Наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом

Наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом

Исследовано влияние тиаминтрифосфата на тиаминсвязывающую активность (ТСА) в препаратах плазматических мембран синаптосом (ПМС), изолированных из головного мозга крыс. Показано ингибирование тиаминтрифосфатом тиаминсвязывающей активности ПМС, которое носит конкурентный характер (Кi =1,0 ± 0,3 мкМ)....

Повний опис

Збережено в:
Бібліографічні деталі
Дата:2010
Автори: Пархоменко, Ю.М., Строкина, А.А., Пилипчук, С.Ю., Степаненко, С.П., Чеховская, Л.И., Донченко, Г.В.
Формат: Стаття
Мова:Russian
Опубліковано: Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України 2010
Назва видання:Український біохімічний журнал
Теми:
Експериментальні роботи
Онлайн доступ:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/19021
Теги: Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:Наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом / Ю.М. Пархоменко, А.А. Строкина, С.Ю. Пилипчук, С.П. Степаненко, Л.И. Чеховская, Г.В. Донченко // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 34-41. — Бібліогр.: 21 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-19021
record_format dspace
spelling irk-123456789-190212011-04-17T12:04:52Z Наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом Пархоменко, Ю.М. Строкина, А.А. Пилипчук, С.Ю. Степаненко, С.П. Чеховская, Л.И. Донченко, Г.В. Експериментальні роботи Исследовано влияние тиаминтрифосфата на тиаминсвязывающую активность (ТСА) в препаратах плазматических мембран синаптосом (ПМС), изолированных из головного мозга крыс. Показано ингибирование тиаминтрифосфатом тиаминсвязывающей активности ПМС, которое носит конкурентный характер (Кi =1,0 ± 0,3 мкМ). В то же время тиамин в диапазоне концентраций 0,5–20 мкМ не оказывает ингибирующего действия на тиаминтрифосфатазную (ThTP-азную) активность, а, напротив, наблюдается ее активация с максимумом при концентрации 2,5 мкМ. Изучено влияние классических антагонистов тиамина (ампролиума, окситиамина и пиритиамина) на биологическую активность плазматических мембран, присущую тиаминсвязывающему протеину (ТСП). Величина IC50 для ингибирования ампролиумом тиаминсвязывающей активности ПМС определена равной 50 ± 4,0 мкМ, в то время как на ThTP-азную активность этот антагонист не оказывает влияния. Показано ингибирование окситиамином обоих видов активности ТСП. Величина IC50 составляет 125 ± 28 и 1000 ± 95 мкМ соответственно для ТСА и ThTP-азной активности. А величины IC50 для ингибирования ТСА и ThTP-азной активности пиритиамином отличаются на порядок, составляя соответственно 2,2 ± 0,2 и 43 ± 9 мкМ. Полученные данные свидетельствуют о том, что активные центры на ПМС, отвечающие за ТСА и ThTP-азную активность, обладают различной чувствительностью к антагонистам тиамина. Полученные результаты дают основание предположить, что за специфическое связывание и гидролиз тиаминфосфатов в ТСП синаптических мембран отвечают различные активные центры. Досліджено вплив тіамінтрифосфату на тіамінзв’язуючу активність у препаратах плазматичних мембран синаптосом (ПМС), ізольованих з головного мозку щурів. Показано інгібування тіамінтрифосфатом тіамінзв’язувальної активності ПМС, яке має конкурентний характер (Кi =1,0 ± 0,3 мкМ). У той самий час тіамін у діапазоні концентрацій 0,5–20 мкМ не інгібує тіамінтрифосфатазну (ThTP-азну) активність, а навпаки, спостерігається її активація з максимумом концентрації близько 2,5 мкМ. Досліджено вплив класичних антагоністів тіаміну (ампроліуму, окситіаміну та піритіаміну) на біологічну активність плазматичних мембран, яка властива тіамінзв’язувальному протеїну (ТЗП). Величина IC50 для інгібування ампроліумом тіамінзв’язувальної активності ПМС складає 50 ± 4,0 мкМ, в той час як на ThTP-азну активність цей антагоніст не має впливу. Показано інгібування окситіаміном обох видів активності ТЗП. Величина IC50 складає 125 ± 28 та 1000 ± 95 мкМ для тіамінзв’язувальної та ThTP-азної активності відповідно. Визначені величини IC50 для інгібування тіамінзв’язувальної та ThTP-азної активності піритіаміном відрізнялись на порядок, складаючи, відповідно, 2,2 ± 0,2 та 43 ± 9 мкМ. Одержані дані свідчать про різну чутливість до антагоністів тіаміну активних центрів на ПМС, які відповідають за тіамінзв’язувальну та ThTP-азну активність. Наші результати дозволяють зробити припущення, що за специфічне зв’язування відповідають окремі активні центри. The current work is aimed at understanding the structure and functionality of thiamine binding protein (TBP) in neural cells plasma membranes. The influence of thiamine triphosphate on thiamine binding by TBP in synaptic plasma membranes (SPM) isolated from the rat brain was investigated. It was shown that thiamine triphosphate inhibits thiamine binding activity of SPM in concurrent manner (Кi = 1.0 ± 0.3 μМ). At the same time thiamine had no effect on thiamine triphosphatase (ThTPase) activity at the concentration range 0.5–20 μМ. Otherwise, ThTPase activation with the maximum at the concentration about 2.5 μМ was observed. Further, the influence of classic thiamine antagonists (amprolium, oxythiamine and pyrithiamine) on both biological activities of TBP in SPM was studied. The IC50 value for inhibition of thiamine binding on SPM by amprolium comprised 50 ± 4.0 μМ. Still, this antagonist had no effect on ThTPase activity. For the oxythiamine inhibition of both TBP activities was detected. The values of IC50 were 125 ± 28 and 1000 ± 95 μМ for thiamine binding and ThTPase activity, respectively. The values of IC50 for thiamine binding and ThTPase activity inhibition differed by more than one order of magnitude and comprised 2.2 ± 0.2 and 43 ± 9 μМ, respectively. The obtained data indicate that the active sites on SPM responsible for thiamine binding and ThTPase activity have different sensitivity to thiamine antagonists. Our results allow us to suppose that different active protein sites are responsible for the specific binding and for thiamine phosphates hydrolysis by TBP of synaptic membranes. 2010 Article Наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом / Ю.М. Пархоменко, А.А. Строкина, С.Ю. Пилипчук, С.П. Степаненко, Л.И. Чеховская, Г.В. Донченко // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 34-41. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. 0201-8470 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/19021 577.152.3:577.164.11 ru Український біохімічний журнал Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
topic Експериментальні роботи
Експериментальні роботи
spellingShingle Експериментальні роботи
Експериментальні роботи
Пархоменко, Ю.М.
