Імуноглобуліни молозива як молекулярні маркери доклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль

З метою виявлення нових молекулярних маркерів автоімунних порушень у породіль проаналізовано антигенну специфічність, каталітичну і цитотоксичну активність імуноглобулінів, одержаних із молозива 25 клінічно здорових породіль осадженням цих білків 50%-м сульфатом амонію. Встановлено, що препарати іму...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2008
Автори:	Кіт, Ю.Я., Старикович, М.О., Білий, Р.О., Скорохід, Н.Р., Янів, Л.Б., Стойка, Р.С.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України 2008
Теми:	Експериментальні статті
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/3914
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Імуноглобуліни молозива як молекулярні маркери доклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль / Ю. Я. Кіт, М. О. Старикович, Р. О. Білий, Н. Р. Скорохід, Л. Б. Янів, Р. С. Стойка // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 3. — С. 37-46. — Бібліогр.: 29 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-3914
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-39142013-02-13T02:13:27Z Імуноглобуліни молозива як молекулярні маркери доклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль Кіт, Ю.Я. Старикович, М.О. Білий, Р.О. Скорохід, Н.Р. Янів, Л.Б. Стойка, Р.С. Експериментальні статті З метою виявлення нових молекулярних маркерів автоімунних порушень у породіль проаналізовано антигенну специфічність, каталітичну і цитотоксичну активність імуноглобулінів, одержаних із молозива 25 клінічно здорових породіль осадженням цих білків 50%-м сульфатом амонію. Встановлено, що препарати імуноглобулінів суттєво відрізняються між собою за цитотоксичною активністю щодо лейкемічних Т-клітин лінії Jurkat, здатністю гідролізувати плазмідну ДНК та гістон Н1, а також за вмістом авто-АТ до дволанцюгової ДНК та гістонів. Зроблено висновок про те, що функціональні властивості імуноглобулінів молозива залежать від індивідуальних особливостей стану гуморального імунітету у породіль. Ці властивості можуть бути використані для комплексного визначення пов’язаних із вагітністю та пологами ранніх автоімунних порушень у жінок. С целью выявления новых молекулярных маркеров аутоимунных нарушений у рожениц проведен анализ антигенной специфичности, каталитической и цитотоксической активности ммуноглобулинов, полученных из молозива осаждением 50%-м сульфатом аммония. Установлено, что препараты иммуноглобулинов существенно различаются по цитотоксической активности относительно лейкемических Т-клеток линии Jurkat, способности гидролизовать плазмидную ДНК и гистон Н1, а также по содержанию ауто-АТ к двухцепочной ДНК и гистонам. Сделан вывод о том, что функциональные свойства иммуноглобулинов молозива зависят от индивидуальных особенностей состояния гуморального иммунитета рожениц. Эти свойства могут быть использованы для комплексного определения ранних аутоиммунных нарушений у женщин, связанных с беременностью и родами. Analysis of antigen specificity, catalytic and cytotoxic activity of colostrum immunoglobulins was carried out in order to detect novel molecular markers of autoimmune disorders. Immunoglobulins were isolated from parturient women colostrums by precipitation with 50%-ammonium sulfate. It was shown that preparations of immunoglobulins possessed significantly different cytotoxic activity towards Jurkat leukemia T-cells, various hydrolyzing ability towards plasmid DNA and histone H1, and also differed by content of auto-antibodies to double-stranded DNA and histones. We concluded that functional properties of colostrums immunoglobulins depended on individual peculiarities of parturient women humoral immunity. These properties can be used for complex detection of early autoimmune disorders linked with pregnancy and delivery. 2008 Article Імуноглобуліни молозива як молекулярні маркери доклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль / Ю. Я. Кіт, М. О. Старикович, Р. О. Білий, Н. Р. Скорохід, Л. Б. Янів, Р. С. Стойка // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 3. — С. 37-46. — Бібліогр.: 29 назв. — укр. http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/3914 577.112.083:577.112.4:577.151.05 uk Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Експериментальні статті Експериментальні статті
spellingShingle	Експериментальні статті Експериментальні статті Кіт, Ю.Я. Старикович, М.О. Білий, Р.О. Скорохід, Н.Р. Янів, Л.Б. Стойка, Р.С. Імуноглобуліни молозива як молекулярні маркери доклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль
description	З метою виявлення нових молекулярних маркерів автоімунних порушень у породіль проаналізовано антигенну специфічність, каталітичну і цитотоксичну активність імуноглобулінів, одержаних із молозива 25 клінічно здорових породіль осадженням цих білків 50%-м сульфатом амонію. Встановлено, що препарати імуноглобулінів суттєво відрізняються між собою за цитотоксичною активністю щодо лейкемічних Т-клітин лінії Jurkat, здатністю гідролізувати плазмідну ДНК та гістон Н1, а також за вмістом авто-АТ до дволанцюгової ДНК та гістонів. Зроблено висновок про те, що функціональні властивості імуноглобулінів молозива залежать від індивідуальних особливостей стану гуморального імунітету у породіль. Ці властивості можуть бути використані для комплексного визначення пов’язаних із вагітністю та пологами ранніх автоімунних порушень у жінок.
format	Article
author	Кіт, Ю.Я. Старикович, М.О. Білий, Р.О. Скорохід, Н.Р. Янів, Л.Б. Стойка, Р.С.
author_facet	Кіт, Ю.Я. Старикович, М.О. Білий, Р.О. Скорохід, Н.Р. Янів, Л.Б. Стойка, Р.С.
author_sort	Кіт, Ю.Я.
