.А. Луценко, Е.Д. Останков, М.В. Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Существенной проблемой трансплантации гистонесовместимого костного мозга (КМ) является развитие иммунного конфликта, который клинически манифестируется в виде болезни «трансплантат против хозяина» (БТПХ). На модели экспериментально индуцированной БТПХ изучено состояние кроветворной системы животных. Патологию индуцировали введением нативного или криоконсервированного аллогенного КМ совместно с клетками лимфоузлов. Определяли уровень экспрессии гена gata2 в стволовых кроветворных клетках (СКК) КМ реципиентов с БТПХ. В работе использовали методы криоконсервирования, иммунофлуоресценции, ПЦР-анализа с этапом обратной транскрипции. Показано увеличение в клетках КМ уровня экспрессии гена gata2, отвечающего за самоподдержание СКК, на фоне изменения их субпопуляционного состава, что может приводить к снижению медуллярного кроветворения животных с БТПХ. В группе животных с БТПХ, индуцированной аллогенным криоконсервированным КМ с высоким уровнем экспрессии гена gata2, наблюдался низкий уровень медуллярного кроветворения. Данный факт подчеркивает значимость ингибирующего эффекта криоконсервирования в отношении функционального статуса СКК, выражающегося в данном случае снижением их дифференцировочного потенциала и восстановления медуллярного кроветворения. Проведенные исследования расширяют наше представление о механизмах развития БТПХ на клеточном и молекулярном уровнях, что может обосновать целесообразность направленного повышения эффективности лечения одной из форм аутоиммунных патологий. Істотною проблемою трансплантації гістонесумісного кісткового мозку (КМ) є розвиток імунного конфлікту, який клінічно маніфестується у вигляді хвороби «трансплантат проти хазяїна» (ХТПХ). На моделі експериментально індукованої ХТПХ було вивчено стан кровотвірної системи тварин. Патологію індукували введенням нативного або кріоконсервованого алогенного КМ разом із клітинами лімфовузлів. Визначено рівень експресії гена gata2 у стовбурових кровотвірних клітинах (СКК) КМ реципієнтів із ХТПХ. У роботі використовували методи кріоконсервування, імунофлуоресценції, ПЛР-аналізу з етапом зворотної транскрипції. Показано збільшення у клітинах КМ експресії гена gata2, який відповідає за самопідтримку СКК, на тлі зміни їхнього субпопуляційного складу, що може приводити до зниження медулярного кровотворення тварин із ХТПХ. У групі тварин із ХТПХ, яку було індуковано кріоконсервованим алогенним КМ із високим рівнем експресії гена gata2, спостерігався низький рівень медулярного кровотворення. Даний факт підкреслює значущість інгібуючого ефекту кріоконсервування щодо функціонального статусу СКК, який виражається в даному випадку як зниження їх диференціювального потенціалу та відновлення медулярного кровотворення. Проведені дослідження розширюють нашу уяву про механізми розвитку ХТПХ на клітинному й молекулярному рівнях, що може обґрунтувати доцільність спрямованого підвищення ефективності лікування однієї з форм аутоімунних патологій. A significant problem of transplantation of histoincompatible bone marrow (BM) is the development of an immune conflict, which is clinically manifested as the graft-versus-host disease (GVHD). This paper concerns the state of hematopoietic system in animals under conditions of experimentally induced GVHD. The pathology was induced by introduction of either native or cryopreserved allogeneic BM jointly with lymph node cells. The rate of gata2 gene expression was examined in hematopoietic stem cells (HSCs) of BMs from the recipients with GVHD. Methods of cryopreservation, immune fluorescence, and RT-PCR were used in the research. Bone marow cells exhibited an increased expression of gata2 gene, responsible for self-maintenance of HSCs, as well as changed subpopulation composition, that could lead to the reduction of the medullary haematopoiesis in GVHD animals. In the group of animals with GVHD, induced by allogeneic cryopreserved BM with a high level of gata2 gene expression, a low rate of medullary haematopoiesis was found. This fact emphasizes the importance of inhibitory effect rendered by cryopreservation in terms of functional status of the HSCs, which is manifested in this case as the decrease of their differentiation potential and recovery of medullary haematopoiesis. The performed studies expand our understanding about the mechanisms of GVHD at cell and molecular levels, which may prove the expediency of the directed elevation of efficiency in the treatment of one of autoimmune pathologies. 2015 Article Состояние гена gata2 в стволовых кроветворных клетках реципиентов с болезнью «трансплантат против хозяина», индуцированной аллогенным криоконсервированным материалом / А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Ю.А. Гаевская, Е.Д. Луценко, М.В. Останков // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2015. — Т. 25, № 1. — С. 67–75. — Бібліогр.: 17 назв. — рос. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/140000 611.018.5:57.083.324 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология
spellingShingle	Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Гаевская, Ю.А. Луценко, Е.Д. Останков, М.В. Состояние гена gata2 в стволовых кроветворных клетках реципиентов с болезнью «трансплантат против хозяина», индуцированной аллогенным криоконсервированным материалом Проблемы криобиологии и криомедицины
description	Существенной проблемой трансплантации гистонесовместимого костного мозга (КМ) является развитие иммунного конфликта, который клинически манифестируется в виде болезни «трансплантат против хозяина» (БТПХ). На модели экспериментально индуцированной БТПХ изучено состояние кроветворной системы животных. Патологию индуцировали введением нативного или криоконсервированного аллогенного КМ совместно с клетками лимфоузлов. Определяли уровень экспрессии гена gata2 в стволовых кроветворных клетках (СКК) КМ реципиентов с БТПХ. В работе использовали методы криоконсервирования, иммунофлуоресценции, ПЦР-анализа с этапом обратной транскрипции. Показано увеличение в клетках КМ уровня экспрессии гена gata2, отвечающего за самоподдержание СКК, на фоне изменения их субпопуляционного состава, что может приводить к снижению медуллярного кроветворения животных с БТПХ. В группе животных с БТПХ, индуцированной аллогенным криоконсервированным КМ с высоким уровнем экспрессии гена gata2, наблюдался низкий уровень медуллярного кроветворения. Данный факт подчеркивает значимость ингибирующего эффекта криоконсервирования в отношении функционального статуса СКК, выражающегося в данном случае снижением их дифференцировочного потенциала и восстановления медуллярного кроветворения. Проведенные исследования расширяют наше представление о механизмах развития БТПХ на клеточном и молекулярном уровнях, что может обосновать целесообразность направленного повышения эффективности лечения одной из форм аутоиммунных патологий.
format	Article
author	Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Гаевская, Ю.А. Луценко, Е.Д. Останков, М.В.
author_facet	Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Гаевская, Ю.А. Луценко, Е.Д. Останков, М.В.
author_sort	Гольцев, А.Н.
