Воспроизводимость результатов криоконсервирования черенков различных сортов семечковых плодовых деревьев
Получены жизнеспособные деконсервированные образцы яблони (Белый налив, Теремок, Радость), груши (Велика літня, Улюблена Клапа, Вдала, Зелена Мліївська). При помощи дисперсионного анализа установлено, что вероятность развития деконсервированных черенков растений зависит от сорта и способа криоконсер...
Збережено в:
| Дата: | 2009 |
|---|---|
| Автор: | |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2009
|
| Назва видання: | Проблемы криобиологии |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/42574 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Воспроизводимость результатов криоконсервирования черенков различных сортов семечковых плодовых деревьев / Л.В. Горбунов // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 4. — С. 473-480. — Бібліогр.: 8 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-42574 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-425742013-03-30T03:07:21Z Воспроизводимость результатов криоконсервирования черенков различных сортов семечковых плодовых деревьев Горбунов, Л.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология Получены жизнеспособные деконсервированные образцы яблони (Белый налив, Теремок, Радость), груши (Велика літня, Улюблена Клапа, Вдала, Зелена Мліївська). При помощи дисперсионного анализа установлено, что вероятность развития деконсервированных черенков растений зависит от сорта и способа криоконсервирования. Средние показатели жизнеспособности для разных сортов яблони отличаются на 32% и груши – на 86%. Максимальные показатели жизнеспособности черенков получены после их температурной адаптации при –10 °С в течение 14–60 суток, ступенчатого охлаждения со скоростью 0,1– 0,5°C/ч до –30 °С (выдержка 3–7 суток) прямого погружения в жидкий азот, хранения в течение от 1 до 30 суток и отогрева со скоростью 70 °C/мин. Одержанi життєздатні деконсервовані зразки яблуні (Белый налив, Теремок, Радость), груші (Велика літня, Улюблена Клапа, Вдала, Зелена Мліївська). За допомогою дисперсійного аналізу виявлено, що вірогідність розвитку деконсервованих живців рослин залежить від сорту і способу кріоконсервування. Середні показники життєздатності різних сортів яблуні відрізняються на 32% і груші – на 86%. Максимальні показники життєздатності живців одержані після їх температурної адаптації при –10 °С протягом 14–60 діб, ступінчастого охолодження зразків із швидкістю 0,1–0,5 °C/год до –30 °С з витримкою 3–7 діб, при наступному прямому зануренні в рідкий азот, зберіганні строком від 1 до 30 діб і відігріванні зі швидкістю 70°C/хв. Viable frozen-thawed samples of apple (Belyy Naliv, Teremok, Radost), pear (Velyka Litnya, Ulyublena Klapa, Vdala, Zelena Mliivska) were obtained. With dispersion analysis it has been established that the development probability of frozen-thawed plant cuttings depends on variety and cryopreservation method. Mean indices of viability for different apple varieties differ by 32% and pear by 86%. Maximal indices of cuttings’ viability are obtained after their temperature adaptation at −10°C during 14÷60 days, stepwise cooling of the samples with 0.1–0.5°C/hr rate down to −30°C (exposure 3–7 days), direct plunging into liquid nitrogen, storage from 1 to 30 days and thawing rate of 70°C/min. 2009 Article Воспроизводимость результатов криоконсервирования черенков различных сортов семечковых плодовых деревьев / Л.В. Горбунов // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 4. — С. 473-480. — Бібліогр.: 8 назв. — рос., англ. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/42574 635.076:57.043 ru Проблемы криобиологии Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Горбунов, Л.В. Воспроизводимость результатов криоконсервирования черенков различных сортов семечковых плодовых деревьев Проблемы криобиологии |
| description |
Получены жизнеспособные деконсервированные образцы яблони (Белый налив, Теремок, Радость), груши (Велика літня, Улюблена Клапа, Вдала, Зелена Мліївська). При помощи дисперсионного анализа установлено, что вероятность развития деконсервированных черенков растений зависит от сорта и способа криоконсервирования. Средние показатели жизнеспособности для разных сортов яблони отличаются на 32% и груши – на 86%. Максимальные показатели жизнеспособности черенков получены после их температурной адаптации при –10 °С в течение 14–60 суток, ступенчатого охлаждения со скоростью 0,1– 0,5°C/ч до –30 °С (выдержка 3–7 суток) прямого погружения в жидкий азот, хранения в течение от 1 до 30 суток и отогрева со скоростью 70 °C/мин. |
| format |
Article |
| author |
Горбунов, Л.В. |
| author_facet |
Горбунов, Л.В. |
| author_sort |
Горбунов, Л.В. |
| title |
Воспроизводимость результатов криоконсервирования черенков различных сортов семечковых плодовых деревьев |
| title_short |
Воспроизводимость результатов криоконсервирования черенков различных сортов семечковых плодовых деревьев |
| title_full |
Воспроизводимость результатов криоконсервирования черенков различных сортов семечковых плодовых деревьев |
| title_fullStr |
Воспроизводимость результатов криоконсервирования черенков различных сортов семечковых плодовых деревьев |
| title_full_unstemmed |
Воспроизводимость результатов криоконсервирования черенков различных сортов семечковых плодовых деревьев |
| title_sort |
воспроизводимость результатов криоконсервирования черенков различных сортов семечковых плодовых деревьев |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2009 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/42574 |
| citation_txt |
Воспроизводимость результатов криоконсервирования черенков различных сортов семечковых плодовых деревьев / Л.В. Горбунов // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 4. — С. 473-480. — Бібліогр.: 8 назв. — рос., англ. |
| series |
Проблемы криобиологии |
| work_keys_str_mv |
AT gorbunovlv vosproizvodimostʹrezulʹtatovkriokonservirovaniâčerenkovrazličnyhsortovsemečkovyhplodovyhderevʹev |
| first_indexed |
2025-07-04T00:54:12Z |
| last_indexed |
2025-07-04T00:54:12Z |
| _version_ |
1836675710557618176 |
| fulltext |
473 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 19, 2009, №4
УДК 635.076:57.043
Л.В. ГОРБУНОВ
Воспроизводимость результатов криоконсервирования черенков
различных сортов семечковых плодовых деревьев
UDC 635.076:57.043
L.V. GORBUNOV
Reproducibility of Results for Cryopreservation
of Different Variety Cuttings of Pomefruit Trees
Получены жизнеспособные деконсервированные образцы яблони (Белый налив, Теремок, Радость), груши (Велика літня,
Улюблена Клапа, Вдала, Зелена Мліївська). При помощи дисперсионного анализа установлено, что вероятность развития
деконсервированных черенков растений зависит от сорта и способа криоконсервирования. Средние показатели жизнеспособности
для разных сортов яблони отличаются на 32% и груши – на 86%. Максимальные показатели жизнеспособности черенков
получены после их температурной адаптации при –10 °С в течение 14–60 суток, ступенчатого охлаждения со скоростью 0,1–
0,5°C/ч до –30 °С (выдержка 3–7 суток) прямого погружения в жидкий азот, хранения в течение от 1 до 30 суток и отогрева
со скоростью 70 °C/мин.