title	Імуноглобуліни молозива як молекулярні маркери доклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль
title_short	Імуноглобуліни молозива як молекулярні маркери доклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль
title_full	Імуноглобуліни молозива як молекулярні маркери доклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль
title_fullStr	Імуноглобуліни молозива як молекулярні маркери доклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль
title_full_unstemmed	Імуноглобуліни молозива як молекулярні маркери доклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль
title_sort	імуноглобуліни молозива як молекулярні маркери доклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль
publisher	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
publishDate	2008
topic_facet	Експериментальні статті
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/3914
citation_txt	Імуноглобуліни молозива як молекулярні маркери доклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль / Ю. Я. Кіт, М. О. Старикович, Р. О. Білий, Н. Р. Скорохід, Л. Б. Янів, Р. С. Стойка // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 3. — С. 37-46. — Бібліогр.: 29 назв. — укр.
work_keys_str_mv	AT kítûâ ímunoglobulínimolozivaâkmolekulârnímarkeridoklíníčnoídíagnostikiavtoímunnihporušenʹuporodílʹ AT starikovičmo ímunoglobulínimolozivaâkmolekulârnímarkeridoklíníčnoídíagnostikiavtoímunnihporušenʹuporodílʹ AT bílijro ímunoglobulínimolozivaâkmolekulârnímarkeridoklíníčnoídíagnostikiavtoímunnihporušenʹuporodílʹ AT skorohídnr ímunoglobulínimolozivaâkmolekulârnímarkeridoklíníčnoídíagnostikiavtoímunnihporušenʹuporodílʹ AT ânívlb ímunoglobulínimolozivaâkmolekulârnímarkeridoklíníčnoídíagnostikiavtoímunnihporušenʹuporodílʹ AT stojkars ímunoglobulínimolozivaâkmolekulârnímarkeridoklíníčnoídíagnostikiavtoímunnihporušenʹuporodílʹ
first_indexed	2025-07-02T07:15:02Z
last_indexed	2025-07-02T07:15:02Z
_version_	1836518476584321024
fulltext	37 у розвиткові автоімунних захворювань [5]. Визначення вмісту цих авто�АТ у сироватці крові людей було використано для діагнос� тики різних автоімунних захворювань, а та� кож для прогнозування розвитку хвороби [6]. Масштаби пошуку молекулярних марке� рів автоімунних порушень у людини значно розширились після відкриття каталітично активних авто�АТ, здатних каталізувати гідроліз авто�АГ [7]. Каталітично активні антитіла, які називають натуральними аб� зимами, можна класифікувати за їхньою субстратною специфічністю на низькоспе� цифічні та високоспецифічні. Низькоспеци� фічні абзими, що здатні гідролізувати ДНК, РНК та синтетичні олігонуклеотиди, було виявлено у сироватці крові хворих на авто� імунні та деякі інші захворювання, а також у молоці й молозиві клінічно здорових жінок [8]. Вони отримали назву ДНК�зимів. Окрім каталітичної активності, характерною ознакою ДНК�зимів є висока цитотоксична Імунна система ссавців не тільки забез� печує захист організму від впливу шкідли� вих чинників довкілля, але й задіяна у регу� ляції біологічних функцій, які визначають його гомеостаз [1]. У підтриманні гомеоста� зу важливу роль відіграють антитіла (АТ), спрямовані як до чужорідних антигенів, так і до антигенів власного організму (авто�АГ). Антитіла, які взаємодіють з авто�АГ, мають назву автологічних антитіл (авто�АТ) [1,2]. Авто�АТ виявлено як в організмі клінічно здорових людей, так і в осіб з автоімунними захворюваннями [3]. У клінічно здорових людей авто�АТ представлені, головним чи� ном, низькоафінними поліспецифічними імуноглобулінами класу М або високоспеци� фічними низькоафінними імуноглобуліна� ми класу G (антиідіотипні АТ), що залучені до регуляції імунної відповіді [3, 4]. У па� цієнтів з автоімунними захворюваннями ви� явлено високоспецифічні авто�АТ класу IgG, які можуть безпосередньо брати участь ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ СТАТТІ УДК 577.112.083:577.112.4:577.151.05 ІМУНОГЛОБУЛІНИ МОЛОЗИВА ІМУНОГЛОБУЛІНИ МОЛОЗИВА ЯК МОЛЕКУЛЯРНІ МАРКЕРИ ЯК МОЛЕКУЛЯРНІ МАРКЕРИ ДОКЛІНІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ ДОКЛІНІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ АВТОІМУННИХ ПОРУШЕНЬ У ПОРОДІЛЬАВТОІМУННИХ ПОРУШЕНЬ У ПОРОДІЛЬ Ю. Я. Кіт1 М. О. Старикович1 Р. О. Білий1 1Інститут біології клітини НАН України, Львів Н. Р. Скорохід1 2Львівський обласний перинатальний центр Л. Б. Янів2 Р. С. Стойка 1 E/mail: kit@сellbiol.lviv.ua З метою виявлення нових молекулярних маркерів автоімунних порушень у породіль проаналізовано анти� генну специфічність, каталітичну і цитотоксичну активність імуноглобулінів, одержаних із молозива 25 клі� нічно здорових породіль осадженням цих білків 50%�м сульфатом амонію. Встановлено, що препарати імуно� глобулінів суттєво відрізняються між собою за цитотоксичною активністю щодо лейкемічних Т�клітин лінії Jurkat, здатністю гідролізувати плазмідну ДНК та гістон Н1, а також за вмістом авто�АТ до дволанцюгової ДНК та гістонів. Зроблено висновок про те, що функціональні властивості імуноглобулінів молозива залежать від індивідуальних особливостей стану гуморального імунітету у породіль. Ці властивості можуть бути використані для комплексного визначення пов’язаних із вагітністю та пологами ранніх