Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів

Досліджено регуляторні послідовності, що забезпечують органоспецифічну та світлозалежну експресію химерних генів у бактеріальних та рослинних клітинах. Вивчено і проклоновано у плазмідних векторах ділянку, яка відповідає 5'-кінцевій послідовності хлоропластного гена рибосомного білка S12 (rpS12...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2003
Автори:	Льошина, Л.Г., Медведева, Т.В., Булко, О.В., Галкін, А.П., Кухар, В.П.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України 2003
Назва видання:	Біополімери і клітина
Теми:	Молекулярна та клітинна біотехнології
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156427
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів / Л.Г. Льошина, Т.В. Медведева, О.В. Булко, А.П. Галкін, В.П. Кухар // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 2. — С. 169-178. — Бібліогр.: 36 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-156427
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-1564272019-06-19T01:28:52Z Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів Льошина, Л.Г. Медведева, Т.В. Булко, О.В. Галкін, А.П. Кухар, В.П. Молекулярна та клітинна біотехнології Досліджено регуляторні послідовності, що забезпечують органоспецифічну та світлозалежну експресію химерних генів у бактеріальних та рослинних клітинах. Вивчено і проклоновано у плазмідних векторах ділянку, яка відповідає 5'-кінцевій послідовності хлоропластного гена рибосомного білка S12 (rpS12), регуляторну ділянку гена пататину λpatl22 та промоторну послідовність гена малої субодинщі рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилази (rbcS3A). Показано органоспецифічну активність досліджуваних промоторів. У сконструйовані вектори введено ген металотіонеїну. Виявлено підвищену здатність трансгенних рослин до акумуляції іонів важких металів у клітинах органів з експресією гена металотіонеїну, що вибірково індукується різними промоторами. Исследованы регуляторные последовательностии, обеспечивающие органоспецифическую и светозависимую экспрессию хиерных генов в бактериальных и растительных клетках. Фрагмент, соответствующий 5'-концевой последовательности хлоропластного гена рибосомного белка S12 (rpS12), регуляторный фрагмент гена пататина λpatl22, промоторная последовательность гена малой субъединицы рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы (rbcS3A) выделены и проклонированы в плазмидных векторах. Выявлена органоспецифическая активность полученных промоторов. В сконструированный вектор введен ген металлотионеина. Показана повышенная способность трансгенных растений к аккумуляции ионов тяжелых металлов в клетках органов с избирательной промотор-индуцируемой экспрессией гена металлотионеина. In this study the regulatory sequences ensuring organ-specific and light-dependent expression of several chimerical genes in bacterial and plant cells have been received and investigated. A fragment corresponding to the 5'-end sequence of the chloroplast ribosomal gene S12 (rpS12), a regulatory fragment of the patatin gene λpatl22, a promoter sequence of the gene of small subunit of ribulose-1,5-disphosphate carboxylase (rbcS3A) have been extracted and cloned in vectors containing marker genes. The organ-specific activity of the cloned promoters has been shown. The metallo-thioneine gene has been introduced into the vector constructed. The increased ability of transgenic plants to accumulate the ions of heavy metals in organ's cells with selective promoter-induced expression of the metallothioneine gene has been demonstrated. 2003 Article Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів / Л.Г. Льошина, Т.В. Медведева, О.В. Булко, А.П. Галкін, В.П. Кухар // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 2. — С. 169-178. — Бібліогр.: 36 назв. — укр. 0233-7657 DOI:http://dx.doi.org/10.7124/bc.00064A http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156427 577.214.625 uk Біополімери і клітина Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Молекулярна та клітинна біотехнології Молекулярна та клітинна біотехнології
spellingShingle	Молекулярна та клітинна біотехнології Молекулярна та клітинна біотехнології Льошина, Л.Г. Медведева, Т.В. Булко, О.В. Галкін, А.П. Кухар, В.П. Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів Біополімери і клітина
description	Досліджено регуляторні послідовності, що забезпечують органоспецифічну та світлозалежну експресію химерних генів у бактеріальних та рослинних клітинах. Вивчено і проклоновано у плазмідних векторах ділянку, яка відповідає 5'-кінцевій послідовності хлоропластного гена рибосомного білка S12 (rpS12), регуляторну ділянку гена пататину λpatl22 та промоторну послідовність гена малої субодинщі рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилази (rbcS3A). Показано органоспецифічну активність досліджуваних промоторів. У сконструйовані вектори введено ген металотіонеїну. Виявлено підвищену здатність трансгенних рослин до акумуляції іонів важких металів у клітинах органів з експресією гена металотіонеїну, що вибірково індукується різними промоторами.
format	Article
author	Льошина, Л.Г. Медведева, Т.В. Булко, О.В. Галкін, А.П. Кухар, В.П.
author_facet	Льошина, Л.Г. Медведева, Т.В. Булко, О.В. Галкін, А.П. Кухар, В.П.
author_sort	Льошина, Л.Г.
title	Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів
title_short	Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів
title_full	Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів
title_fullStr	Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів
title_full_unstemmed	Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів
title_sort	органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів
publisher	Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
publishDate	2003
topic_facet	Молекулярна та клітинна біотехнології
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/156427
citation_txt	Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів / Л.Г. Льошина, Т.В. Медведева, О.В. Булко, А.П. Галкін, В.П. Кухар // Вiopolymers and Cell. — 2003. — Т. 19, № 2. — С. 169-178. — Бібліогр.: 36 назв. — укр.