Строкина, А.А.
Пилипчук, С.Ю.
Степаненко, С.П.
Чеховская, Л.И.
Донченко, Г.В.
Наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом
Український біохімічний журнал
description Исследовано влияние тиаминтрифосфата на тиаминсвязывающую активность (ТСА) в препаратах плазматических мембран синаптосом (ПМС), изолированных из головного мозга крыс. Показано ингибирование тиаминтрифосфатом тиаминсвязывающей активности ПМС, которое носит конкурентный характер (Кi =1,0 ± 0,3 мкМ). В то же время тиамин в диапазоне концентраций 0,5–20 мкМ не оказывает ингибирующего действия на тиаминтрифосфатазную (ThTP-азную) активность, а, напротив, наблюдается ее активация с максимумом при концентрации 2,5 мкМ. Изучено влияние классических антагонистов тиамина (ампролиума, окситиамина и пиритиамина) на биологическую активность плазматических мембран, присущую тиаминсвязывающему протеину (ТСП). Величина IC50 для ингибирования ампролиумом тиаминсвязывающей активности ПМС определена равной 50 ± 4,0 мкМ, в то время как на ThTP-азную активность этот антагонист не оказывает влияния. Показано ингибирование окситиамином обоих видов активности ТСП. Величина IC50 составляет 125 ± 28 и 1000 ± 95 мкМ соответственно для ТСА и ThTP-азной активности. А величины IC50 для ингибирования ТСА и ThTP-азной активности пиритиамином отличаются на порядок, составляя соответственно 2,2 ± 0,2 и 43 ± 9 мкМ. Полученные данные свидетельствуют о том, что активные центры на ПМС, отвечающие за ТСА и ThTP-азную активность, обладают различной чувствительностью к антагонистам тиамина. Полученные результаты дают основание предположить, что за специфическое связывание и гидролиз тиаминфосфатов в ТСП синаптических мембран отвечают различные активные центры.
format Article
author Пархоменко, Ю.М.
Строкина, А.А.
Пилипчук, С.Ю.
Степаненко, С.П.
Чеховская, Л.И.
Донченко, Г.В.
author_facet Пархоменко, Ю.М.
Строкина, А.А.
Пилипчук, С.Ю.
Степаненко, С.П.
Чеховская, Л.И.
Донченко, Г.В.
author_sort Пархоменко, Ю.М.
title Наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом
title_short Наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом
title_full Наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом
title_fullStr Наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом
title_full_unstemmed Наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом
title_sort наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом
publisher Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
publishDate 2010
topic_facet Експериментальні роботи
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/19021
citation_txt Наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом / Ю.М. Пархоменко, А.А. Строкина, С.Ю. Пилипчук, С.П. Степаненко, Л.И. Чеховская, Г.В. Донченко // Укр. біохім. журн. — 2010. — Т. 82, № 1. — С. 34-41. — Бібліогр.: 21 назв. — рос.
