Опіоїдергічна регуляція активності Р2Х3-рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв

Традиційно вважається, що аналгетичний ефект опіоїдів зумовлений їх дією на механізми ЦНС. Останнім часом, проте, накопичуються докази того, що потужного знеболюючого ефекту можна досягти активацією опіоїдних рецепторів на периферії (особливо при запальних процесах). Ми вивчали впливи модуляції ак...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2015
Автори:	Кулик, В. Б., Чижмаков, І.В., Волкова, Т.М., Кришталь, О.О.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України 2015
Назва видання:	Нейрофизиология
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148139
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Опіоїдергічна регуляція активності Р2Х3-рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв / В.Б. Кулик, І.В. Чижмаков, Т.М. Волкова, О.О. Кришталь // Нейрофизиология. — 2015. — Т. 47, № 1. — С. 14-18. — Бібліогр.: 19 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-148139
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1481392019-02-18T01:23:28Z Опіоїдергічна регуляція активності Р2Х3-рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв Кулик, В. Б. Чижмаков, І.В. Волкова, Т.М. Кришталь, О.О. Традиційно вважається, що аналгетичний ефект опіоїдів зумовлений їх дією на механізми ЦНС. Останнім часом, проте, накопичуються докази того, що потужного знеболюючого ефекту можна досягти активацією опіоїдних рецепторів на периферії (особливо при запальних процесах). Ми вивчали впливи модуляції активності опіоїдних рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв (ДСГ) щурів на Р2Х3-опосередковані струми та намагались окреслити можливі шляхи передачі внутрішньоклітинних сигналів між цими рецепторами. Іонні струми, викликані аплікацією α,β-Мe-АТФ в нейронах ДСГ та опосередковані пуринергічними Р2Х3-рецепторами, оборотно інгібувались ендогенним опіоїдним пептидом лейенкефаліном (ЛЕК, 100 нМ) у середньому на 74 %. Селективний конкурентний антагоніст µ-опіоїдних рецепторів СТОР цілком усував ефект ЛЕК. Ми припустили, що в механізмі передачі внутрішньоклітинного сигналу між опіоїдними та Р2Х3-рецепторами задіяний шлях, опосередкований фосфоліпазою С (PLC), і ця гіпотеза отримала експериментальне підтвердження. Синтетичний активатор PLC викликав пригнічення Р2Х3-опосередкованих струмів, а інгібітор синтезу фосфатидилінозитол4,5-дифосфату-2 (РІР2) вортманін прискорював та посилював інгібуючий вплив ЛЕК на Р2Х3-струми. Таким чином, в основі інгібуючого впливу ЛЕК на Р2Х3-рецептори лежать активація PLC та гідроліз РІР₂. 2015 Article Опіоїдергічна регуляція активності Р2Х3-рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв / В.Б. Кулик, І.В. Чижмаков, Т.М. Волкова, О.О. Кришталь // Нейрофизиология. — 2015. — Т. 47, № 1. — С. 14-18. — Бібліогр.: 19 назв. — укр. 0028-2561 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148139 611.81.14:612.822.3 uk Нейрофизиология Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
description	Традиційно вважається, що аналгетичний ефект опіоїдів зумовлений їх дією на механізми ЦНС. Останнім часом, проте, накопичуються докази того, що потужного знеболюючого ефекту можна досягти активацією опіоїдних рецепторів на периферії (особливо при запальних процесах). Ми вивчали впливи модуляції активності опіоїдних рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв (ДСГ) щурів на Р2Х3-опосередковані струми та намагались окреслити можливі шляхи передачі внутрішньоклітинних сигналів між цими рецепторами. Іонні струми, викликані аплікацією α,β-Мe-АТФ в нейронах ДСГ та опосередковані пуринергічними Р2Х3-рецепторами, оборотно інгібувались ендогенним опіоїдним пептидом лейенкефаліном (ЛЕК, 100 нМ) у середньому на 74 %. Селективний конкурентний антагоніст µ-опіоїдних рецепторів СТОР цілком усував ефект ЛЕК. Ми припустили, що в механізмі передачі внутрішньоклітинного сигналу між опіоїдними та Р2Х3-рецепторами задіяний шлях, опосередкований фосфоліпазою С (PLC), і ця гіпотеза отримала експериментальне підтвердження. Синтетичний активатор PLC викликав пригнічення Р2Х3-опосередкованих струмів, а інгібітор синтезу фосфатидилінозитол4,5-дифосфату-2 (РІР2) вортманін прискорював та посилював інгібуючий вплив ЛЕК на Р2Х3-струми. Таким чином, в основі інгібуючого впливу ЛЕК на Р2Х3-рецептори лежать активація PLC та гідроліз РІР₂.