автоімунних порушень у жінок. Ключові слова: молозиво здорових породіль, імуноглобуліни, цитотоксична активність, каталітична активність, рівень авто�АТ. БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008 38 Наведені вище аргументи свідчать про те, що функціональна активність імуногло� булінів молозива може вказувати на зміни у гуморальному імунітеті породіль. Ці влас� тивості можуть бути використані для комп� лексного визначення пов’язаних із вагітністю та пологами ранніх автоімунних порушень у жінок. У роботі наведено результати ана� лізу антигенної специфічності, цитотоксич� ної та каталітичної активності препаратів імуноглобулінів, одержаних із молозива 25 клінічно здорових породіль. Матеріали і методи Препарати Ig із молозива породіль Зразки молозива (2 мл) отримували у Львівському обласному пренатальному центрі МОЗ України. Для виділення антитіл (АТ) молозиво центрифугували протягом 20 хв при 2000 g, після чого відділяли ліпід� ну та клітинну фракції. Препарати Ig одер� жали триразовим переосадженням білків молозива 50%�м сульфатом амонію [18]. Для цього до 0,5 мл молозива додавали крап� лями 0,5 мл насиченого розчину сульфату амонію і осаджували Ig центрифугуванням при 2 000 g упродовж 5 хв. Осад розчиняли в об’ємі 0,5 мл дистильованою водою і повтор� но осаджували Ig 50%�м сульфатом амонію. Після триразового переосадження фракції Ig протягом 18 год діалізували проти забу� ференого фосфатного розчину (ЗФР) (0,01 M Na2HPO4, 0,01 M NaH2PO4, 0,145 M NaCl, pH 7,4 ). Концентрацію білка у препаратах визначали за методом Лоурі [19]. Білковий склад отриманих препаратів аналізували електрофорезом у градієнті концентрації ПААГ (6–17,5%) у присутності 0,1% SDS [20]. Препарати Ig зберігали при –20 0С у присут� ності 10%�го гліцеролу (Sigma, США). Вплив препаратів Ig на ріст клітин у культурі У роботі використовували лейкемічні Т�лімфоцити людської лінії Jurkat, одержа� ні з колекції Інституту експериментальної патології, онкології та радіології ім. Р. Є. Ка� вецького НАН України (Київ). Клітини культивували у флаконах Карреля у середо� вищі RPMI�1640 (Sigma, США) у присут� ності 10%�ї ембріональної сироватки (Sigma, США) та 50 мкг/мл гентаміцину (Sigma, США) до досягнення клітинами суб� конфлюентного стану. Для досліду висівали 6,5·105 клітин у 96�лункові планшети і після 2 год інкубації у лунки додавали Ig у кінце� вій концентрації 0,7 мг/мл та інкубували активність їх щодо пухлинних і трансфор� мованих клітин та активованих лімфоцитів людини [9, 10]. Оскільки у сироватці крові клінічно здорових людей ДНК�зими не ви� явлено, їхня присутність в організмі людей свідчить про порушення, що можуть приз� водити до розвитку автоімунних захворю� вань [8, 11]. Прикладом високоспецифічних каталі� тичних авто�АТ є абзими із протеолітичною активністю, що отримали назву протабзимів [8]. Каталітична активність протабзимів, виявлених у сироватці крові людей з авто� імунними захворюваннями, спрямована переважно на гідроліз авто�АГ, задіяних у розвитку того чи іншого захворювання. Наприклад, у хворих на гострий алергічний тироїдит антитиреоглобулінові авто�АТ здатні гідролізувати тиреоглобулін. У хво� рих на алергічний міокардит виявлено авто� АТ, які гідролізують міозин, а у хворих на розсіяний склероз — авто�АТ з гідролізую� чою активністю щодо основного білка мієлі� ну [12]. Вузька субстратна специфічність робить протабзими перспективними моле� кулярними маркерами у прогнозуванні роз� витку автоімунних захворювань [8]. Відомо, що зміни в гормональному та імунному статусі жінок, пов’язані з вагітніс� тю, пологами та лактацією, можуть призво� дити до розвитку автоімунних захворювань [13]. Унаслідок порушення автоімунної то� лерантності в організмі жінки з’являються високоспецифічі авто�АТ та абзими, визна� чення вмісту яких може бути корисним для прогнозування виникнення автоімунних захворювань. Оскільки лактація є частиною репродук� тивного циклу жінки, функціональна ак� тивність імуноглобулінів молозива та молока може відображати індивідуальні особли� вості стану її гуморального імунітету. У мо� лозиві людини присутні усі класи імуногло� булінів [14]. Серед імуноглобулінів молока виявлено високоафінні та поліреактивні ав� то�А, а також абзими з різною каталітичною активністю [15, 16, 17]. Подібно до авто�АТ та абзимів сироватки крові вони можуть функ� ціонувати як фактори імунного захисту або як патогенні чинники. Окрім того, функціо� нальна активність імуноглобулінів може ре� алізуватися через взаємодію їх із білками молока, здатними впливати на проліфера� цію, диференціацію та апоптоз клітин різно� го типу [14]. Утворення комплексів із цими білками може змінювати функціональну ак� тивність імуноглобулінів та активність са� мих комплексоутворювальних білків. Експериментальні статті 39 Протеазну активність препаратів Ig виз� начали згідно [22]. Для цього 5 мкг Ig інку� бували із 5 мкг гістону Н1 протягом 2 год при 37 0С у 10 мМ трис�HCl, pH 8,0. Білки розділяли електрофорезом у 12% ПААГ за присутності 0,1% SDS, гелі зафарбовува� ли Coomassie R�250. Імуноцитохімічний аналіз препаратів Ig проводили, як описано [23], із деякими модифікаціями. Клітини лінії Jurkat попе� редньо промивали