series Український біохімічний журнал
work_keys_str_mv AT parhomenkoûm naličiedvuhrazličnyhaktivnyhcentrovnatiaminsvâzyvaûŝemproteineplazmatičeskihmembransinaptosom
AT strokinaaa naličiedvuhrazličnyhaktivnyhcentrovnatiaminsvâzyvaûŝemproteineplazmatičeskihmembransinaptosom
AT pilipčuksû naličiedvuhrazličnyhaktivnyhcentrovnatiaminsvâzyvaûŝemproteineplazmatičeskihmembransinaptosom
AT stepanenkosp naličiedvuhrazličnyhaktivnyhcentrovnatiaminsvâzyvaûŝemproteineplazmatičeskihmembransinaptosom
AT čehovskaâli naličiedvuhrazličnyhaktivnyhcentrovnatiaminsvâzyvaûŝemproteineplazmatičeskihmembransinaptosom
AT dončenkogv naličiedvuhrazličnyhaktivnyhcentrovnatiaminsvâzyvaûŝemproteineplazmatičeskihmembransinaptosom
first_indexed 2025-07-02T19:54:43Z
last_indexed 2025-07-02T19:54:43Z
_version_ 1836566271489998848
fulltext ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 134 УДК 577.152.3:577.164.11 наличие двух различных активных центров на тиаминсвязывающем протеине плазматических мембран синаптосом Ю. М. ПархоМенко, а. а. Строкина, С. Ю. ПилиПчУк, С. П. СтеПаненко, л. и. чеховСкая, Г. в. Донченко институт биохимии им. а. в. Палладина нан Украины, киев; e-mail: yupark@biochem.kiev.ua исследовано влияние тиаминтрифосфата на тиаминсвязывающую активность (тСа) в препа- ратах плазматических мембран синаптосом (ПМС), изолированных из головного мозга крыс. Показано ингибирование тиаминтрифосфатом тиаминсвязывающей активности ПМС, которое носит конку- рентный характер (кi =1,0 ± 0,3 мкМ). в то же время тиамин в диапазоне концентраций 0,5–20 мкМ не оказывает ингибирующего действия на тиаминтрифосфатазную (ThTP-азную) активность, а, на- против, наблюдается ее активация с максимумом при концентрации 2,5 мкМ. изучено влияние классических антагонистов тиамина (ампролиума, окситиамина и пиритиа- мина) на биологическую активность плазматических мембран, присущую тиаминсвязывающему про- теину (тСП). величина IC50 для ингибирования ампролиумом тиаминсвязывающей активности ПМС определена равной 50 ± 4,0 мкМ, в то время как на ThTP-азную активность этот антагонист не оказывает влияния. Показано ингибирование окситиамином обоих видов активности тСП. величина IC50 составляет 125 ± 28 и 1000 ± 95 мкМ соответственно для тСа и ThTP-азной активности. а величины IC50 для ингибирования тСа и ThTP-азной активности пиритиамином отличаются на поря- док, составляя соответственно 2,2 ± 0,2 и 43 ± 9 мкМ. Полученные данные свидетельствуют о том, что активные центры на ПМС, отвечающие за тСа и ThTP-азную активность, обладают различной чувствительностью к антагонистам тиамина. Полученные результаты дают основание предположить, что за специфическое связывание и гидролиз тиаминфосфатов в тСП синаптических мембран отвечают различные активные центры. к л ю ч е в ы е с л о в а: тиамин, тиаминтрифосфат, тиаминтрифосфатаза, плазматические мембраны синаптосом, тиаминсвязывающий протеин, антагонисты тиамина. Высокую чувствительность нервных кле­ ток к дефициту тиамина (витамина В1), отмечаемую уже на ранних этапах изу­ чения этого витамина, оказалось невозмож­ ным объяснить только с позиции его энзимной функции, то есть с позиции участия тиамин­ дифосфата (ThDP) в функционировании не­ скольких энзимов углеводного обмена [1–3]. Это обстоятельство побудило исследователей искать и другие пути участия тиамина в био­ химических процессах, обеспечивающих функ­ циональную активность нервных клеток. Анализ результатов собственных исследо­ ваний и данных литературы позволил авторам выдвинуть предположение о существовании в нервных клетках подвижного пула тиамина и его фосфатов (не связанных с протеинами), циркуляция которых между внутриклеточным пространством и пресинаптической щелью обеспечивает сопряжение между обменом тиа­ мина в нервной клетке и ее функцией [1]. На­ рушение такого сопряжения может вносить су­ щественный вклад в развитие дегенеративных изменений в клетках независимо от причины, ее вызвавшей: недостаточность витамина али­ ментарного происхождения [2, 4], генетические дефекты протеинов, принимающих участие в обмене и функционировании витамина В1 [2, 5], действие антагонистов этого витамина, блокирующих определенные реакции в его об­ мене [6]. По нашим представлениям, ТСП, изо­ лированный нами ранее из нервных клеток [7, 8], опосредует перенос тиамина через плаз­ матическую мембрану в обоих направлениях. Сведения о мембранной локализации ТСП [9] и выявленная его способность избиратель­ но гидролизовать фосфорные эфиры тиамина [8] перекликаются с ранними наблюдениями в опытах с нервно­мышечными препарата­ ми, свидетельствующими о том, что из этих препаратов при возбуждении высвобождается екСПериМентальні роботи ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 35 в среду свободный тиамин, а не его фосфор­ ные эфиры, превалирующие в общем внутри­ клеточном пуле производных тиамина [10]. Согласно сформулированной гипотезе, клю­ чевыми звеньями обмена тиамина, обеспечи­ вающими циркуляцию его подвижного пула в клетку и из нее, в