format	Article
author	Кулик, В. Б. Чижмаков, І.В. Волкова, Т.М. Кришталь, О.О.
spellingShingle	Кулик, В. Б. Чижмаков, І.В. Волкова, Т.М. Кришталь, О.О. Опіоїдергічна регуляція активності Р2Х3-рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв Нейрофизиология
author_facet	Кулик, В. Б. Чижмаков, І.В. Волкова, Т.М. Кришталь, О.О.
author_sort	Кулик, В. Б.
title	Опіоїдергічна регуляція активності Р2Х3-рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв
title_short	Опіоїдергічна регуляція активності Р2Х3-рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв
title_full	Опіоїдергічна регуляція активності Р2Х3-рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв
title_fullStr	Опіоїдергічна регуляція активності Р2Х3-рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв
title_full_unstemmed	Опіоїдергічна регуляція активності Р2Х3-рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв
title_sort	опіоїдергічна регуляція активності р2х3-рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв
publisher	Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
publishDate	2015
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/148139
citation_txt	Опіоїдергічна регуляція активності Р2Х3-рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв / В.Б. Кулик, І.В. Чижмаков, Т.М. Волкова, О.О. Кришталь // Нейрофизиология. — 2015. — Т. 47, № 1. — С. 14-18. — Бібліогр.: 19 назв. — укр.
series	Нейрофизиология
work_keys_str_mv	AT kulikvb opíoídergíčnaregulâcíâaktivnostír2h3receptorívunejronahdorsalʹnihspínalʹnihganglíív AT čižmakovív opíoídergíčnaregulâcíâaktivnostír2h3receptorívunejronahdorsalʹnihspínalʹnihganglíív AT volkovatm opíoídergíčnaregulâcíâaktivnostír2h3receptorívunejronahdorsalʹnihspínalʹnihganglíív AT krištalʹoo opíoídergíčnaregulâcíâaktivnostír2h3receptorívunejronahdorsalʹnihspínalʹnihganglíív
first_indexed	2025-07-12T18:26:06Z
last_indexed	2025-07-12T18:26:06Z
_version_	1837466672726802432
fulltext	NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 114 УДК 611.81.14:612.822.3 В. Б. КУЛИК1, І. В. ЧИЖМАКОВ1, Т. М. ВОЛКОВА1, О. О. КРИШТАЛЬ1 ОПІОЇДЕРГІЧНА РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ Р2Х3-РЕЦЕПТОРІВ У НЕЙРОНАХ ДОРСАЛЬНИХ СПІНАЛЬНИХ ГАНГЛІЇВ Надійшла 28.07.14 Традиційно вважається, що аналгетичний ефект опіоїдів зумовлений їх дією на механізми ЦНС. Останнім часом, проте, накопичуються докази того, що потужного знеболюючо- го ефекту можна досягти активацією опіоїдних рецепторів на периферії (особливо при запальних процесах). Ми вивчали впливи модуляції активності опіоїдних рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв (ДСГ) щурів на Р2Х3-опосередковані струми та намагались окреслити можливі шляхи передачі внутрішньоклітинних сигналів між цими рецепторами. Іонні струми, викликані аплікацією α,β-Мe-АТФ в нейронах ДСГ та опосередковані пуринергічними Р2Х3-рецепторами, оборотно інгібувались ендогенним опіоїдним пептидом лейенкефаліном (ЛЕК, 100 нМ) у середньому на 74 %. Селективний конкурентний антагоніст µ-опіоїдних рецепторів СТОР цілком усував ефект ЛЕК. Ми припустили, що в механізмі передачі внутрішньоклітинного сигналу між опіоїдними та Р2Х3-рецепторами задіяний шлях, опосередкований фосфоліпазою С (PLC), і ця гіпотеза отримала експериментальне підтвердження. Синтетичний активатор PLC викликав пригнічення Р2Х3-опосередкованих струмів, а інгібітор синтезу фосфатидилінозитол- 4,5-дифосфату-2 (РІР2) вортманін прискорював та посилював інгібуючий вплив ЛЕК на Р2Х3-струми. Таким чином, в основі інгібуючого впливу ЛЕК на Р2Х3-рецептори лежать активація PLC та гідроліз РІР2. КЛЮЧОВІ СЛОВА: опіоїдні рецептори, лейенкефалін, P2Х3-рецептори, фосфоліпаза С, фосфатидилінозитол-4,5-дифосфат. 1Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ (Україна). Ел. пошта: Kulyk@biph.kiev.ua (В. Б. Кулик). ВСТУП Результати численних досліджень свідчать про те, що на мембранах нейронів дорсальних спінальних гангліїв (ДСГ) із сомами малого та середнього діа- метрів експресуються пуринергічні іонотропні ре- цептор-канальні комплекси як мінімум двох типів – Р2Х3 та Р2Х2/3 [1–4]. Активація цих рецепторів призводить до модуля- ції больової чутливості. Аплікація АТФ або інших агоністів Р2Х-рецепторів викликає больові поведін- кові феномени у тварин, а також підвищує чутли- вість до ноцицептивної стимуляції у людини та тва- рин [2]. Cелективний антагоніст Р2Х3-рецепторів А-317491 ефективно усував гіпералгезію та ало- динію в дослідах in vivo [5]. Водночас результати клінічних спостережень показали, що введення се- лективних антагоністів Р2Х3-рецепторів ефективно блокувало невропатичний біль; блокувався також біль, викликаний запаленням [4]. У мишей, нока- утних за Р2Х3-субодиницею, а також у щурів, яким уводили антисмислові олігонуклеотиди щодо мРНК даної субодиниці, чутливість до болю знижувала- ся внаслідок припинення або порушення експресії Р2Х3- та Р2Х2/3-рецепторів [2]. Згідно з результа- тами цих досліджень, як гомомерні (Р2Х3), так і ге- теромерні (Р2Х2/3) Р2Х-рецептори широко залуче- ні до больової сигналізації. У ЦНС існують ціла низка спецiальних механiзмiв модуляцiї больових вiдчуттiв. До їх чис- ла входить i так звана опiоїдна аналгетична система. Діяльність такої системи базується на активації опі- оїдних рецепторів трьох чітко визначених типів – µ, δ та κ [6]. Усі опіоїдні рецептори є метаботроп- ними та лігандкерованими; вони спряжені з гетеро- тримерними G-білками, чутливими до кашлюково- го токсину (насамперед з Gi/Go-білками). Активація цих рецепторів призводить до пригнічення актив- ності аденілатциклази [7, 8]. Інгібування аденілат- циклази внаслідок активації опіоїдних рецепторів морфіном забезпечує усунення потенціації TRPV1- NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 1 15 ОПІОЇДЕРГІЧНА РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ Р2Х3-РЕЦЕПТОРІВ опосередкованих струмів при запальних процесах. Згадані рецептори задіяні до генерації больових сигналів [9]. Наразі відомо, що активація опіоїдних рецепторів призводить до активації низки мембран- них каналів, зокрема G-білок-активованих калієвих каналів внутрішнього випрямлення, кальційакти- вованих калієвих каналів, дендротоксинчутливих калієвих каналів та калієвих каналів М-типу. Як і інші члени родини G i/Go-спряжених рецепторів, опіоїдні рецептори всіх типів здатні пригнічувати активацію високопорогових потенціалактивованих кальцієвих каналів [10]. Традиційно вважається, що аналгетичний ефект опіоїдів зумовлений їх дією в межах ЦНС. Проте, як вже було вказано, відомо, що опiоїдні рецепто- ри всiх основних типів експресуються в первинних сенсорних нейронах та їх периферичних терміна- лях [11]. Останнім часом накопичуються очевид- ні докази того, що