ЗФР, щоб видалити куль� туральне середовище, готували цитологічні мазки, фіксували їх метанолом протягом 90 с і висушували при кімнатній темпера� турі. Після цього мазки інкубували із препа� ратами Ig (розведення 1:75) при 4 0C упро� довж ночі. Після інкубації мазки промивали ЗФР двічі по 10 хв та інкубували з міченими FITC IgG кози, специфічними до Н�лан� цюгів IgA людини (Sigma, США) у розве� денні 1 : 50 протягом 1,5 год при 37 0С. Мазки промивали ЗФР, фарбували флуоресцент� ним барвником DAPI (1 мкг/мл) протягом 1 хв, знову промивали ЗФР, дистильованою водою і фотографували під мікроскопом Мікмед К�2�12 (ЛОМО, РФ) при відповідних довжинах хвилі збудження та емісії для ви� явлення флуоресценції. Результати та обговорення Препарати імуноглобулінів (Ig) одержу� вали із молозива 25 клінічно здорових по� роділь триразовим переосадженням білків молозива за умов 50%�го насичення сульфа� ту амонію. Концентрація білка у цих препа� ратах коливалася від 1 мг/мл до 16 мг/мл і в середньому становила 2–3 мг/мл. Ре� зультати електрофорезу за денатурувальних умов показали, що досліджувані препарати Ig складаються переважно з поліпептидів із мол. масою 80, 62, та 25 кДа (рис. 1), які відповідають важким (Н) та легким (L) лан� цюгам імуноглобулінів класу IgM та sIgA [14]. У складі препаратів Ig виявлено також інші білки з мол. масою 50, 30 та 14 кДа. Є підстави припустити, що цими білками є важкі ланцюги IgG, бета�казеїн та лакто� альбумін. Останні два білки містяться у знач� ній кількості у молоці людини і, очевидно, виділяються спільно з імуноглобулінами під час осадження білків молозива сульфатом амонію. На відміну від сироватки крові, у молозиві та молоці людини відзначено ви� сокий вміст димерної форми секреторного IgA (sIgA) [14, 17]. У свою чергу, sIgA є над� молекулярним комплексом, який складає� ться із Н� і L�ланцюгів IgA (62, 25 кДа), упродовж 24 год. Для визначення життє� здатності клітин використовували тест із фарбуванням мертвих клітин 0,1%�м вод� ним розчином трипанового синього. Вміст АТ зі спорідненістю до ДНК та гістонів Для визначення вмісту антитіл зі спорід� неністю до дволанцюгової ДНК (анти�дДНК АТ) та гістонів (антигістонові АТ) у препара� тах Ig застосовували метод імуноферментно� го аналізу (ІФА). Антигенами слугували ДНК тимуса теляти (Sigma, США) та препа� рат тотальних гістонів із тимуса теляти (люб’язно наданий д.б.н. М. Д. Луциком). На полістироловому 96�лунковому планше� ті сорбували ДНК (10 мкг/мл) або гістони (2 мкг/мл) упродовж 16 год при 4 0С. Препа� рати Ig розводили у співвідношенні 1:40 у буфері А (1%�й бичачий сироватковий альбумін у ЗФР ) і в об’ємі 200 мкл вносили у лунки із сорбованими антигенами. Інку� бацію проводили протягом 2 год при 37 0С, після чого лунки тричі промивали буфером А. У лунки вносили кон’югат білка А з пе� роксидазою хрону (Sigma, США) у розведен� ні 1 : 500, інкубували 1 год при 37 0С, після чого промивали буфером А. Як субстрат пе� роксидазної реакції використовували діаміно� бензидин. Реакцію зупиняли 1 М ортофосфор� ною кислотою. Оптичну густину розчину визначали при довжині хвилі 492 нм на спектрофотометрі NanoDrop ND 1000 (NanoDrop Technologies, США). Рівень авто�АТ у лун� ках вираховували за величиною оптичного поглинання розчину забарвлених продуктів пероксидазної реакції. Визначення прово� дили у трьох паралельних дослідах. Статис� тичне опрацювання результатів здійснюва� ли за допомогою комп’ютерної програми OriginPro 7.0. Каталітична активність препаратів Ig Каталітичну активність препаратів Ig досліджували за їхньою здатністю гідролі� зувати плазмідну ДНК та гістон Н1. Топоізомеразну активність препаратів Ig визначали, як описано [21]. Як субстрат ви� користовували плазміду pBR 322 (Fermen� tas, Литва). Для аналізу аліквоти Ig у кіль� кості 5 мкг інкубували із 3 мкг плазмідної ДНК у 20 мМ трис�HCl, 75 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 упродовж 1 год при 37 0С. Продукти реакції розділяли електрофорезом у 1%�му гелі агарози у трис�борат�ЕДТА буфері, рН 8,6, у присутності 0,001%�го етидію бро� міду. Гель фотографували при ультрафіоле� товому освітленні. БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008 40 [24]. Головна відмінність полягала в тому, що Ig клінічно здорових людей мали вищу цитотоксичну активність щодо Т�лейкеміч� них клітин людини порівняно з Ig хворих на розсіяний склероз. При цьому слід зазначи� ти, що деякі з препаратів Ig, виділених із си� роватки крові хворих переважно із важкою формою, були здатні стимулювати проліфе� рацію лейкемічних клітин. На основі отри� маних результатів було зроблено висновок про те, що зміни цитотоксичної активності Ig сироватки крові щодо лейкемічних клі� тин можуть бути характерною ознакою ав� тоімунних порушень у хворих на розсіяний склероз [24]. Беручи до уваги ці результати, було до� сліджено, як впливають Ig молозива поро� діль на ріст людських лейкемічних Т�клітин лінії Jurkat. Цитотоксичний ефект Ig визна� чали за співвідношенням кількості живих і мертвих клітин у культурі порівняно з контролем. Встановлено, що більшість препаратів Ig індукують загибель лейкеміч� них клітин in vitro (рис. 2). При цьому 11 пре� паратів Ig із 25 досліджених