Молекулярное клонирование, секвенирование и экспрессия в клетках Escherichia coli лейцил-тРНК синтетазы Thermus thermophilus - Яремчук, А.Д.; Коваленко, О.П.; Гудзера, О.И.; Тукало, М.А. (Вiopolymers and Cell, 2011)
Цель. Клонирование и секвенирование лейцил-тРНК синтетазы T. thermophilus (ЛейРСТТ) с последующим созданием генно-инженерной конструкции для экспрессии белка в клетках E. coli и его выделение. Методы. Поиск гена ЛейРСТТ проводили методом Саузерн-блот-гибридизации с хромосомной ДНК, где в качестве зондов использованы меченные дигоксигенином ПЦР-фрагменты ДНК. Результаты. Ген ЛейРС из клеток T. thermophilus HB27 клонирован и секвенирован. Открытая рамка считывания кодирует полипептид длиной 878 аминокислотных остатков (молекулярная масса 101 кДа). Сравнение аминокислотной последовательности ЛейРСТТ с таковыми гомологичных ферментов из других организмов показало, что она входит в группу аналогичных ферментов прокариотов, образуемую белками протобактерий, риккетсий, а также митохондрий эукариотов. Полученное филогенетическое древо Лей РС демонстрирует дихотомическое разветвление на две линии: прокариото/митохондриально-эукариотические и архейно/цитоплазмо-эукариотические белки. Отличия между прокариотической и архейной ветвями филогенетического древа ЛейРС в первую очередь связаны со структурой двух доменов фермента – корректирующего и С-концевого. Для экспрессии гена ЛейРСТТ в клетках E. coli соответствующий ген клонирован в экспресирующий вектор pET29b. Выводы. Клонированный ген leuS T. thermophilus и экспрессирующийся рекомбинантный белок будут использованы для структурно-функциональных исследований ЛейРСТТ, включая рентгеноструктурный анализ фермента и его мутантных форм в комплексе с различными субстратами. Ключевые слова: аминоацил-тРНК синтетазы, лейцил-тРНК синтетаза Thermus thermophilus, филогенетическое древо.