Одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV

Розроблено високоефективну технологію одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу бичачої лейкемії з підтвердженими методом імуноферментного аналізу (ІФА) антигенними властивостями. У процесі досліджень відібрано найкращий штамм-реципієнт E. coli BL21(DE3) CodonPlus-RIL для інтродукції реком...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2008
Автори:	Коновалова, А.М., Кобозєв, Ю.А., Грабченко, Н.І., Ганова, Л.О.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України 2008
Теми:	Експериментальні статті
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/4063
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV / А. М. Коновалова, Ю. А. Кобозєв, Н. І. Грабченко, Л. О. Ганова // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 1. — С. 100-105. — Бібліогр.: 5 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-4063
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-40632013-02-13T02:11:43Z Одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV Коновалова, А.М. Кобозєв, Ю.А. Грабченко, Н.І. Ганова, Л.О. Експериментальні статті Розроблено високоефективну технологію одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу бичачої лейкемії з підтвердженими методом імуноферментного аналізу (ІФА) антигенними властивостями. У процесі досліджень відібрано найкращий штамм-реципієнт E. coli BL21(DE3) CodonPlus-RIL для інтродукції рекомбінантної плазміди, оптимізовано склад живильного середовища для культивування продуцента. Розроблено методику проведення металохелатафінного хроматографічного очищення та рефолдингу рекомбінантного білка. Як критерій для оцінки ефективності кожного етапу застосовували ІФА, за допомогою якого контролювали антигенні характеристики рекомбінантного білка. Встановлено, що вид штамму-продуцента та склад живильного середовища впливають на продуктивність і розподіл рекомбінантного білка у клітині між цитоплазматичною та нерозчинною фракціями. Розроблена технологія дає змогу одержувати препарати білка зі ступенем чистоти 98% та поліпшеними антигенними властивостями, що дозволяє використовувати його для підвищення специфічності та чутливості імуноферментних діагностичних тестсистем для виявлення збудника бичачої лейкемії. Разработана высокоэффективная технология получения рекомбинантного аналога белка р24 вируса бычьей лейкемии с подтвержденными методом иммуноферментного анализа (ИФА) антигенными свойствами. В процессе исследований выбран наилучший штамм-реципиент E. coli BL21(DE3) CodonPlus-RIL для интродукции рекомбинантной плазмиды и оптимизирован состав питательной среды. Разработана методика проведения металлохелатаффинной хроматографической очистки и рефолдинга рекомбинантного белка. В качестве критерия эффективности каждого этапа использовали ИФА, с помощью которого контролировали антигенные характеристики рекомбинантного белка. Установлено, что вид штамма-продуцента и состав питательной среды влияют на продуктивность и распределение рекомбинантного белка между цитоплазматической и нерастворимой фракциями в клетке. Разработанная технология дает возможность получать препараты белка со степенью чистоты 98% и улучшенными антигенными свойствами, что позволяет использовать его для увеличения специфичности и чувствительности иммуноферментных диагностических тест-систем для выявления возбудителя бычьей лейкемии. Highly effective technology for production of recombinant analogue of p24 protein of bovine leukemia virus with proven antigenic properties using immune-oenzyme was developed. During investigation the best strain E. coli BL21(DE3) CodonPlus-RIL for introduction of recombinant plasmid was chosen, the composition of growth media was optimized. The procedure of metal-helateaffinity chromatography and refolding of recombinant protein was developed. The results of immunoenzyme were used as criteria of quality of recombinant protein on each stage of the work. The influence of bacterial host strains and growth media composition on the yield and distribution of recombinant protein between soluble form in cytoplasm and insoluble inclusion bodies was shown. Using this technology it is possible to obtain recombinant protein with 98% purity and improved antigenic properties. This protein can be used to increase specificity and sensitivity of BLV-diagnostic test kits based on results of immunoenzyme. 2008 Article Одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV / А. М. Коновалова, Ю. А. Кобозєв, Н. І. Грабченко, Л. О. Ганова // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 1. — С. 100-105. — Бібліогр.: 5 назв. — укр. http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/4063 616.36:578.891 uk Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Ukrainian
topic	Експериментальні статті Експериментальні статті
spellingShingle	Експериментальні статті Експериментальні статті Коновалова, А.М. Кобозєв, Ю.А. Грабченко, Н.І. Ганова, Л.О. Одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV
description	Розроблено високоефективну технологію одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу бичачої лейкемії з підтвердженими методом імуноферментного аналізу (ІФА) антигенними властивостями. У процесі досліджень відібрано найкращий штамм-реципієнт E. coli BL21(DE3) CodonPlus-RIL для інтродукції рекомбінантної плазміди, оптимізовано склад живильного середовища для культивування продуцента. Розроблено методику проведення металохелатафінного хроматографічного очищення та рефолдингу рекомбінантного білка. Як критерій для оцінки ефективності кожного етапу застосовували ІФА, за допомогою якого контролювали антигенні характеристики рекомбінантного білка. Встановлено, що вид штамму-продуцента та склад живильного середовища впливають на продуктивність і розподіл рекомбінантного білка у клітині між цитоплазматичною та нерозчинною фракціями. Розроблена технологія дає змогу одержувати препарати білка зі ступенем чистоти 98% та поліпшеними антигенними властивостями, що дозволяє використовувати його для підвищення специфічності та чутливості імуноферментних діагностичних тестсистем для виявлення збудника бичачої лейкемії.