series	Біополімери і клітина
work_keys_str_mv	AT lʹošinalg organospecifíčnatasvítlozaležnaekspresíâgenívutransgennihroslinahoderžannâíklonuvannâkorenebulʹbotalistspecifíčnihpromotorív AT medvedevatv organospecifíčnatasvítlozaležnaekspresíâgenívutransgennihroslinahoderžannâíklonuvannâkorenebulʹbotalistspecifíčnihpromotorív AT bulkoov organospecifíčnatasvítlozaležnaekspresíâgenívutransgennihroslinahoderžannâíklonuvannâkorenebulʹbotalistspecifíčnihpromotorív AT galkínap organospecifíčnatasvítlozaležnaekspresíâgenívutransgennihroslinahoderžannâíklonuvannâkorenebulʹbotalistspecifíčnihpromotorív AT kuharvp organospecifíčnatasvítlozaležnaekspresíâgenívutransgennihroslinahoderžannâíklonuvannâkorenebulʹbotalistspecifíčnihpromotorív
first_indexed	2025-07-14T08:48:17Z
last_indexed	2025-07-14T08:48:17Z
_version_	1837611506855837696
fulltext	ISSN 0233-7657. Біополімери і клітина. 2003. Т. 19. № 2 М О Л Е К У Л Я Р Н А І К Л І Т И Н Н А БІОТЕХНОЛОГІ Ї Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів JL Г. Льошина, Т. В. Медведева, О. В. Булко, А. П. Галкін, В. П. К у х а р Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України Вул. Мурманська, 5, Київ, 02094, Україна Досліджено регуляторні послідовності, що забезпечують органоспецифічну та світлозалежну експресію химерних генів у бактеріальних та рослинних клітинах. Вивчено і проклоновано у плазмідних векторах ділянку, яка відповідає 5'-кіниевій послідовності хлоропластного гена рибосомного білка SJ2 (rpS12), регуляторну ділянку гена пататину Xpatl22 та промоторну послідовність гена малої субодинщі рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилази (rbcS3A). Показано орга носпецифічну активність досліджуваних промоторів. У сконструйовані вектори введено ген металотіонеїну. Виявлено підвищену здатність трансгенних рослин до акумуляції іонів важких металів у клітинах органів з експресією гена металотіонеїну, що вибірково індукується різними промоторами. Вступ. Важливим завданням сучасної біотехнології є отримання трансгенних рослин з органоспеци- фічною експресією чужорідних генів у клітинах, які можна було б використовувати як селекційний матеріал для одержання нових сільськогосподар ських культур, надаючи їм таких корисних власти востей, як підвищений вміст поживних білків, стій кість до гербіцидів, вірусних захворювань, комах- шкідників та несприятливих умов довкілля [1—5] . Необхідність подібних робіт обумовлена тим, що практично у кожному випадку бажано, щоб введе ний ген експресувався лише в конкретному органі чи в певному типі клітин рослини. Здатність РНК-полімерази ініціювати транс крипцію залежить головним чином від властиво стей промотору та прилеглих до нього регулятор них послідовностей [6 ]. Тому особливий інтерес викликає клонування та структурно-функціональ не вивчення промоторів, які ініціюють експресію генів у різних частинах рослини. © Л. Г. Л Ь О Ш И Н А , Т. В. М Е Д В Е Д Є В А , О. В. Б У Л К О , А. П. ГАЛКІН, В. П. К У Х А Р , 2 0 0 3 Виходячи з цього ми вирішили клонувати три органоспецифічні промотори (коренеспецифічний, бульбоспецифічний та світлозалежний), створити модельні вектори з цими промоторами для введен ня досліджуваних генів у рослини, проаналізувати функціональні властивості промоторів, оцінюючи ефективність експресії химерних генів хлорамфе- ніколацетилтрансферази (CAT) та неоміцинфос- фотрансферази II (NPT II) [7 ] у трансформованих рослинах, та, використовуючи отримані результа ти, вивчити накопичення іонів важких металів у різних частинах трансгенних рослин шляхом кло нування химерного гена металотіонеїну (МТ) з Neurospora crassa під цими промоторами. М а т е р і а л и і м е т о д и . Д л я конструювання транспортних векторів використовували плазміди pUC19, pSK+, бактеріальні штами Escherichia coli, T G I , НВ101 та штам Agrobacterium tumefaciens pGV3850. Д Н К гідролізу в а л и , використовуючи ферменти рестрикції та ДНК-модифікуючі фермен та фірм «New England BioLabs» (США), «Serva» (Швеція) , «Promega» (США). Роботи з бактеріаль ними культурами, трансформацію Е. соїі, рестрик- 169 Л Ь О Ш И Н А Л. Г ТА ІН. цію, лігування, введення мітки в Д Н К та видален ня рекомбінантних плазмід здійснювали за стан дартною методикою, як описано у Маніатіса [8 ]. Первинну структуру Д Н К визначали за методом Сенгера [9] з використанням Т7-ДНК-полімерази і фрагмента Кльонова. Ампліфікацію гена проводили за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) на приладі ТС480 (фірма «Регкіп-Elmer Cetus», США). За відомою нуклеотидною послідовністю [10] відбира ли відповідні праймери, які, в свою чергу, були отримані за допомогою хіміко-ферментативного синтезу твердофазним Н-фосфатним методом [11 ]. При отриманні геномної Д Н К 50 г рослин швидко заморожували в рідкому азоті, гомогенізували та додавали 2 об'єми буфера (1-й %-й саркозил, 0,25 М сахароза, 50 мМ NaCl, 20 мМ ЕДТА, 50 мМ трис-НСІ, рН 8,0) Далі дотримувалися методики, наведеної у Меттлера [12] . Температурний режим для ПЛР підбирали з урахуванням довжини амп- ліфікованого фрагмента, довжини і складу викори станих праймерів. Реакція ампліфікації була за програмована на один цикл при 97 °С — 5 хв з наступними ЗО циклами: гібридизація 50 °С — 1 хв, елонгація 72 °С — 1,5 хв та денатурація при 94 °С — 1 хв і потім ще один кінцевий цикл: гібридизація 50 °С — 1 хв, елонгація 72 °С — 5 хв. Для електрофоретичного аналізу Д Н К в 1 %-му агарозному гелі у 1Н ТВЕ буфері (45 мМ трис-бо- рат, 1 мМ ЕДТА, рН 8,0) при 100 В впродовж 2 год брали 1/10 частину суміші з подальшим фарбуван ням бромистим етидієм. Клітини A tumefaciens трансформували пря мим методом [13] , протопласти — за модифіко ваною методикою Шиліто [14] . Трансгенні рослини тютюну регенерували і підтримували в культурі за методом Потрікуса [15]. Мікробульбочкові диски картоплі трансфор мували співкультивуванням з агробактеріальними векторами. На всіх етапах трансформації та реге нерації використовували живильне середовище MLS [16]. Селекцію трансформантів у всіх випад ках проводили на середовищі з 100 м г / л сульфату канаміцину. Експресію химерного гена npt-II та гена cat аналізували за методиками, описаними в лабора торному керівництві під редакцією Дж. Дрейпера та ін. [7 ]. Комп'ютерний аналіз послідовностей здійсню вали за допомогою пакетів програм: «PC-GENE», «DNA-STAR», «DNASIS», «TRANSFAC». Акумуляцію металів у рослинах визначали після вирощування рослин на MLS середовищі, яке містило 0,86 мг C u S 0 4 (200 мкмоль/кг) та 0,2 мг CdCl 2 (40 мкмоль/кг) . Умови вирощування: темпе ратура — 26 °С, освітлення 4000 — 5000 лк (18 год на день). Концентрацію металів у рослинах визна чали методом атомної адсорбційної спектроскопії («Регкіп-Elmer 300»). Клітинні екстракти наносили на колонку з сефадексом G-50 («Рпагтасіа», Шве ція) , яку обробляли буфером (25 мМ фосфат калія, рН 7,5). Результати і обговорення» Клонування та до слідження фрагмента геномної ДНК тютюну, що функціонує як коренеспецифічний промотор у трансгенних рослинах. Як джерела промоторних послідовностей звичайно використовують клоновані гени, які функціонують у рослинах. Відомо, що деякі з функціонуючих у рослинах промоторів здатні ініціювати транскрипцію в клітинах Е. соїі [17] . Отже, їх можна відбирати за проявленням функцій у бактеріальних клітинах. Цей підхід використано для клонування послідовностей ядер ної Д Н К тютюну, що функціонували як промотори в клітинах Е. соїі. Припустили, що деякі з послі довностей могли б функціонувати як промотори і в клітинах рослин [18] . Для перевірки цього припу щення випадкові фрагменти геномної Д Н К тютюну вбудовували перед кодуючою послідовністю гена npt-II без промотору і потенційні промотори вияв ляли за активністю NPT-I I в бактеріальних клі тинах. Одна з отриманих конструкцій у плазміді pDNt23t, що містила вставку довжиною 500 п. н. перед структурною частиною гена npt-II, була осо бливо ефективною в клітинах Е. соїі, тому її використали для трансформації рослин. Перш за все, було визначено нуклеотидну послідовність досліджуваного фрагмента Д Н К та сайт ініціації транскрипції химерного гена в бак теріальних клітинах і в трансгенних рослинах. Внаслідок аналізу нуклеотидної послідовності і блот-гібридизації показано, що клонований фраг мент гібридизувався як з ядерною, так і з хлороп- ластною ДНК. Порівняльний аналіз послідовності з використанням комп 'ютерної програми «DNA- STAR» виявив повну гомологію досліджуваного фрагмента з EcoRI-BgUI послідовністю промоторної частини хлоропластного рибосомного гена 572 [19]. В подальшому клоновану 5'-ділянку промоторо- подібної Д Н К досліджували на наявність потен ційних сайтів зв 'язування для різних факторів транскрипції. Для цього використано базу даних TRANSFAC, версія 2.3 (h t tp : / / t r ans facgbf -braun- schweig.de/index.html) . Виявилося, що фрагмент, по-перше, містить послідовності, подібні за струк турою до прокаріотичних промоторів (TATA/GA- T G ) , а саме — до промотору гена тирозинової т Р Н К Е. соїі: (TATGATG) [20 ] та промотору гена 170 http://transfacgbf-braun- http://schweig.de/index.html О Р Г А Н О С П Е Ц И Ф І Ч Н А ТА С В І Т Л О З А Л Е Ж Н А ЕКСПРЕСІЯ ГЕНІВ великої субодиниці рибу лозо-1,5-дифосфаткарбок- силази/оксигенази ( Р Д Ф К / О ) кукурудзи (ТАТ- САТ) [21 ]. Це пояснює функціонування фрагмента як промотору в бактеріальних клітинах. По-друге, фрагмент містить послідовності, які нагадують блок Гольдберга-Хогнеса в еукаріотичних промоторах, що дозволяє йому функціонувати і в еукаріотичних організмах. По-третє, в нуклеотидній послідовності фрагмента часто зустрічаються блоки нуклеотидів T G T G та TGA, характерні для регуляторних послі довностей [22]. Крім цього, виявлено прямі та інвертовані повтори, які також, імовірно, входять до складу регуляторних елементів, які контролю ють експресію підпромоторного гена (рис 1). Вихо дячи з цього ми припустили, що ця послідовність здатна ініціювати транскрипцію як у бактеріальних клітинах, так і в клітинах рослин. В результаті трансформації та регенерації протопластів тютюну плазмідною Д Н К з геном npt-II під досліджуваною послідовністю отримано сім стійких до канаміцину рослин, у яких експресію гена npt-II визначали за методикою, наведеною в лабораторному керівницт ві [7 ]. Для доведення того, що стійкість рослин до канаміціну зумовлена експресією химерного гена npt-II, визначали активність ферменту в різних органах рослини (рис 2) . Із викладених вище даних випливає, що активність NPT-I I в трансген них рослинах максимальна в коренях, дещо слабша в стеблах і практично не виявлена в листях Це свідчить про коренеспецифічний характер експресії гена npt-II. Рівень експресії гена, злитого з промо- торною послідовністю тютюну, помітно нижчий, а б в г Рис. 2. Визначення активності NPT-II в органах трансгенних рослин тютюну: а — лист; б — стебло; в — корінь трансгенної рослини, що трансформована плазмідою pDNt23neo; г — лист контрольної рослини, трансформованої pLGV23neo ніж у випадку позитивного контролю. Розміри білкових продуктів химерних генів npt-II як у досліді, так і в контролі приблизно однакові, хоча в досліді молекулярна маса білка дещо вища, а розподілення його в гелі дифузніше. Ц е може бути позв 'язано з відсутністю у плазміді з промоторною послідовністю