Повышение воспроизводимости результатов исследования криоконсервирования биообъекта
С помощью предложенной математической модели определены условия повышения воспроизводимости результатов криобиологического исследования. Показано, что повышение воспроизводимости результатов исследования обеспечивается при учете начального состояния биологического материала и эффективности его исп...
Gespeichert in:
| Datum: | 2010 |
|---|---|
| 1. Verfasser: | |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2010
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/44476 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Повышение воспроизводимости результатов исследования криоконсервирования биообъекта / Л.В. Горбунов // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 3. — С. 246-254. — Бібліогр.: 11 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-44476 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-444762013-06-03T03:06:42Z Повышение воспроизводимости результатов исследования криоконсервирования биообъекта Горбунов, Л.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология С помощью предложенной математической модели определены условия повышения воспроизводимости результатов криобиологического исследования. Показано, что повышение воспроизводимости результатов исследования обеспечивается при учете начального состояния биологического материала и эффективности его использования. Применение данной математической модели повышает воспроизводимость результатов исследования до 5 раз, что дает возможность получить достоверный результат при уменьшении количества биологического материала до 25 раз. Апробация предложенной модели показала, что учет начального состояния спермиев быка и карпа, эмбрионов мыши повышает воспроизводимость результа- тов в среднем в 1,5 раза, что дает возможность сравнивать результаты, полученные в разных опытах. На основі запропонованої математичної моделі визначено умови підвищення відтворюваності результатів кріобіологічного дослідження. Показано, що підвищення відтворюваності результатів дослідження забезпечується при врахуванні початкового стану біологічного матеріалу і ефективності його використовування. Застосування даної математичної моделі підвищує відтворюваність результатів дослідження до 5 разів, що надає можливість одержати достовірний результат при зменшенні кількості біологічного матеріалу до 25 разів. Апробація запропонованої моделі показала, що врахування початкового стану сперміїв бугая і коропа, ембріонів миші підвищує відтворюваність результатів в середньому в 1,5 рази, що надає можливість порівнювати результати, одержані в різних дослідах. Conditions of reproducibility increase for cryobiological research results were examined with the proposed mathematical model. It has been shown that increase of reproducibility of research results is provided with taking into account the initial state of biological material and the efficiency of its using. Application of this mathematical model increases the reproducibility of research results up to 5 times that provides the obtaining significant result when reducing the biological material number to 25 times. Testing of the suggested model showed, that taking into account of initial state of bovine and carp spermatozoa and murine embryos increased reproducibility of results in average in 1.5 times, allowing the comparison of the results of various experiments. 2010 Article Повышение воспроизводимости результатов исследования криоконсервирования биообъекта / Л.В. Горбунов // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 3. — С. 246-254. — Бібліогр.: 11 назв. — рос., англ. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/44476 635.076:57.043 ru Проблемы криобиологии Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Горбунов, Л.В. Повышение воспроизводимости результатов исследования криоконсервирования биообъекта Проблемы криобиологии |
| description |
С помощью предложенной математической модели определены условия повышения воспроизводимости результатов
криобиологического исследования. Показано, что повышение воспроизводимости результатов исследования обеспечивается
при учете начального состояния биологического материала и эффективности его использования. Применение данной
математической модели повышает воспроизводимость результатов исследования до 5 раз, что дает возможность получить
достоверный результат при уменьшении количества биологического материала до 25 раз. Апробация предложенной модели
показала, что учет начального состояния спермиев быка и карпа, эмбрионов мыши повышает воспроизводимость результа-
тов в среднем в 1,5 раза, что дает возможность сравнивать результаты, полученные в разных опытах. |
| format |
Article |
| author |
Горбунов, Л.В. |
| author_facet |
Горбунов, Л.В. |
| author_sort |
Горбунов, Л.В. |
| title |
Повышение воспроизводимости результатов исследования криоконсервирования биообъекта |
| title_short |
Повышение воспроизводимости результатов исследования криоконсервирования биообъекта |
| title_full |
Повышение воспроизводимости результатов исследования криоконсервирования биообъекта |
| title_fullStr |
Повышение воспроизводимости результатов исследования криоконсервирования биообъекта |