частности, являются: 1 – вышеуказанный мембранный тиаминсвязыва­ ющий протеин, осуществляющий перенос ти­ амина через плазматическую мембрану внутрь клетки, 2 – цитозольный энзим тиаминкиназа (КФ 2.7.6.2), фосфорилирующий поступивший в клетку тиамин до ThDP, что способствует созданию позитивного градиента свободного тиамина внутрь клетки, 3 – мембранная ти­ аминфосфатгидролаза, осуществляющая гид­ ролиз тиаминфосфатов до свободного тиамина при выходе его из клетки. Последняя энзима­ тическая активность, согласно полученным нами данным, также присуща мембранному ТСП. В наших предыдущих исследованиях было показано, что ТСП является единствен­ ным носителем тиаминтрифосфатазной актив­ ности, ассоциированной с плазматическими мембранами [11]. Вопрос о том, является ли этот протеин тиаминфосфатгидролазой, где один активный центр отвечает за связывание тиамина и его фосфатов и за гидролиз послед­ них, или на протеине имеется два различных активных центра, один из которых проявляет аффинность к тиамину, а другой отвечает за избирательный гидролиз тиаминфосфатов, ос­ тается не выясненным. Изолированный нами протеин по изученным сегодня свойствам отличается как от описанного транспортера тиамина [12], так и от хорошо изученной рас­ творимой цитозольной тиаминтрифосфатазы (ThTP­азы) [13] и, как можно заключить из ре­ зультатов электрофореза в ПААГ, состоит из двух субъединиц [14]. Поскольку нет полной уверенности в том, что ТСП, который мы изу­ чаем в изолированном состоянии, сохраняет свои нативные свойства, наше исследование проведено на препаратах ПМС, где данный протеин локализован [9]. Цель настоящей ра­ боты – приблизиться к пониманию структурно функциональной организации тиаминсвязыва­ ющего протеина в плазматической мембране. материалы и методы В работе использовали сахарозу, пируват, тиамин, окситиамин (1­[(4­амино­2­метил­ 5­пиримидил)метил]­4­(2­гидроксиэтил)­5­ метилпиримидиниум­1­хлорид), ампролиум (1­[(4­амино­2­пропил­5­пиримидил)метил]­ 2­метилпиримидин), пиритиамин (1­([4­ами­ но­2­метил]­5­пиримидилметил)­2­метил­ 3­(β­гидроксиэтил)пиридиниум бромид), алкогольдегидрогеназу, (Sigma, США), трис­ гидроксиметиламинометан, тиаминдифосфат, NАDН (Fluka, Швейцария). Тиаминтрифос­ фат гидрохлорид был синтезирован и любезно предоставлен нам проф. В.Н. Сильниковым (Институт химической биологии и фундамен­ тальной медицины РАН, Новосибирск), за что мы выражаем ему глубокую благодарность. Остальные реактивы были отечественного производства квалификации чда и хч. В экспериментах использованы крысы­ самцы с массой тела 180–200 г. Синаптосомы и плазматические мембра­ ны синаптосом получали из мозга крыс мето­ дом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы как описано ранее [15]. До использования препараты ПМС сохранялись в жидком азоте. Связывание [14С]тиамина с препаратами ПМС исследовали с помощью радиолигандно­ го метода описанного ранее [15]. Определение тиаминсвязывающей активности проводили с использованием меченого по углероду [тиазол­ 214C]тиамина в 0,05 М Рингер­бикарбонатном буфере, рН 7,4 (в мМ): NaCl – 125, КСl – 4,5, СаCl2 – 2,5, КН2PО4 – 1,3, MgSO4 ⋅ 7H2О – 1,3, NaHCО3 – 17,6, глюкоза – 11). Объем инкуба­ ционной среды составлял 0,5 мл, концентра­ ция [14С]тиамина в пробе – 0,8–1,2 мкМ, пре­ параты плазматических мембран добавлялись из расчета 0,5 мг общего протеина в 1 мл. В опытах по изучению влияния холодного тиа­ мина, тиаминдифосфата и тиаминтрифосфата на связывание меченого тиамина препаратами синаптосом и ПМС конечная концентрация указанных соединений составляла 10 мкМ. Инкубацию проводили при 37 °С в течение 5 мин. Реакцию останавливали охлаждением на ледяной бане (0 °С). Несвязанный лиганд отделяли фильтрацией на мембранных филь­ трах Whatman GF/C с диаметром пор 0,45 мкм после введения в инкубационную среду 0,1%­го раствора γ­глобулина G и 25%­го полиэтилен­ гликоля (Мr = 6000) для осаждения протеинов. На фильтрах препарат дважды промывали 5 мл охлажденной до 0 °С инкубационной смесью без тиамина. Вся процедура промывания и фильтрации занимала не более 30 с. Фильтры с препаратами высушивали в потоке воздуха и переносили во флаконы со сцинтилляционной жидкостью (СЖ­1). Радиоактивность измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике SL­20 (Intertechnique, Франция). Специфичес­ кое связывание определяли по разнице меж­ ду общим связыванием (инкубация только с Ю. М. ПархоМенко, а. а. Строкина, С. Ю. ПилиПчУк и др. ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 136 меченым тиамином) и неспецифическим (в присутствии 100­кpатного избытка немечено­ го тиамина). Удельную активность выражали в пмолях тиамина, связавшегося с 1 мг про­ теина. ThTP­азную активность ПМС определя­ ли по накоплению ThDP, который образуется в результате реакции гидролиза ThTP. Энзи­ матическое определение ThDP основывается на рекомбинации его как коэнзима с апопи­ руватдекарбоксилазой (апоПДК) и проведении реакции с избытком пирувата в присутствии алкогольдегидрогеназы (АДГ) [16]. Реакция оценивалась по окислению NADH. Для оп­ ределения ThDP получали апоПДК из пив­ ных дрожжей (Saccharomyces carlsbergensis) в виде сульфатной пасты, которую хранили при ­20 °С. Непосредственно перед работой из пас­ ты получали апоэнзим [16]. ThTP­азную активность определяли при 37 °С в стандартной среде инкубации (объем 0,25 мл), которая содержала: 50 мМ трис­HCl буфер, pН 7,4, 5 мМ МgCl2, 80 мкМ ThTP. Время инкубации – 20 мин. Энзиматичес­ кую реакцию инициировали введением в сре­ ду инкубации 50 мкл суспензии ПМС (50 мкг протеина) и останавливали добавлением 1 мл 0,05 М Na­фосфатного буфера, рН 6,8. Для ко­ личественного определения образовавшегося ThDP 0,1 мл аликвоты инкубировали в течение 30 мин при 25 °С с апоПДК [16]. Активность определяли в сопряженной с АДГ реакции по снижению экстинкции NADH при 340 нм. Количество образовавшегося ThDP рассчиты­ вали по калибровочной кривой, которую стро­ или, используя определенные концентрации хроматографически чистого ThDP. Содержание протеина в мембранном пре­ парате определяли по методу Лоури. Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t­критерия Стьюдента. Кинетический анализ и статисти­ ческую обработку данных проводили с помо­ щью программы Excel. результаты и обсуждение Согласно предыдущим исследованиям [7–9], изолированный нами ранее из мемб­ ранных препаратов ТСП, является бифунк­ циональным и состоит из двух субъединиц. Присущи ли оба вида биологической актив­ ности ТСП (способность связывать тиамин и способность гидролизовать тиаминфосфаты) одному и тому же активному центру (субъ­ единице) или они являются функцией разных активных центров или субъединиц не установ­ лено. Этот вопрос возник в связи с результа­ тами предыдущих исследований, проведенных на изолированном ТСП. Было показано, что тиаминмонофосфат (ThMP) и тиаминтрифос­ фат (ThTP), но не ThDP, способны частично конкурировать с тиамином за тиаминсвязы­ вающие участки на ТСП. Так, ThMP снижа­ ет связывание меченого тиамина в среднем на 50, а ThTP – на 25% при концентрации этих соединений в среде инкубации в десять раз превышающей концентрацию тиамина [7]. В то же время тиаминфосфатгидролазная актив­ ность ТСП не является строго специфичной к ThTP, что отличает данный протеин от рас­ творимой тиаминтрифосфатазы, проявляющей строгую специфичность только к ThTP [13, 17]. Показано, что ТСП избирателен к фосфорным эфирам тиамина, его активность в отношении гидролиза трех природных тиаминфосфатов составляет ряд: ThTP> ThDP > ThMP. Чтобы найти ответ на поставленный выше вопрос в данной работе проведено исследова­ ние влияния некоторых производных тиамина на активность ПМС. Слабое ингибирование ThTP тиаминсвя­ зывающей активности ТСП в составе плазма­ тических мембран синаптосом было показано ранее [7]. Мы исследовали кинетику этого ингибирования, используя концентрацию ти­ аминтрифосфата, начиная с физиологической и выше (диапазон 0,1–8 мкМ), и две концент­ рации меченого тиамина – 0,8 и 1,2 мкМ. Ре­ зультаты приведены на рис. 1. Полученные данные свидетельствуют о том, что ингибирование ТСА плазматических мембран ThTP является конкурентным. Сред­ нее значение кажущейся кi, рассчитанное по данным трех экспериментов, определено рав­ ным 1,0 ± 0,3 мкМ, что не сильно превыша­ ет величину возможной концентрации ThTP в нервных клетках, если учитывать, что общая концентрация всех производных тиамина в этих клетках находится в пределах 10–12 мкМ. Однако этот результат еще не является дока­ зательством того, что тиаминсвязывающие участки на мембране (или ТСП) отвечают и за гидролиз тиаминфосфатов. Скорее всего, они свидетельствуют о сродстве этих участков к тиамину и его фосфатам. При сравнитель­ ном изучении способности холодного тиамина и тиаминфосфатов конкурировать с меченым тиамином за связывание с изолированными синаптосомами и ПМС оказалось, что ThTP и, в некоторой степени, ThDP, проявляют кон­ курентную способность только на препаратах мембран и не конкурируют с тиамином за свя­ зывание с целыми синаптосомами (табл. 1). екСПериМентальні роботи ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 37 рис. 1. Связывание [14С]тиамина с плазматическими мембранами синаптосом в присутствии в ин- кубационной среде ThTP (а); и выраженное в координатах Диксона (б); 1 – концентрация тиамина 0,8 мкМ, 2 – концентрация тиамина 1,2 мкМ. Bp – количество меченого тиамина, связавшегося с 1 мг протеина (данные типичного эксперимента) Более четкий ответ был получен при ис­ следовании влияния связывания тиамина с мембранами на ThTP­азную активность ТСП. В этом исследовании диапазон концентрации тиамина варьирует от 0,5 до 20 мкМ. Приве­ денные на рис. 2 результаты свидетельствуют, что на изолированных мембранах тиамин не ингибирует ThTP­азную активность. Напро­ тив, наблюдается достоверное повышение этой активности, пик которой приходится на кон­ центрацию тиамина порядка 2,5 мкМ. Эти данные дают основания предположить, что, во­первых, на ТСП за его активность отвечают различные