потужний ефект знеболювання може бути досягнутий активацією опіоїдних рецеп- торів не тільки в мозкових структурах, але й на пе- риферії, особливо при запальних процесах [1, 12, 13]. Ми вивчали вплив опіоїдних рецепторів на Р2Х3-опосередковані струми в нейронах ДСГ щу- рів та намагалися окреслити можливі шляхи пере- дачі внутрішньоклітинних сигналів між цими ре- цепторами. МЕТОДИКА Експерименти проводили на культивованих про- тягом 24 год нейронах ДСГ щурiв із сомами дiаметром 10–30 мкм. У дослiдженнях використо- вували бiлих щурiв лiнiї Вiстар WAG/GSto вiком вісім дiб. Для видiлення нейронiв ДСГ тварину декапiтували, спинномозковий канал розтинали та виділяли груднi і поперековi ДСГ. Видiленi ганглiї вмiщували в чашку Петрi iз зовнiшньоклiтинним розчином (надалі нормальний розчин) такого скла- ду (у мілімолях на 1 л): NaCl – 130, KCl –5, СаСl2 – 2, MgCl2 –2, HEPES – 10 (pH доводили до 7.3, кори- стуючись NaOH). Пiсля цього ганглiї переносили в камеру з розчином для ферментативної обробки. Цей розчин на основі середовища МЕМ уміщував 1.3 мг/мл колагенази (тип IV) та 4 мг/мл трип- сину. Ганглії iнкубували в термостатi протягом 30 хв при 34 °С, пiсля чого вiдмивали при кiмнатнiй температурi (20–22 °С) середовищем для культиву- вання нейронів МЕМ із доданням 10 мМ НЕРЕS та 10 % сироватки крові ембріонів телят. Для інгібування активності ферментів ганглії витриму- вали в даному розчині протягом 5 хв. Для виділення ізольованих клітин оброблені ганглії пропускали через скляні піпетки Пастера різних діаметрів. От- риману клітинну суспензію висівали на покривні скельця, вміщені в стерильні чашки Петрі з 2 мл се- редовища МЕМ. Отриманi в такий спосiб нейрони інкубували протягом 24 год при 37 °С в атмосфері повітря, збагаченого СО2 до 5 %, після чого їх вико- ристовували для електрофiзiологiчних вимірювань протягом 1–2 год. Реєстрацiю іонних струмів проводили iз засто- суванням фіксації потенціалу (“петч-клемп”) у конфігурації “ціла клітина”. Струми вимірювали при 22 ± 2 °С iз використанням підсилювача Axopatch 200B (“Axon Instruments”, США), фiльтрували з частотою зрiзу 2 кГц за допомо- гою двополюсного фiльтра Бессела та оцифро- вували із застосуванням АЦП Digidata 1200B (“Axon Instruments”, США). Мiкропiпетки для внутрiшньоклiтинної перфузiї та вiдведення елек- тричних сигналiв виготовляли з боросилiкатних скляних капілярів. Кiнчики мiкропiпеток оплавля- ли пiд мiкроскопом, наближуючи їх до розпеченої платинової спiралi. Пiсля оплавлення дiаметр кiнчика мiкропiпетки складав 3–6 мкм, а опiр при заповненнi стандартним внутрiшньоклiтинним роз- чином – 2–4 МОм. Склад згаданого розчину був на- ступним (у мілімолях на 1 л): KCl – 130, HEPES –10, ЕГТА – 10, ГТФ – 0.5, ATФ – 5 (pH доводили до 7.3, використовуючи КОН). Р2Х3-опосередкованi струми (Р2Х3-струми) ха- рактеризуються надзвичайно швидкою кiнетикою десенситизацiї та повiльним виходом із десенсити- зованого стану. Це зумовлювало необхiднiсть мак- симально швидкого прикладання та вiдмивання агонiстiв. Ми використовували модифiкований метод фiксацiї концентрацiї, що дозволяло про- тягом 10 мс повнiстю замiнювати розчин, омива- ючий дослiджувану клiтину. Р2Х3-струми викли- кали прикладанням розчину, що вміщував 30 мкМ агонiста відповідних рецепторів α,β-Мe-АТФ, про- тягом 250 мс з інтервалами 2 хв. Це давало змо- гу отримувати добре