| title_full_unstemmed |
Повышение воспроизводимости результатов исследования криоконсервирования биообъекта |
| title_sort |
повышение воспроизводимости результатов исследования криоконсервирования биообъекта |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2010 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/44476 |
| citation_txt |
Повышение воспроизводимости результатов исследования
криоконсервирования биообъекта / Л.В. Горбунов // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 3. — С. 246-254. — Бібліогр.: 11 назв. — рос., англ. |
| series |
Проблемы криобиологии |
| work_keys_str_mv |
AT gorbunovlv povyšenievosproizvodimostirezulʹtatovissledovaniâkriokonservirovaniâbioobʺekta |
| first_indexed |
2025-07-04T02:57:03Z |
| last_indexed |
2025-07-04T02:57:03Z |
| _version_ |
1836683439990898688 |
| fulltext |
246
Institute of Cattle Breeding of Ukrainian Academy
of Agrarian Sciences, Kharkov
Институт животноводства УААН, г. Харьков
УДК 635.076: 57.043
Л.В. ГОРБУНОВ
Повышение воспроизводимости результатов исследования
криоконсервирования биообъекта
UDC 635.076: 57.043
L.V. GORBUNOV
Increase in Reproducibility of Research Results
of Bioobject Cryopreservation
С помощью предложенной математической модели определены условия повышения воспроизводимости результатов
криобиологического исследования. Показано, что повышение воспроизводимости результатов исследования обеспечивается
при учете начального состояния биологического материала и эффективности его использования. Применение данной
математической модели повышает воспроизводимость результатов исследования до 5 раз, что дает возможность получить
достоверный результат при уменьшении количества биологического материала до 25 раз. Апробация предложенной модели
показала, что учет начального состояния спермиев быка и карпа, эмбрионов мыши повышает воспроизводимость результа-
тов в среднем в 1,5 раза, что дает возможность сравнивать результаты, полученные в разных опытах.
Ключевые слова: воспроизводимость, математическая модель, криоконсервирование, эффективность, спермии быка и
карпа, эмбрионы мыши.
На основі запропонованої математичної моделі визначено умови підвищення відтворюваності результатів кріобіологічного
дослідження. Показано, що підвищення відтворюваності результатів дослідження забезпечується при врахуванні початкового
стану біологічного матеріалу і ефективності його використовування. Застосування даної математичної моделі підвищує
відтворюваність результатів дослідження до 5 разів, що надає можливість одержати достовірний результат при зменшенні
кількості біологічного матеріалу до 25 разів. Апробація запропонованої моделі показала, що врахування початкового стану
сперміїв бугая і коропа, ембріонів миші підвищує відтворюваність результатів в середньому в 1,5 рази, що надає можливість
порівнювати результати, одержані в різних дослідах.
Ключові слова: відтворюваність, математична модель, кріоконсервування, ефективність, спермії бугая і коропа, ембріони
миші.
Conditions of reproducibility increase for cryobiological research results were examined with the proposed mathematical model.
It has been shown that increase of reproducibility of research results is provided with taking into account the initial state of biological
material and the efficiency of its using. Application of this mathematical model increases the reproducibility of research results up to
5 times that provides the obtaining significant result when reducing the biological material number to 25 times. Testing of the suggested
model showed, that taking into account of initial state of bovine and carp spermatozoa and murine embryos increased reproducibility
of results in average in 1.5 times, allowing the comparison of the results of various experiments.
Key words: reproducibility, mathematical model, cryopreservation, efficiency, bovine and carp spermatozoa, murine embryos.
Необходимое условие научного исследования –
воспроизводимость его результатов. Анализ опыта
работы Института высоких статистических техно-
логий и эконометрики МГТУ им. Н.Э. Баумана
показал, что причиной низкой эффективности
проведения эксперимента является применение
устаревших и частично ошибочных статистичес-
ких технологий [9]. Экономический эффект от
использования статистического контроля в про-
мышленности США составляет 0,8% от валового
национального продукта (20 млрд долларов в год),
что существенно больше, чем от любого иного эко-
номико-математического метода.
При использовании несовершенных статисти-
ческих технологий в криобиологических исследо-
ваниях невозможны учет начального состояния
The requirement to scientific research is reproduc-
ibility of its results. Analysis of the experience of the
Institute of High Technologies and Econometrics of
N.E. Bauman Moscow State Technical University
(MSTU) showed that the reason of low efficiency of
performed experiment was the usage of outdated and
partially incorrect statistical technologies [9]. Economi-
cal effect of using statistical control in the USA indus-
try makes 0.8% of gross national product (20 billion
dollars annually) that is significantly higher than any
other economical-mathematical method.