участки, во­вторых, что эти участ­ ки конформационно могут взаимодействовать. Для того, чтобы окончательно убедиться в том, что два типа активности ТСП не являются результатом функционирования одного и того же центра на протеине, далее мы провели ис­ следование влияния производных тиамина – его антагонистов: ампролиума, окситиамина и пиритиамина на обе активности. Поскольку в настоящее время доказано, что ТСП локализо­ ван в плазматических мембранах [9, 11], где он проявляет обе свои активности, в данной се­ рии исследования проведены на изолирован­ ных препаратах плазматических мембран. Данные литературы свидетельствуют о том, что диапазон концентраций различных антагонистов тиамина, при которых наблюда­ За 100% принято связывание [14C]тиамина при отсутствии производных тиамина (M ± m, n = 5). Концент­ рация меченого тиамина в среде колеблется в пределах 1 мкМ, конечная концентрация холодного тиамина и его фосфатов – 10 мкМ. * р < 0,05 в сравнении с контролем, # р < 0,05 в сравнении с экспериментами на синаптосомах. т а б л и ц а 1. влияние тиамина и его фосфатов на связывание [14C]тиамина с препаратами синапто- сом и плазматических мембран синаптосом Соединение, добавленное в инкубационную среду Связывание, % Синаптосомы Плазматические мембраны синаптосом Контроль 100,0 ± 12,0 100,0 ± 9,8 Тиамин (холодный) 37,1 ± 14,3* 11,4 ± 2,1*,# Тиаминдифосфат 94,3 ± 9,0 74,3 ± 15,0 Тиаминтрифосфат 122,2 ± 15,6 22,9 ± 3,7*,# Ю. М. ПархоМенко, а. а. Строкина, С. Ю. ПилиПчУк и др. 17 0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 [ThTP], 1 2 1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 -4 -2 0 2 4 6 8 10 [ThTP], 1/ B p 1 2 . 1. А Б 2 1 А 17 0 2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 6 8 10 [ThTP], 1 2 1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 -4 -2 0 2 4 6 8 10 [ThTP], 1/ B p 1 2 . 1. А ББ 1 2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 138 ется их действие на определенные реакции об­ мена тиамина, очень отличается [18]. Поэтому были проведены исследования по оценке эф­ фективных концентраций выбранных соедине­ ний для тиамисвязывающей и тиаминтрифос­ фатазной активности ПМС, которые в случае ингибирования оценивались по величине IC50 (концентрация антагониста, которая приводит к 50%­му ингибированию от максимально воз­ можного для этого антагониста) [18, 19]. На рис. 3 приведены данные, полученные в экспериментах с ампролиумом. Ампролиум описан в литературе как спе­ цифический ингибитор транспорта тиамина в клетку [20]. Действительно, полученные дан­ ные подтверждают ингибирование ампроли­ умом связывания тиамина с ПМС, в то же время в наших исследованиях он не оказывал достоверного эффекта на тиаминтрифосфатаз­ ную активность ПМС. Данные по влиянию окситиамина на ис­ следуемую активность приведены на рис. 4. Согласно данным литературы, окситиамин, в отличие от ампролиума, способен проникать в клетки и взаимодействовать с протеинами, принимающими участие в обмене тиамина, хотя его сродство к этим протеинам значитель­ но ниже, чем для тиамина [21]. В наших ис­ следованиях окситиамин ингибирует оба вида анализируемой активности, однако определяе­ мая величина IC50 для ThTP­азной активности намного выше, чем для тиаминсвязывающей. Пиритиамин считается одним из наибо­ лее сильных антагонистов тиамина [20] по токсичному эффекту на нервную систему in vivo. В наших исследованиях он, так же как и окситиамин, ингибирует активность ПМС, однако диапазон эффективных концентраций для ThTP­азной активности, как можно видеть из рис. 5, более чем на порядок выше, чем для тиаминсвязывающей. рис. 2. влияние тиамина на тиаминтрифосфа- тазную активность плазматических мембран синаптосом. За 100% принята тhтр-азная ак- тивность при отсутствии в инкубационной сре- де тиамина (M ± m, n = 6) 18 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 5 10 15 20 25 [ ], T hT P- , % . 2. [тиамин], мкм рис. 3. концентрационная зависимость влияния ампролиума на тиаминсвязывающую и ThTP-азную ак- тивность изолированных плазматических мембран синаптосом: а – тиаминсвязывающая активность (пмоль тиамина, связавшегося с 1 мг протеина), концентрация тиамина в среде инкубации – 1,4 мкМ; б – ThTP-азная активность (нмоль ThDP, образовавшегося за 1 мин в 1 мг протеина), концентрация ThTP в среде инкубации – 80 мкМ 19 , M 50 100 150 200 1 0 2 4 6 8 , 0 500 1000 1500 2000 T hD P/ • 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 . 3. А Б 19 , M 50 100 150 200 1 0 2 4 6 8 , 0 500 1000 1500 2000 T hD P/ • 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 . 3. А Б ампролиум, мкм 50 100 150 200 0 2 4 6 8 пм ол ь ти ам ин а на 1 м г пр от еи на А 0 500 1000 1500 2000 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 нм ол ь T hD P /м ин н а 1 м г пр от еи на 0,0 Б ампролиум, мкм екСПериМентальні роботи ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 39 20 , M 0 200 400 600 800 1000 1200 1 0 1 2 3 4 5 6 , M 2 4 6 8 10 T hD P/ • 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 . 