Ключевые слова: черенки яблони и груши, криоконсервирование, жизнеспособность, эффективность, скорости охлаждения
и отогрева.
Одержанi життєздатні деконсервовані зразки яблуні (Белый налив, Теремок, Радость), груші (Велика літня, Улюблена
Клапа, Вдала, Зелена Мліївська). За допомогою дисперсійного аналізу виявлено, що вірогідність розвитку деконсервованих
живців рослин залежить від сорту і способу кріоконсервування. Середні показники життєздатності різних сортів яблуні
відрізняються на 32% і груші – на 86%. Максимальні показники життєздатності живців одержані після їх температурної
адаптації при –10 °С протягом 14–60 діб, ступінчастого охолодження зразків із швидкістю 0,1–0,5 °C/год до –30 °С з витрим-
кою 3–7 діб, при наступному прямому зануренні в рідкий азот, зберіганні строком від 1 до 30 діб і відігріванні зі швидкістю
70°C/хв.
Ключові слова: живці яблуні і груші, кріоконсервування, життєздатність, ефективність, швидкості охолодження і
відігрівання.
Viable frozen-thawed samples of apple (Belyy Naliv, Teremok, Radost), pear (Velyka Litnya, Ulyublena Klapa, Vdala, Zelena
Mliivska) were obtained. With dispersion analysis it has been established that the development probability of frozen-thawed plant
cuttings depends on variety and cryopreservation method. Mean indices of viability for different apple varieties differ by 32% and
pear by 86%. Maximal indices of cuttings’ viability are obtained after their temperature adaptation at −10°C during 14÷60 days,
stepwise cooling of the samples with 0.1–0.5°C/hr rate down to −30°C (exposure 3–7 days), direct plunging into liquid nitrogen,
storage from 1 to 30 days and thawing rate of 70°C/min.
Key-words: apple and pear cuttings, cryopreservation, viability, efficiency, cooling and thawing rates.
.
Для обеспечения жизнеспособности деконсер-
вированных черенков яблони на уровне 20–30% их
предварительно высушивают до 30% влажности с
последующим охлаждением со скоростью 1°C/ч до
–30°С [6, 8]. Однако данный способ криоконсер-
вирования черенков яблони сорта Белый налив не
позволил получить жизнеспособные образцы [2].
Вероятно, что для криоконсервирования каждого
сортотипа культурных растений необходимо подби-
рать соответствующие условия: влажность образ-
цов; режим замораживания, имеющий оптималь-
ную скорость и конечную температуру охлажде-
ния; время их выдержки перед погружением в
жидкий азот; способ отогрева.
Повышение уровня жизнеспособности декон-
сервированного объекта – один из аспектов реше-
To provide viability of frozen-thawed apple cuttings
at the level of 20–30% they were previously dried-up
to 30% humidity with further cooling rate of 1°C/hr
down to −30°C [6, 8]. However this cryopreservation
method of Belyy Naliv apple cuttings did not enable
the obtaining of viable samples [2]. It is likely that for
cryopreservation of each plant variety it is necessary
to select the corresponding protocols such as: samp-
les’ humidity, freezing regimen with optimal rate and
final temperature of cooling, their exposure term prior
to plunging into liquid nitrogen, thawing method.
The increase of frozen-thawed object viability
level is one of the aspects of solving the problem of
reproducing the experimental results, based on
optimization of variety of interrelated biological and
physical and chemical parameters. High variation of
* Адрес для корреспонденции: п/в Кулиничи, Харьковский
район, Харьковская область, Украина, 62404; тел.: (+38057) 740-
31-66, электронная почта: lab_cryo@ukr.net
* Address for correspondence: PO Kulinichi, Kharkov region,
Ukraine 61480; tel.: +380 57 740 3166; e-mail: lab_cryo@ukr.net
Институт животноводства УААН, г. Харьков Institute of Animal Breeding of Ukrainian Academy of Agricul-
tural Sciences, Kharkov, Ukraine
474 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 19, 2009, №4
ния задачи воспроизводимости результатов экспе-
римента основанного на оптимизации множества
взаимосвязанных биологических и физико-хими-
ческих параметров. Высокая вариация параметров,
влияющих на сохранность деконсервированного
объекта, является основной причиной низкого
уровня воспроизводимости результатов экспери-
мента. Коэффициент вариации жизнеспособности
деконсервированных черенков растений достигает
100%. Следовательно, для получения достоверных
результатов необходимо неоднократное повторение
опытов, что требует большого расхода биологи-
ческого материала [4].