format	Article
author	Коновалова, А.М. Кобозєв, Ю.А. Грабченко, Н.І. Ганова, Л.О.
author_facet	Коновалова, А.М. Кобозєв, Ю.А. Грабченко, Н.І. Ганова, Л.О.
author_sort	Коновалова, А.М.
title	Одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV
title_short	Одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV
title_full	Одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV
title_fullStr	Одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV
title_full_unstemmed	Одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV
title_sort	одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу blv
publisher	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
publishDate	2008
topic_facet	Експериментальні статті
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/4063
citation_txt	Одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV / А. М. Коновалова, Ю. А. Кобозєв, Н. І. Грабченко, Л. О. Ганова // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 1. — С. 100-105. — Бібліогр.: 5 назв. — укр.
work_keys_str_mv	AT konovalovaam oderžannârekombínantnogoanalogabílkar24vírusublv AT kobozêvûa oderžannârekombínantnogoanalogabílkar24vírusublv AT grabčenkoní oderžannârekombínantnogoanalogabílkar24vírusublv AT ganovalo oderžannârekombínantnogoanalogabílkar24vírusublv
first_indexed	2025-07-02T07:18:21Z
last_indexed	2025-07-02T07:18:21Z
_version_	1836518685910499328
fulltext	Однією з актуальних проблем тваринни< цтва є лейкоз великої рогатої худоби (ВРХ), етіологічним агентом якого є онкоретрові< рус бичачої лейкемії (bovine leukemia virus — BLV) [1]. Вчасне виявлення збудника бича< чої лейкемії BLV має вирішальне значення для запобігання поширенню цього захворю< вання, особливо в умовах утримання тварин у великих тваринницьких господарствах. Імуноферментний аналіз (ІФА) вирізняєть< ся з<поміж інших серологічних методів ви< сокою специфічністю, ефективністю, прос< тотою та легкістю поставлення. Останнім часом у діагностичних тест<сис< темах широко використовують рекомбінант< ні аналоги антигенів збудників, синтезова< них у клітинах Escheriсhia coli, оскільки для одержання нативного вірусного білка по< трібно розмножити вірус у культурі клітин, що є дуже дорогим і громіздким методом, а в разі з патогенами людини — ще й потен< ційно небезпечним [2]. Коровий (серцевин< ний) білок BLV р24 є одним із найбільш іму< ногенних, тому його часто використовують як антиген в ІФА<тест<системах для вияв< лення збудника BLV<інфекції [3]. Метою даної роботи було дослідження впливу умов біосинтезу рекомбінантного аналога білка р24 BLV у різних штамах E.coli на його антигенні характеристики. Матеріали і методи Бактеріальні штами та плазміди. У роботі було використано такі штами<реципієнти з му< зейної колекції штамів НВК «Діапроф<Мед»: Escherichia coli BL21(DE3) [E. coli B F–ompT HsdSB(rB–mB–) gal dcm λ (DE3)], E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL [E. coli B F–ompT HsdSB(rB–mB–) gal dcm λ (DE3) endA Hte [argU ileY leuW Camr]], E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RP [E. coli B F–ompT HsdSB(rB–mB–) gal dcm λ (DE3) endA Hte [argU proL Camr]], E. coli BL21 AI [E. coli B F–ompT HsdSB(rB–mB–) gal dcm ara B:T7 RNAP$tet A]. Одержання компетентних клітин та їх трансформацію здійснювали за стандарт< ною схемою з використанням 0,1М CaCl2 [4]. Для трансформації застосовували рекомбі< нантну плазміду, створену на основі експре< сійного вектора рЕТ24а шляхом клонуван< ня фрагмента гена gag, який кодує білок р24 BLV. Експресія рекомбінатного білка конт< ролюється промотором бактеріофага Т7. Як генетичний маркер плазміда містить ген стійкості до канаміцину. БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №1, 2008 100 Розроблено високоефективну технологію одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу бичачої лей< кемії з підтвердженими методом імуноферментного аналізу (ІФА) антигенними властивостями. У процесі дослі< джень відібрано найкращий штам<реципієнт E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL для інтродукції рекомбінантної плазміди, оптимізовано склад живильного середовища для культивування продуцента. Розроблено методику проведення