title	Состояние гена gata2 в стволовых кроветворных клетках реципиентов с болезнью «трансплантат против хозяина», индуцированной аллогенным криоконсервированным материалом
title_short	Состояние гена gata2 в стволовых кроветворных клетках реципиентов с болезнью «трансплантат против хозяина», индуцированной аллогенным криоконсервированным материалом
title_full	Состояние гена gata2 в стволовых кроветворных клетках реципиентов с болезнью «трансплантат против хозяина», индуцированной аллогенным криоконсервированным материалом
title_fullStr	Состояние гена gata2 в стволовых кроветворных клетках реципиентов с болезнью «трансплантат против хозяина», индуцированной аллогенным криоконсервированным материалом
title_full_unstemmed	Состояние гена gata2 в стволовых кроветворных клетках реципиентов с болезнью «трансплантат против хозяина», индуцированной аллогенным криоконсервированным материалом
title_sort	состояние гена gata2 в стволовых кроветворных клетках реципиентов с болезнью «трансплантат против хозяина», индуцированной аллогенным криоконсервированным материалом
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2015
topic_facet	Криомедицина, клиническая и экспериментальная трансплантология
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/140000
citation_txt	Состояние гена gata2 в стволовых кроветворных клетках реципиентов с болезнью «трансплантат против хозяина», индуцированной аллогенным криоконсервированным материалом / А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Ю.А. Гаевская, Е.Д. Луценко, М.В. Останков // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2015. — Т. 25, № 1. — С. 67–75. — Бібліогр.: 17 назв. — рос.
series	Проблемы криобиологии и криомедицины
work_keys_str_mv	AT golʹcevan sostoâniegenagata2vstvolovyhkrovetvornyhkletkahrecipientovsboleznʹûtransplantatprotivhozâinainducirovannojallogennymkriokonservirovannymmaterialom AT dubravatg sostoâniegenagata2vstvolovyhkrovetvornyhkletkahrecipientovsboleznʹûtransplantatprotivhozâinainducirovannojallogennymkriokonservirovannymmaterialom AT gaevskaâûa sostoâniegenagata2vstvolovyhkrovetvornyhkletkahrecipientovsboleznʹûtransplantatprotivhozâinainducirovannojallogennymkriokonservirovannymmaterialom AT lucenkoed sostoâniegenagata2vstvolovyhkrovetvornyhkletkahrecipientovsboleznʹûtransplantatprotivhozâinainducirovannojallogennymkriokonservirovannymmaterialom AT ostankovmv sostoâniegenagata2vstvolovyhkrovetvornyhkletkahrecipientovsboleznʹûtransplantatprotivhozâinainducirovannojallogennymkriokonservirovannymmaterialom
first_indexed	2025-07-10T02:56:16Z
last_indexed	2025-07-10T02:56:16Z
_version_	1837226973346136064
fulltext	УДК 611.018.5:57.083.324 А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Ю.А. Гаевская, Е.Д. Луценко, М.В. Останков Состояние гена gata2 в стволовых кроветворных клетках реципиентов с болезнью «трансплантат против хозяина», индуцированной аллогенным криоконсервированным материалом UDC 611.018.5:57.083.324 A.N. Goltsev, T.G. Dubrava, Yu.A. Gaevskaya, E.D. Lutsenko, M.V. Ostankov State of gata2 Gene in Hematopoietic Stem Cells of Recipients With Graft Versus Host Disease Induced by Cryopreserved Allogeneic Material Реферат: Существенной проблемой трансплантации гистонесовместимого костного мозга (КМ) является развитие иммунного конфликта, который клинически манифестируется в виде болезни «трансплантат против хозяина» (БТПХ). На модели экспериментально индуцированной БТПХ изучено состояние кроветворной системы животных. Патологию инду- цировали введением нативного или криоконсервированного аллогенного КМ совместно с клетками лимфоузлов. Определяли уровень экспрессии гена gata2 в стволовых кроветворных клетках (СКК) КМ реципиентов с БТПХ. В работе использовали методы криоконсервирования, иммунофлуоресценции, ПЦР-анализа с этапом обратной транскрипции. Показано увеличение в клетках КМ уровня экспрессии гена gata2, отвечающего за самоподдержание СКК, на фоне изменения их субпопуляционного состава, что может приводить к снижению медуллярного кроветворения животных с БТПХ. В группе животных с БТПХ, индуцированной аллогенным криоконсервированным КМ с высоким уровнем экспрессии гена gata2, наблюдался низкий уровень медуллярного кроветворения. Данный факт подчеркивает значимость ингибирующего эффекта криоконсерви- рования в отношении функционального статуса СКК, выражающегося в данном случае снижением их дифференцировочного потенциала и восстановления медуллярного кроветворения. Проведенные исследования расширяют наше представление о механизмах развития БТПХ на клеточном и молекулярном уровнях, что может обосновать целесообразность направ- ленного повышения эффективности лечения одной из форм аутоиммунных патологий. Ключевые слова: болезнь «трансплантат против хозяина», стволовые кроветворные клетки, ген gata2. Реферат: Істотною проблемою трансплантації гістонесумісного кісткового мозку (КМ) є розвиток імунного конфлікту, який клінічно маніфестується у вигляді хвороби «трансплантат проти хазяїна» (ХТПХ). На моделі експериментально індукованої ХТПХ було вивчено стан кровотвірної системи тварин. Патологію індукували введенням нативного або кріоконсервованого алогенного КМ разом із клітинами лімфовузлів. Визначено рівень експресії гена gata2 у стовбурових кровотвірних клітинах (СКК) КМ реципієнтів із ХТПХ. У роботі використовували методи кріоконсервування, імунофлуоресценції, ПЛР-аналізу з етапом зворотної транскрипції. Показано збільшення у клітинах КМ експресії гена gata2, який відповідає за самопідтримку СКК, на тлі зміни їхнього субпопуляційного складу, що може приводити до зниження медулярного кровотворення тварин із ХТПХ. У групі тварин із ХТПХ, яку було індуковано кріоконсервованим алогенним КМ із високим рівнем експресії гена gata2, спостерігався низький рівень медулярного кровотворення. Даний факт підкреслює значущість інгібуючого ефекту кріоконсер- вування щодо функціонального статусу СКК, який виражається в даному випадку як зниження їх диференціювального потенціалу та відновлення медулярного кровотворення. Проведені дослідження розширюють нашу уяву про механізми розвитку ХТПХ на клітинному й молекулярному рівнях, що може обґрунтувати доцільність спрямованого підвищення ефек- тивності лікування однієї з форм аутоімунних патологій. Ключові слова: хвороба «трансплантат проти хазяїна», стовбурові кровотвірні клітини, ген gata2. Abstract: A significant problem of transplantation of histoincompatible bone marrow (BM) is the development of an immune conflict, which is clinically manifested as the graft-versus-host disease (GVHD). This paper concerns the state of hematopoietic system in animals under conditions of experimentally induced GVHD. The pathology was induced by introduction of either native or cryopreserved allogeneic BM jointly with lymph node cells. The rate of gata2 gene expression was examined in hematopoietic stem cells (HSCs) of BMs from the recipients with GVHD. Methods of cryopreservation, immune fluorescence, and RT-PCR were used in the research. Bone marow cells exhibited an increased expression of gata2 gene, responsible for self-maintenance of HSCs, as well as changed subpopulation composition, that could lead to the reduction of the medullary haematopoiesis in GVHD animals. In the group of animals with GVHD, induced by allogeneic cryopreserved BM with a high level of gata2 gene expression, a low rate of medullary haematopoiesis was found. This fact emphasizes the importance of inhibitory effect rendered by cryopreservation in terms of functional status of the HSCs, which is manifested in this case as the decrease of their differentiation potential and recovery of medullary haematopoiesis. The performed studies expand our understanding about the mechanisms of GVHD at cell and molecular levels, which may prove the expediency of the directed elevation of efficiency in the treatment of one of autoimmune pathologies. Key words: graft-versus-host disease, hematopoietic stem cells, gata2 gene. Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию: ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38 057) 373-57-89, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта: cryopato@gmail.com To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 5789, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryopato@gmail.com Department of Cryophysiology, Institute for Problems of Cryobiol- ogy and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Отдел криопатофизиологии и иммунологии, Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Поступила 30.09.2014 Принята в печать 12.11.2014 Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2015. – Т. 25, №1. – С. 67–75. © 2015 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины Received September, 30, 2014 Accepted November, 12, 2014 Probl. Cryobiol. Cryomed. 2015. 25(1): 67–75. © 2015 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine оригинальное исследование research article 68 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 Неоднократно отмечалось, что применение аллогенной кроветворной ткани для лечения гема- тологических и онкологических заболеваний, иммунодефицитных состояний и других патологий вызывает развитие болезни «трансплантат против хозяина» (БТПХ) и сопровождается нарушением кроветворения на самых разных уровнях [3, 10, 12, 16]. В связи с этим очевидна актуальность иссле- дований, направленных на расшифровку механиз- мов развития и предупреждения БТПХ [9, 12, 13]. Результаты наших предыдущих исследований про- демонстрировали выраженное нарушение состоя- ния T-регуляторного звена иммунитета при разви- тии БТПХ [1]. Известно, что Т-лимфоциты, кроме реализации сугубо иммунного потенциала, имеют широкий спектр регуляторной активности в отно- шении гемопоэтической системы [6]. Поэтому представляло интерес определить популяционный состав кроветворных клеток стволового компарт- мента, а также уровень экспрессии генов, контроли- рующих кроветворение реципиентов с БТПХ. Данные исследования могут дать дополнительную информацию для понимания механизмов развития этой патологии. Известно, что gata2 является транскрипционным фактором, который экспрес- сируется в стволовых кроветворных клетках (СКК) и их предшественниках [11, 15]. Важность функ- ционирования гена gata2 подтверждается тем, что его целенаправленная инактивация приводит к летальному исходу [15]. Установлено, что вслед- ствие повышения экспрессии гена gata2 происхо- дит ингибирование G0-фазы клеточного цикла CКК, а также их предшественников in vitro и in vivo [14]. Весьма интересным представляется исследование состояния этого гена на фоне разви- тия БТПХ. Во многоступенчатом процессе аппликации кле- ток костного мозга (КМ) в клинической практике обязательным компонентом является их криокон- сервирование, которое позволяет долговременно хранить биоматериал в условиях низкотемператур- ных банков и использовать его по мере востребо- ванности. Ранее нами было получено эксперимен- тальное подтверждение возможности снижения тяжести протекания БТПХ путем применения криоконсервированного аллогенного КМ [2]. В дан- ном случае элиминация определенных субпопуля- ций клеток аллогенного КМ, наблюдаемая после криоконсервирования, может рассматриваться как позитивный момент, обуславливая минимизацию проявления его иммунореактивности. Оценка гемопоэтической системы реципиента с БТПХ на клеточном и молекулярном уровнях позволит рас- ширить наше представление о механизмах раз- вития этой патологии. There is a widespread opinion that the use of allogeneic hematopoietic tissue to treat hematological and oncological diseases, immunodeficient states and other pathologies causes the development of graft- versus-host disease (GVHD) and could be accompa- nied with impaired haematopoiesis of different depth [4, 8, 11, 16]. Therefore the relevance of studies targeted to elucidation of the mechanisms of developing and preventing GVHD is evident [1, 11, 12]. The results of our previous studies have shown the marked impair- ment of T-regulatory immunity link under GVHD deve- lopment [2]. In addition to their direct immune function T lymphocytes are known as possessing a wide range of regulatory activities in respect of hematopoietic system [10]. Therefore, it was of interest to examine the population of hematopoietic stem cells, as well as the rate of genes expression, controlling the hemato- poiesis of the recipients with GVHD. These studies may provide an additional information for understanding the mechanisms of this pathology development. It is known, that gata2 is a transcription factor, expressed in hematopoietic stem cells (HSCs) and their proge- nitors [9, 15]. The importance of gata2 gene functio- ning is confirmed by the fact that its targeted inacti- vation leads to a lethal outcome [15]. It has been estab- lished that an increase of the gata2 gene expression resulted in an inhibition of G0-phase of the HSCs cell cycle, as well as their progenitors in vitro and in vivo [14]. Of interest could be the investigation of this gene functioning on the background of GVHD develop- ment. Multi-stage process of bone marrow (BM) cells application in clinical practice includes the cryopreser- vation as a mandatory step, allowing the storage of the biospecimen for a long time at low-temperature banks and their use on demand. We have previously confirmed experimentally the possibility of reducing the severity of GVHD proceeding by applying the cryo- preserved allogeneic BM [3]. In this case the elimina- tion of certain cell subpopulations in allogeneic BM after cryopreservation could be regarded as a positive moment, stipulating the minimal manifestation of its immune reactivity. Evaluation of the hematopoietic system of GVHD recipient at the cell and molecular levels would enhance our understanding about the me- chanisms of this pathology. The research aim was to determine the gata2 gene expression rate in hematopoietic stem cells of bone marrow of the recipients with the graft-versus-host disease, induced by the introduction of cryopreserved allogeneic material with lymphocyte cells. Materials and methods The experiments were performed in CBA/H and (CBA/H×C57Bl)F1 