Для проведения полного факторного криобиоло-
гического эксперимента необходимо несколько
десятков тысяч проб N = n×hg [5], поскольку коли-
чество проб (черенков) в одном опыте составляет
n ≥ 30, исследуемых факторов – h ≥ 4 при уровне
их градации g ≥ 5. Последовательное оптимизиро-
вание технологических параметров на каждом этапе
криоконсервирования биообъекта дает возможность
уменьшить их число. Выявление значимых факто-
ров на основе дисперсионного или регрессионного
анализа уменьшает их число до h = 3 ± 2 [4, 5].
Количество градаций при градиентном поиске
оптимальных значений исследуемых факторов сок-
ращается до g = 3 ± 1 [4, 5]. Многократное умень-
шение количества проб (n < 30) осуществляется за
счет учета индивидуальных свойств биообъекта и
повышения эффективности его использования в
процессе исследования.
Повышение воспроизводимости результатов
сохранности черенков растений связано с необходи-
мостью исследования свойств биообъекта, обус-
ловленных его видом и сортом. Следовательно, изу-
чение закономерностей воспроизводимости резуль-
татов криоконсервирования меристимальных кле-
ток является актуальной задачей, решение которой
создает условия для проведения многофакторного
исследования при небольшом количестве повторов
опыта, что позволяет научно обосновывать новые
подходы к созданию эффективных способов крио-
консервирования. Поэтому для сохранения генофон-
да клеток растений необходимо изучить воспроизво-
димость результатов криоконсервирования черенков
различных сортотипов и определить оптимальные
значения варьируемых параметров, обеспечиваю-
щих максимальную жизнеспособность деконсерви-
рованных образцов.
Цель работы – исследовать влияние вида и сор-
та плодовых культур (яблони и груши) на воспроиз-
водимость результатов, полученных на различных
этапах криоконсервирования черенков.
Материалы и методы
Объектом исследования были черенки яблони
(Malus domestica L.): Белый налив, Амулет, Эдэра,
the parameters, affecting an integrity of frozen-tha-
wed object is basic cause of low level reproducibility
of experimental results. Coefficient of viability varia-
tion of frozen-thawed plant cuttings achieves 100%.
Therefore for obtaining the significant results the
multiple replication of experiments is necessary, that
causes a high expenditure of a biological material [4].
To perform a complete factor cryobiological expe-
riment some dozens of samples’ thousands N = n×hg
[5] are needed, whereas the number of samples (cut-
tings) in one experiment makes n ≥ 30, the one of the
studied factors is h ≥ 4 and at their gradation level of
g ≥ 5. Serial optimization of the technological para-
meters at each stage of bioobject cryopreservation
allows the reduction of their number. Exposure of
significant factors based on dispersion and regression
analysis reduces their number down to h = 3 ± 2 [4,5].
Gradation number at gradient search of the optimal
values for the studied factors is reduced down to
g = 3 ± 1 [4,5]. Multiple decrease of the samples’
number (n < 30) is implemented due to taking into
account of individual properties of bioobject and inc-
rease of its application efficiency during the research.
Increase of the results’ reproducibility of integrity
of plant cuttings is associated with the need of stu-
dying the bioobject’s properties, stipulated by its
species and variety. Therefore the study of repro-
ducibility regularities of meristem cell cryopreser-
vation results is the actual problem, the solving of
which creates the conditions to perform the multi-
factor research at a few amount of the experiment
repeats, enabling to prove scientifically new approa-
ches of development of effective cryopreservation
methods. Thus, for preserving the plant cell gene bank
it is necessary to study the reproducibility of cryopre-
servation results of different variety cuttings and
determine optimal values of varied parameters, pro-
viding maximal viability of frozen-thawed samples.
The research aim was to study the effect of fruit
species and variety (apple and pear) on reproducibility
of the results, obtained at different stages of cryopre-
servation of the cuttings.
Materials and methods
The research objects were the apple (Malus
domestica L.) cuttings such as: Belyi Naliv, Amulet,
Edera, Teremok, Radost, Katya; pear summer cuttings
as: Velyka Litnya, Ulyublena Klapa, autumn are
Gorodischenska, Vdala and winter are Bere Kyivska
and Zelena Mliyivska.
The cuttings were cut from one year shoots and
divided into separated samples (by 10 pieces) of 10–
12 cm length and 0.8–1.0 cm diameter. The cuttings
had from 2 to 5 vegetative buds. Prior to carrying-out
the research the viability and initial humidity of samples
were examined. For the research the samples with
the viability not less than 100% were chosen.
475 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 19, 2009, №4
Теремок, Радость, Катя; черенки груши (Pyrus com-
munis L.): летней – Велика літня, Улюблена Клапа,
осенней – Городищенська, Вдала, зимней – Бере
Київська, Зелена Мліївська.
Черенки нарезали из однолетних побегов и делили
на отдельные образцы (по 10 штук) длиной 10–12 см,
диаметром 0,8–1,0 см. Черенки имели 2–5 веге-
тативных почек. Перед проведением исследования
проверяли жизнеспособность и начальную влаж-
ность образцов. Для работы отбирали образцы с
жизнеспособностью не менее 100%.
Влажность образцов η (%) определяли взвеши-
ванием до и после криоконсервирования и рассчи-
тывали по формуле:
η = ((m0 – mk)/m0)×100 %,
где m0 – начальная масса нативного образца, г;
mk – конечная масса образца после обезвоживания
до постоянной массы, г.
Влажность черенков изменяли с 50 до 30%, вы-
держивая их в холодильнике при температуре
–5 ± 2 и –10 ± 2°С от 14 до 60 суток.