металохелатафінного хроматографічного очищення та рефолдингу рекомбінантного білка. Як кри< терій для оцінки ефективності кожного етапу застосовували ІФА, за допомогою якого контролювали антигенні характеристики рекомбінантного білка. Встановлено, що вид штаму<продуцента та склад живильного середови< ща впливають на продуктивність і розподіл рекомбінантного білка у клітині між цитоплазматичною та нероз< чинною фракціями. Розроблена технологія дає змогу одержувати препарати білка зі ступенем чистоти 98% та поліпшеними антигенними властивостями, що дозволяє використовувати його для підвищення специфічності та чутливості імуноферментних діагностичних тест<систем для виявлення збудника бичачої лейкемії. УДК 616.36:578.891 ОДЕРЖАННЯ РЕКОМБІНАНТНОГО АНАЛОГАОДЕРЖАННЯ РЕКОМБІНАНТНОГО АНАЛОГА БІЛКА р24 ВІРУСУ BLVБІЛКА р24 ВІРУСУ BLV Ключові слова: вірус бичачої лейкемії, білок р24, Escheriсhia coli BL21(DE3), металохелатафінна хро< матографія, рефолдинг, імуноферментний аналіз. А. М. Коновалова Ю. О. Кобозєв АТЗТ Науково<виробнича компанія «Діапроф<Мед», Київ Н. І. Грабченко E$mail: kon_anna@ukr.net Л. О. Ганова Трансформовані плазмідним вектором культури висівали на чашки Петрі з агари< зованим (1,5%) середовищем LB, що місти< ло в кінцевій концентрації 25 мкг/мл кана< міцину, а в разі використання реципієнтів E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL та E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RP — 17 мкг/мл хло< рамфеніколу. Умови культивування. Для вирощуван< ня штамів<продуцентів використовували стандартні середовища LB, TB, 2YT [4] та M4 (сольова основа М9 [4] з додаванням глюкози до кінцевої концентрації 0,5%, ка< замінові кислоти до кінцевої концентрації 1%). В усі середовища додавали канаміцин у кінцевій концентрації 50 мкг/мл та хло< рамфенікол («КиївМедПрепарат», Україна; для штамів E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL та E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RP) — у кін< цевій концентрації 34 мкг/мл. Культури ви< рощували на шутель<апараті за умов інтен< сивного перемішування (180 об/хв) при температурі 37 0С, контролюючи значення оптичної густини культури за допомогою спектрофотометра марки DR5000 (Lange, Німеччина). Для запуску механізму біосин< тезу рекомбінантного білка в середовище вносили індуктор IPTG (ізопропіл<β<D<1<тіо< галактопіранозид) до кінцевої концентрації 1мМ при оптичній густині ОГ600 0,3 од. З ме< тою індукування експресії цільового білка у штамі E. coli BL21 AI окрім IPTG додавали арабінозу до кінцевої концентрації 0,2%. Ферментацію проводили за тих самих умов упродовж 3,5 год для накопичення цільово< го рекомбінантного білка в бактеріальних клітинах. Лізис біомаси. Після завершення фермен< тації одержану біомасу осаджували центри< фугуванням (10 000g, 15хв) та заморожували при –70 0С. Розморожену в умовах кімнат< ної температури біомасу ресуспендували в бу< фері для лізису (трис<цитрат 50 мМ, Na2< EDTA 1 мМ, фенілметилсульфонілфлуорид 1 мМ, тритон Х<100 0,1%) на гомогенізаторі Polytron PT 3 000 (Kinematica AG, Швей< царія) та обробляли ультразвуком за допо< могою дезінтегратора УЗДН<А (SELMI, Ук< раїна) серією із 6 імпульсів по 10 с. Вносили до суспензії лізоцим до кінцевої концентрації 0,2 мкг/мл та інкубували 1,5 год при 37 0С. Для гідролізу хромосомної ДНК додавали до суспензії розчин ДНК<ази<І до кінцевої кон< центрації 6 од/мл та розчин MgSO4 до кінце< вої концентрації 1мМ. Інкубували 1 год при 37 0С. Фракцію розчинних білків відокрем< лювали центрифугуванням (10 000g, 25 хв) від нерозчинної фракції, що містила тільця включення, які розчиняли в буфері із сечо< виною (трис<HCl, рН 8,0 — 20 мМ, NaCl — 0,5 М, імідазол — 20 мМ, 2<меркаптоета< нол — 1 мМ, сечовина — 8 М). Сумарний де< натурований білок одержували шляхом додавання сечовини до первинного лізату (що містить тільця включення) до кінцевої концентрації 8 М. Визначення концентрації білка (С) про< водили біуретовим методом. Для цього до 1,9 мл 0,1 н NaOH додавали 100 мкл зразка та 100 мкл фарби Бенедикта. Інкубували 15 хв та заміряли оптичну густину при дов< жині хвилі 330 нм (ОД330). Концентрацію білка розраховували за формулою С = (ОД330 – – 0,0043)/0,087 [мг/мл]. Електрофорез здійснювали методом Лем< млі у 15%<му поліакріламідному гелі в де< натурувальних умовах з додаванням 0,1% SDS з наступним забарвленням гелю в роз< чині Кумасі R<250 [5]. Обрахунок електро< фореграм виконували за допомогою програ< ми GelScan 5.1. Імуноферментний аналіз (ІФА). При поставленні ІФА рекомбінантний білок сор< бували в лунках планшета PolySorp (Nunc, Данія) в концентрації 1 мкг/мл у 100 мкл розчину, що містив 0,5М карбонатно<бікар< бонатний буфер, рН 9,2, та інкубували протягом ночі при 37 0С. Як контроль вико< ристовували рекомбінантний аналог р24, синтезований у штамі BL21(DE3), який не піддавали рефолдингу. Після відмивання та блокування вільної поверхні вносили розве< дені 1:10 сироватки стандартної панелі по< зитивних (15) та негативних (14) сироваток крові ВРХ АТЗТ («НВК Діапроф<Мед», Ук< раїна). Інкубація тривала 1 год при 37 0С. Вміст лунок видаляли, промивали, вносили в них по 100 мкл моноклональних антитіл до IgG ВРХ, кон’югованих з пероксидазою хрону, та інкубували протягом 30 хв при 37 0С. Після відмивання незв’язаних компо< нентів у лунки додавали розчин проявника — субстрату пероксидази (пероксид водню) і хромогену (3,3′<, 5,5′<тетраметилбензи< дин) та інкубували при кімнатній температу< рі в темряві упродовж 30 хв. Кольорову ре< акцію зупиняли за допомогою стоп<реагента (0,5 М H2SO4). Оптичну густину в лунках визначали у двохвильовому режимі (450 нм проти 620 нм). Критерієм якості рекомбі< нантного білка був показник співвідношен< ня середніх значень оптичної густини пози< тивних та негативних сироваток Хроматографічне очищення рекомбіна6 нтного білка. Металохелатафінну хромато< графію проводили на хроматографічній + / .– ср срОГ ОГ Експериментальні статті 101 системі BioRad BioLogic LP. Як сорбент ви< користовували IDA (iminodiacetic acid)< Toyopearl з іммобілізованими іонами Ni2+. Білок наносили на колонку з розрахунку 5 мг білка на 1 мл сорбенту зі швидкістю по< току буфера 0,5 мл/хв. У процесі хромато< графії застосовували: для розчинної фракції білків — буфер для лізису клітин; для очи< щення екстракту тілець включення — буфер, в якому розчиняли тільця включення; для сумарного денатурованого білка — буфер для лізису клітин з 8 М сечовиною. Елюцію білка, який зв’язався із сорбентом, проводи< ли ступінчастим градієнтом імідазолу з ви< користанням відповідних буферів. Вміст білка в одержаних фракціях контролювали електрофоретичним аналізом. Рефолдинг денатурованого білка здійс< нювали методом розведення: препарат очи< щеного білка додавали до ренатураційного буфера у співвідношенні об’ємів 1:9 (склад буферів наведено в табл. 1). Розчин струшу< вали на шейкері протягом 60 хв, після чого видаляли центрифугуванням (10 000g, 15 хв) агрегати нерозчиненого білка. Результати та обговорення Для трансформації штамів<реципієнтів E. coli використовували рекомбінантну плаз< міду рЕТ24а, що містить вставку гена, яка кодує білок р24 BLV; транскрипція його контролюється промотором бактеріофага Т7. Ця генетична конструкція забезпечує суперсинтез рекомбінантних білків. Для експресії клонованих генів у таких векторах застосовують кілька штамів<реципієнтів E. coli, які за своїм призначенням можна роз< ділити на три групи: 1) для загального при< значення — E. coli BL21(DE3); 2) для експресії рекомбінантних генів, що містять рідкісні кодони, — E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL, E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RP та ін.; 3) для більш жорсткої регуляції експресії токсич< них білків — E. coli BL21 AI, E. coli BL21 (DE3) pLysS. З метою визначення опти< мального штаму<реципієнта нами було проведено трансформацію рекомбінантною плазмідою рЕТ24а<р24BLV клітин чотирьох штамів: E. coli BL21(DE3), E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL, E. coli BL21(DE3) Codon< Plus<RP, E. coli BL21 AI, які представляють кожну із цих груп. Як свідчать дані електрофоретичного аналізу (рис. 1), в усіх досліджуваних ліза< тах спостерігається індукований біосинтез поліпептиду очікуваної молекулярної маси (~25кДа). За результатами комп’ютерного обрахунку електрофореграм не було виявле< но істотних