канонічного еукаріотичного 3'-регу ляторного елемента і бути причиною молекулярної негомогенності м Р Н К і білкового продукту. Щ е одним підтвердженням того, що клонова- ний у векторі фрагмент Д Н К хлоропластного гено му є промотором, стало дослідження експресії гена cat, транскрипційно злитого з цим промотором. Ген cat під контролем послідовності rpSI2 було введено до протопластів тютюну в складі плазміди pUC23- cat і через 48 год культивування в цих протопла стах визначали транзієнтну експресію введеного гена. На радіоавтографі хроматограми (рис 3) видно, що досліджуваний екстракт має САТ-ак- тивність. Це свідчить про те, що фрагмент ядерної Д Н К тютюну плазміди pDNt23t, який розташова ний перед геном cat і відповідає фрагменту хлоро- пластної Д Н К , а саме — гену SI2, має властивості 171 Л Ь О Ш И Н А Л. Г. ТА ІН. а б Рис. 3. САТ-активність у рослинних протопластах тютюну, трансформованих вектором pDNt23cat: а — контрольні клітини Е. coli, використані як маркер ацетильованої форми , 4 С - х л о - рамфеніколу; б — трансформовані протопласти тютюну промотору і може ініціювати транскрипцію, незва жаючи на те, що він не є класичним промотором. Отримані результати дозволяють припустити, що хлоропластна промотороподібна послідовність виявляється в ядерній Д Н К і її промоторна фун кція може бути активована внаслідок природного або штучного переносу в ядерний геном. Аналіз активності продукту репортерного ге на під бульбоспецифічним промотором гена пата- тину в регенерованих трансформантах картоплі. Ген запасного білка картоплі — пататин — є зруч ною моделлю для дослідження механізмів органо- специфічної і індукованої експресії в клітинах рос лин [23 ]. Виходячи з того, що ген пататину класу І, позначений як ВЗЗ [24] , містить у своєму складі промотор з прямим повтором довжиною 208 п. н. та АТ-збагаченою послідовністю довжиною 37 п. н., яка тандемно повторюється три рази, здатний стимулювати експресію злитого з ним гена в клі тинах бульб, а при індукції 7—10 % - ю цукро зою — у клітинах листової тканини [25 ], було вирішено клонувати промотор пататину аналогіч ного типу з геномної бібліотеки генів картоплі сорту Зарево. Для скринінгу бібліотеки генів кар топлі цього сорту було синтезовано олігонуклео- тиди [11] , комплементарні консервативній ділянці 5'-кінцевої послідовності повтору 37 п. н. у промо торі гена пататину ВЗЗ (5 -АТТАТАТААТАСТАА- TAAAGA-3' ; 3 ' - T T A T G A T T A T T T C T T A T C T - 5 ) . У результаті трьох послідовних скринінгів віді брано клон рекомбінантного фага 2EMBL3-Apatl22, який гібридизувався зі специфічним олігонуклео- тидним зондом. З цього клону виділили фагову Д Н К та здійснили рестрикційне картування клоно- ваної вставки та її блот-гібридизацію з міченим олігонуклеотидним зондом [26 ]. Порівнюючи рестриктні карти і нуклеотидні послідовності відомих генів пататину класу І, вияв лені в комп'ютерному банку нуклеотидних по слідовностей EMBL за допомогою програми «РС- GENE», встановлено, що 5'-кінець усіх генів пата тину досить консервативний, причому на початку кодуючої послідовності всіх секвенованих генів класу І знаходиться сайт рестриктази DraL Цей сайт розташований в частині 5'-послідовності генів, яка не транслюється, через 12—20 п. н. після точки ініціації транскрипції. Внаслідок цього промоторну ділянку гена пататину можна клонувати як Dra- фрагмент. Враховуючи цю обставину, ми клону вал и ^ г а - фрагмент Apatl22 в плазміді pBluescript SK(+) («Stratagene», США) в сайт Smal. Після цього за загальною схемою переносили промотор у базовий вектор pDEI на основі плазміди pUC19. Промотор пататину довжиною 1600 п, н. і фрагмент полі- аденілювання гена нопалінсинтази (термінатор транскрипції) з 'єднували з маркерним геном cat по сайту рестрикції ВатНІ. Химерний ген Xpatl22- cat-term(nos), фланкований сайтами рестрикції Hindlll, клонували у відповідний сайт полілінкера бінарного вектора рBin 19. Ц ю конструкцію викори стано для прямої трансформації клітин A. tume- faciens штаму pGV3850. Рослини-регенеранти про аналізували на наявність експресії гена cat у різних органах рослини. Активність продукту введеного гена визначали в листях, коренях і мікробульбах регенерантів. Як позитивний контроль використовували клі тинний екстракт штаму Е. coli, що містить плаз- міду pBR325 з геном cat, як негативний — аліквоту реакційної суміші з екстрактом мікробульб не- трансформованих рослин, яку наносили на доріжку геля, 3 хроматограми видно, що максимальна ак- 172 О Р Г А Н О С П Е Ц И Ф І Ч Н А ТА С В І Т Л О З А Л Е Ж Н А ЕКСПРЕСІЯ ГЕНІВ Рис. 4. Аналіз САТ-активності в різних органах трансгенної картоплі: / — pCaMVcat (мікробульби); 2 — patl22-cat (корінь, індукований 8 %-ю сахарозою); 3 — patl22-cat (листя, інду коване 8 %-ю сахарозою); 4, 5 — patl22-cat мікробульби двох різних рослин (простежується САТ-активність); 6 — контрольні клітини Е. соїі, використані як маркер ацетильованої форми С-хлорамфеніколу тивність CAT спостерігається в мікробульбах трансформованих рослин картоплі і практично від сутня у тканинах листя і в корені (рис. 4) Цей факт підтверджує, що клонований промотор гена пататину забезпечує бульбоспецифічну експресію гена cat. Відсутність експресії в коренях дає мож ливість віднести промотор гена пататину Xpatl22 до класу І сімейства пататинових генів, оскільки ві домо, що гени пататину класу І здатні забезпечу вати високі рівні експресії винятково в бульбах [25, 27] . Вищенаведені результати аналізу експресії ге на cat отримані у рослин, які вирощували на поживних середовищах з мінімальним вмістом цук рози: 5 % для індукції бульбоутворення та 2 % для регенерації