Разные скорости замораживания-отогрева,
необходимые для криоконсервирования черенков,
получали следующим способом. Для регулирования
скорости охлаждения термостатирующего уст-
ройства изменяли напряжение с 0 до 25 В и
сопротивление нагревательного элемента 30 и 70
Ом. Ступенчатое охлаждение проводили со скорос-
тью 0,01–0,1°C/ч в диапазоне температур –5...–30°С
с интервалом 5°С и выдержкой 1, 3 и 7 суток соот-
ветственно. Образцы помещали в бытовые термо-
сы ёмкостью 1,5 и 2 л, и переносили в рефриже-
раторы. Охлажденные черенки до –30°С погружали
в жидкий азот со скоростью 600–800°C/мин.
Образцы отогревали со скоростью 70°C/мин при
температуре воздуха 20°С или со скоростью 1–
3°C/мин при 5°С.
Жизнеспособность черенков контролировали
после каждого этапа криоконсервирования. Для
гидратации образцы помещали в эксикатор, распо-
лагая их над дистиллированной водой, и выдер-
живали 12 суток при температуре 5°С, а затем
проращивали в условиях in vitro (в стаканах с водой
при 20°С). Набухание и развитие почек свидетель-
ствовали о жизнеспособности исследуемого образ-
ца. Процент жизнеспособности образца оценивали
по отношению количества черенков с раскрытыми
почками в условиях in vitro к общему их количеству
в образце.
Статистическую обработку результатов прово-
дили с использованием критерия Стьюдента-
Фишера [4]. Индивидуальные особенности био-
объекта учитывали по усредненной разности жизне-
способности черенков на заданном и предшест-
The humidity of samples η(%) was determined
by weighting prior to and after cryopreservation and
was calculated according to the formula:
η = ((m0 – mk)/m0)×100 %,
where m0 – initial mass of native sample, g; mk –
final mass of sample after dehydration to constant
mass, g.
Humidity of cuttings was varied from 50 to 30%,
keeping them in a freezer under −5±2 and −10±2°C
from 14 to 60 days.
Different freeze-thawing rates, essential for cryo-
preservation of cuttings were obtained by these
methods. To control thermostatic device cooling rate
the voltage from 0 to 25 V and resistance of heating
element of 30 and 70 Ohm were changed. Stepwise
cooling was done with 0.01–0.1°C/hr rate within the
range of −5...−30°C temperatures with 5°C interval
and 1, 3 and 7 days exposure, correspondingly. The
samples were placed into domestic thermal flasks of
1.5 and 2l and transferred into freezers. Cooled down
to −30°C cut-tings were placed into liquid nitrogen
with 600–800°Cmin rate.
The samples were thawed with 70°C/min rate at
20°C or with 1–3°C/min rate at 5°C.
The viability of cuttings was controlled after each
cryopreservation stage. For hydration the samples
were removed into exicator, placing them above
distilled water and exposed for 12 days under 5°C,
and later grown in vitro (in the glasses with water at
20°C). Swelling and development of the buds testified
to viability of the studied sample. The percentage of
sample viability was estimated as the ratio of cuttings’
number with opened-up buds to their total number in
the sample in vitro.
The results were statistically processed using Stu-
dent-Fisher’s test [10]. Individual peculiarities of
biological object were taken into account according
to averaged difference of cuttings’ viabilities at the
current and previous cryopreservation stages [4], and
for elimination of these peculiarities the averaged
relation of their viabilities was used during estimation
of the stage efficiency [3].
Results and discussion
Optimisation of technological parameters for each
apple and pear variety was carried out stepwise: the
temperature adaptation was −10°C and cooling down
to −30°C and −196°C. Maximal indices of samples’
viability of the studied varieties were obtained due to
their temperature adaptation (−10°C) during 14–60
days and stepwise cooling with 0.1–0.5°C/hr under
−10...−30°C (exposure of 3–7 days), following direct
plunging into liquid nitrogen, storage from 1 to 30 days
and thawing with 70°C/min rate. The exposure term
476 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 19, 2009, №4
вующем этапах криоконсервирования [4], а для уст-
ранения этих особенностей использовали усреднен-
ное отношение их жизнеспособности при оценке
эффективности этапа [3].
Результаты и обсуждение
Оптимизацию технологических параметров для
каждого сорта яблони и груши проводили поэтапно:
температурная адаптация –10°С; охлаждение до
–30°С и –196°С. Максимальные показатели жизне-
способности образцов исследуемых сортов получе-
ны в результате их температурной адаптации (при
–10°С) в течение 14–60 суток, ступенчатого охлаж-
дения со скоростью 0,1–0,5°C/ч от температуры
–10 до –30 °С (выдержка 3–7 суток), последующего
прямого погружения в жидкий азот, хранения в
течение 1–30 суток, отогрева со скоростью 70°C/мин.
Длительность выдержки образцов при температуре
–10°С определяли по показателю влажности, кото-
рый для яблони и груши должен быть не ниже 30%
[2, 6, 8].
Полученные результаты показывают, что жизне-
способность деконсервированных черенков зависит
от сорта: у яблони она отличается более чем в 4
раза, груши – в 10 раз (табл. 1) . Для разных сортов
яблони разброс значений жизнеспособности декон-
сервированных образцов, содержащих 10 черенков
в каждом, составил от 0 до 100%. Анализ проб, сос-
тоящих из 5 образцов, полученный на разных этапах
криоконсервирования, проводили с помощью кри-
терия Стьюдента. В пределах одного вида средние
показатели для разных сортов яблони отличаются
на 32%, груши – 86% (табл. 1). Достоверность
различия анализируемых сортов установлена в 3
группах яблони и 4 группах груши при уровне
надежности Р ≥ 0,95. При использовании показателя,
усредняющего изменение жизнеспособности ∆М
(табл. 1), ошибка среднеквадратического отклоне-
ния m в среднем уменьшилась в 1,5 раза, что дало
возможность повысить надежность результатов
достоверности различия сравниваемых значений до
уровня Р ≥ 0,99.
