Створення та впровадження в медичну практику тест-систем для генної діагностики тяжких спадкових захворювань

Розроблені тест-системи та створені їх лабораторні зразки, основані на застосуванні ДНК-аналізу для діагностики найбільш поширених в Україні моногенних спадкових захворювань таких як, муковісцидоз, спадковий гемохроматоз, синдром Мартіна-Бела (ламкої Х-хромосоми) та генетично обумовлених форм чолові...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2005
Автори:	Лівшиць, Л.А., Пампуха, В.М., Ясінська, О.А., Лівшиць, Г.Б., Грищенко, Н.В., Кравченко, С.А., Нечипоренко, М.В., Єльська, Г.В.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України 2005
Теми:	Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/2671
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Створення та впровадження в медичну практику тест-систем для генної діагностики тяжких спадкових захворювань / Л.А. Лівшиць, В.М. Пампуха, О.А. Ясінська, Г.Б. Лівшиць, Н.В. Грищенко, С.А. Кравченко, М.В. Нечипоренко, Г.В. Єльська // Наука та інновації. — 2005. — Т. 1, № 3. — С. 62-69. — Бібліогр.: 9 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-2671
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-26712017-02-12T22:36:03Z Створення та впровадження в медичну практику тест-систем для генної діагностики тяжких спадкових захворювань Лівшиць, Л.А. Пампуха, В.М. Ясінська, О.А. Лівшиць, Г.Б. Грищенко, Н.В. Кравченко, С.А. Нечипоренко, М.В. Єльська, Г.В. Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України Розроблені тест-системи та створені їх лабораторні зразки, основані на застосуванні ДНК-аналізу для діагностики найбільш поширених в Україні моногенних спадкових захворювань таких як, муковісцидоз, спадковий гемохроматоз, синдром Мартіна-Бела (ламкої Х-хромосоми) та генетично обумовлених форм чоловічого безпліддя. Розроблені тест-системи можуть застосовуватись в спеціалізованих медико-генетичних, педіатричних закладах, центрах з планування родини та клініках, які застосовують допоміжні репродуктивні технології. Ключові слова: мутації, муковісцидоз, спадковий гемохроматоз, синдром ламкої Х-хромосоми, фактор азооспермії, ДНК-діагностика, ПЛР. Разработаны тест-системы и созданы их лабораторные образцы, основанные на применении ДНК-анализа для диагностики наиболее распространенных в Украине моногенных наследственных заболеваний таких как, муковисцидоз, наследственный гемохроматоз, синдром Мартина-Белла (ломкой Х-хромосомы) и генетически обусловленных форм мужского бесплодия. Разработанные тест-системы могут применяться в специализированных медико-генетических, педиатрических заведениях, центрах по планированию семьи и клиниках, которые применяют вспомогательные репродуктивные технологии. Ключевые слова: мутации, муковисцидоз, наследственный гемохроматоз, синдром ломкой Х-хромосомы, фактор азооспермии, ДНК-диагностика, ПЦР. Test-systems and their exhibition working samples based on the DNA-analysis for diagnosis most spread in Ukraine monogenic hereditary disorders such as: cystic fibrosis, hereditary chromatosis, Martin-Bell syndrome (fragile X), genetic forms of male infertility were elaborated. The elaborated test-systems would be used in special medical centers for medical genetics, pediatric and in IVF clinics, which apply assessment reproductive technologies. Keywords: mutations, cystic fibrosis, hereditary chromatosis, Martin-Bell syndrome (fragile X), azoospermia factor, DNA-diagnosis, PCR. 2005 Article Створення та впровадження в медичну практику тест-систем для генної діагностики тяжких спадкових захворювань / Л.А. Лівшиць, В.М. Пампуха, О.А. Ясінська, Г.Б. Лівшиць, Н.В. Грищенко, С.А. Кравченко, М.В. Нечипоренко, Г.В. Єльська // Наука та інновації. — 2005. — Т. 1, № 3. — С. 62-69. — Бібліогр.: 9 назв. — укр. 1815-2066 DOI: doi.org/10.15407/scin1.03.062 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/2671 uk Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України
spellingShingle	Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України Лівшиць, Л.А. Пампуха, В.М. Ясінська, О.А. Лівшиць, Г.Б. Грищенко, Н.В. Кравченко, С.А. Нечипоренко, М.В. Єльська, Г.В. Створення та впровадження в медичну практику тест-систем для генної діагностики тяжких спадкових захворювань
description	Розроблені тест-системи та створені їх лабораторні зразки, основані на застосуванні ДНК-аналізу для діагностики найбільш поширених в Україні моногенних спадкових захворювань таких як, муковісцидоз, спадковий гемохроматоз, синдром Мартіна-Бела (ламкої Х-хромосоми) та генетично обумовлених форм чоловічого безпліддя. Розроблені тест-системи можуть застосовуватись в спеціалізованих медико-генетичних, педіатричних закладах, центрах з планування родини та клініках, які застосовують допоміжні репродуктивні технології. Ключові слова: мутації, муковісцидоз, спадковий гемохроматоз, синдром ламкої Х-хромосоми, фактор азооспермії, ДНК-діагностика, ПЛР.