паростків на першій стадії трансфор мації рослин. Але відомо, що функціонування генів пататину класу І не лише органоспецифічне, а й регулюється вмістом сахарози в культуральному середовищі. Так , показано, що зростання рівня сахарози до 8 % індукує підвищену експресію генів пататину класу І у листовій тканині [25]. Для вивчення впливу сахарози на роботу химерного гена Xpatl22-cat отримано трансгенні рослини на середовищах з концентрацією сахарози 8 % та здійснено аналіз активності ферменту, ген якого регулюється досліджуваним промотором. З 'ясува лося, що в одержаних рослинах-регенерантах мо дифіковане середовище індукувало експресію CAT у листі, але вона була значно слабшою, ніж у коренях (рис. 4) . Таким чином, можна стверджувати, що клоно- вана послідовність Xpatl22 належить до пататино вих промоторів класу І і містить в собі необхідну інформацію для забезпечення бульбоспецифічної експресії химерних генів. Клонування промотору, що спрямовує світло- залежну експресію в регенерованих рослинах тю тюну. Процес фотосинтезу, що відбувається всере дині хлоропластів, перетворює енергію світла на енергію, яку рослина безпосередньо використовує у формі цукру. Р Д Ф К / О — ключовий фермент фото синтезу — являє собою мультисубодиничний білок, велика субодиниця (rbcL) якого кодується хлоро- пласним геномом, а мала (rbcS) — ядерним. Ін- тронно-екзонна структура генів Р Д Ф К / О має висо ку консервативність послідовностей та розміру. У цих генів регуляторні ділянки також висококонсер- вативні. Вони переключають гени під дією світ ла /темряви за допомогою фітохромів і забезпечу ють світлоіндуковану та органоспецифічну регу ляцію рослин [28—ЗО]. Враховуючи ці положення, було вирішено клону вати за допомогою ПЛР ана логічний промотор, який би скеровував світлоза- лежну експресію генів у рослинних організмах. Для ампліфікації відібрано послідовність промотору гена rbcS-ЗА томата, яку попередньо було секвено- вано [10] . Після аналізу послідовності промотору для праймерів відібрано такі олігонуклеотиди: 5 - G A T - T G A G T G A A T G G A C T T T T T G T G C - 3 ' (положення від -1076 до -1051) ; 5 ' - A A G A G G G T T A T T G C T T - T C T A G T C T C T C T - 3 ' (положення від +8 до - 1 8 ) . У результаті П Л Р з використанням цих праймерів та геномної Д Н К томатів сорту Киргизький отримано фрагменти Д Н К довжиною 1094 п. н. (рис. 5) . Для визначення існуючих у відомій послідовності сайтів рестрикції використовували комп'ютерну програму «DNASIS». Аналіз здійснювали за допомогою екзо- нуклеаз АІиІ і Rsal. Рестрикційне картування та секвенування підтвердили, що ампліфіковані фраг менти відповідають промоторній послідовності гена 173 Л Ь О Ш И Н А Л. Г. ТА ІН. 1 2 3 4 5 6 тис. п. «, rbe-ЗА томата. Порівняння консервативних 5'-про- моторних ділянок відомих генів rbcS-ЗА томата з отриманою послідовністю показало, що досліджу вана послідовність містить передбачений ТАТА бокс (-32 ТАТАААТ-26 від місця ініціації транс крипці ї ) та п о т е н ц і й н у СААТ д і л я н к у ( -98 CGAAT-93), які беруть участь у зв 'язуванні Р Н К - полімерази II. Відміни між відомими та ампліфі- кованим фрагментами проявляються головним чи ном у точкозих мутаціях, які істотно не впливають на їхнє функціонування як промоторів. Отриманий фрагмент клоновано в плазміді pSKBluescript(+) по сайтах упізнавання рестрикта зою Smal, з якої його надалі вирізали по EcoRI та ВатНІ. Загальну схему конструювання експресуючого вектора наведено на прикладі плазміди, що містить касету rbcS-CAT-term (рис. 6) . Для цього як базовий обрано вектор pUC19, у якому по ВатНІ- і Hindi ІІ-сайтах полілінкеру вбудували фрагмент поліаденілювання гена но- палінсинтази Гг-плазміди (термінатор транскрип ції — term) із вектора pLGV23neo. Нова конст рукція отримала термінуючу послідовність, флан ковану ВатНІ- та HindIII-сатаыи, перед якими знаходяться сайти для ферментів EcoRI та Narl (останній є ізошизомером ЕКеГ). У гідролізований сайт Ehel вбудували нефосфорильований лінкер HindlH. В результаті полілінкер та термінатор стали обмеженими Hindi1/-сайтами. Далі в цю плазміду по сайтах EcoRI і ВатНІ спрямовано вводили промотор rbcS, проклонований раніше по EcoRI ВатНІ pUC19 ~\\ІПП<ІШ \^Ehel+IImdIIIlinker ВатНІ term HindlH Р и с 6. Схема конструювання вектора pDLIC, який містить маркерний ген cat під промотором rbcS Smal-сашах у векторі pSK(+). Таким чином, ми отримали вектор, який між промотором та терміну ючою послідовністю містить ун ікальний сайт BamHI, у який можна вбудовувати маркерні або досліджувані гени (в даному випадку — це маркер ний ген cat). Орієнтацію злитого гена у векторі визначали рестрикційним аналізом за допомогою сайтів EcoRI, що містяться як у гені, так і в плазміді. Химерну касету rbcS-cat-term вирізали з вектора pDLl по сайтах рестрикції Hindi І і і клону- вали у відповідний сайт полілінкеру бінарного век тора рВіпІЯ, який методом прямої трансформації вводили до клітин A. tumefaciens штаму pGV3850. Трансформанти відбирали за стійкістю до канамі- цину та хлорамфеніколу. Отриманими штамами агробактерій інфікували листові диски тютюну, відбирали стійкі до вищезгаданих антибіотиків кло ни, з яких регенерували дорослі рослини. Для 174 • • • 1 2 3 Рис. 7. Аналіз САТ-активності в рослинах, трансформованих плазмідою pDLIC: а — корінь; б — листя; в — контрольний ек стракт Е. coli, використаний як маркер ацетильованої форми 1 4 С-хлорамфеніколу доказу наявності маркерного гена у трансформова них рослинах на рівні транскрипції та в різних органах рослини використовували метод визначен ня САТ-активності. Результати аналізу показали наявність активності