С помощью двухфакторного дисперсионного
анализа [4] при использовании средней величины
М определили, что жизнеспособность деконсервиро-
ванных черенков яблони зависит только от способа
криоконсервирования. Сила влияния η2
А (отношение
выделенной дисперсии к общей) [4], обусловленная
индивидуальными свойствами биообъекта (сортом),
составила 0,07, тогда как технологического (проце-
дура криоконсервирования) η2
В – 0,82 при уровне
надежности полученных результатов Р ≥ 0,95.
Совместное воздействие указанных факторов
определило силу влияния η2
AB – 0,07, а неучтенных
факторов η2
z – 0,06. По показателю разности ∆М
сила влияния биологического фактора η2
A – 0,02,
for the samples under −10°C was determined accord-
ing to humidity index, not to be less than 30% for apple
and pear [2, 6, 8].
The findings show that viability of frozen-thawed
cuttings depends on variety, for apple it differs more
than in 4 times and 10 times for pear (Table 1). For
different apple varieties the range of viability values
of the frozen-thawed samples, containing 10 cuttings
each made from 0 to 100%. The analysis of tests,
consisting of 5 samples, obtained at different cryopre-
servation stages was carried out with the Student’s
criterion. Within one species the mean indices for
different apple varieties differ by 32% and pear by
86% (Table 1). The significance of difference of the
analysed varieties was established in 3 apple groups
and 4 pear ones at the integrity level of P ≥ 0.95. When
using the index, smoothing the via-bility change ∆M
(Table 1) the error in standard devia-tion m in average
reduced in 1.5 times that allowed the possible increase
in the reliability of the results of difference statistical
significance of the compared values up to the level of
P ≥ 0.99.
With two-factor dispersion analysis [4] and mean
value M there was determined that viability of frozen-
thawed apple cuttings depended only on cryopreser-
vation method. Power effect of η2
A (relation of
detailed dispersion to total) [4] due characteristic
properties of bioobject (variety) made 0.07, whereas
technologic η2
B (cryopreservation procedure) did 0.82
at the integrity level of the findings P ≥ 0.95. Combined
influence of the mentioned factors determined the
effect power η2
AB as 0.07 and not considered ones
η2
Z as 0.06. According to the difference index ∆M it
has been found that effect power of biological factor
η2
A was 0.02, technological η2
B was 0.49, their
combined effect η2
AB 0.38 and not considered factors
η2
Z made 0.12 at P ≥ 0.95. Therefore when coming
to the mean difference ∆M the combined effect of
biological and technologic parameters has the effect
power similar to cryogenic one.
During cryopreservation of pear cuttings the signi-
ficant difference in 4 groups for the six studied
varieties was obtained (Table 1). When coming to the
difference mean ∆M the error in standard deviation
m decreases approximately in 1.5 times. The effect
power of biological factor made 0.10 and 0.11, techno-
logic did 0.68 and 0.24, and their combined effect did
0.16 and 0.59 when using the absolute indices M and
their difference ∆M, accordingly (P ≥ 0.95).
Analysis of reproducibility of apple cuttings’ viabi-
lity indices carried out with Cv variation coefficient
has shown that during cryopreservation from 1st to
3rd stages this index changes for the apple varieties
as: 9–32% for Radost; 8–81% for Teremok; 14–
105% for Belyy Naliv; 36–91% for Sprint and up to
40% for Katya; pear varieties as: 10–26% for Velyka
477 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 19, 2009, №4
технологического η2
B – 0,49, их совместного влия-
ния η2
AB – 0,38, а неучтенных факторов η2
z – 0,12
при Р ≥ 0,95. Следовательно, при переходе к показа-
телям разности средних ∆M совместное действие
биологических и технологических параметров
оказывает силу влияния, сопоставимую с криоген-
ным воздействием.
При криоконсервировании черенков груши
получено достоверное различие в четырех группах
из шести исследуемых сортов (табл. 1). При пере-
ходе к показателю разности средних ∆М ошибка
среднеквадратического отклонения m уменьшается
приблизительно в 1,5 раза. Сила влияния биологи-
ческого фактора составила 0,10 и 0,11, технологичес-
Таблица 1. Жизнеспособность черенков различных сортов яблони и груши,
оцененная на разных этапах криоконсервирования
Table 1. Viability of cuttings of different apple and pear varieties,
evaluated at different cryopreservation stages
Примечания: m – ошибка среднеквадратического отклонения; n ≥ 50 – количество черенков в каждой пробе; охлаждение до
–30°С со скоростью 0,1°С/ч; замораживание 600–800°С/мин с погружением в жидкий азот; отогрев 70°С/мин; разными супер-
скриптами а, b, c, d обозначены значения, имеющие достоверность различия с уровнем надежности Р ≥ 0,95, в пределах каж-
дого столбца и вида растения.
Notes: m – error in standard deviation; n ≥ 50 – number of cuttings in each sample; cooling down to −30°C with 0.1°C/hr rate; freezing
600–800°C/min with plunging into liquid nitrogen; thawing 70°C/min. Values with significant differences of P ≥ 0.95 integrity level,
within the ranges of each column and plant species are denoted with a, b, c, d superscripts.
Litnya; 8–59% for Ulyublena Klapa; 6–10% for
Vdala; 10–105% for Zelena Mliivska; 10–137% for
Bere Kiivska; 36–91% for Gorodischenska (Table 2).