format	Article
author	Лівшиць, Л.А. Пампуха, В.М. Ясінська, О.А. Лівшиць, Г.Б. Грищенко, Н.В. Кравченко, С.А. Нечипоренко, М.В. Єльська, Г.В.
author_facet	Лівшиць, Л.А. Пампуха, В.М. Ясінська, О.А. Лівшиць, Г.Б. Грищенко, Н.В. Кравченко, С.А. Нечипоренко, М.В. Єльська, Г.В.
author_sort	Лівшиць, Л.А.
title	Створення та впровадження в медичну практику тест-систем для генної діагностики тяжких спадкових захворювань
title_short	Створення та впровадження в медичну практику тест-систем для генної діагностики тяжких спадкових захворювань
title_full	Створення та впровадження в медичну практику тест-систем для генної діагностики тяжких спадкових захворювань
title_fullStr	Створення та впровадження в медичну практику тест-систем для генної діагностики тяжких спадкових захворювань
title_full_unstemmed	Створення та впровадження в медичну практику тест-систем для генної діагностики тяжких спадкових захворювань
title_sort	створення та впровадження в медичну практику тест-систем для генної діагностики тяжких спадкових захворювань
publisher	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
publishDate	2005
topic_facet	Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/2671
citation_txt	Створення та впровадження в медичну практику тест-систем для генної діагностики тяжких спадкових захворювань / Л.А. Лівшиць, В.М. Пампуха, О.А. Ясінська, Г.Б. Лівшиць, Н.В. Грищенко, С.А. Кравченко, М.В. Нечипоренко, Г.В. Єльська // Наука та інновації. — 2005. — Т. 1, № 3. — С. 62-69. — Бібліогр.: 9 назв. — укр.
work_keys_str_mv	AT lívšicʹla stvorennâtavprovadžennâvmedičnupraktikutestsistemdlâgennoídíagnostikitâžkihspadkovihzahvorûvanʹ AT pampuhavm stvorennâtavprovadžennâvmedičnupraktikutestsistemdlâgennoídíagnostikitâžkihspadkovihzahvorûvanʹ AT âsínsʹkaoa stvorennâtavprovadžennâvmedičnupraktikutestsistemdlâgennoídíagnostikitâžkihspadkovihzahvorûvanʹ AT lívšicʹgb stvorennâtavprovadžennâvmedičnupraktikutestsistemdlâgennoídíagnostikitâžkihspadkovihzahvorûvanʹ AT griŝenkonv stvorennâtavprovadžennâvmedičnupraktikutestsistemdlâgennoídíagnostikitâžkihspadkovihzahvorûvanʹ AT kravčenkosa stvorennâtavprovadžennâvmedičnupraktikutestsistemdlâgennoídíagnostikitâžkihspadkovihzahvorûvanʹ AT nečiporenkomv stvorennâtavprovadžennâvmedičnupraktikutestsistemdlâgennoídíagnostikitâžkihspadkovihzahvorûvanʹ AT êlʹsʹkagv stvorennâtavprovadžennâvmedičnupraktikutestsistemdlâgennoídíagnostikitâžkihspadkovihzahvorûvanʹ
first_indexed	2025-07-02T05:51:37Z
last_indexed	2025-07-02T05:51:37Z
_version_	1836513228435226624
fulltext	62 Інноваційні проекти Національної академії наук України © НАУКА ТА ІННОВАЦІЇ. 2005 Наука та інновації.2005.Т 1.№ 3.С. 62–69. СТВОРЕННЯ ТА ВПРОВАДЖЕННЯ В МЕДИЧНУ ПРАКТИКУ ТЕСТ�СИСТЕМ ДЛЯ ГЕННОЇ ДІАГНОСТИКИ ТЯЖКИХ СПАДКОВИХ ЗАХВОРЮВАНЬ Л. А. Лівшиць, В. М. Пампуха, О. А. Ясінська, Г. Б. Лівшиць, Н. В. Грищенко, С. А. Кравченко, М. В. Нечипоренко, Г. В. Єльська Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ Надійшла до редакції 08.04.05 Резюме: Розроблені тест�системи та створені їх лабораторні зразки, основані на застосуванні ДНК� аналізу для діагностики найбільш поширених в Україні моногенних спадкових захворювань таких як, муковісцидоз, спадковий гемохроматоз, синдром Мартіна�Бела (ламкої Х�хромосоми) та генетично обумовлених форм чоловічого безпліддя. Розроблені тест�системи можуть застосовуватись в спеціалізованих медико�генетичних, педіатричних закладах, центрах з планування родини та кліні� ках, які застосовують допоміжні репродуктивні технології. Ключові слова: мутації, муковісцидоз, спадковий гемохроматоз, синдром ламкої Х�хромосоми, фак� тор азооспермії, ДНК�діагностика, ПЛР. Л. А. Лившиц, В. Н. Пампуха, О. А. Ясинская, А. Б. Лившиц, Н. В. Грищенко, С. А. Кравченко, М. В. Нечипоренко, А. В. Ельская. СОЗДАНИЕ И ВНЕДРЕНИЕ В МЕДИЦИНСКУЮ ПРАКТИКУ ТЕСТ�СИСТЕМ ДЛЯ ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ТЯЖЕЛЫХ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. Резюме: Разработаны тест�системы и созданы их лабораторные образцы, основанные на использова� нии ДНК�анализа для диагностики наиболее распространенных в Украине моногенных наследствен� ных заболеваний таких как, муковисцидоз, наследственный гемохроматоз, синдром Мартина�Белла (ломкой Х�хромосомы) и генетически обусловленных форм мужского бесплодия. Разработанные тест�системы могут применяться в специализированных медико�генетических, педиатрических заве� дениях, центрах по планированию семей и клиниках, которые применяют вспомогательные репро� дуктивные технологии. Ключевые слова: мутации, муковисцидоз, наследственный гемохроматоз, синдром ломкой Х�хромо� сомы, фактор азооспермии, ДНК�диагностика, ПЦР. L. A. Livshits, V. M. Pampukha, O. A. Yasinska, G. B. Livshits, N. V. Hryshchenko, S. A. Kravchenko, M. V. Nechyporenko, G. V. Elska. CREATION AND APPLICATION OF TEST�KITS FOR SEVERE HEREDITARY DISEASES GENE DIAGNOSTICS TO MEDICAL PRACTICE. Abstract: Test�systems and their exhibition working samples based on the DNA�analysis for diagnosis most spread in Ukraine monogenic hereditary disorders such as: cystic fibrosis, hereditary chromatosis, Martin� Bell syndrome (fragile X), genetic forms of male infertility were elaborated. The elaborated test�systems would be used in special medical centers for medical genetics, pediatric and in IVF clinics, which apply assessment reproductive technologies. Keywords: mutations, cystic fibrosis, hereditary chromatosis, Martin�Bell syndrome (fragile X), azoosper� mia factor, DNA�diagnosis, PCR. 63НАУКА ТА ІННОВАЦІЇ. № 3, 2005 Інноваційні проекти Національної академії наук України Результати проведених нами досліджень природи, спектру та розповсюдженості му� тацій, які призводять до розвитку муковісци� дозу, спадкового гемохроматозу, синдрому ламкої Х�хромосоми, факторів азооспермії, проведені серед населення різних регіонів України, дозволили встановити специфіч� ність спектру мажорних мутацій, що локалі� зуються в різних екзонах гена ТРБМ, 2�му та 4�му екзонах гена HFEI, в ділянці FRAXA ге� на FMR1, в ділянці AZFc фактора азооспер� мії [1–4]. Отримані результати стали під� ґрунтям для розробки методів ДНК�діагнос� тики мутантних генів в родинах високого ри� зику та при проведенні селективного і масо� вого скринінгу населення з метою профілак� тики та прецизійного ефективного лікування цих тяжких спадкових захворювань. Метою проекту була розробка діагностичних мето� дик ДНК�аналізу мутацій в різних екзонах гена ТРБМ (муковісцидоза), 2�му та 4�му ек� зонах гена HFEI, в ділянці FRAXA гена FMR1, в ділянці AZFc фактора азооспермії та створення готових до впровадження дію� чих лабораторних зразків ампліфікаційних тест�систем, для використання в спеціалізо� ваних медико�генетичних центрах та дитя� чих лікарнях з метою пре� і постнатальної діагностики, уточнення діагнозу, медико�ге� нетичного консультування родин високого ризику та проведення масового і селективного скринінгу носіїв мажорних мутацій вище оз� начених генів. В ході даної розробки були поставлені та вирішені наступні задачі: 1) Оптимізація методу виділення та очи� щення препаратів геномної ДНК з біоло� гічних тканин людини (лейкоцитів пери� ферійної крові, біоптатів хоріона, пла� центи). Створення колекції зразків ДНК з мутантними і нормальними варіантами. 