ферменту у листковій тканині та її відсутність у коренях рослини (рис 7) . В останні роки з 'явилися повідомлення про новий маркерний ген, застосування якого не потре бує використання радіологічних методів дослід ження. Мова йде про зелений білок, який флуо ресціює (GFP — green fluorescent protein), медузи Aequorea victoria. Це перший приклад клонованого маркерного білка, який має власне флуоресцентне свічення. Серед його переваг можна відмітити такі, як стабільна флуоресценція, яка не вимагає додат кових екзогенних кофакторів і субстратів, неток- сичність для клітини-господаря, малий розмір (27 кДа) та відносно проста можливість тестування за допомогою УФ світла. GFP придатний для вико ристання як флуоресцентна мітка генів при вив ченні їхньої експресії та транспорту в рослинній клітині [31, 32 ] . Кодуюча послідовність GFP гена була вбудова на нами в експресуючий вектор під подвійним промотором rbcS-35SCaMV з подальшою трансфор мацією цим вектором клітин тютюну. Але отримані рослини мали слабке забарвлення. Очевидно, що введена касета негативно впливала на фотосинте- зуючий апарат та продукцію хлорофілу. Це явище ще потребує детального дослідження. Органоспецифічна експресія химерного гриб- О Р Г А Н О С П Е Ц И Ф І Ч Н А ТА С В І Т Л О З А Л Е Ж Н А ЕКСПРЕСІЯ ГЕНІВ ного гена металотіонеїну в трансгенних росли нах. Проблема забруднення довкілля і родючих грунтів важкими металами призводить до погли нання цих металів рослинами та подальшого по трапляння їх у харчові продукти, що становить серйозну загрозу здоров'ю людей і спричинює за гибель самих рослин. У клітинах більшості видів хребетних тварин та грибів важкі метали зв 'язуються і таким чином інактивуються спеціалізованими низькомолекуляр ними цистеїнбагатими білками — металотіонеїнами [33] . В рослинах подібних білків немає, і зв 'язу вання важких металів здійснюється фітохелати- нами — невеликими пептидами, які не є продукта ми генів і не можуть бути такими ефективними, як МТ. Тому проблема отримання та дослідження рослин з такими якостями є дуже актуальною [34—36 ]. Наше дослідження спрямоване на вивчення можливості підвищення акумуляці ї важких металів у різних частинах рослин. Для цього ген МТ з N. crassa (царина Fungi, клас Ascomicetes, родина Sordariaceae), послідовність якого відома, синтезу вали хіміко-ферментативним методом у дві стадії [11 ] і вбудовували у вектори: pDNt23t — під коре- неспецифічний промотор rpS12; pDEI — під буль- боспецифічний промотор Xpatl22; pDLI — під світ- лозалежний промотор rbcS. Згідно з літературними даними [34] , найшвидше перевірити експресію ге нів, які забезпечують стійкість до іонів важких металів, можна, проаналізувавши, як трансгенні рослини ростуть на середовищі, що містить дослід жуваний метал (у нашому випадку Cd та Си). Концентрацію металу в рослинах визначали мето дом атомної адсорбційної спектроскопії. Дані експе рименту представлено в таблиці. Летальні дози досліджуваних металів (Си-200, Cd-40 ммоль/кг) викликали у контрольних рослин (тютюну та картоплі) потемніння листя та їхню загибель протягом чотирьох днів. Рослини, транс формовані геном МТ під контролем 35S промотора, росли нормально, але дещо повільніше, ніж конт рольні, на середовищі без вмісту металу. На 15-й день у всіх рослин спостерігалася поява коренів (для порівняння: нормальні рослини в нетоксично му середовищі утворювали корені на 8-й день). У трансформантів картоплі під контролем пататино- вого промотору коренева система розвивалася недо статньо, але в деяких з них відбувалося бульбоут ворення. Розвиток пагонів також був слабким, але рослина виживала. Рівень акумуляції важких ме талів у коренях тютюну та бульбах картоплі дося гав критичної величини порівняно з рослинами, що містили МТ ген під 35S промотором. 175 Л Ь О Ш И Н А Л Г. ТА ІН. Концентрація важких металів у трансгенних рослинах на 25-й день експерименту РОСЛИНИ тютюну з експресією МТ гена під коренеспецифічним промотором розвивалися на ступним чином: ріст надземної частини сповіль нювався (затримка в рості була порівнянною з контрольними рослинами), корені утворювалися на рівні рослин з 35S промотором. У тютюну і картоплі з експресією МТ гена під світлозалежним промотором спостерігався непро порційний розвиток морфологічних ознак. Коли зелена надземна частина рослин розвивалася нор мально, формування коренів не спостерігалося. На межі надземної та підземної частин рослин форму валася калу сна тканина. На поверхні пагонів з ' яв лялися повітряні кореневі утворення. Рівень аку муляції металів був схожий з таким у рослин, що містили 35S промотор. Результати експерименту засвідчили, що всі рослини, трансформовані геном металотіонеїну, на були стійкості до підвищеної концентрації іонів важких металів у живильному середовищі. В за лежності від експресії МТ гена спостерігалася се лективна толерантність до шкідливого впливу ме талів у різних органах трансформантів. Порівняно з контролем рослини, що містили ген МТ, витри мували підвищену в 2—3 рази концентрацію важ ких металів. Нетрансформовані тканини та росли ни гинули на модифікованому середовищі в перші дні після проростання. Аналізуючи результати, отримані після вив чення акумулюючих властивостей трансгенних рослин, ми встановили, що 35S промотор та промо тор rbcS забезпечують приблизно однаковий рівень експресії гена МТ у трансформантах, але рослини, що містять світлозалежний промотор, менш жит тєздатні внаслідок слабко розвиненоє кореневої системи. У випадку з rpS12 та Xpatl22 промотора ми експресія МТ в бульбах та коренях значно вища, ніж у рослин з 35S промотором. Взагалі досить високий рівень акумуляції