When using imperfect statistical technologies in
cryobiological researches a scientist could not take into
account an initial state of bioobject and efficiency de-
termination of its cryopreservation stages, and that is
the reason of low reproducibility of experimental re-
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
* Адрес для корреспонденции: п/в Кулиничи, Харьковский
район, Харьковская область, Украина, 62404; тел.: (+38 057)
740-31-66, электронная почта: lab_cryo@ukr.net
* Address for correspondence: PO Kulinichi, Kharkov region,
Ukraine 61480; tel.: +380 57 740 3166; e-mail: lab_cryo@ukr.net
247 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
биообъекта и определение эффективности этапов
его криоконсервирования, что является причиной
низкой воспроизводимости результатов опытов [3–
6]. Сохранность нативных спермиев и эмбрионов
в разных опытах может изменяться в пределах
нескольких десятков процентов [4–6]. Это ограни-
чивает возможность применения методов много-
факторного исследования при работе со спермия-
ми и эмбрионами.
Общепринятые параметрические (t) и непара-
метрические (χ2) критерии анализа полученных
результатов основаны на усреднении показателей
сохранности биообъекта, оцененного до и после
эксперимента [1, 7]. Недостатком данных методов
является большое количество проб (эякулятов или
эмбрионов n ≥ 30) в каждой выборке, что связано
с ранговым распределением значений сохранности
биообъекта (оценка в баллах). Следствиями усред-
нения рангового распределения показателей со-
хранности биообъекта являются большой расход
биологического материала для получения досто-
верного результата и сложность сравнения резуль-
татов отдельных опытов.
Таким образом, низкая воспроизводимость ре-
зультатов отдельных опытов затрудняет сопоста-
вимость данных всего эксперимента. С помощью
общепринятых способов парного сравнения резуль-
татов сохранности биообъекта (в опыте и контро-
ле) невозможно определить эффективность проце-
дуры его криоконсервирования и отдельных её
этапов (культивирование, применение криопротек-
тора и режима замораживания-оттаивания). Для
сопоставления результатов, полученных в разных
опытах, при малом количестве проб (n ≤ 30) необхо-
димо создать математическую модель, обеспечи-
вающую учет индивидуальных особенностей био-
объекта и оценку эффективности выбранного спо-
соба его криоконсервирования.
Цель работы – разработать математическую
модель, повышающую воспроизводимость резуль-
татов криобиологического исследования, и опреде-
лить условия, обеспечивающие уменьшение коли-
чества используемого биообъекта.
Материалы и методы
Сохранность биообъекта, оцененную на i-м
этапе криоконсервирования, определяли из выра-
жения:
0n
nS i
i = , (1)
где ni – количество пригодного к дальнейшему
использованию биообъекта, оцененного на i-м
этапе криоконсервирования; n0 – общее количест-
во биообъекта.
sults [3–6]. Integrity of native spermatozoa and em-
bryos in different experiments could vary within the
range of several tens of percent [4–6]. It limits the
possibility of multifactor research methods’ applica-
tion when working with spermatozoa and embryos.
Conventional parametric (t) and non-parametric (χ2)
criteria of analysis of the obtained results are based on
averaging the integrity indices for the bioobject, esti-
mated prior to and after the experiment [1, 7]. A huge
number of the samples (either ejaculates or embryos
n ≥ 30) in each sampling, associated with the rank dis-
tribution of the bioobject integrity values (estimation in
points) is disadvantage of these methods. A high ex-
penditure of biological material for obtaining a sig-
nificant result and difficulty of its comparison in differ-
ent experiments are the results of rank distribution av-
eraging of the bioobject integrity indices.
Thus, low reproducibility of the results of different
experiments makes difficult a comparability of the
whole experiment data. It is impossible to determine
the efficiency of cryopreservation and its single stages
(culturing, exposure in cryoprotectant and utilized
freeze-thawing protocol) for the results of bioobject
integrity (in the experiment and control) using conven-
tional paired comparison methods. It is necessary to
develop a mathematical model, providing considera-
tion of the individual peculiarities of bioobject and esti-
mation of efficiency of chosen cryopreservation method
to compare the results, obtained in different experi-
ments with a little number of the samples (n ≤ 30).
The research aim was to develop the mathematical
model, increasing the reproducibility of the results of
cryobiological research and to establish the conditions,
providing the reduction of the used bioobject's amount.