2) Розробка дизайна (нуклеотидної послі� довності) праймерів для ампліфікації ДНК in vitro в 2�му, 3�му, 4�му, 7�му, 10�му, 11�му, 20�му, 21�му екзонах та в 2�му, 3�му, 4�му і 10�му інтронах гена трансмембранного регуляторного білку муковісцидозу (ТРБМ), 2�му та 4�му ек� зонах гена HFEI, в ділянці FRAXA гена FMR1, локусів: sY240, sY146, sY254, sY255, sY158 (AZFc). Синтез олігонукле� отидів відповідних послідовностей. 3) Розробка і оптимізація складу реакційної суміші та температурно�часових режимів для проведення полімеразної ланцюгової реакції з метою специфічної ампліфікації in vitro наступних послідовностей ДНК: 2�й, 3�й, 4�й, 7�й, 10�й, 11�й, 20�й, 21�й ек� зони та 2�й, 3�й, 4�й і 10�й інтрони (ген ТРБМ), 2�й та 4�й екзони гена HFEI, в ділянці FRAXA гена FMR1, локусів: sY240, sY146, sY254, sY255, sY158 (AZFc). 4) Підбір ендонуклеаз рестрикції із сайтами впізнавання, специфічними для послі� довностей 1717�1G, R553X, G551D, R117H, 621+1G→T, R334, R347, N1303K, G542X, 1154insTC, 1717�1GaA, S5491, 1677delTA (ген ТРБМ) та C282Y, H63D (ген HFEI). 5) Відпрацювання та оптимізація складу ре� акційної суміші для проведення специ� фічної рестрикції. 6) Відпрацювання та оптимізація темпера� турно�часових режимів для проведення специфічної рестрикції. 7) Розробка методів детекції ампліконів з використанням електрофоретичного фрак� ціювання в поліакриламідному та агароз� ному гелях. 8) Розробка робочих діагностичних мето� дик та лабораторних зразків тест�систем. СТВОРЕННЯ КОЛЕКЦІЇ ЗРАЗКІВ ДНК З МУТАНТНИМИ І НОРМАЛЬНИМИ ВАРІАНТАМИ Для виділення препаратів геномної ДНК з біологічних матеріалів людини (лейкоцити, 64 Інноваційні проекти Національної академії наук України НАУКА ТА ІННОВАЦІЇ. № 3, 2005 біоптати хоріону, плаценти, клітини амніо� тичної рідини та букального епітелію) зазви� чай використовують депротеінізацію лізатів клітин з використанням протеінази К та очи� щення препаратів ДНК фенол�хлороформ� ною екстракцією з наступним осадженням етиловим спиртом [5]. Для виділення препа� ратів геномної ДНК із зразків свіжої крові, консервованої стандартним препаратом глю� гициром, нами проводився розділ лейкоци� тарної і еритроцитарної маси за рахунок се� диментації клітин в розчині, що містить 3,5 % желатину і 0,8 % NaCl. Після розшарування такого розчину у вузькому циліндрі відбира� ли верхній шар, що містить завись лейко� цитів, промивали його 0,8 % NaCl рівним об'ємом і осаджували клітини центрифугу� ванням (3000 об/хв, 10 хвилин). Осад клітин ресуспендували в 2�х мл 0,8 % NaCl, додава� ли 2 мл 0,5 М ЕДТА (рН 8,0). Після цього лізували розчином додецилсульфату натрію (кінцева концентрація 1 %). Проводили виді� лення ДНК додаванням розчину перхлорату натрію до кінцевої концентрації 1,2 М. Очи� щення препарату ДНК проводили хлоро� формною екстракцією, осадження препарату ДНК проводили 0,6–0,8 об'ємами ізопропі� лового спирту. Використаний метод дозволяє уникнути використання токсичної речовини – фенолу, що є суттєвим для охорони навколишнього середовища та охорони праці співробітників. Крім того, з процесу вилучено застосування коштовного препарату – протеінази К, який не виробляється в Україні і є критичним імпортом. Було створено банк лейкоцитарної ДНК хворих та членів їх родин, що налічує 50 зраз� ків, з ідентифікованими мутаціями генів: ТРБМ, HFEІ, FMR1 та AZF. Зразки ДНК створеного банку відповідають наступним ге� нотипам: 1. ТРБМ – ∆F508/∆F508; ∆F508/W; ∆F508/CFTRdel21kb; ∆F508/1677delTA; ∆F508/G542X; ∆F508/N1303K; N1303K/N1303K; 1677delTA/W; CFTRdel21kb/W; N1303K/W; W1282X/X; G542X/X; R117H/X. 2. HFE – H63D/W; H63D/H63D; H63D/C282Y; C282Y/W; C282Y/C282Y. 3. FMR1 – зразки містять широкий спектр алельних варіантів з різною кількістю CGG� повторів (від 18 до 57 копій). 