трансформанта- ми іонів важких металів за допомогою цих промо торів дає підставу для використання таких транс генних рослин для біоремедитації забруднених грунтів. Таким чином, при обговоренні отриманих ре зультатів необхідно ще раз наголосити на винят ковій важливості дослідження регуляторних послі довностей, які контролюють транскрипцію рослин них генів, не лише для розуміння процесів, що відбуваються в клітинах, а й для вирішення біотех- нологічних завдань, особливо тоді, коли необхідно експресу вати ген у певному типі клітин. Нами клоновано одночасно три промотори, специфічні для різних частин рослини: коренеспецифічний промотор помірної сили рибосомного гена тютюну (rpsJ2); бульбоспецифічний сильний промотор кла су І гена пататину картоплі (XpatJ22); листспе- цифічний промотор малої субодиниці РДФК тома та, дія якого обумовлена світлом (rbcS-ЗЛ). Для отримання коренеспецифічного промотору ми використали нетрадиційний підхід, який був пов 'язаний з відбором послідовностей з рестрикт- них фрагментів геномної Д Н К , що функціонують як промотори перед маркерними генами Е. coli і в трансгенних рослинах; пататинового промотору, клонованого класичним шляхом — відбором з ге номної Д Н К за допомогою гібридизаційних зондів, комплементарних певним ділянкам промотору па татину; промотору Р Д Ф К — за допомогою специ фічних праймерів та реакції полімеразного копі ювання відібраних фрагментів Д Н К . Клоновані промотороподібні ділянки Д Н К ідентифікували шляхом конструювання спеціальних плазмідних векторів, які містять модельні гени під цими по слідовностями, генетичної трансформації клітин рослин цими плазмідами, отримання з трансформо ваних клітин трансгенних рослин-регенерантів і вивчення експресії химерних генів в окремих час тинах рослин. Належність клонованих послідов ностей до промоторів доведено не лише за їхніми функціями, а й за наявності в їхній первинній структурі регуляторних ділянок, які характерні для про- та еукаріотичних промоторів, описаних у літературі. Отримано також докази на користь того, що тканиноспецифічна експресія гена мета лотіонеїну гриба відбувається в трансгенних росли нах під органоспецифічними та світлоіндукованими промоторами. 176 О Р Г А Н О С П Е Ц И Ф І Ч Н А ТА С В І Т Л О З А Л Е Ж Н А ЕКСПРЕСІЯ ГЕНІВ L. G. Ljoshina, Т. V. Medvedeva, О. V. Bulko, A. P. Galkin, V. P. Kukhar Organ-specific and light-inducible expression of genes in transgenic plants: receiving and cloning root-, tuber- and leaf-specific promoters Summary In this study the regulatory sequences ensuring organ-specific and light-dependent expression of several chimerical genes in bacterial and plant cells have been received and investigated. A fragment corresponding to the 5'-end sequence of the chloroplast ribosomal gene SJ2 (rpSI2), a regulatory fragment of the patatin gene Xpatl22, a promoter sequence of the gene of small subunit of ribulose-l,5-disphosphate carboxylase (rbcS3A) have been extracted and cloned in vectors containing marker genes. The organ-specific activity of the cloned promoters has been showti The metallo- thioneine gene has been introduced into the vector constructed. The increased ability of transgenic plants to accumulate the ions of heavy metals in organ's cells with selective promoter-induced expression of the metallothioneine gene has been demonstrated. JI. Г. Лешина, Т. В. Медведева, О. В. Булко, А. П. Галкин, В. П. Кухарь Органоспецифическая и светозависимая экспрессия генов в трансгенных растениях: получение и клонирование корне-, клубне- и листспецифических промоторов Резюме Исследованы регуляторные последовательностии, обеспечива ющие органоспецифическую и светозависимую экспрессию хи мерных генов в бактериальных и растительных клетках. Фрагмент, соответствующий 5'-концевой последовательно сти хлоропластного гена рибосомного белка S12 (rpS12), регуляторный фрагмент гена пататина Xpatl22, промотор- ная последовательность гена малой субъединицы рибу лозо-1,5- дифосфаткарбоксилазы (rbcS3A) выделены и проклонированы в плазмидных векторах. Выявлена органоспецифическая актив ность полученных промоторов. В сконструированный вектор введен ген металлотионеина. Показана повышенная способ ность трансгенных растений к аккумуляции ионов тяжелых металлов в клетках органов с избирательной промотор-инду- цируемой экспрессией гена металлотионеина. ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРИ 1. Streber W. R., Willmitzer L. Transgenic tobacco plants ex pressing a bacterial detoxitying enzymes are resistance to 2 ,4D / / Bio-Technology.—1989.—7.—P. 811—816. 2. Vaeck M.t Reynaerts A., Hofte H. Transgenic plants protected from insect attack / / Nature.—1987.—328.—P. 33—37. 3. Ebskamp M. J. M., van der Meer I. M., Spronk B. A., Weisbeek P. J. Accumulation of fructose polymers in transgenic tobacco / / Bio-Technology.—1994.—12.—P. 272—275. 4. Sano Т., Nagayama A., Ogawa Т., Ishida I., Okada Y. Transgenic potato expressing a double-stranded RNA-specific ribonuclease is resistant to potato spindle tuber viroid / / Nature Biotechnol.—1997.—15, N 12.—P. 1290—1294. 5. Tacke E., Salamini F., Rohde W. Genetic engineering of potato for broad-spectrum protection against virus infection / / Nature Biotechnol.—1996.—14, N 11.—P. 1597—1601. 6. Walden R., Schell J. Techniques in plant molecular biology — progress and problems / / Eur. J. Biochem.—1990.—192, N 2 . - P . 5 6 3 - 5 7 6 . 7. Дрейпер Дж., Скотт P., Армитидж Ф., Уолден Р. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство.—Москва: Мир, 1991.—408 с. 8. Maniatis Т., Fritsch Е. Е., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual.—New York: Cold Spring Harbor Lab. press, 1987.—352 p. 9. Hindley J., Staden R. DNA sequencing.—Amsterdam; New York; Oxford: Elsevier Biomed. press, 1983.—384 p. 10. Veda N., Pichersky E., Malik S. K, Coshmore A. A. Level of expression of the tomato rbc-3A gene is modulated by a far upstream promoter element in a developmentally regulated manner / / Plant Cel l .—1989.—1.—P. 217—227. 11. Dubey I. Ya., Lyapina Т. V., Galkin A. P., Fedoryak D. M. Obtaining of highly efficient polymer support for the synthesis of the DNA fragments on the basis of the microspheric silica «Silochrom-2» / / Биополимеры и клетка—1993.—9, № 4.— P. 26—31 . 12. Mettler A. A small and rapid method for minipreparation of DNA from tissue cultured plant cells / / Plant Мої. Biol. Rep.—1987.—5, N 3 .—P. 346—349. 13. Burow M. D., Chlan C. A., Sen P., Lisca A. High-frequency generation of transgenic tobacco plants after modified leaf discs co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens II Plant Мої. Biol. Rep.—1990.—8, N 2 .—P. 124—139. 14. Shillito R. D., Paszkowski J., Potrykus I. Agarose plating and a bead type culture technique enable and stimulate develop ment of protoplast-derived colonies in a number of plant species / / Plant Cell Rep .—1983 .—2.—P. 244—247. 15. Potrykus I., Shillito R. D. Protoplasts: isolation, culture, plant regeneration / / Meth. Enzymol .—1985.—118.—P. 549—577. 16. Медведева Т. В., Ефименко И. М. Использование микро клубневых дисков для трансформации картофеля посред ством клубнеспецифических векторов на основе Agrobac terium tumefaciens II Физиология и биохимия культ, рас тений.—1997.—29, № 3 .—С. 187—193. 17. Herrera-Estrella L., Depicker A., Van Montagu М., Schell J. Expression of chimaeric genes transferred into plant cell using 77-plasmid derived vector / / Nature.—1983.—303, N 5914 .— P. 209—213. 18. Доманский H. #., Генинг Л. В., Галкин А. П., Газарян К. Г. Клонирование последовательностей ядерной ДНК Nico- tiana tabacum, функционирующих как промоторы в клет ках Escherichia соїі II Д А Н СССР.—1986 .—21 , № 4.— С. 151 — 154. 19. Grgzelyak N. К, Galkin А. P., Gening L. V., Medvedeva Т. V. Chloroplast «cryptic» promoter can be activated upon their transfer to plant nuclear genome / / Биополимеры и кле тка.—1996.—12, № 6.—С. 8 7 — 9 3 . 20. Pribnow D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter / / Proc. Nat. Acad. Sci. USA.—1975 .—72, N 3 .—P. 784—788 . 21 . Bohnert H. J., Crouse E. J., Schmitt J. M. Organization and expression of plastid genomes / / Nucleic acids and proteins in plants II.—Berlin; Heidelberg: Springer, 1982.—P. 530. 22. Nussinov R. Some guidelines for identification of recognition sequences: regulatory sequences frequently contain TG~ T G / C A C ( A ) , TGA/TCA and (T)CTC/GAG(A) / / Biochim. et biophys. acta .—1986.—866, N 14.—P. 93—108. 23. Mignery C. A., Pikaard C. S., Park W. D. Molecular characterization of the patatin multigene family of potato / / Gene .—1988.—62.—P. 27—44. 24. Rocha-Sosa M., Sonnewald U., Frommer W.t Stratmann M. Both developmental and metabolic signals activate the promoter of a class I patatin gene / / EMBO J .—1989.—8, N 1.— P. 23—29. 25. Liu X. Y.t Prat S., Willmitzer L, Frommer W. B. Cis- regulatory elements directing tuber-specific and sucrose-in- 177 Л Ь О Ш И Н А Л Г. ГА ІН. ducible expression of a chimeric class I patatin promoter GUS-gene fusion / / Мої. and Gen. Genet .—1990.—223, N 3 . - P . 401-406. 26. Yefimenko I. M., Medvedeva Т. V., Kovalenko P. G., Gaza- ryan K. G , Galkin A. P. Organ-specific gene expression in transgenic potato: the cloning a new promoter of a class I patatin gene / / Биополимеры и клетка.—1995.—11, № 6.— P. 96—103. 27. Paiva E., Lister P. M., Park W. D. Induction and accumulation of major tuber proteins of potato in stems and petioles / / Plant Physiol .—1983.—71.—P. 616—618. 28. Manzara Т., Gruissem W. Organization and expression of the genes encoding ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase in higher plants / / Photosyn. Res .—1988.—16.—P. 117—139. 29. Herrera-Estrella L., Van der Broesk G., Maenhaut R., Van Moniagy M. Light-inducible and chloioplast-assuuated e x p l o sion of a chimeric gene introduced into Nicotiana tabacum using a 77-plasmid vector / / Nature.—1984.—310.—P. 115— 120. 30. Morelli C , Nagy R, Fraley R. Т., Rogers S. G. A shot conserved sequence is involved in the light-inducibility of a gene encoding ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit of pea / / Nature.—1985.—315.—P. 200—204. 31. Haseloff J., Amos B. GFP in plants / / T I G . - 1 9 9 5 . - 1 1 , N 8.—P. 328—329. 32. Pang S. Z., Deboer D. L., Wan G. В., Ye G. B. An improved green fluorescent protein gene as a vital marker in plants / / Plant Physiol .—1996.—112.—P. 893—900. 33. Kagi J. H. R., Schaffler A. Biochemistry of metallothionein / / Biochemistry.—1988.—27, N 23 .—P. 8509—8515. 34. Misra S.t Gedman L. Heavy metal tolerant transgenic Brassica napus L. and Nicotiana tabacum L. plants / / Theor. and Appl. Gene t—1989 .—78 .—P. 161 — 168. 35. Raskin I., Kumar P. B. A. N., Duchenkov S., Saft D. E. Bioconcentration of heavy metals by plants / / Curr. Opin. Biotechnol.—1994.—5.—P. 285—290. 36. Rauser W. E. Metal-binding pcplidcb in plaub / / Sulfui nutrition and assimilation in higher plants.—Amsterdam: SPB Acad, publ., 1993.—P. 239—250. УДК 577.214.625 Надійшла до редакції 19.02.02 178

Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів у трансгенних рослинах: одержання і клонування корене-, бульбо- та листспецифічних промоторів

Репозитарії

Схожі ресурси