To reduce the effect of individual properties of biolo-
gical object when estimating the efficiency of cryo-
preservation stages there was used the index, calcu-
lated as the ratio of bioobject viability after implemen-
ting of the set operation and prior to it.
When coming to the relative index, the efficiency
of cryopreservation stage W the reproducibility of the
results increased in 1.5 times in average. Exceptions
are the data, obtained for cuttings’ viability lower than
10%. These indices of cuttings’ cryopreservation effi-
ciency were obtained for the apple varieties as: 68%
яинетсаР
tnalP
итсонбосопсензижеиненемзии)%(МьтсонбосопсензиЖ ∆ вокнереч)%(М
ырутарепметодяинеджалхоелсоп
ytilibaivnisegnahcdna)%(MytilibaiV ∆ foerutarepmetehtotnwodgniloocretfasgnittucfo)%(M
диВ
seicepS
троС
yteiraV
С°01- С°03- С°691-
∆ m±М m±М ∆ m±М m±М ∆ m±М m±М
янолбЯ
elppA
ьтсодаР
tsodaR 7,3±0,8 7,3±0,29 0±0,04 7,3±0,25 4,2±0,61 1,5±0,63
а
комереТ
komereT 2,3±0,01
а 2,3±0,09 а 0,2±0,24 а 7,3±0,84 1,5±0,62 а 0,8±0,22
виланйылеБ
vilaNiyleB 5,4±0,03
b 5,4±0,07 b 0,2±0,81 b 7,3±0,25 а 4,2±0,44 b 7,3±0,8 b
тнирпС
tnirpS 5,7±0,45
c 5,7±0,64 c 5,5±0,04 c 4,2±0,6 b 4,2±0,6 c 0,0±0,0 с
ятаK
aytaK 1,7±0,06 1,7±0,04 1,7±0,04 0,0±0,0
c 0,0±0,0 d 0,0±0,0
телумА
telumA 3,7±0,26 3,7±0,83 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0
арэдЭ
aredE 4,8±0,47 4,8±0,62 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0
ашурГ
raeP
янтiЛакилеВ
ayntiLakyleV 0,4±0,6 0,4±0,49 4±41 1,7±0,08 4,2±0,6
а 7,8±0,47
апалKанелбюлУ
apalKanelbuylU 2,3±0,01 2,3±0,09 7,3±0,8 8,5±0,28 4,2±0,45
b 3,7±0,82 b
аладВ
aladV 4,2±0,6 ±0,49 4,2 0,2±0,2
а 0,2±0,29 а 4,2±0,6 а 0,4±0,68 а
iлМанелеЗ ї акьсв
aksviyilManeleZ 7,3±0,21
а 7,3±0,88 1,5±0,61 b 6,8±0,27 b 1,5±0,46 c 7,3±0,8 c
иKереБ ї акьсв
aksviyKereB 0,4±0,64
b 0,4±0,68 а 0,2±0,28 c 4,2±0,4 c 4,2±0,4 d 0,0±0,0 d
акьснещидороГ
aksnehcsydoroH 5,7±0,45 5,7±0,64
b 5,5±0,04 d 4,2±0,6 4,2±0,6 0,0±0,0
478 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 19, 2009, №4
кого – 0,68 и 0,24, их совместного воздействия –
0,16 и 0,59 при использовании абсолютных показате-
лей М и их разности ∆М соответственно при Р ≥ 0,95.
Анализ воспроизводимости показателей жизне-
способности черенков яблони, проведенный при
помощи коэффициента вариации Cv, показал, что в
процессе криоконсервирования с первого до третьего
этапов этот показатель изменяется для сортов
яблонь: Радость – 9–32%, Теремок – 8–81%, Белый
налив – 14–105%, Спринт – 36–91% и Катя – до
40%; сортов груши: Велика Літня – 10–26%,
Улюблена Клапа – 8–59%, Вдала – 6–10%, Зелена
Мліївська – 10–105%, Бере Київська – 10–137%,
Городищенська – 36–91% (табл. 2). Для уменьшения
влияния индивидуальных свойств биообъекта при
оценке эффективности этапов криоконсервирования
использовали показатель, вычисленный как отноше-
ние жизнеспособности биообъекта после выполне-
ния заданной операции и до неё.
При переходе к относительному показателю –
эффективности этапа криоконсервирования W
воспроизводимость результатов увеличилась в
среднем в 1,5 раза. Исключением являются данные,
полученные для жизнеспособности черенков ниже
10%. Показатели эффективности криоконсервирова-
ния черенков сортов яблони составили: Радость –
for Radost, 42% for Teremok, 14% for Belyy Naliv;
pear varieties as: 92% for Velyka Litnya, 33% for
Ulyublena Klapa, 93% for Osinnya Vdala, 9% for
Zelena Mliivska.
Under dispersion analysis when using the relative
indices the results close to absolute ones were obtai-
ned. The effect power of biological factor for apple
made 0.11 and for pear did 0.12; technologic one was
0.69 and 0.65; combined one made 0.12 and 0.19,
correspondingly (at P ≥ 0.95).
The analysis of frozen-thawed cuttings’ viability
of different apple and pear varieties has shown that
within the ranges of one species the mean indices for
different varieties of apple differ by 36 and pear by
74% and those for cryopreservation efficiency by 68
and 93%, correspondingly. Specific difference of
apple and pear cuttings affects viability of frozen-
thawed bioobject if compared with the variety one.
Significant difference of efficiency indices obtained
for different species and varieties of cuttings is ex-
plained with a combined effect of individual properties
of biological object and the chosen cryopreservation
method.