пригнічували ріст клітин більш ніж на 80% від контроль� ного рівня. Два препарати характеризува� лися цитотоксичним ефектом на нижчому рівні (50–60%), ніж у попередніх 11 препа� ратів, у восьми препаратів він був незначним (20–25%), а в одного препарату — у межах контролю. Як видно із рис. 2, препарати №19 та №25, на відміну від інших препаратів, характеризувалися здатністю стимулювали проліферацію лейкемічних Т�лімфоцитів лінії Jurkat. Отже, результати проведених нами досліджень свідчать про те, що препа� рати Ig, одержані з молозива породіль, сут� тєво відрізняються між собою щодо дії на лейкемічні Т�клітини лінії Jurkat. Оскільки низький рівень або відсутність цитотоксич� ної активності Ig є характерною ознакою хворих на розсіяний склероз, можна при� пустити, що стан гуморального імунітету породіль, у яких Ig молозива мають подібні властивості, зазнав певних автоімунних по� рушень. Характерною ознакою автоімунних по� рушень в організмі людини є поява високо� специфічних авто�АТ. Відомо, що в патогенезі багатьох автоімунних захворювань значну роль відіграють авто�АТ зі спорідненістю до ядерних антигенів — дволанцюгової ДНК (дДНК) та гістонів [6]. Ми дослідили препа� рати Ig на присутність анти�дДНК АТ та ан� тигістонових АТ за допомогою ІФА. Як позитивний контроль застосовували препа� рати IgG сироватки крові хворих на секреторного компонента (80 кДа) та J�лан� цюгів (14 кДа). Виявлення цих поліпептидів свідчить про те, що препарати Ig, одержані із молозива породіль осадженням сульфа� том амонію, збагачені секреторним IgA. Наступним етапом роботи було дослі� дження препаратів Ig на цитотоксичну та ка� талітичну активність, а також на присут� ність у них авто�АТ зі спорідненістю до дволанцюгової ДНК і гістонів. Раніше нами було встановлено, що Ig, виділені із сироват� ки крові клінічно здорових людей та хворих на розсіяний склероз, різняться за їхнім впливом на ріст лейкемічних клітин in vitro Рис. 1. Аналіз препаратів Ig електрофорезом у градієнті (6–17,5% ) ПААГ за присутності 0,1% SDS: 1–25 — препарати Ig молозива породіль; М — стандарти молекулярної маси білків кДа кДа кДа Експериментальні статті 41 На відміну від анти�дДНК АТ, антигісто� нові АТ було виявлено у складі 12 препара� тів Ig молозива породіль (рис. 3). При цьому у шести препаратах рівень їх був близьким або перевищував рівень антигістонових АТ, виявлених у препаратах IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз. Найви� щим вмістом антигістонових АТ характери� зувався препарат № 4, де рівень антигістоно� вих АТ у 2,5 раза перевищував рівень їх у препаратах IgG сироватки крові хворих на розсіяний склероз. Варто зазначити, що, на відміну від інших препаратів Ig, молозиво породіллі №4 окрім антигістонових АТ міс� тило також анти�дДНК АТ. Присутність ав� то�АТ із різною специфічністю у молозиві жінки дає підстави припустити, що в її орга� нізмі можуть відбуватися зміни в імунному статусі, а отже в подальшому це може приз� водити до виникнення автоімунних або алергічних захворювань. Важливою характеристикою авто�АТ є їхня каталітична активність щодо авто�АГ. Встановлено, що ДНК�гідролізуючі антиті� ла (ДНК�зими) присутні у крові хворих на автоімунні та деякі інші захворювання, однак їх не виявлено у крові клінічно здоро� вих людей. ДНК�зими було знайдено у сиро� ватці крові пацієнтів з автоімунними захво� рюваннями (системний червоний вівчак, ревматоїдний артрит, автоімунний тирої� дит, розсіяний склероз та ін.), а також у хво� рих на СНІД, променеву хворобу та деякі лімфопроліферативні захворювання (В�лім� фолейкози) [8, 25]. ДНК�гідролізуючі анти� тіла ізотипів sIgA та IgG було також виявле� но у молоці та молозиві клінічно здорових породіль [17]. Частота, з якою ці абзими трапляються у молозиві, та взаємозвязок їх з автоімунними порушеннями у породіль за� лишаються малодослідженими. Ми провели аналіз ДНК�гідролізуючої активності препаратів Ig молозива породіль. Відомо, що ДНК�зимам притаманна топоізо� меразна активність щодо надспіралізованої ДНК плазміди [26]. ДНК�зими, подібно до топоізомераз, каталізують розриви в одній із двох ниток ДНК, що призводить до утво� рення релаксованої форми ДНК плазміди. Оскільки ці дві форми ДНК мають різну електрофоретичну рухливість, їх можна розділити електрофорезом у гелі агарози. Було встановлено, що препарати Ig №4, 8, 18 та 21 гідролізують надспіралізовану плаз� мідну ДНК подібно до ДНК�зимів, виділених із сироватки крові пацієнтів з автоімунними захворюваннями (рис. 4). В інших препаратах Ig топоізомеразну активність не виявлено. розсіяний склероз, а як негативний — пре� парати IgG сироватки крові клінічно здоро� вих донорів. Було встановлено, що вміст ан� ти�дДНК АТ в усіх препаратах Ig молозива породіль, окрім препарату Ig №4, суттєво не відрізнявся від вмісту анти�дДНК АТ у пре� паратах IgG, виділених із сироватки крові здорових донорів (рис. 3). Вміст анти�дДНК АТ у препараті № 4 був достовірно вищим, ніж у інших препаратах АТ, хоча й був ниж� чим, ніж у препаратах IgG, виділених із си� роватки крові хворих на розсіяний склероз. Рис. 2. Рівень виживання ТKклітин лінії Jurkat під впливом препаратів Ig (1–25), очищених із молоK зива породіль. К — контроль (за відсутності Ig) Рис. 3. Імуноферментний аналіз (ІФА) відносного вмісту автоKАТ зі спорідненістю до дволанцюгової ДНК (антиKдДНК АТ) та гістонів (антигістонові АТ) у препаратах Ig. На діаграмі показано співвідношення вмісту авто� АТ у препаратах Ig, визначеного за величиною оп� тичного поглинання забарвлених продуктів перок� сидазної реакції: 1–25 — препарати Ig молозива породіль; К1+, К2+ — препарати Ig сироватки крові хворих на розсіяний склероз; К1–, К2– — препарати Ig сироватки крові клінічно здорових до� норів антигістонові АТанти�дДНК АТ БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008 42 не є вузькоспецифічними щодо субстратів і крім ДНК вони можуть також гідролізува� ти синтетичні олігонуклеотиди та різні типи РНК [7, 26]. Тому не виключено, що ДНК� зими каталітично активних препаратів Ig №4, 8, 21 є авто�АТ зі спорідненістю до одно� ланцюгової ДНК або РНК. У табл. 1 подано узагальнені результати дослідження антигенної специфічності, ци� тотоксичної та каталітичної активності пре� паратів Ig молозива породіль. Як випливає із результатів цього аналізу, функціональна активність Ig молозива двох породіль (№4 і №21) суттєво відрізняється від функціона� льної активності Ig інших породіль. Спіль� ною ознакою для породіль №4 і №6 є: – високий вміст секреторних імуногло� булінів класу А; – низька (або відсутня) цитотоксична ак� тивність щодо людських лейкемічних Т� клітин лінії Jurkat; – наявність антигістонових АТ; – топоізомеразна та протеолітична ак� тивність. Наведена сукупність ознак свідчить про те, що стан гуморального імунітету цих по� роділь відрізняється від стану інших поро� діль, і причиною цих змін можуть бути авто� імунні процеси, пов’язані з вагітністю та пологами. В анамнезі цих породіль виявле� но суттєві відхилення від норми, зокрема перебіг вагітності у них супроводжувався загрозою переривання вагітності, токсико� зом, набряками кінцівок, що певною мірою Іншим типом абзимів, присутність яких в організмі свідчить про автоімунні порушен� ня, є протеїнгідролізувальні авто�АТ (про� табзими). Протабзими класів sIgA і IgG, що здатні гідролізувати бета�казеїн жіночого та коров’ячого молока, було виявлено у молоці клінічно здорових жінок і в сироватці крові хворих на СНІД [27, 28]. Нами було встанов� лено, що високоочищені препарати sIgA, виділені з молозива породіль, гідролізують гістон Н1 [29]. Антитіла класу IgG із подіб� ною субстратною специфічністю також було знайдено у сироватці крові хворих на розсія� ний склероз (дані не опубліковано). Одержа� ні результати вказують на те, що абзими, які гідролізують гістон Н1, подібно до інших протабзимів, можуть слугувати маркерами автоімунних порушень в організмі людини. У даній роботі встановлено, що препарати Ig № 4 та № 21 гідролізують гістон Н1 (рис. 5). Іншим препаратам не притаманна каталі� тична активність щодо цього білка. Враховуючи ту обставину, що препарати Ig були недостатньо очищені від домішок інших білків молозива, не можна виключи� ти, що каталітична активність деяких із цих препаратів може бути наслідком дії домі� шок ензимів молока. Підвищений вміст ав� то�АТ зі спорідненістю до ДНК та гістонів у складі каталітично активних препаратів Ig №4 і №21 свідчить на користь присутнос� ті в них абзимів. Відсутність авто�АТ зі спо� рідненістю до дволанцюгової ДНК у складі препаратів Ig № 8, 18, 21 не виключає мож� ливості функціонування ДНК�зимів. Відомо, що, на відміну від протабзимів, ДНК�зими Рис. 4. Гідроліз плазмідної ДНК під впливом препаратів Ig молозива породіль: 3, 7, 17, 20 — препарати Ig, у яких топоізомеразна активність відсутня; 4, 8, 18, 21 — препарати Ig, яким притаманна топо� ізомеразна активність; К — плазміда pBR322. Стрілками вказано положен� ня на гелі релаксованої (РП) та надспіралізованої (СП) форм плазмідної ДНК Рис. 5. Гідроліз гістону Н1 під впливом препаратів Ig молозива породіль: 3, 22 — препарати Ig, у яких протеолітична актив� ність відсутня; 4, 21 — препарати Ig, здатні гідролізувати гістон Н1; К — гістон Н1. Стрілкою вказано положення на гелі гістону Н1 1 Н1 2221К43 СП РП К21201817874 Експериментальні статті 43 нуклеопротеїнів ядра можуть слугувати діагностичними маркерами розвитку дея� ких автоімунних захворювань [6, 23]. Для визначення положення ядер фіксовані клітини лінії Jurkat фарбували флуоресцен� тним барвником DAPI. Встановлено, що у препаратах Ig №4, 21 і 24 присутні авто� АТ класу IgA зі спорідненістю до біострук� тур Т�клітин лінії Jurkat (рис. 6). У препа� раті Ig породіллі № 20 авто�АТ класу sIgA з подібною антигенною специфічністю не виявлено. Накладання фазово�контрастних та флуоресцентних зображень клітин дозво� лило продемонструвати, що антигени авто� sIgA антитіл препаратів Ig №4 містяться у ядрі клітин і, ймовірно, є компонентами підтверджує припущення щодо розвитку ав� тоімунних порушень. Важливою ознакою автоімунних пору� шень у людини є поява у сироватці крові ав� то�АТ до внутрішньоклітинних автоанти� генів [23]. Враховуючи ту обставину, що sIgA є головним компонентом фракції Ig мо� лозива людини, було проведено досліджен� ня спорідненості sIgA�антитіл препаратів Ig до антигенів Т�клітин лінії Jurkat. Викорис� тано препарати Ig породіль №4, 