Materials and methods
Integrity of bioobject, evaluated at i-th cryopreserva-
tion stage was determined by the formula:
0n
nS i
i = , (1)
where ni is amount of bioobject, suitable for further
use, evaluated at i-th stage of cryopreservation; n0 is
total amount of bioobject.
Integrity of bioobject is the value of general prob-
ability, which may be presented as the product of con-
ditional probabilities of consequently related events
according to the Bayes' formula [1,7]:
∏
=
=
3
1i
ici WSS , (2)
where Sc is initial integrity of bioobject, i. e. ratio of number
nc of suitable native bioobject to total number n0 (Sc =
nc/n0); Wi is efficiency of i-th stage of cryopreservation:
248 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
Сохранность биообъекта является величиной
общей вероятности, которая может быть пред-
ставлена как произведение условных вероятностей
последовательно связанных событий в соответст-
вии с формулой Байеса [1, 7]:
∏
=
=
3
1i
ici WSS , (2)
где Sc – начальная сохранность биообъекта, т. е.
отношение количества пригодного нативного
биообъекта nc к общему числу n0 (Sc = nc/n0); Wi –
эффективность i-го этапа процедуры криокон-
сервирования: культивирования Wk, применения
криопротектора Wt, замораживания-оттаивания Wz,
полного цикла криоконсервирования Wd.
Сохранность биообъекта определяли на сле-
дующих этапах: культивирование (Sk = ScWk);
обработка криопротектором и культивирование
(St = ScWtWk); замораживание-оттаивание и
культивирование (Sd = ScWt; WzWk = ScWd). Сле-
довательно, из выражения (2) можно определить
эффективность i-го этапа криоконсервирования
через отношение показателей сохранности био-
объекта на заданном и предшествующем этапах:
1−
=
i
i
i S
SW . (3)
Оценивали показатель эффективности на эта-
пах: культивирования Wk = Sk/Sc; применения крио-
протектора Wt = St/Sk; замораживания-оттаивания
Wz = Sd/St; полного цикла криоконсервирования Wd =
Sd/Sc = WtWzWk.
Среднеквадратическое отклонение рассчиты-
вали по методу альтернативного варьирования
[1, 7]:
)1(( PP −=σ , (4)
где P – вероятность сохранности (1) или эффектив-
ность криоконсервирования биообъекта (3).
Воспроизводимость результатов эксперимента
оценивали при помощи коэффициента вариации:
%100⋅=
P
Cv
σ . (5)
Повышение воспроизводимости результатов
эксперимента определяли как отношение величин
коэффициентов вариации, полученных для показа-
теля сохранности и эффективности криоконсерви-
рования биообъекта:
Wv
vS
C
Cz = . (6)
Wk of culturing, Wt of cryoprotectant use, Wz of freeze-
thawing, Wd of complete cycle of cryopreservation.
Integrity of bioobject was determined at the fol-
lowing stages: culturing (Sk = ScWk); treatment with
cryoprotectant and culturing (St = ScWtWk); freeze-
thawing and culturing (Sd = ScWt; WzWk = ScWd).
Therefore the efficiency of i-th stage of cryopreserva-
tion could be determined from the formula (2) through
relation of the indices of bioobject integrity at given
and previous stages:
1−
=
i
i
i S
SW . (3)
Index of efficiency was estimated for the following
stages: Wk = Sk/Sc for culturing; Wt = St/Sk for cryopro-
tectant application; Wz = Sd/St for freeze-thawing; Wd =
Sd/Sc = WtWzWk for complete cycle of cryopreservation.
Root-mean-square deviations were evaluated by
the method of alternative variation [1,7]:
)1(( PP −=σ , (4)
where P is probability of integrity (1) or efficiency of
bioobject cryopreservation (3).