Due to taking into account the variety features with
a viability difference index prior to and after the set
procedure of cuttings’ cryopreservation of different
Таблица 2. Эффективность этапов криоконсервирования черенков различных сортов яблони и груши
Table 2. Efficiency of cryopreservation stages of different apple and pear variety cuttings
Примечания: охлаждение до –30°С со скоростью 0,1°С/ч; замораживание 600–800°С/мин с погружением в жидкий азот;
отогрев 70°С/мин; разными суперскриптами а, b, c, d обозначены значения, имеющие достоверность различия с уровнем
надежности Р ≥ 0,95, в пределах каждого столбца и вида растения; W – эффективность, отношение жизнеспособности биообъекта,
оцененной на заданном этапе, к жизнеспособности на предшествующем; Cv – коэффициенты вариации показателя эффективности
технологического этапа и жизнеспособности (в скобках) – V (Cv).
Notes: cooling down to −30°C with 0.1°C/hr rate; freezing 600–800°C/min with plunging into liquid nitrogen; thawing 70°C/min.
Values with significant differences of P ≥ 0.95 integrity level, within each column and plant species are denoted with a, b, c, d
superscripts; W – efficiency, ratio of bioobject viability, evaluated at the set stage to viability at previous one; Cv – variation coefficient
of technologic stage efficiency index, viability in brackets – V (Cv).
яинетсаР
tnalP
ерутарепметирп)%(WяинаворивреснокоиркапатэьтсонвиткеффЭ
foerutarepmetta)%(WegatsnoitavreserpoyrcfoycneiciffE
диВ
seicepS
троС
yteiraV
С°01- С°03- С°691-
m±W C
v
m±W C
v
m±W C
v
янолбЯ
elppA
ьтсодаР
tsodaR 7,3±0,29 9 8,1±2,65 )61(6 а2,6±0,86 )23(02
комереТ
komereT 2,3±0,09
а 8 7,2±1,35 а )71(9 3,41±3,24 )18(67
виланйылеБ
vilaNiyleB 5,4±0,07
b 41 7,2±3,47 b )61(8 4,6±0,41 b )501(201
ашурГ
raeP
янтiЛакилеВ
ayntiLakyleV 0,4±0,49 01 6,4±6,48 )02(21 5,3±6,19
а )62(9
апалKанелбюлУ
apalKanelbuylU 2,3±0,09 8 2,4±8,09 )61(01 5,6±5,23
b )95(54
аладВ
aladV 4,2±0,49 6 0,2±0,89 )5(5 7,2±3,39
а )01(7
iлМанелеЗ ї акьсв
aksviyilManeleZ 7,3±0,88 01 4,6±8,08 )72(81 0,4±4,9
c )501(69
479 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 19, 2009, №4
68%, Теремок – 42%, Белый налив – 14%; сортов
груши Велика Літня – 92%; Улюблена Клапа – 33%,
Осіння Вдала – 93%, Зелена Мліївська – 9%.
При дисперсионном анализе с использованием
относительных показателей получены результаты,
близкие к абсолютным. Сила влияния биологичес-
кого фактора для яблони составляет 0,11 и груши –
0,12; технологического – 0,69 и 0,65; совместного –
0,12 и 0,19 соответственно при Р ≥ 0,95.
Анализ жизнеспособности деконсервированных
черенков различных сортов яблони и груши показал,
что в пределах одного вида средние показатели для
разных сортов яблони отличаются на 36, груши –
на 74%, а показатели эффективности криоконсерви-
рования – на 68 и 93% соответственно. Видовое
различие черенков яблони и груши оказывает боль-
шее влияние на жизнеспособность деконсервирован-
ного биообъекта, чем сортовое. Существенное раз-
личие показателей эффективности, полученное для
разных видов и сортов черенков, объясняется сов-
местным влиянием индивидуальных свойств
биообъекта и выбранного способа криоконсервиро-
вания.
В результате учета сортовых особенностей с
помощью показателя разности жизнеспособности
до и после заданной процедуры криоконсервиро-
вания черенков различных сортов яблони и груши
установлено, что индивидуальные свойства био-
объекта влияют на результаты опытов, как и проце-
дура криоконсервирования. Сила влияния биологи-
ческого и технологического факторов на жизнеспо-
собность деконсервированного объекта для выбран-
ного способа криоконсервирования практически
одинакова.
Таким образом, жизнеспособность деконсерви-
рованных черенков растений зависит от их сорта и
способа криоконсервирования. Повышение воспроиз-
водимости результатов криоконсервирования черен-
ков яблони и груши в среднем в 1,5 раза основано
на использовании показателей, отражающих измене-
ние жизнеспособности биообъекта в результате
выполнения заданной операции. Использование
разности абсолютных показателей жизнеспособ-
ности и их отношения позволили уменьшить
количество используемых биообъектов в 2 раза [4].
По разности показателей жизнеспособности можно
оценить влияние индивидуальных свойств исследуе-
мого биообъекта, а по их отношению – устранить
данное воздействие при оценке эффективности
технологической операции. На основе результатов
проведенных исследований был предложен способ
криоконсервирования черенков различных сортов
яблони и груши, позволяющий длительно хранить
замороженные образцы при температуре жидкого
азота.
apple and pear varieties it has been established that
individual properties of bioobject affect the experi-
mental results as well as the cryopreservation pro-
cedure. The power effect of biological and technologic
factors renders practically the same effects on
viability of frozen-thawed object as the selected
cryopreservation method.
Thus, the viability of frozen-thawed plant cuttings
depends on their variety and cryopreservation method.
For increasing the reproducibility of apple and pear
cuttings’ cryopreservation results in average in 1.5
times there are used the parameters, reflecting the
change of bioobject’s viability due to performing the
set operation. Use of the difference in viability abso-
lute indices and their ratio enabled the two-fold
reduction of a number of the used bioobjects [4].