відмінностей між клонами за рівнем біосинтезу цільового білка, який варіював від 26 до 31%. Переважна частина рекомбінантного білка р24 синтезується в розчинній формі (90–93%). Для використаної в роботі рекомбінантної плазміди рЕТ24а<р24BLV зміна штаму<ре< ципієнта мала значний вплив на антигенні властивості білка, які оцінювали за показ< ником в ІФА. Як штам<реципієнт відібрали E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL з найвищими показниками — 8,3. Штам<продуцент, названий E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL<p24, було висіяно на рідкі живильні середовища LB, ТВ, М4 та 2YT (попередньо посівні дози було стандартизо< вано за оптичною густиною). Найбільший вихід біомаси було одержа< но в разі культивування продуцента на сере< довищі ТВ. Це можна пояснити збагаченим складом середовища та наявністю в ньому буферної системи, що запобігає зниженню рН у процесі культивування і таким чином попереджає інгібування росту бактерій кис< лими продуктами метаболізму. З біомаси, отриманої при культивуванні на кожному із середовищ, було одержано дві фракції — тільця включення та розчинні білки цито< плазми. Вихід білка в обох фракціях, від< носний вміст його у тільцях включення та розчинній фракції, а також результати ІФА подано на рис. 2. Як свідчать наведені дані, тип живиль< ного середовища впливає як на кількісний /+ – ср срОГ ОГ /+ – ср срОГ ОГ БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №1, 2008 102 25 кДа Рис. 1. Електрофореграма розподілу рекомбінантного білка р24 за фракціями для різних штамів6реципієнтів E. сoli: БМ — лізат біомаси; ЕТВ — екстракт тілець включення; Розч — розчинна фракція; BL — E. coli BL21(DE3); RIL — E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL; RP — E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RP; AI — E. coli BL21(DE3) AI вихід цільового продукту, так і на розподіл його між фракціями, а також і на його анти< генні характеристики. Згідно з даними ІФА, найвищий показник має білок, одержаний зі штаму E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL<р24, вирощеного на середо< вищі ТВ. Нуклеотидна послідовность гена<встав< ки, який кодує білок р24, містить кодони, що рідко трапляються в геномі Е. coli, але є більш поширеними в геномах вищих ви< дів, зокрема людини, та вірусів, що персис< тують у цих видах. Штами E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL та E. coli BL21(DE3) CodonPlus< RP мають екстракопії генів тРНК, що відповідають рідкісним кодонам. Штам E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL містить тРНК для більшої кількості рідкісних ко< донів, присутніх у клонованій вставці ДНК, що, очевидно, й зумовлює вищу антигенну якість білка, синтезованого з рекомбінант< ної матриці в цьому штамі. Для максимально ефективного відокрем< лення цільового поліпептиду від клітинних білків E. coli було оптимізовано методику /+ – ср срОГ ОГ очищення рекомбінантного білка р24 шляхом підбору оптимальних концентрацій імідазо< лу для елюції з колонки. Із цією метою вико< ристовували проміжну елюцію сорбованого білка буферними розчинами, що містили 20, 40, 50 та 70 мМ імідазолу. Оптимальною бу< ло визнано схему очищення із нанесенням білкового екстракту на колонку в буфері з 40 мМ імідазолу та елюцією цільового білка буфером, що містив 100 мМ імідазолу. За цією схемою було одержано препарат рекомбінант< ного білка р24 зі ступенем чистоти 98%. Для поліпшення антигенних характе< ристик очищеного рекомбінантного білка виконували процедуру рефолдингу з викорис< танням ренатураційних буферних розчинів, рекомендованих для рефолдингу рекомбі< нантних білків виробниками спеціалізо< ваних наборів для рефолдингу Protein Refolding Kits (Hampton Research, USA, www.Hamptonresearch.com) та Athenaes (USA, www.Athenaes.com) з певними мо< дифікаціями (табл.1). Після проведення попереднього скринін< гу ренатураційних буферів різного складу за результатами ІФА найвищий показник Експериментальні статті 103 Таблиця 1. Склад буферів, використаних для рефолдингу рекомбінантного аналога білка р24 Номер буфера MES, pH 6,5, мМ Tris< HCL, pH 8,21, мМ NaCl, мМ KCl, мМ MgCl2, мМ CaCl2, мМ Gua< nidin HCl, М