20, 21, 24, у яких вміст sIgA, згідно з даними, наведе� ними на рис.1, був найвищим. Для виявлен� ня sIgA застосовували FITC�мічені IgG кози, моноспецифічні до Н�ланцюгів sIgA люди� ни. Відомо, що авто�АТ зі спорідненістю до Таблиця 1. Характеристика функціональної активності препаратів Ig, виділених із молозива породіль Донори молозива № п/п Цитотоксична активність Ig Мітогенна aктивність Ig Вміст анти�ДНК АТ Вміст анти� гістонових АТ Топоізоме� разна активність Ig Протеолітич� на активність Ig щодо гістону Н1 1 + + + 2 + + 3 + + + + 4 + + + ++ + + + + 5 + + + 6 + + + 7 + + + 8 + + 9 + + + 10 + + 11 + + + 12 + + + + + 13 + + + ++ 14 + + 15 + 16 + + 17 + + 18 + + + 19 + + 20 + + + + + 21 + + + + + + + + 22 + 23 + + + 24 + 25 + + + Примітка: «+» — низький, «++» — середній, «+++» — високий рівень прояву функціонального марке� ра у препаратах Ig. БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008 44 1. Полетаев А. Г. Иммунологический гомун� кулус (иммункулус) в норме и при патоло� гии // Биохимия. — 2002. — Т. 67, №5. — С. 721–730. 2. Mackay I. R. Autoimmunity: Paradigms of Burnet and complexities of today // Immun. Cell. Biol. — 1992. — V. 70, N3. — P. 159–171. 3. Avrameas S. Natural autoantibodies. From horror autotoxicus to gnothi seauton // Immunol. Today. — 1991. — V. 12, N5. — P. 154–159. 4. Bouvet J/P., Dighitro G. From natural polyreactive autoantibodies to a la Carte monoreactive antibodies to infection agents: is it a small world after all? // Infection and Immunity. — 1998. — V. 66, N1. — C. 1–4. 5. Dawson K., Bell D. Production and patho� genic effect of anti�DNA antibodies: rele� vance to antisense research // Antisense Res. Devel. — 1991. — V. 1, N4. — C. 351–360. 6. Kurien B. T., Scofield R. H. Autoantibody determination in the diagnosis of systemic lupus erythematosus // Scan. J. Immunol. — 2006. — V. 64, N3. — P. 227–235. 7. Невинский Г. А., Канышкова Т. Г., Бунева В. Н. Природные каталитически активные ан� титела (абзимы) в норме и при патологии // Биохимия. — 2002. — Т. 65, №11. — С. 1473–1487. 8. Gabibov A., Ponomarenko N., Tretyak E. et al. // Catalytic autoantibodies in clinical auto� immunity and modern medicine // Auto� imm. Rev. — 2006. — V. 5, N5. — P. 324–330. 9. Сучков С. В. Сравнительное исследование каталитических (ДНК�гидролизирующих) и цитотоксических свойств анти�ДНК ау� тоантител // Бюл. эксперим. биол. мед. — 2001. — Т. 131, №4. — С. 420–423. 10. Kozyr A. V., Sashchenko L. P., Kolesnikov A. V. et al. Anti�DNA autoantibodies reveal toxi� city to tumor cell lines // Immunol. Lett. — 2002. — V. 80, N1. — P. 41–47. 11. Gabibov A. Antibody catalysis: Biochemist� ry, immunology, pathology // Ibid. — 2006. — V. 103, N1. — P. 1–2. 12. Nevinsky G., Bunetva N. Catalytic antibodies in healthy humans and patients with autoimmune and viral diseases // J. Cell. Mol. Med. — 2003. — V. 7, N3. — P. 265–276. 13. Сervera R., Font J., Balasch J. Pregnancy outcome in systemic lupus erythematosus: хроматину. Водночас антигени авто�sIgA антитіл препаратів Ig № 21 і № 24 розміщені головним чином у цитоплазмі та плазма� тичній мембрані Т�клітин лінії Jurkat. Аналіз результатів проведених дослі� джень дає підстави зробити висновок про те, що функціональні властивості імуноглобулінів молозива можуть відображати індивіду� альні особливості стану гуморального імуні� тету у породіль. Проте отримані результати поки що не дозволяють однозначно стверд� жувати, які саме характеристики антитіл молозива — цитотоксичність, спорідненість до автоантигенів чи каталітична актив� ність — можуть слугувати маркерами у ран� ній діагностиці автоімунних порушень у по� роділь. Щоб відповісти на це запитання, потрібно провести комплексне дослідження стану здоров’я ширшої вибірки породіль, яких за сумою виявлених нами ознак можна віднести до групи ризику. Автори висловлюють подяку д.б.н. М. Д. Лу� цику за надані ним препарати гістонів. Ро� боту виконано за фінансової підтримки спільного проекту НАН України та Сибір� ського відділення Російської АН. Рис. 6. Аналіз антигенної специфічності секреторних IgA препаратів Ig молозива породіль щодо лейкемічних ТKклітин лінії Jurkat: К — клітини, не інкубовані з препаратами Ig (конт� роль); 4, 21 — клітини, інкубовані з Ig препаратів №4 та 21; ФМК — фазово�контрастна мікроскопія препаратів клітин; A�IgA — флуоресцентна мікроскопія препаратів клітин після оброблення їх FITC�мічени� ми IgG кози, специфічними до Н�ланцюгів IgA людини; DAPI — флуоресцентна мікроскопія препаратів клітин, зафарбованих DAPI ЛІТЕРАТУРА Експериментальні статті 45 Mol. Med. — 2003. — V. 7, N3. — P. 265–276. 26. Nevinky G. A., Buneva V. N. Human cathalyt� ic RNA� and DNA�hydrolyzing antibodies // J. Immunol. Methods. — 2002. — V. 269, N1–3. — P. 235–249. 27. Odintsova E. S., Buneva V. N., Nevinsky G. A. Casein�hydrolyzing activity of sIgA antibod� ies from human milk // J. Mol. Recognit. — 2005. — V. 18, N5. — P. 413–421. 28. Одинцова Е. С., Харитонова М. А., Барано/ вский А. Г. и др. Протеолитическая актив� ность IgG антител из крови больных синд� ромом приобретенного иммунодефицита человека // Биохимия. — 2006. — Т. 71, №3. — С. 320 — 332. 