Reproducibility of experimental results was esti-
mated with variation coefficient:
%100⋅=
P
Cv
σ . (5)
Increase of experimental results’ reproducibility was
determined as the ratio of values of variation coeffi-
cients, obtained for integrity and efficiency of bioobject
cryopreservation:
Wv
vS
C
Cz = . (6)
Minimal amount of bioobject, providing significant
mean value of the indices of integrity and efficiency of
cryopreservation, was determined according to [2, 3]:
2
VC
р
tn
= , (7)
where t is Student's criterion (at n > 30 t = 2); p is
admissible relative error (p = 5%)
Decrease in bioobject's amount was estimated as
the ratio of minimum number of bioobjects, providing
the significance of its integrity estimation, to cryopre-
servation efficiency (h = ns/nw). During substitution by
(7) and reduction of the values of admissible relative
error p and Student's t criterion with further replace-
ment for (6) we obtain:
2zh = . (8)
249 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
Минимальное количество биообъекта, обеспе-
чивающего достоверное среднее значение пока-
зателей сохранности и эффективности криокон-
сервирования, определяли по [2, 3]:
2
VC
р
tn
= , (7),
где t – критерий Стьюдента (при n > 30 t = 2); р –
допустимая относительная ошибка (р = 5%).
Уменьшение количества биообъекта оценивали
как отношение минимального числа биообъекта,
обеспечивающего достоверное значение оценки
его сохранности, к эффективности криоконсерви-
рования (h = ns/nw). При подстановке (7) и со-
кращении значений допустимой относительной
ошибки р и критерия Стьюдента t с последующей
заменой на (6) получаем:
2zh = . (8)
Предложенную математическую модель про-
веряли на основе полученных результатов криокон-
сервирования спермиев быка, карпа и эмбрионов
мыши [3–6]. В каждом отдельном опыте изменяли
только один технологический параметр в соответ-
ствии с [1, 7]. Защитную среду для криоконсерви-
рования спермы карпа готовили по методике
Л.И. Цветковой [11], а быка – по методике
Ф.И. Осташко [10]. Все манипуляции с эмбрио-
нами мыши – выделение и подготовка к экспери-
ментам проводили по общепринятым методикам
[8]. В качестве криопротектора применяли раствор
1 М глицерина. Эмбрионы инкубировали в данном
растворе при 20 ± 2°С в течение 10 мин. После
замораживания-отогрева криопротектор отмывали
с помощью раствора 0,5 М сахарозы. Заморажи-
вание спермиев и эмбрионов осуществлялось в
разработанных нами устройствах, основанных на
пассивном охлаждении термоблока в горловине
сосудов Дьюара X-34 (V = 35 л) и X-5 (V = 5 л) [3].
Экспериментально полученные значения сред-
неквадратического отклонения эффективности i-го
этапа криоконсервирования биообъекта рассчиты-
вали по [1, 7]:
1
)(
1
2
−
−
=
∑
=
n
WW
k
j
jii
iσ , (9)
где Wji – эффективность криоконсервирования j-го
эмбриона (или спермодозы для спермиев), вычис-
ленная как отношение показателей сохранности
j-го биообъекта на i-м Sji и предшествующем Si–1
этапах криоконсервирования; n – общее количество
эмбрионов (спермодоз).
The suggested mathematical model was examined
on the base of the obtained results of bovine, carp sper-
matozoa and murine embryos’ cryopreservation [3–
6]. In each particular experiment just one technologic
parameter was changed according to [1, 7]. Protec-
tive medium for cryopreservation of carp sperm was
prepared according to L.I. Tsvetkova [11], for bovine
sperm the method of F.I. Ostashko [10] was used. All
manipulations with murine embryos such as obtaining
and preparing to the experiments were carried-out ac-
cording to the standard methods [8]. As cryoprotectant
1M glycerol solution was used. Embryos were incu-
bated in cryoprotectant solution at 20 ± 2°C during
10 min. Cryoprotectant was washed-out after freeze-
thawing using the 0.5 M sucrose solution. The sper-
matozoa and embryos were frozen-thawed in devel-
oped by us devices, which are based on passive cool-
ing of thermoblock in the neck of Dewar vessels X-34
(35 l) and X-5 (5 l).
The experimentally obtained values of root-mean-
square deviation of efficiency of bioobject i-th cryo-
preservation stage were evaluated [1,7]:
1
)(
1
2
−
−
=
∑
=
n
WW
k
j
jii
iσ , (9)
where Wji is efficiency of j-th embryo cryopreservation
(or dose for spermatozoa) calculated as the ratio of
j-th bioobject's integrity assessed at the i-th cryopreser-
vation stage Sji and the previous stage Sj–1; n is total
number of embryos (sperm doses).
Integrity Sji was determined as the ratio of nji, the
number of admissible j-th bioobject at i-th stage to nj0,
the initial number of j-th bioobject.