Triton X<100, % DDT, мМ PEG, % GSH, мМ GSSH, мМ Саха< роза, М ЕДТА, мМ 1 55 10,56 0,44 2,2 2,2 0,75 0,5 1 2 55 10,56 0,44 0,75 0,5 1 0,055 1,1 3 55 264 11 0,75 1 0,44 1,1 4 55 264 11 2,2 2,2 0,75 1 0,055 5 55 10,56 0,44 2,2 2,2 0,5 0,055 1 0,1 0,44 6 55 10,56 0,44 0,5 1 1,1 7 55 264 11 0,055 1 0,1 1,1 8 55 10,56 0,44 2,2 2,2 0,75 1 0,1 0,44 9 55 264 11 0,055 1,1 10 55 10,56 0,44 0,44 1,1 11 55 10,56 0,44 2,2 2,2 0,5 0,055 12 55 264 11 2,2 2,2 0,75 0,055 1 0,1 0,44 13 55 10,56 0,44 2,2 2,2 0,55 14 55 10,56 0,44 0,55 1 0,055 0,44 1,1 15 55 10,56 0,44 0,55 0,055 0,44 1,1 16 55 264 11 0,55 1,1 17 55 264 11 0,75 1 1,1 18 55 264 11 2,2 2,2 0,75 1 0,055 1 0,1 Примітка. Сірим кольором виділено буфери, білок після рефолдингу в яких мав найвищі значення за результатами ІФА./+ – ср срОГ ОГ спостерігався у білка після рефолдингу в буфері №8 (табл. 2). Цей резуль< тат можна пояснити тим, що підібраний склад компонентів буфера для рефолдингу до< зволяє більшому відсотку молекул очищеного білка перейти у відповідний конформацій< ний стан, коли антигенні детермінанти моле< кули стають доступнішими для зв’язування специфічних антитіл порівняно з референс< ним білком р24. Таким чином, у результаті проведених досліджень нами розроблено ефективну тех< нологію одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу бичачої лейкемії з поліпше< ними антигенними властивостями, викори< /+ – ср срОГ ОГ стання якого може сприяти підвищенню специфічності та чутливості сучасних іму< ноферментних діагностичних тест<систем для виявлення збудника цього захворювання. БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №1, 2008 104 Рис. 2. Залежність рівня біосинтезу рекомбінантного аналога білка р24 у клітинах штаму E. coli BL21(DE3) CodonPlus6RIL від типу живильного середовища: — співвідношення середніх значень оптичної густини позитивних та негативних сироваток за ІФА/+ – ср срОГ ОГ Таблиця 2. Результати ІФА після проведення рефолдингу рекомбінантного білка р24 Номер буфера 4 7 8 17 18 Ref Сиро< ватки + – + – + – + – + – + – ОГср 0,585 0,037 0,544 0,035 0,655 0,039 0,67 0,048 0,570 0,036 0,398 0,033 15,8 15,5 16,7 14,0 16,0 12,0 + ср – ср ОГ ОГ Примітка: «+» — позитивні сироватки; «–» — негативні сироватки; ОГср — середнє значення оптичної густини; — співвідношення середніх значень оптичної густини позитивних та негативних сироваток; Ref — рекомбінантний білок р24, який використовується у тест<системі DIA<BLV<Ab. /+ – ср срОГ ОГ ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНАЛОГА БЕЛКА Р24 ВИРУСА BLV А. Н. Коновалова Ю. А. Кобозев Н. И. Грабченко Л. А. Ганова АТЗТ Научно$производственная компания «Диапроф$Мед», Киев Е$mail: kon_anna@ukr.net Разработана высокоэффективная техноло< гия получения рекомбинантного аналога белка р24 вируса бычьей лейкемии с подтвержден< ными методом иммуноферментного анализа (ИФА) антигенными свойствами. В процессе исследо< ваний выбран наилучший штамм<реципиент E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL для интродук< ции рекомбинантной плазмиды и оптимизиро< ван состав питательной среды. Разработана методика проведения металлохелатаффинной хроматографической очистки и рефолдинга рекомбинантного белка. В качестве критерия эффективности каждого этапа использовали ИФА, с помощью которого контролировали анти< генные характеристики рекомбинантного белка. Установлено, что вид штамма<продуцента и состав питательной среды влияют на продуктивность и распределение рекомбинантного белка между цитоплазматической и нерастворимой фракция< ми в клетке. Разработанная технология дает воз< можность получать препараты белка со степенью чистоты 98% и улучшенными антигенными свой< ствами, что позволяет использовать его для увели< чения специфичности и чувствительности имму< ноферментных диагностических тест<систем для выявления возбудителя бычьей лейкемии. Ключевые слова: вирус бычьей лейкемии, бе< лок р24, Escheriсhia coli BL21(DE3), металлохелат< аффинная хроматография, рефолдинг, иммунофер< ментный анализ. SYNTHESIS OF RECOMBINANT ANALOGUE OF P24 PROTEIN OF BLV VIRUS A. M. Konovalova Y. O. Kobozyev N. I. Grabchenko L. O. Ganova JST «Diaproph$Med», Kiyv E$mail: kon_anna@ukr.net