4. AZF – del sY153, sY240, sY146, sY254 (DAZ), sY255 (DAZ), sY158; del sY240, sY146, sY254 (DAZ); del sY254 (DAZ), sY255 (DAZ), sY158; del sY117, sY124, sY134. Зразки ДНК зберігаються при темпера� турі –20 °С і можуть бути використані як стандарти для контролю якості результатів діагностики відповідних спадкових захворю� вань. РОЗРОБКА ДИЗАЙНА (НУКЛЕОТИДНОЇ ПОСЛІДОВНОСТІ) ПРАЙМЕРІВ Проведено розробку дизайна (нуклеотидної послідовності) праймерів для ампліфікації ДНК in vitro в 2�му, 3�му, 4�му, 7�му, 10�му, 11�му, 20�му, 21�му екзонах та в 2�му, 3�му, 4�му і 10�му інтронах гена трансмембранного регуляторного білку муковісцидозу (ТРБМ), в 2�му та 4�му екзонах гена HFEI, в ділянці FRAXA гена FMR1, локусів: sY240, sY146, sY254, sY255, sY158 (AZFc). Аналіз послідо� вності праймерів на специфічність проводи� ли з використанням комп'ютерної бази даних BLAST SEARCH за умов сканування геном� ної послідовності ДНК генів ТРБМ [6], HFEI [7], FMR1 [8], AZFc [9]. Основні вимо� ги до дизайну були наступні: висока спе� цифічність з гомологією не менше ніж 90 %; якомога нижчий склад гуанідину в послідо� вності; однакові температури плавлення для 65НАУКА ТА ІННОВАЦІЇ. № 3, 2005 Інноваційні проекти Національної академії наук України кожного з членів пари праймерів. За резуль� татами аналізу були відібрані послідовності, які відповідають всім необхідним вимогам. Послідовності знаходяться в процесі патен� тування. З використанням твердофазного фосфоамедітного метода проведено синтез відповідних олігонуклеотидів, які можуть бу� ти використані в якості праймерів, що вхо� дять до реакційної суміші, в тест�системах з ДНК�діагностики муковісцидоза, спадкового гемохроматоза, синдрома ламкої Х�хромосо� ми та факторів азооспермії. РОЗРОБКА ТА ОПТИМІЗАЦІЯ СКЛАДУ РЕАКЦІЙНОЇ СУМІШІ ТА ТЕМПЕРАТУРНО�ЧАСОВИХ РЕЖИМІВ ДЛЯ ПРОВЕДЕННЯ СПЕЦИФІЧНОЇ ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ Оптимальні умови проведення полімеразної ланцюгової реакції – склад реакційної сумі� ші та температурно�часовий режим дозволя� ють отримати достатню для детекції кіль� кість високо специфічного продукту амплі� фікації ДНК in vitro. З метою створення та� ких умов проведення реакції нами прово� дився аналіз послідовностей ДНК�матриць для ПЛР та відповідних фланкуючих прай� мерів. Критичними параметрами для реак� ційної суміші були: концентрація іонів маг� нію, кількість ферменту – термостабільної Taq�полімерази та концентрація праймерів. Критичними вимогами до температурних режимів була: температура відпалення прай� мерів на ДНК�матриці та температура син� тезу. Вимоги до часових режимів були на� ступними: співвідношення періоду денату� рації до періоду відпалення праймерів та оп� тимальний час фази синтезу, а також загаль� на кількість повних циклів реакції. В резуль� таті дослідження цих параметрів були роз� роблені відповідні температурно�часові ре� жими. ПІДБІР СПЕЦИФІЧНИХ ЕНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦІЇ З САЙТАМИ ПІЗНАВАННЯ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ МУТАЦІЙ ГЕНА ТРБМ ТА ГЕНА HFEI Для детекції мононуклеотидних замін, які мають місце у випадку