mice weighing 24–26 g. The studies проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 69 were carried out in accordance with General Principles of Experiments in Animals approved by the 5th Natio- nal Congress in Bioethics (Kiev, 2013) and coordinated with the statements of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experi- mental and Other Scientific Purposes (Strasbourg, 1986). Bone marrow cells were washed-out from the femurs, the inguinal lymph nodes were disintegrated in Potter’s homogenizer in medium 199 (Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides of Russian Academy of Medical Sciences, Russia) supplemented with 10% fetal bovine serum (BioloT, Russia) and 2% sodium citrate (hereinafter the hand- ling medium). The solution for BM cryopreservation was a hand- ling medium with 20% DMSO (Arterium, Ukraine). Suspension of BM cells in handling medium was dropwise mixed with the solution for cryopreservation in 1: 1 ratio at 22°C during 2–3 min (final cryoprotectant concentration was 10%). The cells were then exposed to the solution for 10 min at the stated temperature. The cell suspension was cooled with UOP-6 programm- able freezer (Special Designing Technical Bureau with Experimental Unit of the IPC&C NAS of Ukraine) according to two-stage program with a rate of 1 deg/min down to –25°C and following immersion into liquid nitrogen (–196°C) [3]. The BM cell suspension of 1.8 ml and concentration of 5×106 cells/ml was frozen in plastic vials (Nunc, Germany). The samples were warmed in a water bath at 40...41°C up to the disappearance of solid phase. Cells were once washed of DMSO by slow adding of a double volume of hand- ling medium and subsequent 10-min-long centrifugation (200g). The sediment was then diluted with a fresh portion of the handling medium and the content of nucleated cells was counted. The BM cell suspension, not subjected to freezing and thawing, would be defined hereinafter as native. Bone marrow recipients were (CBA/H×C57Bl)F1 mice, irradiated with RUM-17 (Mosrentgen, Russia) at a dose of 850 R, and then intravenously injected with 5×106/mouse either native or cryopreserved BM cells (CBA/H) with lymph node (LN) cells in 3: 1 ratio, respectively [5]. The irradiation conditions were as follows: 38.6 R/min dose rate, 220 kV voltage, 10 mA current, 0.5 mm Cu + 1 mm Al filters, 50 cm focal-dorsal length. The GVHD intensity was evaluated to the day 14 according to the spleen index (SI), state of medullary hematopoiesis, content of HSCs and survival of the recipients. Previous studies have shown the true deve- lopment of pathology in this model to the day 14 in terms of clinical and laboratory indices [5]. The SI was calculated as the ratio of the weights of spleen and entire body of the animals. In intact animals the SI Цель работы – определить уровень экспрессии гена gata2 в стволовых кроветворных клетках костного мозга реципиентов с болезнью «транс- плантат против хозяина», индуцированной введе- нием криоконсервированного аллогенного материа- ла с клетками лимфоцитов. Материалы и методы Эксперименты выполняли на мышах линии СВА/Н и (СВА/Н×С57Вl) F1 массой 24–26 г. Ис- следования проводили в соответствии с «Общими принципами экспериментов на животных», одоб- ренными V Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, 2013) и согласованными с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986). Клетки КМ вымывали из бедренных костей, паховые лимфоузлы дезинтегрировали в гомогени- заторе Поттера в среде 199 (Институт полиомие- лита и вирусных энцефалитов, Россия) с добавле- нием 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки («БиолоТ», Россия) и 2%-го цитрата натрия (далее в тексте – рабочая среда). Раствор для криоконсервирования КМ пред- ставлял собой рабочую среду с 20% ДМСО («Ар- териум», Украина). К полученной на рабочей среде суспензии клеток КМ по каплям добавляли раст- вор для криоконсервирования в соотношении 1:1 при температуре 22°С на протяжении 2–3 мин (конечная концентрация криопротектора составила 10%). Экспозицию клеток в растворе проводили в течение 10 мин при той же температуре. Охлажде- ние суспензии клеток КМ осуществляли на про- граммном замораживателе УОП-6 (СКТБ с ОП ИПКиК НАН Украины, Харьков) по двухэтапной программе со скоростью 1 град/мин до –25°С и последующим погружением в жидкий азот (–196°С) [2]. Суспензию клеток КМ объемом 1,8 мл с концентрацией 5×106 кл/мл замораживали в пластиковых ампулах («Nunc», Германия). Образцы отогревали на водяной бане при темпе- ратуре 40...41°С до исчезновения твердой фазы. Клетки однократно отмывали от ДМСО путем медленного добавления двойного объема рабочей среды и последующего 10-минутного центрифуги- рования (200g). Осадок разбавляли свежей порцией рабочей среды и подсчитывали содержание ядро- содержащих клеток. Суспензию клеток КМ, не подвергавшуюся процедуре замораживания-отог- рева, далее будем называть нативной. Реципиентами КМ были мыши (СВА/ Н×С57Вl)F1, облученные на установке РУМ-17 («Мосрентген», Россия) в дозе 850 Р, которым внутривенно вводили 5×106/мышь нативных или 70 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 криоконсервированных клеток КМ (СВА/Н) с клетками лимфоузлов (ЛУ) в соотношении 3:1 соот- ветственно [4]. Условия облучения: мощность дозы – 38,6 Р/мин, напряжение – 220 кВ, сила тока – 10 мА, фильтры – 0,5 мм Cu + 1 мм Al, фокусно-дорзальное расстояние – 50 см. Интенсивность развития БТПХ оценивали на 14-е сутки по индексу селезенки, состоянию медул- лярного кроветворения, содержанию СКК и выжи- ваемости реципиентов. В ранее проведенных исследованиях показано развитие патологии в дан- ной модели к 14-м суткам по клиническим и лабо- раторным показателям [4]. Индекс селезенки (ИС) рассчитывали как соотношение массы органа к массе тела животных. У интактных животных ИС принимали за 1, показатель более 1,3 указывал на развитие БТПХ [8, 9] . Животные были разделены на следующие груп- пы: 1 – интактные животные (интактный контроль); 2 – мыши, которым вводили сингенный КМ (син- генный контроль); 3 – мыши, у которых индуциро- вали БТПХ введением аллогенного нативного КМ совместно с клетками лимфоузлов – БТПХ (нКМ + ЛУ); 4 – мыши, у которых индуцировали БТПХ введением аллогенного криоконсервированного КМ совместно с клетками лимфоузлов – БТПХ (кКМ + ЛУ). Содержание CD34+CD38– и CD117+-клеток в КМ животных с БТПХ оценивали на проточном цитофлуориметре «FACS Calibur» («Becton Dickin- son», США), используя моноклональные антимы- шиные антитела CD117 (FITC), CD34 (PE), CD38 (FІTC) («BD Biosciences», США; «Abcam», Вели- кобритания) согласно инструкции производителя. Статистический учет данных, полученных цито- флуориметрическим анализом, осуществляли с помощью программы «WinMDI 2.8.» (J. Trotter). Для оценки скорости восстановления медулляр- ного кроветворения нами был введен такой пока- затель, как индекс дифференцировки СКК, пред- ставляющий собой соотношение содержания менее потентных СКК (CD117+) к более потентным (CD34+CD38–). Фракцию СКК получали из КМ мышей мето- дом позитивной