For reduction of root-mean-square deviation value
(9) the current values of integrity Wji of j-th bioobject,
assessed at the i-th stage of cryopreservation, Wi, were
averaged. This operation eliminates systemic errors of
experiments by transition from indirect measurements
to direct ones [1, 7].
Results and discussion
The mathematical model, based on the Bayes' for-
mula (2) and (3), was developed for determination of
the conditions of increase for cryobiological research
results’ reproducibility. For testing of the suggested
mathematical model the expressions (4–8) were used.
Efficiency indices were calculated by substitution of
virtual values of integrity of the bioobject, assessed at
different stages of cryopreservation: 80% after obtain-
ing, 70% after culturing, 60% after cryoprotectant ap-
plication and culturing, 50% after freeze-thawing and
culturing (Table 1). Variation coefficients made 50, 65,
82 and 100%, correspondingly. Obtained efficiency in-
dices for culturing made 88%, equilibration in cryopro-
ыпатЭ
яинаворивреснокоирк
аткеъбооиб
tcejbooiB
segatsnoitavreserpoyrc
%,ьтсоннархоС
%,ytirgetnI
%,ьтсонвиткеффЭ
ffE i %,ycneic
z h
S C
s
n
s
W C
w
n
w
еинечулоП
gniniatbO 08 05 004 - - - - -
еинаворивитьлуK
gnirutluC 07 56 686 88 83 922 37,1 00,3
яицарбиливкЭ
noitarbiliuqE 06 28 7601 68 14 762 00,2 00,4
еинавижаромаЗ
gnizeerF
05 001 0061
38 54 023 42,2 00,5
еинаворивреснокоирK
noitavreserpoyrC 36 77 069 92,1 76,1
250 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
Сохранность Sji определяли как отношение ко-
личества пригодного j-го биообъекта на i-м этапе
nji к начальному количеству j-го биообъекта nj0.
Для уменьшения величины среднеквадратичес-
кого отклонения (9) усредняли текущие значения
Wji относительной сохранности j-го биообъекта,
оцененного на i-м этапе криоконсервирования Wi.
Данная операция устраняет систематические
ошибки опытов посредством перехода от косвен-
ных измерений к прямым [1, 7].
Результаты и обсуждение
Для определения условий повышения воспроиз-
водимости результатов криобиологического иссле-
дования создана математическая модель, основой
которой являются формулы Байеса (2) и (3). Для
апробации предложенной математической модели
применяли выражения (4–8). Показатели эффек-
тивности рассчитывали посредством подстановки
виртуальных значений сохранности биообъекта,
оцененного на разных этапах криоконсервирования:
после получения – 80%, культивирования – 70%,
применения криопротектора и культивирования –
60%, процедур замораживания-оттаивания и куль-
тивирования – 50% (табл. 1). Коэффициенты вариа-
ции составили 50, 65, 82 и 100% соответственно.
Получены показатели эффективности для этапов:
культивирования – 88%, эквилибрации в криопро-
текторе – 86 %, замораживания-оттаивания – 83%,
полного цикла криоконсервирования – 63%. При
этом коэффициенты вариации снижаются до 38, 41,
Таблица 1. Уменьшение количества используемого биообъекта посредством
повышения воспроизводимости результатов криобиологического эксперимента
Table 1. Reduction of used bioobject’s amount by reproducibility increase
of cryobiological experimental results
45 и 77% соответственно.
Применение относи-
тельных показателей (3)
для оценки эффектив-
ности составляющих эта-
пов криоконсервирования
повышает воспроизводи-
мость результатов экспе-
римента в 1,3–2,2 раза,
что дает возможность по-
лучения достоверных
данных при уменьшении
количества используе-
мого биообъекта в 1,7–5
раз (табл. 1).
Для определения усло-
вий повышения воспроиз-
водимости результатов
криоконсервирования
биообъекта в зависимос-
ти от его начального сос-
тояния и эффективности
выбранного этапа(ов)
криоконсервирования
необходимо рассчитать
Примечание: S, W – средние значения; Cs, Cw – коэффициенты вариации; ns, nw – минимальное
количество биообъекта, обеспечивающее уровень надежности среднего значения Р = 0,95;
z – кратность повышения воспроизводимости результатов (6); h – коэффициент сокращения
количества биообъекта (8).