According to the difference in viability indices one
may estimate the effect of individual properties of the
used bioobject and according to their relation to
eliminate this effect when assessing the efficiency of
a technologic operation. Due to the research findings,
the cryopreservation method of different apple and
pear varieties, enabling to store for a long period the
frozen samples under liquid nitrogen temperature has
been proposed.
Conclusions
1. Maximal viability indices of the studied varieties
of frozen-thawed apple and pear cuttings were
obtained due to their temperature adaptation under
–10°C during 14–60 days, stepwise cooling of the
samples with 0.1–0.5°C/hr down to −30°C (exposure
3–7 days), direct plunging into liquid nitrogen, storage
during 1–30 days and thawing with rate of 70°C/min.
2. Development probability of apple and pear
frozen-thawed cuttings depends on their variety and
cryopreservation method. Species difference of apple
and pear cuttings twice more affects the viability of
frozen-thawed bioobject, if compared with the variety
one. Selection of apple and pear cuttings’ variety as
well as the cryopreservation method determine the
experimental results’ reproducibility. Efficiency of the
proposed cryopreservation method for apple and pear
cuttings depends on their variety.
References
Verzhuk V.G., Philippenko G.I., Tikhonova N.G., Zhestkov A.S.
Cryopreservation methods of fruit cultures gene plasma by
the example of currant berry, honeyberry and gooseberry//
Biofizika Zhivoy Kletki.– 2008.– Vol. 9.– P. 35–36.
Gorbunov L.V., Shiyanova T.P. Cryopreservation of fruit-berry
culture cuttings// Problems of Cryobiology.– 2009.– Vol. 19,
N3.– P. 147–154.
Gorbunov L.V., Bugrov A.D., Gorbunova N.I. Methods of effi-
ciency evaluation of performing biotechnological operations,
1.
2.
3.
480 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, №4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 19, 2009, №4
Выводы
1. Максимальные показатели жизнеспособности
исследуемых сортов деконсервированных черенков
яблони и груши получены в результате их темпера-
турной адаптации при –10 °С в течение 14–60 суток,
ступенчатого охлаждения образцов со скоростью
0,1–0,5 °C/ч до –30°С (выдержка 3–7 суток), пря-
мого погружения в жидкий азот, хранения в течение
1–30 суток и отогрева со скоростью 70°C/мин.
2. Вероятность развития деконсервированных
черенков яблони и груши зависит от их сорта и
способа криоконсервирования. Видовое отличие
черенков яблони и груши оказывает в 2 раза большее
влияние на жизнеспособность деконсервированного
биообъекта, чем сортовое. Выбор сорта черенков
яблони и груши, как и способ криоконсервирования,
определяют воспроизводимость результатов опы-
тов. Эффективность предложенного способа крио-
консервирования черенков яблони и груши зависит
от их сорта.
Литература
Вержук В.Г., Филиппенко Г. И., Тихонова Н.Г., Жестков А.С.
Способы криосохранения генплазмы плодовых культур на
примере смородины, жимолости и крыжовника // Биофизика
живой клетки.– 2008.– Т. 9, №5.– С. 35–36.
Горбунов Л.В. Шиянова Т.П. Криоконсервирование
черенков плодово-ягодных культур // Пробл. криобиоло-
гии.– 2009.– Т. 19, №3.– С. 338–348.
Горбунов Л.В., Бугров А.Д., Горбунова Н.І. Спосіб оцінки
ефективності проведення біотехнологічних операцій, які
пов’язані з кріоконсервацією сперматозоїдів та ембріонів
ссавців // Вісник Білоцерківського держ. аграр. ун–ту.–
2000.– Т. 3, №14.– С. 178–183.
Лакин Б.Ф. Биометрия.– М.: Высш. шк., 1990.– 254 с.
Методы исследований и организация экспериментов /
Под ред. К.П. Власова.– Харьков: “Гуманитарный центр”,
2002.– 256 с.
Popov A.S., Popova E.V., Nikishina T.V., Vysotskaya O.N.
Cryobank of plant genetic resources in Russian Academy of
Sciences // International Journal of Refrigeration.– 2006.–
Vol. 29, N3.– P. 403–410
Towill L.E., Forsline P.L. Cryopreservation of sour cherry
(Prunus cerasus L.) using a dormant vegetative bud method //
Cryoletters.– 1999.– Vol. 20, N4.– P. 215–225.
Wu Y., Zhao Y., Engelmann F. et al. Cryopreservation of
apple dormant buds and shoot tips // Cryoletters.– 2001.–
Vol. 22, N6.– P. 375–380.
Поступила 06.03.2009
Рецензент Т.Ф. Стрибуль
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
associated with cryopreservation of spermatozoa and
mammalian embryos// Visnyk Bilotserkovskogo Derzh. Agrarn.
Univ.– 2000.– Vol. 3, N14.– P. 178–183.
Lakin B.F. Biometry.– Moscow: Vysshaya shkola, 1990.–
254 p.
Research methods and organization of experiments/ Ed. by
K.P. Vlasov.– Kharkov: Gumanitarnyy tsentr, 2002.– 256 p.
Popov A.S., Popova E.V., Nikishina T.V., Vysotskaya O.N.
Cryobank of plant genetic resources in Russian Academy of
Sciences // International Journal of Refrigeration.– 2006.–
Vol. 29, N3.– P. 403–410
Towill L.E., Forsline P.L. Cryopreservation of sour cherry
(Prunus cerasus L.) using a dormant vegetative bud method //
Cryoletters.– 1999.– Vol. 20, N4.– P. 215–225.
Wu Y., Zhao Y., Engelmann F. et al. Cryopreservation of
apple dormant buds and shoot tips // Cryoletters.– 2001.–
Vol. 22, N6.– P. 375–380.
Accepted in 06.03.2009
4.
5.
6.
7.
8.
|