вiдтворюванi Р2Х3-струми протягом усього часу проведення експерименту. Пiдтримуваний потенцiал становив −80 мВ. Дiючi речовини (агонiсти Р2Х3-рецепторів, агоністи опiоїдних рецепторiв, антагоніст μ-опіоїдних рецепторів СТОР) розчиняли в нормальному розчинi. Всi хiмiкати були виробленi компанiєю NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 116 В. Б. КУЛИК, І. В. ЧИЖМАКОВ, Т. М. ВОЛКОВА, О. О. КРИШТАЛЬ “Sigma” (США). Опiоїднi пептиди прикладали до дослiджуваної клiтини, додаючи їх або до нормального розчину, або до розчину з агонiстом. Аплікація тривала, поки її ефект не досягав стацiонарного рiвня. Впливи опiоїда на амплітуду Р2Х3-струмів виражали як вiдношення стаціонарної амплiтуди струму за даної концентрацiї опiоїда до амплiтуди контрольного струму. Числові значення поданi нижче як середні ± стандартне вiдхилення. Аналiз міжгрупових розбіжностей прово- дили з використанням t-тесту Ст’юдента; відмінності вважали значущими при P < 0.05 (програмний пакет „Origin 8.0”, „OriginLab Corp.”, США). РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Прикладання α,β-Мe-АТФ викликало струми, опо- середковані гомомерними Р2Х3-рецепторами та рецепторами Р2Х3+P2X2/3. Струми, що опосеред- ковувалися лише гомомерними Р2Х3-рецепторами, складеними з відповідних субодиниць, швидко (за 5–7 мс) наростали та досить швидко (протягом 100 мс) входили в десенситизацію. Внаслідок коекс- пресії на мембрані пуринергічних рецептор-ка- нальних комплексів кількох типів (гомомерних та Р2Х3+P2X2/3) інтегральний струм, що спостере- жувався, демонструє змішану кінетику. Характер- ною особливістю такого струму є наявність двох фаз кінетики його десенситизації – швидкої (100 мс) та повільної (500 мс). Кінетичні параметри та- ких «змішаних» струмів розрізняються залежно від внеску рецептор-канального комплексу того або іншого типу [1]. Враховуючи це, внесок Р2Х3- струму визначали як різницю амплітуд інтеграль- ного струму і струму з повільною кінетикою десен- ситизації (рис. 1, Б). Амплітуди струмів у перебігу двох-трьох послідовних аплікацій агоніста були стабільними. Оскільки відомо, що майже повний вихід Р2Х3-рецепторів, активованих α,β-Мe-АТФ, із десенситизованого стану відбувається протягом 2–3 хв (струм наближується до 90 % вихідного зна- чення) [14], інтервал між аплікаціями агоніста зви- чайно становив 2 хв. Застосування ендогенного агоніста опіоїдних рецепторів лейенкефаліну (ЛЕК) призводи- ло до пригнічення Р2Х3-струмів. Цей агоніст у концентрації 100 нМ пригнічував дані струми в се- редньому на 74 ± 8 % (n = 6). Величина інгібуючого впливу залежала від часу та концентрації ЛЕК. Ча- совий перебіг такого впливу прискорювався зі збільшенням концентрації ЛЕК до 1 мкМ; за 2 хв Р2Х3-струми пригнічувалися практично повністю (в середньому на 99 ± 1 %) (рис. 1, В). Подібні результати вказують на те, що саме кінетика зв’язування ЛЕК з опіоїдними рецепторами, а не процес передачі сигналу від опіоїдних до Р2Х3- рецепторів є лімітуючим фактором в інгібуванні Р2Х3-струмів. Інгібуючий ефект був повністю оборотним; незалежно від концентрації опіоїда амплітуда струмів відновлювалася повною мірою при заміні розчину з опіоїдом на нормальний че- 2 2 300 пА 200 пА 100 нМ ЛЕК 100 нМ ЛЕК Ме-АТФ А Б В Ме-АТФ 100 мс 250 мс Р2Х2/3 Р2Х3 4 4 6 6 8 6 8 10 2 2 4 4 6 8 Р и с. 1. Інгібування лейенкефаліном (ЛЕК) Р2Х3-опо- середкованих