селекции с применением магнит- ного сортера («BD ImagnetTM», США) и CD117 «MicroBeads» («Miltenyi Biotec», США) согласно протоколу производителя. Содержание транскриптов гена gata2 в выде- ленной CD117+-фракции КМ животных всех групп определяли с помощью ПЦР-анализа с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) [7]. Для выде- ления нуклеиновых кислот из 1×105 кл использо- вали набор «Diatom RNA Prep 100» («Isogene Lab», Россия), содержащий лизирующий реагент – гуани- was assumed as 1, the index of more than 1.3 indicated the GVHD development [1, 13]. The animals were divided into the following groups: group 1 comprised intact animals (intact control); group 2 were the mice injected with syngeneic BM (syn- geneic control); group 3 consisted of the mice with GVHD, induced by introduction of allogeneic native BM with lymph node cells – GVHD (nBM + LN); group 4 was the mice with GVHD, induced by intro- duction of cryopreserved allogeneic BM with lymph node cells – GVHD (cBM + LN). The content of CD34+CD38– and CD117+ cells in the BM of animals with GVHD was evaluated with flow cytometer FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) using the monoclonal anti-mouse antibodies CD117 (FITC), CD34 (PE), CD38 (F²TC) (BD Bio- sciences, USA; Abcam, UK) according to the manu- facturers’ instructions. The data of flow cytometric analysis were statisticaly processed using the WinMDI 2.8 software (J. Trotter). To estimate the recovery rate of medullary hemato- poiesis we introduced the differentiation index of HSCs, which was the ratio of the content of less potent HSCs (CD117+) to more potent ones (CD34+CD38–). HSCs fraction was derived from the mice by posi- tive selection using magnetic sorter (BD ImagnetTM, USA) and CD117 MicroBeads (Miltenyi Biotec, USA) according to the manufacturers’ protocols. The contents of gata2 gene transcripts in isolated CD117+ BM fraction of the animals of all the groups were determined by PCR with a reverse transcription (RT-PCR) [7]. The nucleic acids from 1×105 cells were isolated using the Diatom RNA Prep 100 kit (Isogene Lab, Russia) containing guanidine thiocyanate lysis buffer. The RT-PCR was performed with a set of random-oligonucleotides and revertase (M-Mlv) accor- ding to the manufacturer’s instructions (Reverta L, Russia). The primers of the studied genes: gata2 (NM_008324.1, fragment length of 342 pn) and beta actin (NM_007393.3, fragment length of 113 pn) were developed on the basis of the GenBank database (NCBI BLAST, USA) and synthesized at the JSC Medbioservis (Ukraine). DNA fragments were amplified in Tertsik incubator (JSC SPC DNA Technology, Russia). Denaturation was carried-out at 94°C for 30 seconds, the matrix hybridization was made with a primer at 60°C for 30 seconds and elongation at 72°C for 60 seconds. After PCR finishing the elongation was performed at 72°C for 5 min. The number of cycles for gata2 gene was 40 and 20 for beta actin. The detection of amplification products and comparative assessment of their amount were done with capillary electrophoresis chip bioanaly- zer Agilent 2100 (Agilent Technologies, USA), basing on a relative semi-quantitative scoring. The chips were проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 71 prepared according to the manufacturer’s instructions using the DNA 1000 chip kit (Fermentas, Lithuania). The results were normalized by values of ‘house- keeping’ beta actin gene expression. The obtained data were statistically processed by the Student’s test using the Excel software (Microsoft, USA). Data are presented as a mean ± standard devia- tion. Differences would be considered as statistically significant at p <0.05. Results and discussion One of the criteria of the GVHD development is splenomegaly, which could discovered in an organisms using so-called spleen index (SI). In particular, the recipients of syngeneic BM (Group 2) had the SI not differing significantly from intact control (group 1), whe- reas the recipients of allogeneic native material (group 3) got 1.7 times higher value (Table). The introduced allogeneic cryopreserved material (group 4) caused less increase of SI in comparison with group 2, due to a known reduction of immune reactivity of allogeneic BM post-thaw [3]. Nevertheless, the SI in the animals of this group increased 1.5 times if compared with non-treated control, which also confirmed the GVHD development. It should be noted that the SI value as well as survival of the animals could be determined by the disease severity [1, 2, 16]. Actually, the survival of recipients was clearly coincided with the SI indices (see Table). For example, lower SI index in group 4 if compared to group 3 was correlated with higher survival rate of the animals. Introduction of syngeneic BM to irradiated recipients (group 2) did not cause the GVHD development, in terms of survival and SI values, which did not statistically and signifi- cantly differ from the untreated control (Table). The results of assessment of medullary hemato- poiesis (i. e. the number of cells per femur) in the BM recipients show a decrease of this index in all the experimental groups. In particular, when the syngeneic BM was administered (group 2), this index dropped down by 23% if compared with the untreated control (group 1). In the recipients of allogeneic BM (groups 3 and 4) a more pronounced BM hypoplasia was found if compared with syngeneic and especially untreated controls. On this background there was a change in the con- tent of the BM stem cells with CD34+CD38– pheno- type, associated mainly with linearly non-committed pluripotent HSCs. The cells expressing the CD117 marker are referred to the stem and their committed progenitors [6, 17]. To the day 14 after introduction of syngeneic BM (group 2) the content of both sub- populations of HSCs (CD117+ and CD34+ CD38–) increased if compared with the untreated control (Fig. 1). In the animals of groups 3 and 4 the content динтиоцианат. Для проведения ОТ-ПЦР ис- пользовали комплект random-олигонуклеотидов и ревертазы (М-Мlv) согласно инструкции фирмы- производителя «Реверта L» (Россия). Праймеры исследуемых генов: gata2 (NM_008324.1 (длина фрагмента 342 п.н.) и beta actin (NM_007393.3 (длина фрагмента 113 п.