4. А Б 20 , M 0 200 400 600 800 1000 1200 1 0 1 2 3 4 5 6 , M 2 4 6 8 10 T hD P/ • 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 . 4. А Б окситиамин, мкм 0 200 400 600 800 1000 1200 2 4 6 5 пм ол ь ти ам ин а на 1 м г пр от еи на А 2 4 6 8 10 0,10 0,25 0,30 0,35 0,40 нм ол ь T hD P /м ин н а 1 м г пр от еи на 0,00 Б 1 3 0 0,05 0,20 0,15 окситиамин, мм рис. 4. концентрационная зависимость влияния окситиамина на тиаминсвязывающую и ThTP-азную активность изолированных плазматических мембран синаптосом: а – тиаминсвязывающая актив- ность (пмоль тиамина, связавшегося с 1 мг протеина), концентрация тиамина в среде инкубации – 1,4 мкМ; б – ThTP-азная активность (нмоль ThDP, образовавшегося за 1 мин в 1 мг протеина), концентрация ThTP в среде инкубации 80 мкМ Результаты, полученные в данном иссле­ довании, свидетельствуют о различной чув­ ствительности двух типов активности ТСП к антагонистам тиамина и подтверждают сде­ ланное выше предположение о том, что за спе­ цифическое связывание тиамина и гидролиз тиаминфосфатов отвечают различные актив­ ные центры этого протеина. Для более точной оценки способности производных тиамина ингибировать активность ТСП по приведен­ ным на рис. 1–3 результатам были определены величины IC50 после трансформации данных в полулогарифмические координаты: {V (пмоль тиамина/мг протеина или нмоль ThDP/мин на 1 мг протеина); lg[i]}. Полученные результаты приведены в табл. 2. Анализируя данные относительно влияния производных тиамина на тиаминсвязывающую и тиаминфосфатгидролазную активность ТСП в составе ПМС, можно сделать вывод: актив­ рис. 5. концентрационная зависимость влияния пиритиамина на тиаминсвязывающую и ThTP-аз- ную активность изолированных плазматических мембран синаптосом: а – тиаминсвязывающая ак- тивность (пмоль тиамина, связавшегося с 1 мг протеина), концентрация тиамина в среде инкуба- ции – 1,4 мкМ; б – ThTP-азная активность (нмоль ThDP, образовавшегося за 1 мин в 1 мг протеина), концентрация ThTP в среде инкубации 80 мкМ 21 , M 0 1 2 3 4 5 6 1 0 1 2 3 4 5 6 , M 50 100 150 200 T hD P/ • 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 . 5. ThTP- : – ( , 1 ), – 1,4 ; – ThTP- ( ThDP, 1 1 ), ThTP 80 . А Б 21 , M 0 1 2 3 4 5 6 1 0 1 2 3 4 5 6 , M 50 100 150 200 T hD P/ • 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 . 5. ThTP- : – ( , 1 ), – 1,4 ; – ThTP- ( ThDP, 1 1 ), ThTP 80 . А Б пиритиамин, мкм 50 100 150 200 2 4 6 5 пм ол ь ти ам ин а на 1 м г пр от еи на А 0 1 2 3 4 5 6 0,1 0,3 0,4 нм ол ь T hD P /м ин н а 1 м г пр от еи на 0,0 Б 1 3 0 0,2 пиритиамин, мкм Ю. М. ПархоМенко, а. а. Строкина, С. Ю. ПилиПчУк и др. ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 140 т а б л и ц а 2. IC50 для ингибирования антагонистами тиамина тиаминсвязывающей и ThTP-азной активности плазматических мембран синаптосом Производное тиамина Значение IC50, мкM ТСА ThTP­азная активность Ампролиум 50,0 ± 4,0 – Окситиамин 125,0 ± 28,0 1000,0 ± 95,0 Пиритиамин 2,2 ± 0,2 43,0 ± 9,0 ные центры, отвечающие за оба вида актив­ ности, локализованы на разных участках ТСП, возможно на разных его субъединицах (из вы­ явленных двух) [14]. Можно предположить, что тиаминсвязывающая активность ТСП обеспе­ чивает способность плазматических мембран нервных клеток связывать тиамин и транспор­ тировать его в клетку, тиаминфосфатгидролаз­ ная активность – способность плазматических мембран гидролизовать тиаминфосфаты, что приводит к выходу из клетки свободного тиа­ мина при деполяризации. Принимая во внимание, что антагонисты тиамина используются в настоящее время при изучении роли тиамина в сигнальных процес­ сах клеток, полученные результаты позволяют также определить эффективные концентрации производных тиамина в реакциях обмена под­ вижного пула тиамина в нервных клетках. наявність двох відмінних активних центрів на тіамінзв’язувальному протеїні плазматичних мембран синаптосом Ю. М. Пархоменко, а. о. Строкіна, С. Ю. Пилипчук, С. П. Степаненко, л. і. чехівська, Г. в. Донченко Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ; e­mail: yupark@biochem.kiev.ua Досліджено вплив тіамінтрифосфату на тіамінзв’язуючу активність у препаратах плаз­ матичних мембран синаптосом (ПМС), ізольо­ ваних з головного мозку щурів. Показано інгібу­ вання тіамінтрифосфатом тіамінзв’язувальної активності ПМС, яке має конкурентний ха­ рактер (кi =1,0 ± 0,3 мкМ). У той самий час тіамін у діапазоні концентрацій 0,5–20 мкМ не інгібує тіамінтрифосфатазну (ThTP­азну) активність, а навпаки, спостерігається її ак­ тивація з максимумом концентрації близько 2,5 мкМ. Досліджено вплив класичних антагоністів тіаміну (ампроліуму, окситіаміну та піритіа­ міну) на біологічну активність плазматичних мембран, яка властива тіамінзв’язувальному протеїну (ТЗП). Величина IC50 для інгібуван­ ня ампроліумом тіамінзв’язувальної актив­ ності ПМС складає 50 ± 4,0 мкМ, в той час як на ThTP­азну активність цей антагоніст не має впливу. Показано інгібування окситіа­ міном обох видів активності ТЗП. Величина