мутацій (N1303K, R117H, 1717�1G>A (ген ТРБМ) та C282Y, H63D (ген HFEI)) використовували метод аналізу поліморфізму довжини рестрикцій� них фрагментів (ПДРФ). З цією метою необ� хідно було підібрати ендонуклеази рестрик� ції, які б специфічно гідролізували мутантні та нормальні послідовності гена ТРБМ та ге� на HFEI. Для аналізу таких ендонуклеаз рес� трикції нами була використана програма Vector NTI Suite 6. Реакційна суміш для про� ведення рестрикції була оптимізована таким чином, що рестрикцію можна було проводи� ти безпосередньо в буфері ампліфікації, що дозволяло уникнути додаткової стадії виді� лення та очищення ампліфікованих фраг� ментів ДНК. В результаті проведеного ана� лізу були підібрані необхідні ендонуклеази рестрикції та відповідні температурно�часові режими для реакції гідролізу цими ендонук� леазами. ВІДПРАЦЮВАННЯ УМОВ ЕЛЕКТРОФОРЕТИЧНОГО ФРАКЦІЮВАННЯ Електрофоретичне фракціювання дозволяє проводити візуалізацію та визначення спе� цифічних продуктів ПЛР. Умови проведення цього фракціювання в кожному випадку по� винні вирішувати задачу максимального роз� ділення різних за молекулярною масою про� дуктів ПЛР за мінімальний час. З цією метою нами було проведено дослідження агарозних та поліакріламідних гелів різних концентра� цій. Також відпрацьовувались розміри гелів, параметри сили струму та напруги, час про� 66 Інноваційні проекти Національної академії наук України НАУКА ТА ІННОВАЦІЇ. № 3, 2005 ведення фракціювання. За результатами до� слідження були розроблені відповідні режи� ми для детекції кожної з досліджуваних му� тацій. Розроблено супровідну документацію у вигляді протоколів робочої діагностичної ме� тодики для ДНК�аналізу мутацій при муко� вісцидозі, спадковому гемохроматозі, синд� ромі ламкої Х�хромосоми, факторах азоос� пермії. ЗАГАЛЬНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТЕСТ�СИСТЕМ В ході виконання проекту були розроблені тест�системи та створені їх лабораторні зраз� ки, основані на застосуванні ДНК�аналізу для діагностики найбільш поширених в Ук� раїні моногенних спадкових захворювань та� ких як, муковісцидоз, спадковий гемохрома� тоз, синдром Мартіна�Бела (ламкої Х�хромо� соми) та генетично обумовлених форм чо� ловічого безпліддя. Дані тест�системи дозво� ляють не тільки проводити діагностику ціло� го ряду найбільш розповсюджених спадкових патологій, але й стануть основою системи вторинної профілактики найбільш розпов� сюджених тяжких захворювань в родинах ви� сокого ризику завдяки можливості проведен� ня пренатальної діагностики на ранніх тер� мінах вагітності та організації програм доб� ровільного генетичного тестування гетерози� готних носіїв мутантних генів. 1. Розроблена тест�система для ДНК�діа� гностики наступних найбільш розповсюдже� них в Україні мутацій гена ТРБМ: delF508, delF507, CFTR2, 3del21kb, 1717�1G, R553X, G551D, R117H, 621+1G→T, R334W, R347, N1303K, G542X, 1154insTC, 1717�1GaA, S5491, 1677delTA. На рис. 1 наведено при� клад аналізу деяких мутацій. Тест�система може бути використана в клінічній (постна� тальне уточнення діагнозу), в пренатальній (з першого триместру вагітності) діагностиці МВ та для виявлення гетерозиготних носіїв а – в родинах високого ризику, б – в програ� мах добровільного генетичного тестування населення. 2. Розроблена тест�система для ДНК� діагностики найбільш поширених мутацій C282Y і H63D в гені HFE�1. На рис. 2 наведе� но приклад аналізу деяких мутацій. Тест�сис� Рис. 1. Аналіз мутацій гена ТРБМ: а) в 10�му екзоні,12 %�й ПААГ: 1 – гетерозиготний носій делеції 1677delTA; 2 – індивід із генотипом 1677delTA/delF508; 3 – гетерозиготний носій делеції delF508; 4 – індивід із генотипом delF508/delF508; б) протяжної делеції CFTRdele2,3(2,1 kb), 1,8 %�вий агарозний гель: М – маркер молекуляр� ної маси (Ladder 100 bp, Pharmacia); 1 – носій мутації; 2, 3 – здорові індивіди а б 67НАУКА ТА ІННОВАЦІЇ. № 3, 2005 Інноваційні проекти Національної академії наук України тема може бути використана для уточнення клінічного діагнозу у хворих на гемохрома� тоз, ідеопатичні панкреатити, гепатити, ци� роз печінки, цукровий діабет, кардіоміопатії та деякі онкологічні захворювання з метою вибору тактики лікування, а також для вияв� лення мутантного гена в програмах добро� вільного генетичного тестування населення. 3. Розроблена тест�система для ідентифі� кації алелів з кількістю CGG повторів в гені FMR1, що відповідають премутації (~ 50 CGG повторів) та алелів високого ризику, які експансуються до розміру премутації за одне покоління (~ 40 CGG повторів). На рис. 3 на� ведено результати аналізу CGG повторів гена FMR1. Тест�система може бути використана для виявлення гетерозиготних носіїв прему� тації та алелів "високого ризику" у родичів жіночої статі хворих з синдромом Мартіна� Бела та в програмах добровільного генетич� ного тестування жіночого населення. 4. Розроблена тест�система для ідентифі� кації мікроделеції в генах AZFa, AZFb та AZFc (ген DAZ) з використанням ДНК� аналізу в наступних STS локусах: sY84, sY85, USP9Y, sY117, sY124, sY134, sY141, sY153, sY240, sY146, sY254, sY255, sY158 та SRY. На рис. 4 наведено результати аналізу мікроде� Рис. 2. а) Визначення мутації C282Y методом ПЛР/ПДРФ. 2 %�ий агарозний гель. Розчеплення продуктів ПЛР ензимом рестрикції Rsa 1: М – маркер молекулярної маси (Ladder 123 bp); 1 – здоровий ін� дивід; 2 – гомозигота за наявністю мутації; 3–4 – гете� розиготні носії мутації; 5 – негативний контроль ПЛР); б) Визначення мутації H63D методом ПЛР/ПДРФ. 2 %�ий агарозний гель. Розчеплення продуктів ПЛР ензимом рестрикції Bcl 1: М – маркер молекулярної маси (Ladder 123 bp); 1, 2, 3 – індивіди без мутації; 4 – гетерозиготний носій мутації; 5 – нега� тивний контроль ПЛР а б Рис. 3. Тестування жінок на носійство мутації в області CGG�повторів гена FMR1: 1 – індивід з алелями 38 та 45 CGG�повторів (зона ризику), 2 – індивід з алелями 34 та 44 CGG�повторів (зона ризику), 3 – індивід з алелями 24 та 30 CGG�повторів (норма) 68 Інноваційні проекти Національної академії наук України НАУКА ТА ІННОВАЦІЇ. № 3, 2005 лецій з області AZFb і AZFc. Тест�система може бути використана для діагностики етио� логії у чоловіків із необструктивними форма� ми безпліддя. Діагностика цих порушень є важливою для тактики лікування даних форм чоловічого безпліддя з використанням допоміжних репродуктивних технологій, а також необхідна для прогнозу потомства та попередження народження хлопчиків із тяж� кими порушеннями сперматогенезу. Пілотне виробництво тест�систем може бути організовано на базі Інституту молеку� лярної біології і генетики НАНУ. Масове ви� робництво для забезпечення потреб всіх ре� гіонів України може бути розпочато за умови створення Центру з проблем молекулярної генетики та генних технологій на базі ІМБіГ НАНУ. Потенціальними інвесторами можуть стати вітчизняні підприємства, які спеціалі� зуються на випуску біомедичних тест�сис� тем, наприклад, такі як "Стирол Біофарм", "Діапрофмед", БАТ та інші. Перелік установ, в яких для клінічної діа� гностики 1100 паціентів з муковісцидозом, синдромом Мартіна�Бела, генетично обумов� леними