н.) были сконструированы на основе базы данных «GenBank» (NCBI BLAST, США) и синтезированы в АОЗТ «Медбиосервис» (Украина). Амплификацию фрагментов ДНК осущест- вляли в термостате «Терцик» (ЗАО «НВФ ДНК- технология», Россия). Денатурацию проводили при 94°С в течение 30 с, гибридизацию матрицы с прай- мером при 60°С – 30 с, элонгацию при 72°С – 60 с. После окончания ПЦР осуществляли элонгацию при 72°С в течение 5 мин. Количество циклов для гена gata2 – 40, для beta actin – 20. Детекцию и сравнение количества продуктов амплификации выполняли методом капиллярного электрофореза в чип-анализаторе «Agilent 2100» («Agilent Techno- logies», США) на основе относительной полуколи- чественной оценки. Подготовку чипов осущест- вляли согласно инструкции набора «ДНК 1000» («Fermentas», Литва). Результаты нормировали по отношению к пока- зателю экспрессии гена «домашнего хозяйства» beta actin. Полученные данные статистически обрабаты- вали по методу Стьюдента с применением ком- пьютерной программы «Exсel» («Microsoft», США). Данные приведены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Различия считали статис- тически значимыми при p < 0,05. Результаты и обсуждение Одним из критериев развития БТПХ является спленомегалия, наличие которой в организме реци- пиента можно констатировать по индексу селезен- ки (ИС). Так, у реципиентов сингенного КМ (группа 2) ИС значимо не отличался от интактного конт- роля (группа 1), в то время, как у реципиентов алло- генного нативного материала (группа 3) он был в 1,7 раза выше (таблица). Вводимый аллогенный криоконсервированный материал (группа 4) вызы- вал меньшее по сравнению с группой 2 увеличение ИС, поскольку в процессе замораживания снижает- ся иммунореактивность аллогенного КМ [3]. Тем не менее ИС у животных этой группы увеличивал- ся в 1,5 раза по сравнению с интактным контролем, что также свидетельствует о развитии БТПХ. Сле- дует отметить, что величина ИС, как и выживае- мость животных, определяется степенью тяжести патологии [1, 2, 16]. Действительно, выживаемость реципиентов четко коррелировала с показателями ьлетазакоП xednI хынтовижаппурГ slaminafopuorG 1 2 3 4 ,икнезелесскеднИ .де.лсу ,xednineelpS stinu.bra 90,0±00,1 01,0±01,1 11,0±7,1 # 9,0±5,1 # котелковтсечилоK 01x,ордебанМK 6 sllecMBforebmuN 01x,rumefrep 6 67,0±45,9 85,0±03,7 25,0±10,4 # 81,0±77,2 # %,ьтсомеавижыВ %,lavivruS 00,8±001 88,6±00,88 60,5±43,36 # 62,6±72,07 # 72 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 of CD117+ cells decreased if compared with syngeneic control by 1.4 and 2.5 times, respectively, which was apparently due to the lack of medullary hematopoiesis. The content of more potent HSCs, i. e. CD34+CD38– cells, was significantly reduced only in group 4 animals, if compared with syngeneic control. тов аллогенного КМ (группы 3 и 4) наблюдалась более выраженная гипоплазия КМ по сравнению с сингенным и тем более интактным контролем. На этом фоне изменялось содержание клеток стволового компартмента КМ с фенотипом СD34+ CD38–, ассоциированным в основном с полипотент- ными линейно некоммитированными СКК. Клетки, экспрессирующие СD117-маркер, относятся к стволовым и их коммитированным предшествен- никам [5, 17]. На 14-е сутки после введения син- генного КМ (группа 2) содержание обеих субпопу- ляций СКК (CD117+ и CD34+CD38–) увеличивалось по сравнению с интактным контролем (рис. 1). У животных групп 3 и 4 содержание CD117+-клеток снижалось по сравнению с сингенным контролем в 1,4 и 2,5 раза соответственно, что, по-видимому, связано с недостатком медуллярного кроветворе- ния. Содержание же более потентных СКК – CD34+CD38–-клеток было значимо ниже по срав- нению с сингенным контролем только у животных группы 4. В настоящее время накоплено большое коли- чество данных, подчеркивающих значимость от- дельных субпопуляций СКК в скорости восстанов- ления кроветворения и их содержания в регенери- рующем КМ [5]. В связи с этим нами был введен такой показатель, как индекс дифференцировки СКК, представляющий собой соотношение содер- жания менее потентных СКК (CD117+) к более по- тентным (CD34+CD38–). На рис. 2 видно снижение значения индекса дифференцировки по сравнению с сингенным и еще большее с интактным контро- лями в обеих группах животных с БТПХ. Данный факт свидетельствует о перераспределении кон- Показатели развития БТПХ, 14-е сутки (M ± m, n = 5) GVHD development indices, day 14 (M ± m, n = 5) Примечание: различия статистически значимы по сравнению с интактным () и сингенным (#) контролем, p ≤ 0,05. Note: differences are statically significant if compared with intact () and syn- geneic (#) controls, p ≤ 0.05. ИС (таблица). Так, более низкий по- казатель ИС в группе 4 по срав- нению с группой 3 коррелировал с большей выживаемостью живот- ных. Введение облученным реци- пиентам сингенного КМ (группа 2) не вызывало развития БТПХ, судя по показателю выживаемости и ИС, которые значимо не отличались от интактного контроля (таблица). Результаты оценки состояния медуллярного кроветворения, а именно количества клеток на бедро, у реципиентов КМ, свидетель- ствуют о снижении этого показателя во всех опытных группах. Так, при введении сингенного КМ (группа 2) данный показатель снижался на 23% по сравнению с интактным контролем (группа 1). У реципиен- Рис. 1. Содержание клеток CD117+ и CD34+CD38– в КМ животных до и после индукции БТПХ: – CD117+- клетки; – CD34+CD38–-клетки; – количество клеток КМ/бедро, ×106; различия статистически значимы по сравнению с интактным () и сингенным (&) контролем (p < 0,05). Fig. 1. Content of CD117+ and CD34+CD38– cells in the BM animals prior to and after GVHD induction: – CD117+ cells; – CD34+ CD38–cells, – number of BM cells/ femur, ×106; differences are statistically significant if compared with intact () and syngeneic (&) controls (p < 0.05). 0 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 0 2 4 6 8 10 12 & * && С од ер жа ни е C D 11 7+ и C D 34 + C D 38 – -к ле то к, % C D 11 7+ a nd C D 34 + C D 38 – c el l c on te nt , % Группы Groups Ко ли че ст во к ле то к КМ н а бе др о ×1 06 N um be r o f B M c el ls p er fe m ur × 10 6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 0 2 4 6 8 10 12 * & * * & & проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 73 To date there are numerous data emphasizing the significance of certain subpopulations of HSCs for the hematopoiesis recovery rate and their content in rege- nerating BM [6]. In this regard we have introduced the HSC differentiation index, being the ratio of the content of less potent HSCs (CD117+) to more potent ones (CD34+CD38–). Fig. 2 shows a decreased value of the differentiation index in both groups of the animals with GVHD if compared with syngeneic and even more with the untreated control. This fact testifies to the redistribution in the studied subpopulations of HSCs towards more potent (CD34+CD38– cells), which may be the cause of BM hypoplasia. This index could be definitely the criterion for assessing the medullary hematopoiesis, and it likely points to the inhibition of HSCs differentiation and their inability to compensate BM hypoplasia of the recipients with GVHD. The fact that the differentiation index in the animals of group 4 was lower than in group 3 as well as the noted pronoun- ced reduction in medullary hematopoiesis testifies to the change in functional state of post-thaw BM. Thus, to the day 14 of GVHD development induced by either native or cryopreserved allogeneic BM, confirmed with an increased SI, an inhibition of me- dullary hematopoiesis was observed with a reduced amount of HSCs in BM that could be associated with a progressing death of the animals to this term. Study of gata2 gene expression rate in BM hemato- poietic progenitors of the recipients with GVHD can центрации исследуемых субпопуляций СКК в сто- рону более потентных (CD34+CD38–-клеток), что может быть причиной