IC50 складає 125 ± 28 та 1000 ± 95 мкМ для тіамінзв’язувальної та ThTP­азної активності відповідно. Визначені величини IC50 для ін­ гібування тіамінзв’язувальної та ThTP­азної активності піритіаміном відрізнялись на по­ рядок, складаючи, відповідно, 2,2 ± 0,2 та 43 ± 9 мкМ. Одержані дані свідчать про різну чутливість до антагоністів тіаміну активних центрів на ПМС, які відповідають за тіамінзв’язувальну та ThTP­азну активність. Наші результати дозволяють зробити припущення, що за спе­ цифічне зв’язування відповідають окремі ак­ тивні центри. К л ю ч о в і с л о в а: тіамін, тіамінтрифос­ фат, тіамінтрифосфатаза, плазматичні мембра­ ни синаптосом, тіамінзв’язувальний протеїн, антагоністи тіаміну. exisTence of Two DifferenT acTive siTes on Thiamine binDing ProTein in synaPTic Plasma membranes Yu. M. Parkhomenko, A. а. Strokina, S. Yu. Pylypchuk, S. P. Stepanenko, L. I. Chekhivska, G. V. Donchenko Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv; e­mail: yupark@biochem.kiev.ua S u m m a r y The current work is aimed at understanding the structure and functionality of thiamine binding екСПериМентальні роботи ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2010, т. 82, № 1 41 protein (TBP) in neural cells plasma membranes. The influence of thiamine triphosphate on thia­ mine binding by TBP in synaptic plasma mem­ branes (SPM) isolated from the rat brain was investigated. It was shown that thiamine triphos­ phate inhibits thiamine binding activity of SPM in concurrent manner (кi = 1.0 ± 0.3 µМ). At the same time thiamine had no effect on thiamine tri­ phosphatase (ThTPase) activity at the concentra­ tion range 0.5–20 µМ. Otherwise, ThTPase activa­ tion with the maximum at the concentration about 2.5 µМ was observed. Further, the influence of classic thiamine antagonists (amprolium, oxythiamine and py­ rithiamine) on both biological activities of TBP in SPM was studied. The IC50 value for inhibition of thiamine binding on SPM by amprolium com­ prised 50 ± 4.0 µМ. Still, this antagonist had no effect on ThTPase activity. For the oxythiamine inhibition of both TBP activities was detected. The values of IC50 were 125 ± 28 and 1000 ± 95 µМ for thiamine binding and ThTPase activity, respec­ tively. The values of IC50 for thiamine binding and ThTPase activity inhibition differed by more than one order of magnitude and comprised 2.2 ± 0.2 and 43 ± 9 µМ, respectively. The obtained data indicate that the active sites on SPM responsible for thiamine binding and ThTPase activity have different sensitivity to thia­ mine antagonists. Our results allow us to suppose that different active protein sites are responsible for the specific binding and for thiamine phosphates hydrolysis by TBP of synaptic membranes. K e y w o r d s: thiamine, thiamine triphos­ phate, thiamine triphosphatase, synaptic plasma membranes, thiamine­binding protein, thiamine antagonists. 1. Пархоменко Ю. М., Протасова З. С., Дончен- ко Г. в. // Укр. биохим. журн. – 1996. – 68, № 2. – С. 3–15. 2. Haas R. H. //Ann. Rev. Nutr. – 1988. – 8. – P. 483–515. 3. Bâ A. // Cell. Mol. Neurobiol. – 2008. – 28. – P. 923–931. 4. Leevy C. M. // Ann. NY Acad. Sci. – 1982. – 378. – P. 316–326. 5. Stagg A. R., Fleming J. C., Baker M. A. et al. // J. Clin. Invest. – 1975. – 103, N 12. – P. 723– 729. 6. Chornyyi S., Parkhomenko J., Chorna N. // Acta Biochim. Polonica. – 2007. – 54, N 2. – P. 315–322. 7. Постоенко в. о., Пархоменко Ю. М., вовк а. и. и др. // Биохимия. – 1987. – 52, № 11. – С. 1792–1797. 8. Постоенко в. а., Пархоменко Ю. М., Дончен- ко Г. в. // Нейрохимия. – 1990. – 9, № 1. – С. 29–34. 9. Пархоменко Ю. М., Протасова З. С., янчий о. р. и др. // Нейрофизиология. – 2001. – 33, № 3. – С. 161–165. 10. Muralt A. // Exp. Cell. Res. – 1958. – 5, N 1. – P. 72–79. 11. Сидорова а. а., Степаненко С. П., Пархомен- ко Ю. М. // Укр. біохім. журн. – 2009. – 81, № 3. – С. 58–65. 12. Subramanian V. S., Marchant J. S., Parker I., Said H. M. // J. Biol. Chem. – 2003. – 278, N 6 – P. 3976–3984. 13. Szyniarowski P., Lakaye B., Czerniecki J. et al. // Biochim. Biophys. Acta. – 2005. – 1725, N 1. – P. 93–102. 14. янчій о. р., Пархоменко Ю. М., Донченко Г. в. // Укр. біохім. журн. – 2001. – 73, № 3. – С. 107–111. 15. Протасова З. С., Пархоменко Ю. М., Дончен- ко Г. в., чурилова т. я. // Там само. – 1999. – 71, № 4. – С. 50–57. 16. Экспериментальная витаминология / под ред. Ю. М. Островского. – Минск: Наука и техника, 1979. – 552 с. 17. Пархоменко Ю. М., Протасова З. С., Постоен- ко в. а., Донченко Г. в. // ДАН АН Украи­ ны. – 1988. – № 8. – С. 73–76. 18. Casirola D., Ferrari G., Gestaldi G. et al. // J. Physiology. – 1988. – 398. – P. 329–339. 19. келети т. Основы ферментативной кине­ тики. – М: Мир, 1990. – 350 с. 20. Rindi G., Patrini C., Nauti A. et al. // Metab. Brain Dis. – 2003. – 18, N 1. – P. 245–263. 21. островский Ю. М. Тиамин. – Минск: Беларусь, 1971. – 144 с. Получено 16.11.2009 Ю. М. ПархоМенко, а. а. Строкина, С. Ю. ПилиПчУк и др.

Схожі ресурси