Note: S, W are mean values; Cs, Cw are coefficients of variation; ns, nw are minimum numbers of
bioobject, providing reliability level of mean value P = 0.95; z – increase multiplicity for repro-
ducibility of results (6); h – coefficient of bioobject’s amount reduction (8).
tectant did 86%, freeze-thawing did 83% and com-
plete cycle of cryopreservation did 63%. Herewith the
variation coefficients decrease down to 38, 41, 45 and
77%, correspondingly.
Use of relative indices (3) for evaluation of cryopre-
servation stages’ efficiency increases the reproduc-
ibility of experimental results in 1.3–2.2 times, enabling
to obtain significant data during reduction of the used
bioobject's amount in 1.7–5 times (Table 1).
To determine the conditions of bioobject cryopre-
servation results’ reproducibility increase in depend-
ence on its initial state and efficiency of the selected
stage(s) of cryopreservation it is necessary to calcu-
late the complete cycle of cryopreservation (1–8). The
obtained results show that considering the efficiency
of bioobject cryopreservation stage(s) increases the
reproducibility of the study results in 1.1–4.9 times in
the case if bioobject integrity decreases from 90 down
to 30% (Table 2). It enables the obtaining of signifi-
cant result even after reducing the amount number of
bioobject in 1.2–24 times [2]. Increasing the reproduc-
ibility of the results has been found when analyzing the
final stage of technological chain after decreasing of
biological object integrity (Tables 1 and 2).
For testing the suggested model the comparative
analysis of the calculated by (2) and (3) values and
empirically obtained from (1) data of cryopreservation
of various biological material (bovine and carp sper-
matozoa and murine embryos) was carried out (Table 3).
Analysis of experimentally obtained data showed that
efficiency of two-step cooling of carp spermatozoa
ьтсонвиткеффЭ
)во(апатэ
,яинаворивреснокоирк
%
ffE i foycneic
noitavreserpoyrc
(egats - %,)s
.де.лсу,итсомидовзиорпсовеинешывоП
stinuyrartibra,ytilibicudorperniesaercnI
%,аткеъбооибьтсоннархосяаньлачаН
%,stcejbooibfoytirgetnilaitinI
03 04 05 06 07 08 09 001
01 09,1 36,1 54,1 23,1 12,1 31,1 60,1 00,1
02 89,1 07,1 05,1 53,1 42,1 51,1 70,1 00,1
03 80,2 77,1 65,1 04,1 72,1 61,1 80,1 00,1
04 12,2 78,1 36,1 54,1 13,1 91,1 90,1 00,1
05 83,2 00,2 37,1 35,1 63,1 22,1 11,1 00,1
06 16,2 81,2 78,1 36,1 44,1 72,1 31,1 00,1
07 69,2 54,2 80,2 08,1 65,1 53,1 71,1 00,1
08 65,3 29,2 54,2 80,2 77,1 05,1 52,1 00,1
09 39,4 00,4 23,3 77,2 3,2 78,1 54,1 00,1
001 00,1 00,1 00,1 00,1 00,1 00,1 00,1 00,1
251 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
личных типов биологического материала: спер-
миев быка, карпа, эмбрионов мыши (табл. 3).
Анализ экспериментально полученных данных
показал, что эффективность двухступенчатого ох-
лаждения спермиев карпа достигает 58, а быка –
70%, что обеспечивает сохранность 45 и 52%
соответственно [3, 4]. Показатели эффективности
применения криопротектора составляют 92–94%
и режимов замораживания-оттаивания – 77–89%.
Более высокое значение эффективности криокон-
сервирования получено для эмбрионов мыши –
93%, на этапах применения криопротектора – 87%,
режима замораживания – 100%, при которых уро-
вень сохранности составил 80% [5, 6].
Установлено влияние вариации начального
состояния спермиев карпа на разброс показателей
их сохранности, оцененных на этапе инкубации с
криопротектором (51–67%) и после деконсервиро-
вания (35–52%). В результате применения пока-
зателя эффективности криоконсервирования дан-
ный разброс уменьшился более чем в 2 раза отно-
сительно сохранности и составил 68–78 и 46–51%
соответственно для каждого этапа [4].
Показано, что разные способы криоконсервиро-
вания спермиев карпа и вариация их различного
начального состояния дают практически одинако-
Таблица 2. Повышение воспроизводимости результатов эксперимента в
зависимости от начальной сохранности биообъекта и эффективности
выбранного этапа(ов) криоконсервирования
Table 2. Increase of reproducibility of experimental results depending on initial
integrity of bioobject and efficiency of chosen cryopreservation stage(s)
Примечание: см. табл. 1.