струмів (Р2Х3-струмів). А – записи Р2Х3-струмів у контролі, під час і після прикладання опіоїда; Б – записи струмів, опосередкованих Р2Х3+P2X2/3- рецепторами; В – залежність ефекту впливу опіоїда від його концентрації. Тут і надалі протокол прикладання речовин вказаний рисками над записами струмів, час прикладання того або інщого розчину (хв) зазначено під записами струмів. Р < 0.05; ** Р < 0.001 (порівняно з контролем). Контроль 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 10 нМ ЛЕК 100 нМ ЛЕК 1 мкМ ЛЕК * * *** NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 1 17 ОПІОЇДЕРГІЧНА РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ Р2Х3-РЕЦЕПТОРІВ рез 6–8 хв. Як відомо, ЛЕК у концентраціях, більших за 10 нМ, є здатним активувати опiоїдні рецепто- ри двох типів – µ та δ [15]. Щоб ідентифікувати тип опіоїдних рецепторів, задіяний до пригнічення P2X3-струмів, ми використовували CTOP – се- лективний конкурентний антагоніст µ-опіоїдних рецепторів. Як виявилось, аплікації СТОР у концентраціях 50 нМ та 1 мкМ не чинили помітного впливу на Р2Х3-струми в контрольних умовах. Проте коли Р2Х3-струми пригнічувалися під дією 100 нМ ЛЕК та їх амплітуди досягали стаціонарних значень, 50 нМ СТОР усували інгібуючу дію дано- го опіоїда. Як видно з рис. 2, пригнічені P2X3- струми в разі прикладання СТОР на тлі дії ЛЕК практично повністю відновлювалися (до 95 ± 5 % вихідної величини; n = 4) протягом 6–8 хв. Отже, опіоїдіндуковане пригнічення P2X3-струмів у ней- ронах ДСГ опосередковується активацією виключ- но µ-опіоїдних рецепторів. Добре відомо, що вказані опіоїдні рецептори ді- ють через два сигнальних шляхи, інгібуючи аде- нілатциклазу [16] та активуючи фосфоліпазу С (PLС) [17]. Щоб виявити шлях, залучений до ін- гібуючого впливу ЛЕК на Р2Х3-рецептори, ми за- стосовували аплікацію m-3M3FBS – синтетичного активатора PLС (рис. 3). Під дією 20 мкM даного агента Р2Х3-струми пригнічувались у середньому на 41 ± 5 % (n = 5; рис. 3). Ефект був повністю обо- ротним; заміна розчину з m-3M3FBS на нормаль- ний сприяла повільному (10–12 хв), але повному відновленню амплітуди Р2Х3-струмів до контроль- них значень. Показано , що активац ія PLC призво - дить до гідролізу мембранного фосфоліпіду фосфатидилінозитол-4,5-дифосфату (PIP2) [18], а останній є необхідним для підтримки активнос- ті P2X3-рецепторів [19]. Отже, результати опи- саних вище експериментів (рис. 3) дозволяють припустити, що гідроліз РІР2 залучений до меха- нізму інгібування Р2Х3-струмів. Відомо, що рі- вень мембранного РІР2, функціонально зв’язаного з Р2Х-рецепторами, визначається двома фактора- ми – фоновою активністю PLC, яка гідролізує РІР2, та активністю кіназ, котрі забезпечують синтез цієї сполуки [19]. Враховуючи те, що µ-опіоїдні агоніс- ти активують PLC [17], а, з іншого боку, активація самої PLC призводить до інгібування Р2Х3-струмів подібно до дії ЛЕК, потрібно було переконатися в тому, що активність PLC та виснаження запасів мембранного РІР2 можуть модулюватися в разі ак- тивації µ-опіоїдних рецепторів. Для цього ми вико- ристовували вортманін – інгібітор кіназ, що задія- ні до синтезу РІР2 (25 мкМ). Після інкубації ДСГ- нейронів у середовищі з даним агентом протягом 24 год ЛЕК у досить низькій концентрації (всього 10 нМ) посилював та прискорював свій інгібуючий вплив на Р2Х3-струми (рис. 4). Під дією 10 нМ ЛЕК впродовж 4 хв Р2Х3-струми в інкубованих із ворт- маніном нейронах пригнічувались у середньому на 83 ± 6 % (n = 4), тоді як в аналогічних експеримен- тах, але без інкубації із вказаним агентом ЛЕК у тій самій концентрації зменшував амплітуду даних струмів лише на до 48 ± 11 % (n = 3) (рис. 1, В). Цей ефект був оборотним лише частково. Заміна розчину з ЛЕК на нормальний не призводила до 2 2 2 300 пА 300 пА 500 пА 100 нМ ЛЕК 20 мкМ m-3M3FBS 10 нМ ЛЕК 50 нМ СТОР Ме-АТФ Ме-АТФ Ме-АТФ 100 мс 200 мс 250 мс 4 4 4 6 6 6 6 6 8 8 8 10 2 2 2 4 4 4 Р и с. 2. Усування селективним конкурентним антагоністом μ-опіоїдних рецепторів СТОР інгібуючого впливу лейенкефаліну (ЛЕК) на Р2Х3-опосередковані струми. Позначення аналогічні таким на рис. 1, А, Б. Р и с. 3. Інгібування Р2Х3-опосередкованих струмів, викликане активацією фосфоліпази С (PLC) у результаті аплікації синтетичного активатора PLC m-3M3FBS. Позначення аналогічні таким на рис. 1, А, Б. Р и с. 4. Посилення інгібуючого впливу лейенкефаліну (ЛЕК) на Р2Х3-опосередковані струми після інкубації нейронів у розчині з інгібітором кіназ вортманіном (25 мкМ). Позначення аналогічні таким на рис. 1, А, Б. NEUROPHYSIOLOGY / НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ.—2015.—T. 47, № 118 В. Б. КУЛИК, І. В. ЧИЖМАКОВ, Т. М. ВОЛКОВА, О. О. КРИШТАЛЬ повного відновлення амплітуд Р2Х3-струмів. Оче- видно, заблоковані кінази не можуть швидко від- новити рівень РІР2 до контрольного. Прискорення інгібуючого ефекту, вірогідно, пояснюється швид- ким виснаженням запасів мембранного РІР2. Опіо- їдіндукована активація PLC призводить до інтен- сивного гідролізу РІР2, а вортманін є інгібітором синтезу кіназ, необхідних для утворення останньо- го. Отже, рівень мембранного РІР2 істотно впливає на швидкість та ефективність пригнічення Р2Х3- рецепторів під дією ЛЕК. Отримані нами експериментальні результати в основному зводяться до наступного. Активація µ-опіоїдних рецепторів в умовах аплікації ендоген- ного опіоїда ЛЕК зумовлює інтенсивне пригнічення Р2Х3-струмів у нейронах ДСГ із сомами невели- кого діаметра (вірогідно, причетних до систе- ми ноцицепції). Ефективність пригнічення зале- жить від часу та концентрації ЛЕК; інгібування характеризується повною оборотністю. Активація внутрішньоклітинного сигнального ланцюга PLС/ РІР2 є ключовою подією, що зумовлює інгібування Р2Х3-струмів у досліджених нейронах під дією ен- догенного опіоїда. Результати детального вивчення молекуляр- них механізмів функціонального зв’язку між опіоїдними та Р2Х-рецепторами можуть сприяти поліпшенню ефективності застосування опіоїдних препаратів у боротьбі з болем. Отримані нами дані певною мірою поглиблюють розуміння раніше ви- явленого феномену – опіоїдергічного контролю „периферичних” Р2Х-рецепторів, істотно залуче- них у механізми ноцицепції. Дослідження були проведені згідно з положеннями Міжнародної конвенції щодо захисту тварин, які викорис- товуються в експериментах (Страсбург, 1985), а також від- повідно до положень Комітету з біоетики Інституту фізіоло- гії ім. О. О. Богомольця НАН України. Автори – В. Б. Кулик, І. В Чижмаков, Т. М. Волкова та О. О. Кришталь – підтверджують, що при виконанні дослі- дження та публікації його результатів були відсутні будь- які конфлікти щодо комерційних або фінансових відносин, відносин з організаціями та/або особами, котрі могли бути пов'язані з дослідженням, та взаємовідносин авторів статті. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. P. M. Dunn, Y. Zhong, and G. Burnstock, “P2X receptors in peripheral neurons,” Prog. Neurobiol., 65, 107-134 (2001). 2. M. F. Jarvis, “Contributions of P2X3 homomeric and heteromeric channels to acute and chronic pain,” Expert. Opin. Ther. Targets, 7, 513-522 (2003). 3. O. A. Krishtal, S. M. Marchenko, and V. I. Pidoplichko, “Receptor for ATP in the membrane of mammalian sensory neurones,” Neurosci. Lett., 35, 41-45 (1983). 4. S. McGaraughty and M. F. Jarvis, “Antinociceptive properties of a non-nucleotide P2X3/P2X2/3 receptor antagonist,” Drug News Perspect., 18, 501-507 (2005). 5. D. Donnelly-Roberts, S. McGaraughty, C. C. Shieh, et al., “Painful purinergic receptors,” J. Pharmacol. Exp. Ther., 324, 409-415 (2008). 6. Ю. Свердлов, “Современные проблемы боли”, Мед. науч. и учеб.-метод. журн., 2, 31-40 (2001). 7. B. Jordan and L. A. Devi, “Molecular mechanisms of opioid receptor signal transduction,” Br. J. Anaesth., 81, 12-19 (1998). 8. T. Reisine, S. F. Law, A. Blake, and M. Tallent, “Molecular mechanisms of opiate receptor coupling to G proteins and effector systems,” Ann. New York Acad. Sci., 780, 168-175 (1996). 9. I. Vetter, B. D. Wyse, G. R. Monteith, et al., “The mu opioid agonist morphine modulates potentiation of capsaicin-evoked TRPV1 responses through a cyclic AMP-dependent protein kinase A pathway,” Mol. Pain, 2, 22-28 (2006). 10. A. D. Corbett, G. Henderson, A. T. McKnight, and S. J. Paterson, “75 years of opioid research: the exciting but vain quest for the Holy Grail,” Br. J. Pharmacol., 147, Suppl. 1, S153-S162 (2006). 11. K. K. Rau, R. M. Caudle, B. Y. Cooper, and R. D. Johnson, “Diverse immunocytochemical expression of opioid receptors in electrophysiologically defined cells of rat dorsal root ganglia,” J. Chem. Neuroanat., 29, 255-264 (2005). 12. C. Stein, “Opioid receptors on peripheral sensory neurons,” Adv. Exp. Med. Biol., 521, 69-76 (2003). 13. W. Truong, C. Cheng, Q. G. Xu, et al., “Mu opioid receptors and analgesia at the site of a peripheral nerve injury,” Ann. Neurol., 53, 366-375 (2003). 14. E. B. Pratt, T. S. Brink, P. Bergson, et al., “Use-dependent inhibition of P2X3 receptors by nanomolar agonist,” J. Neurosci., 25, 7359-7365 (2005). 15. K. Raynor, H. Kong, Y. Chen, et al., “Pharmacological characterization of the cloned kappa-, delta-, and mu-opioid receptors,” Mol. Pharmacol., 45, 330-334 (1994). 16. S. K. Sharma, W. A. Klee, and M. Nirenberg, “Opiate- dependent modulation of adenylate cyclase,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3365-3369 (1977). 17. W. Xie, G. M. Samoriski, J. P. McLaughlin, et al., “Genetic alteration of phospholipase C beta3 expression modulates behavioral and cellular responses to mu opioids,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 10385-10390 (1999). 18. M. J. Rebecchi and S. N. Pentyala, “Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipase C,” Physiol. Rev., 80, 1291-1335 (2000). 19. G. Mo, L. P. Bernier, Q. Zhao, et al., “Subtype-specific regulation of P2X3 and P2X2/3 receptors by phosphoinositides in peripheral nociceptors,” Mol. Pain, 5, 47-52 (2009).

Опіоїдергічна регуляція активності Р2Х3-рецепторів у нейронах дорсальних спінальних гангліїв

Репозитарії

Схожі ресурси