гипоплазии КМ. Вероятно, именно этот индекс, являясь критерием оценки ме- дуллярного кроветворения, свидетельствует об ингибировании дифференцировки СКК и их неспо- собности компенсировать гипоплазию КМ у реци- пиентов с БТПХ. Тот факт, что у животных груп- пы 4 индекс дифференцировки был ниже, чем у группы 3, а также отмечалось более выраженное снижение медуллярного кроветворения, свидетель- ствует об изменении функционального состояния КМ после криоконсервирования. Таким образом, на 14-е сутки развития БТПХ, индуцированной аллогенным нативным или крио- консервированным КМ, подтвержденной увеличе- нием ИС, наблюдалось ингибирование медулляр- ного кроветворения со снижением в КМ количества СКК, что может обуславливать прогрессирующую гибель животных к этому сроку. Исследование уровня экспрессии гена gata2 в кроветворных предшественниках стволового ком- партмента КМ реципиентов с БТПХ может дать дополнительную информацию для понимания меха- низмов развития данной патологии. Нами был проведен анализ уровня экспрессии гена gata2 во фракции СD117+-клеток, выделенной из КМ реци- пиентов с БТПХ методом иммуномагнитного сортирования. Рис. 3. Содержание транскриптов гена gata2 в CD117+- фракции КМ у животных до и после индукции БТПХ; раз- личия статистически значимы по сравнению с интакт- ным () и сингенным (&) контролем (p < 0,05). Fig. 3. Content of gata2 gene transcripts in CD117+ fraction of BM in the animals prior to and after the GVHD induction; differences are statistically significant if compared with in- tact () and syngeneic (&) controls (p < 0.05). Рис. 2. Индекс дифференцировки СКК (CD117+/CD34+ CD38–): – индекс дифференцировки СКК, – коли- чество клеток в КМ/бедро, ×106; различия статистически значимы по сравнению с интактным () и сингенным (&) контролем (p < 0,05). Fig. 2. Index of HSCs differentiation (CD117+/CD34+CD38–): – index of HSCs differentiation , – number of cells in BM/femur, ×106; differences are statistically significant if compared with intact () and syngeneic (&) controls (p < 0.05). И нд ек с ди ф ф ер ен ци ро вк и, у сл .е д. D iff er en tia tio n in de x, ar b. u ni ts Группы Groups Ко ли че ст во к ле то к КМ н а бе др о ×1 06 N um be r o f B M c el ls p er fe m ur × 10 6 С од ер жа ни е тр ан ск ри пт ов г ен а ga ta 2 от но си те ль но г ен а «д ом аш не го х оз яй ст ва » C on te nt o f ga ta 2 ge ne t ra ns cr ip ts v er su s ho us ek ee pi ng g en e 0 0,5 1 1,5 1 2 3 4 & & Группы Groups 74 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 Как видно из рис. 3, при развитии БТПХ, вне зависимости от того нативным или криоконсер- вированным КМ была индуцирована патология, наблюдалось увеличение в сравнении с обоими контролями уровня экспрессии гена gata2. A.J. Tip- ping и соавт. [14] показали, что увеличение экспрес- сии гена gata2 в гемопоэтических клетках мышей и человека сопровождается снижением экспрессии таких регуляторов клеточного цикла, как CCND3, CDK4 и CDK6, что, в свою очередь, выражалось угнетением кроветворения в целом. Наши данные по оценке медуллярного кроветворения у животных с БТПХ находятся в соответствии с данными этих исследователей (таблица). Хотя значимых разли- чий в уровне экспрессии гена gata2 между груп- пами 3 и 4 выявлено не было, тем не менее макси- мальная его экспрессия отмечена после введения криоконсервированного КМ (группа 4). Самое низкое содержание клеток КМ на бедро (2,77 ± 0,18) наблюдалось именно в этой группе. Данный факт подчеркивает значимость ингибирующего эффекта криоконсервирования в отношении функ- ционального статуса кроветворных предшествен- ников КМ, выражающегося в данном случае в ог- раничении их дифференцировочного потенциала и замедлении процесса восстановления медулляр- ного кроветворения. Однако именно у животных группы 4 клинические признаки патологии (ИС и выживаемость) были менее выражены, чем у груп- пы 3. Таким образом, результаты данного исследо- вания свидетельствуют о снижении иммунореак- тивности аллогенного КМ после криоконсерви- рования, причиной чего может быть изменение функции гена gata2. Выводы Проведенные исследования расширяют наше представление о механизмах развития БТПХ на клеточном и молекулярном уровнях, что может обосновать целесообразность направленного по- вышения эффективности лечения БТПХ. Продемонстрировано, что при введении реци- пиентам аллогенного нативного или криоконсерви- рованного КМ с клетками лимфоузлов к 14-м сут- кам наблюдается увеличение ИС, снижение медул- лярного кроветворения и количества СКК в КМ животных и их прогрессирующая гибель, что яв- ляется свидетельством развития БТПХ у живот- ных к этому сроку. Показано увеличение содержания транскриптов гена gata2 в СКК у животных с БТПХ, что приво- дит к снижению медуллярного кроветворения. В группе животных с БТПХ, индуцированной аллогенным криоконсервированным КМ с высоким уровнем экспрессии гена gata2 по сравнению с интактным контролем, наблюдалось самое низкое provide an additional information for understanding the mechanisms of this disease. We have analyzed the gata2 gene expression rate in the fraction of CD117+ cells isolated from BM of the recipients with GVHD by immune magnetic sorting. Fig. 3 shows an increase in gata2 gene expression rate if compared with both controls observed during the GVHD development independently whether native or cryopreserved BM was used to induce the pathology. A.J. Tipping et al. [14] demonstrated that an increase in gata2 gene expression in hematopoietic cells of mice and humans was accompanied by a decrease in expres- sion of such cell cycle regulators as CCND3, CDK4 and CDK6, which in turn led to myelosuppression in general. These observations are in accordance with our data on evaluation of medullary hematopoiesis in the animals with GVHD (Table). Although no signi- ficant differences in gata2 gene expression rates bet- ween groups 3 and 4 were found, its maximal expres- sion was found after administration of cryopreserved BM (group 4). The lowest content of the BM cells per femur (2.77 ± 0.18) was observed in this group. This fact emphasizes the importance of inhibitory effect of cryopreservation in respect of the functional status of hematopoietic BM progenitors, which is expressed in limiting their differentiation potential and slowing down the recovery of medullary hematopoiesis. However, especially in the animals of group 4 the clinical signs of pathology (SI and survival) were less pronounced than in group 3. Thus, the results of this study demon- strate a decreased immune reactivity of allogeneic BM after cryopreservation, and that this could be caused by the changes in gata2 gene function. Conclusions The performed studies expand our understanding about the mechanisms of GVHD development at cell and molecular levels, that may prove the expediency of the directed rise in the efficiency of GVHD treat- ment. It was demonstrated that introduction of allogeneic native or cryopreserved BM mixed with lymph node cells to the recipients resulted in an increase of SI to the 14th day, as well as reduction of medullary hemato- poiesis and number of HSCs in BM of the animals and their progressing death, and which was the evidence of developed GVHD in the animals by this term. An increase was shown in the content of gata2 gene transcripts in HSCs of the animals with GVHD, leading to the reduction of medullary hematopoiesis. In the group of animals with GVHD, induced with allogeneic cryopreserved BM with a high rate of gata2 gene expression if compared with untreated control, the lowest medullary hematopoiesis recovery was observed, indicating the inhibited differentiation poten- tial of HSCs. проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 25, №/issue 1, 2015 75 восстановление медуллярного кроветворения, что свидетельствует об ингибировании дифференциро- вочного потенциала СКК. Литература 1. Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Гаевская Ю.А. и др. Значение экспрессии гена foxp3 в Т-регуляторных клетках в пато- генезе болезни «трансплантат против хозяина» индуциро- ванной криоконсервированным аллогенным материалом // Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2014. – Т. 24, №4. – С. 322–331. 2. Гольцев А.Н., Луценко Е.Д., Останкова Л.В. и др. Возмож- ности криобиологии в решении иммуноконфликтных проб- лем при пересадке гистонесовместимого костного мозга // Проблемы криобиологии. – 1996. – №2. – С. 3–10. 3. Гольцев А.Н., Мацевитая И.Ю., Луценко Е.Д. и др. К вопро- су модификации иммунореактивности миелотрансплан- тата после криоконсервирования // Проблемы криобиоло- гии. – 2010. – Т. 20, №2. – С. 145–152. 4. Гольцев А.Н., Останкова Л.В., Дубрава Т.Г. и др. Крио- консервирование как фактор модификации структурно- функционального состояния и механизма реализации лечебного эффекта клеток стволового компартмента в условиях развития патологий аутоиммунного генеза // Актуальные проблемы криобиологии и криомедицины / Под. ред. А.Н. Гольцева. – Харьков, 2012. – С. 551–563. 5. Гривцова Л.Ю., Тупицын Н.Н. Субпопуляции транспланти- руемых стволовых кроветворных клеток // Современная онкология. – 2006. – Т. 8, №1. – С. 1–16. 6. Манько В.М., Петров Р.В. Трансплантология и тканевая инженерия кроветворных стволовых клеток. Факторы, контролирующие их функции // Аллергология и иммуно- логия. – 2008. – Т. 9, №4. – С. 413–427. 7. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ. / Под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. – М.: Мир, 1999. – 558 с. 8. Шевелев А.С. Реакция «трансплантат против хозяина» и трансплантационная болезнь. – М.: Медицина, 1976. – 237 c. 9. Ball L.M., Egeler R.M. Acute GVHD: pathogenesis and classifi- cation // Bone marrow transplantation. – 2008. – Vol. 41, №2. – P. 58–64. 10.Ikehara S. A new concept of stem cell disorders and their new therapy // J. Hematother. Stem Cell Res. – 2003. – Vol. 12, №6. – P. 643–653. 11.Ling K.W., Ottersbach K., Hamburg J.P. GATA-2 plays two functionally distinct roles during the ontogeny of hematopoietic stem cells // JEM. – 2004. – Vol. 200, №7. – P. 871–882. 12.Pidala J. Graft-vs-host disease following allogeneic hematopoietic cell transplantation // Cancer Control. – 2011. – Vol. 18, №4. – P. 268–276. 13.Qian L., Wu Z., Shen J. Advances in the treatment of acute graft-versus-host disease // J. Cell. Mol. Med. – 2013. – Vol. 17, №8. – Р. 966–975. 14.Tipping A.J., Pina C., Castor A. et al. High GATA-2 expression inhibits human hematopoietic stem and progenitor cell function by effects on cell cycle // Blood. – 2009. – Vol. 113, №12. – P. 2661–2672. 15.Tsai F.Y., Orkin S.H. Transcription factor GATA-2 is required for proliferation/survival of early hematopoietic cells and mast cell formation, but not for erythroid and myeloid terminal diffe- rentiation // Blood. – 1997. – Vol. 89, №10. – P. 3636–3626. 16.Van Dijken P.J., Wimperis J., Crawford J.M., Ferrara J.L.M. Effect of graft-versus-host disease on hematopoiesis after bone marrow transplantation in mice // Blood. – 1991. – Vol. 78, №10. – P. 2773–2779. 17.Zipori D. The renewal and differentiation of hematopoietic stem cells // FASEB Journal. – 1992. – №6. – P. 2691–2697. References 1. Ball L.M., Egeler R.M. Acute GVHD: pathogenesis and classi- fication. Bone marrow transplantation 2008; 41(2): 58–64. 2. Goltsev A.N., Dubrava T.G., Gayevskaya Yu.A. et al. Foxp3 gene expression value in regulatory T cells in pathogenesis of graft-gersus-host disease induced with cryopreserved allo- genic material// Problems of Cryobiology and Cryomedicine 2014; 24(4): 322–331. 3. Goltsev A.N., Lutsenko E.D., Ostankova L.V. et al. Application of cryobiology in solving immune-conflict problems when graft- ing a histoincompatible bone marrow. Problems of Cryobiology 1996; (2): 3–10. 4. Goltsev A.N., Matsevitaya I.Yu., Lutsenko E.D. et al. On the modification of immunoreactivity of myelotransplant after cryo- preservation. Problems of Cryobiology 2010; 20(2): 145–152. 5. Goltsev A.N., Ostankova L.V., Dubrava T.G. et al. Cryopreser- vation as the factor of modifying structural and functional state and implementation mechanism of therapeutic effect of stem compartment cells under development of pathologies of autoimmune genesis. In: A.N. Goltsev, editor. Current problems of cryobiology and cryomedicine. Kharkov, 2012. p. 551–563. 6. Grivtsova L.Yu., Tupitsyn N.N. Subpopulations of hematopoietic stem cells to be transplanted. Sovremennaya Onkologiya 2006; 8(1): 1–16. 7. Herrington C., McGee J., editors. Molecular clinical diagnostics. Methods. Moscow: Mir; 1999. 8. Ikehara S. A new concept of stem cell disorders and their new therapy. J. Hematother. Stem Cell Res 2003; 12(6): 643–653. 9. Ling K.W., Ottersbach K., Hamburg J.P. GATA-2 plays two functionally distinct roles during the ontogeny of hematopoietic stem cells. JEM 2004; 200(7): 871–882. 10.Manko V.M., Petrov R.V. Transplantology and tissue engineer- ing of hematopoietic stem cells. Factors, controlling their functions. Allergologiya I Immunologiya 2008; 9(4): 413–427. 11.Pidala J. Graft-vs-host disease following allogeneic hemato- poietic cell transplantation. Cancer Control 2011; 18(4): 268– 276. 12.Qian L., Wu Z., Shen J. Advances in the treatment of acute graft-versus-host disease. J. Cell. Mol. Med. 2013; 17(8): 966– 975. 13.Shevelev A.S. Graft-versus-host reaction and transplantation disease. Moscow: Meditsyna; 1976. 14.Tipping A.J., Pina C., Castor A. et al. High GATA-2 expression inhibits human hematopoietic stem and progenitor cell function by effects on cell cycle. Blood 2009; 113(12): 2661–2672. 15.Tsai F.Y., Orkin S.H. Transcription factor GATA-2 is required for proliferation/survival of early hematopoietic cells and mast cell formation, but not for erythroid and myeloid terminal diffe- rentiation. Blood 1997; 89(10): 3636–3626. 16.Van Dijken P.J., Wimperis J., Crawford J.M., Ferrara J.L.M. Effect of graft-versus-host disease on hematopoiesis after bone marrow transplantation in mice. Blood 1991; 78(10): 2773–2779. 17.Zipori D. The renewal and differentiation of hematopoietic stem cells. FASEB Journal 1992; 6: 2691–2697.

Institution

Ähnliche Einträge