29. Кіт Ю. Я., Стойка Р. С. Каталітично ак� тивні антитіла (абзими) молока людини і деякі механізми регуляції їх активності // Матеріали IX Укр. біохім. з’їзду, 24–27 жовтня 2006 р., Харків. — Т. 1. — 20 с. good news for the new millennium // Auto� immun. Rev. — 2002. — V. 1, N6. — P. 354–359. 14. Канышкова Т. Г., Бунева В. А., Невинс/ кий Г. А. Биологические функции молока человека и его компонентов // Успехи совр. биологии. — 2002. — Т. 122, №3. — С. 259–271. 15. Quan C. P., Berneman A., Pires R., Bouvet J. P. Natural polyreactive secretory immuno� globulin A autoantibodies as a possible barri� er to infection in humans // Infect. Im� mun. — 1997. — V. 65, N10. — Р. 3997–4004. 16. Кит Ю. Я., Семенов Д. В., Канышкова Т. Г. и др. Секреторные иммуноглобулины А мо� лока человека обладают сродством к оли� гонуклеотидам и нуклеиновым кислотам // Биохимия. — 1999. — Т. 64, №1. — С. 52–59. 17. Кіт Ю. Я., Стойка Р. С. Каталiтично ак� тивні антитіла (абзими) молока людини // Укр. біохім. журн. — 2007. — Т. 79, №2. — С. 5–16. 18. Иммуноглобулины / Под ред. Г. Леитмена и Р. Гуда. — М.: Мир, 1981. — C. 212–230. 19. Lowry O. H., Rosebrough N. J // Protein mea� surement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. — 1951. — V. 193, N1. — P. 265–270. 20. Laemmly U. K. A cleavege of structugal pro� tein during the assambly of the head of bac� teriofage T4 // Nature. — 1970. — V. 227, N5259. — P. 2244–2750. 21. Nevinsky G. A., Kanyshkova T. G., Semenov D. V. et al. Secretory immunoglobulin A from healthy human mothers’ milk catalyzes nucleic acid hydrolysis // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2000. — V. 83, N1–3. — P. 115–129. 22. Polosukhina D. I., Buneva V. N., Doronin B. M. et al. Hydrolysis of myelin basic protein by IgM and IgA antibodies the sera of patients with multiple sclerosis // Med. Sci. Monit. — 2005. — V. 11, N8. — P. 266–272. 23. Herrington C. S., McGee J. O. D. Diagnostic Molecular Pathology. — Oxford.: IRL Press, 1992. — 536 p. 24. Старикович М. А., Кит Ю. Я., Хавунка М. Я. и др. Цитотоксическая активность имму� ноглобулинов плазмы крови клинически здоровых людей и больных рассеянным склерозом // Цитокины и воспаление. — 2006. — Т. 5, №4. — С. 26–31. 25. Nevinsky G. A, Buneva V. N. Catalytic anti� body in healthy humans and patients with autoimmune and viral diseases // J. Cell БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008 46 IMMUNOGLOBULINS OF COLOSTRUM AS NOVEL MOLECULAR MARKERS OF PRECLINICAL DIAGNOSTICS OF AUTOIMMUNE DISORDERS IN PARTURIENT WOMEN Yu. Ya. Kit1, M. O. Starykovych1, R. O. Bilyy1, N. R. Skorohyd1, L. B.Yanyv2, R. S. Stoika1 1Institute of Cell Biology of National Academy of Sciences of Ukraine, Lviv 2Lviv Regional Perinatal Center E/mail: kit@cellbiol.lviv.ua Analysis of antigen specificity, catalytic and cytotoxic activity of colostrum immunoglobu� lins was carried out in order to detect novel mole� cular markers of autoimmune disorders. Immunoglobulins were isolated from parturient women colostrums by precipitation with 50% ammonium sulfate. It was shown that prepara� tions of immunoglobulins possessed significant� ly different cytotoxic activity towards Jurkat leukemia T�cells, various hydrolyzing ability towards plasmid DNA and histone H1, and also differed by content of auto�antibodies to double� stranded DNA and histones. We concluded that functional properties of colostrums immuno� globulins depended on individual peculiarities of parturient women humoral immunity. These properties can be used for complex detection of early autoimmune disorders linked with preg� nancy and delivery. Key words: colostrum of healthy women, immunoglo� bulins, cytotoxic activity, catalytic activity, level of auto�AB. ИММУНОГЛОБУЛИНЫ МОЛОЗИВА КАК МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ДОКЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ АУТОИМУННЫХ НАРУШЕНИЙ У РОЖЕНИЦ Ю. Я. Кит1, М. О. Старикович1, Р. О. Билый1, Н. Р. Скорохид1, Л. Б. Янив2, Р. С. Стойка 1 1Институт биологии клетки НАН Украины, Львов 2Львовский областной перинатальный центр E/mail: kit@сellbiol.lviv.ua С целью выявления новых молекулярных маркеров аутоимунных нарушений у рожениц проведен анализ антигенной специфичности, каталитической и цитотоксической активнос� ти иммуноглобулинов, полученных из молози� ва осаждением 50%�м сульфатом аммония. Установлено, что препараты иммуноглобули� нов существенно различаются по цитотокси� ческой активности относительно лейкемичес� ких Т�клеток линии Jurkat, способности гидролизовать плазмидную ДНК и гистон Н1, а также по содержанию ауто�АТ к двухцепоч� ной ДНК и гистонам. Сделан вывод о том, что функциональные свойства иммуноглобулинов молозива зависят от индивидуальных особен� ностей состояния гуморального иммунитета рожениц. Эти свойства могут быть использова� ны для комплексного определения ранних ау� тоиммунных нарушений у женщин, связан� ных с беременностью и родами. Ключевые слова: молозиво здоровых рожениц, им� муноглобулины, цитотоксическая активность, ка� талитическая активность, уровень ауто�АТ.

Імуноглобуліни молозива як молекулярні маркери доклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль

Репозитарії

Схожі ресурси