формами чоловічого безпліддя, спад� ковим гемохроматозом та пов'язаних з ним вторинними патологіями було застосовано розроблені методи ДНК�аналізу: Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН Ук� раїни, Науковий центр радіаційної медицини АМНУ, Інститут нейрохірургії АНМУ, Ін� ститут медицини праці АМНУ, Інститут оч� них хвороб і тканинної терапії ім. В. П. Філа� това АМНУ, Інститут спадкової патології АМН України (м. Львів), Кримський респу� бліканський центр медичної генетики та ре� продукції людини (м. Симферополь), Укра� їнський центр діагностики та лікування му� ковісцидозу (м. Одеса), Міжобласні медико� генетичні центри: Київський, Донецький, Харківський, Одеський, Криворізький; об� ластні медико�генетичні консультації: Терно� пільська, Рівненська, Полтавська, Хмель� ницька, Вінницька, Волинська, Івано�Фран� ківська, Чернігівська, Закарпатська, Лу� ганська; клініка "Ісіда–IVF" (м. Київ). За ма� теріалами розробки проводиться оформлен� ня патентів на винахід. Рис. 4. Електрофореграма. Визначення мутацій мікроделецій довгого плеча Y�хромосоми (AZFc): 1 – делеція sY158; 2 – відсутність делеції sY158; 3 – делеція sY255 + відсутність делеції sY117 (AZFb); 4 – відсутність де� леції sY255 і делеція sY117 (AZFb); 5 – делеція sY254; 6 – відсутність делеції sY254; 7 – делеція sY240; 8 – відсутність делеції sY240; 9 – делеція sY153; 10 – відсутність делеції sY153; М – маркер (Ladder 100 bp) 69НАУКА ТА ІННОВАЦІЇ. № 3, 2005 Інноваційні проекти Національної академії наук України ЛІТЕРАТУРА 1. Лівшиць Л. А., Малярчук С. Г., Екшиян О. Ю., Кравченко С. А., Нечипоренко М. В., Пампу� ха В. М., Бичкова А. М., Михайлець Л. П., Афанасьєва Н. О., Сопко Н. І., Бариляк І. Р. Ге� нетика і селекція в Україні на межі тисячоліть у чотирьох томах: Молекулярно�генетичні дослі� дження та ДНК�діагностика найбільш поширених в Україні спадкових захворювань моногенної при� роди // Київ, Логос, 2001.–т. 4.–С. 604–622. 2. Лівшиць Л. А., Ясінська О. А. Роль мікроделе� цій хромосомної області Yq11 в розвитку необст� руктивних форм чоловічого безпліддя // Цитоло� гія і генетика.–2002.–т. 36.–№ 5.–С. 73–78. 3. Пампуха В. М., Розуменко В. Д., Черченко А. П., Лівшиць Л. А. Аналіз мутацій C282Y та H63D ге� ну спадкового гемохроматозу HFE серед населен� ня України та хворих з гліальними пухлинами мозку // Биополимеры и клетка.–2003.–т. 19.– № 6.–С. 536–541. 4. Грищенко Н. В., Малярчук С. Г., Экшиян А. Ю., Бычкова А. М., Лившиц Л. А. Анализ метилиро� вания промоторной области гена FMR1 у больных с синдромом Мартина�Белла из Украины // Цито� логия и генетика.–2002.–т. 36.–№ 4.–С. 53–56. 5. Маниатис Т., Фрич Е. Е., Сэмбрук Ж. Молеку� лярное клонирование.–М.: Мир, 1985.–420 с. 6. Kerem B., Rommens J. M., Buchanan J. A. et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic ana� lysis // Science.–1989.–v. 245.–P. 1073–1080. 7. Feder J. N., Gnirke A., Thomas W. et al. A novel MHC class I�like gene is mutated in patients with he� reditary haemochromatosis // Nature Genet.–1996.– 13.–P. 399–408. 8. Webb T. P., Bundey S. E., Thake A. I., Todd J. Po� pulation incidence and segregation ratios in the Mar� tin�Bell syndrome // Am. J. Med. Genet.–1986.– v. 23.–P. 573–580. 9. Tiepolo L., Zuffardi O. Localization of factors con� trolling spermatogenesis in the nonfluorescent por� tion of the human Y chromosome long arm // Hum. Genet.–1976.–v. 34.–P. 119–124.

Створення та впровадження в медичну практику тест-систем для генної діагностики тяжких спадкових захворювань

Репозитарії

Схожі ресурси