Highly effective technology for production of recombinant analogue of p24 protein of bovi< ne leukemia virus with proven antigenic proper< ties using immunoenzyme was developed. During investigation the best strain E. coli BL21(DE3) CodonPlus<RIL for introduction of recombinant plasmid was chosen, the composi< tion of growth media was optimized. The proce< dure of metal<helate<affinity chromatography and refolding of recombinant protein was devel< oped. The results of immunoenzyme were used as criteria of quality of recombinant protein on each stage of the work. The influence of bacteri< al host strains and growth media composition on the yield and distribution of recombinant pro< tein between soluble form in cytoplasm and insoluble inclusion bodies was shown. Using this technology it is possible to obtain recombinant protein with 98% purity and improved antigenic properties. This protein can be used to increase specificity and sensitivity of BLV<diagnostic test kits based on results of immunoenzyme. Key words: bovine leukemia virus, protein p24, Escherichia coli BL21 (DE3), metal<helate affinity chromatography, refolding, enzyme<linked immuno< sorbent assay. Експериментальні статті 105 1. Kabeya H., Ohashi K., Onuma M. Host immune responses in the course of bovine leukemia virus infection // J. Vet. Sci. — 2001. — V. 63. — N. 7. — P. 703–708. 2. Stephenson J., Warnes A. Recombinant antigens in viral diagnostic // Methods in Molecular Medicine. Diagnostic Virology Protocols, Humana Press — 1998. — V. 12. — Р. 315–330. 3. Gonzales E., Bonzo E., Echeverria M et al. Enzootic bovine leucosis: development of an indirect enzyme linked immunosorbent assay (I<ELISA) in seroepidemiologial stud< ies // Revista de Microbiologia. — 1999. — V. 30. — Р. 37–42. 4. Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Мо< лекулярное клонирование. — М.: Мир, 1984. — 476 с. 5. Laemli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterio< phage T4 // Nature. — 1970. — V. 277. — Р. 680–685. ЛІТЕРАТУРА << /ASCII85EncodePages false /AllowTransparency false /AutoPositionEPSFiles true /AutoRotatePages /None /Binding /Left /CalGrayProfile (Dot Gain 20%) /CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2) /sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CannotEmbedFontPolicy /Warning /CompatibilityLevel 1.4 /CompressObjects /Tags /CompressPages true /ConvertImagesToIndexed true /PassThroughJPEGImages true /CreateJDFFile false /CreateJobTicket false /DefaultRenderingIntent /Default /DetectBlends true /ColorConversionStrategy /LeaveColorUnchanged /DoThumbnails false /EmbedAllFonts true /EmbedJobOptions true /DSCReportingLevel 0 /EmitDSCWarnings false /EndPage -1 /ImageMemory 1048576 /LockDistillerParams false /MaxSubsetPct 100 /Optimize true /OPM 1 /ParseDSCComments true /ParseDSCCommentsForDocInfo true /PreserveCopyPage false /PreserveEPSInfo true /PreserveHalftoneInfo false /PreserveOPIComments false /PreserveOverprintSettings true /StartPage 1 /SubsetFonts false /TransferFunctionInfo /Apply /UCRandBGInfo /Preserve /UsePrologue false /ColorSettingsFile () /AlwaysEmbed [ true ] /NeverEmbed [ true ] /AntiAliasColorImages false /DownsampleColorImages true /ColorImageDownsampleType /Bicubic /ColorImageResolution 300 /ColorImageDepth -1 /ColorImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeColorImages false /ColorImageFilter /DCTEncode /AutoFilterColorImages true /ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG /ColorACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /ColorImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000ColorACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000ColorImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasGrayImages false /DownsampleGrayImages true /GrayImageDownsampleType /Bicubic /GrayImageResolution 300 /GrayImageDepth -1 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeGrayImages false /GrayImageFilter /DCTEncode /AutoFilterGrayImages true /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG /GrayACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /GrayImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000GrayACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000GrayImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasMonoImages false /DownsampleMonoImages false /MonoImageDownsampleType /Bicubic /MonoImageResolution 1200 /MonoImageDepth -1 /MonoImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeMonoImages true /MonoImageFilter /CCITTFaxEncode /MonoImageDict << /K -1 >> /AllowPSXObjects false /PDFX1aCheck false /PDFX3Check false /PDFXCompliantPDFOnly false /PDFXNoTrimBoxError true /PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXSetBleedBoxToMediaBox true /PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXOutputIntentProfile (None) /PDFXOutputCondition () /PDFXRegistryName (http://www.color.org) /PDFXTrapped /Unknown /Description << /JPN <FEFF3053306e8a2d5b9a306f30019ad889e350cf5ea6753b50cf3092542b308030d730ea30d730ec30b9537052377528306e00200050004400460020658766f830924f5c62103059308b3068304d306b4f7f75283057307e305930023053306e8a2d5b9a30674f5c62103057305f00200050004400460020658766f8306f0020004100630072006f0062006100740020304a30883073002000520065006100640065007200200035002e003000204ee5964d30678868793a3067304d307e305930023053306e8a2d5b9a306b306f30d530a930f330c8306e57cb30818fbc307f304c5fc59808306730593002> /FRA <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> /DEU <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> /PTB <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> /DAN <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> /NLD <FEFF004700650062007200750069006b002000640065007a006500200069006e007300740065006c006c0069006e00670065006e0020006f006d0020005000440046002d0064006f00630075006d0065006e00740065006e0020007400650020006d0061006b0065006e0020006d00650074002000650065006e00200068006f00670065002000610066006200650065006c00640069006e00670073007200650073006f006c007500740069006500200076006f006f0072002000610066006400720075006b006b0065006e0020006d0065007400200068006f006700650020006b00770061006c0069007400650069007400200069006e002000650065006e002000700072006500700072006500730073002d006f006d0067006500760069006e0067002e0020004400650020005000440046002d0064006f00630075006d0065006e00740065006e0020006b0075006e006e0065006e00200077006f007200640065006e002000670065006f00700065006e00640020006d006500740020004100630072006f00620061007400200065006e002000520065006100640065007200200035002e003000200065006e00200068006f006700650072002e002000420069006a002000640065007a006500200069006e007300740065006c006c0069006e00670020006d006f006500740065006e00200066006f006e007400730020007a0069006a006e00200069006e006700650073006c006f00740065006e002e> /ESP <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> /SUO <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> /ITA <FEFF00550073006100720065002000710075006500730074006500200069006d0070006f007300740061007a0069006f006e00690020007000650072002000630072006500610072006500200064006f00630075006d0065006e00740069002000500044004600200063006f006e00200075006e00610020007200690073006f006c0075007a0069006f006e00650020006d0061006700670069006f00720065002000700065007200200075006e00610020007100750061006c0069007400e00020006400690020007000720065007300740061006d007000610020006d00690067006c0069006f00720065002e0020004900200064006f00630075006d0065006e00740069002000500044004600200070006f00730073006f006e006f0020006500730073006500720065002000610070006500720074006900200063006f006e0020004100630072006f00620061007400200065002000520065006100640065007200200035002e003000200065002000760065007200730069006f006e006900200073007500630063006500730073006900760065002e002000510075006500730074006500200069006d0070006f007300740061007a0069006f006e006900200072006900630068006900650064006f006e006f0020006c002700750073006f00200064006900200066006f006e007400200069006e0063006f00720070006f0072006100740069002e> /NOR <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> /SVE <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> /ENU <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> >> >> setdistillerparams << /HWResolution [2400 2400] /PageSize [612.000 792.000] >> setpagedevice

Одержання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV

Репозитарії

Схожі ресурси