Note: see Table 1.
полный цикл криоконсерви-
рования (1–8). Полученные
результаты показывают,
что учет эффективности
составляющих этапа(ов)
криоконсервирования био-
объекта при снижении его
сохранности от 90 до 30%
повышает воспроизводи-
мость результатов иссле-
дования в 1,1–4,9 раза
(табл. 2). Это дает возмож-
ность получить достовер-
ный результат при уменьше-
нии количества биообъекта
в 1,2–24 раза [2]. Повыше-
ние воспроизводимости ре-
зультатов установлено при
анализе завершающих эта-
пов технологической цепи
вследствие снижения со-
хранности биологического
объекта (табл. 1, 2).
Для проверки предло-
женной модели проведен
сравнительный анализ рас-
четных значений по (2) и
(3) и эмпирически полу-
ченных данных по (1) после
криоконсервирования раз-
achieved 58 and bovine done 70%, that provided in-
tegrity of 45 and 52%, correspondingly [3, 4]. Effi-
ciency of cryoprotectant application made 92–94% and
freeze-thawing regimens did 77–89%. Higher efficien-
cy value was obtained for murine embryos, 93%; for
the stages of cryoprotectant application it made 87%
and for freezing regimen it was 100%, where the in-
tegrity level was 80% [5, 6].
It has been established that the effect of variation
of carp spermatozoa initial state on the dispersion of
their integrity indices, assessed at the stage of incuba-
tion in cryoprotectant, was 51–67% and after freeze-
thawing it was 35–52%. After application of cryopre-
servation efficiency index this dispersion decreased
twice for integrity and made 68–78 and 46–51%, cor-
respondingly, for each stage [4].
It has been shown that different methods of carp
spermatozoa cryopreservation and variation of their
initial state provide almost the same dispersion of in-
tegrity indices, 35–53 and 35–52%, correspondingly.
When estimating the efficiency of cryopreservation the
dispersion of the values made 44–67% for different
methods of freezing spermatozoa, derived from one
ejaculate. When using different ejaculates and one
method of freezing the dispersion made 53–65% (ini-
tial motility of spermatozoa varied from 60 to 90%).
252 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
вый разброс показателей сохранности 35–53 и 35–
52% соответственно. При оценке эффективности
криоконсервирования разброс значений составляет
44–67% для разных способов замораживания спер-
миев, полученных из одного эякулята. При исполь-
зовании разных эякулятов и одного способа замо-
раживания разброс составил 53–65% (начальная
подвижность спермиев варьировала от 60 до 90%).
При почти одинаковой начальной подвижности
спермиев быка 70–80% и разных способах крио-
консервирования разброс показателей их сохран-
ности составил 13–52%, а эффективности – 20–70%.
Переход к показателям эффективности дает
возможность в 2 раза уменьшить влияние качества
(от удовлетворительного до отличного) эмбрионов
мыши на оценку этапов выбранного способа крио-
консервирования: инкубация с криопротектором –
77–95%, режим охлаждения-отогрева – 73–93%.
Состояние эмбрионов оценивали по морфологичес-
ким показателям и развитию в культуре in vitro [5,
6]. При вариации начального состояния эмбрионов
мыши (от удовлетворительного до отличного)
разброс сохранности деконсервированного объек-
та составил 31–80%, что в 1,4 раза больше (см.
табл. 2), чем расхождение сохранности – 52–86%,
обусловленное выбором способа криоконсервиро-
вания. При использовании показателей эффектив-
ности криоконсервирования биообъекта разброс
уменьшился в 1,6 раза относительно сохранности
и составил 64–83 и 63–93% соответственно.
Для исследования вариации показателей со-
хранности и эффективности проанализированы
величины их коэффициентов вариации (табл. 3). В
результате сопоставления коэффициентов вариации
ткеъбооиБ
tcejbooiB
МйелетазакопсорбзаР
nim
÷М
хam
%,}С,W,S{М,
МsecidnifonoisrepsiD
nim
÷М
хam
%,}С,W,S{М,
S С
S
W С
W
С=z
S
С/
W
иимрепС
апрак
mrepspraC
53 ÷ 35
53( ÷ )25
49 ÷ 731
69( ÷ )631
44 ÷ 76
35( ÷ )56
07 ÷ 311
37( ÷ )49
2,1 ÷ 3,1
3,1( ÷ )5,1
иимрепС
акыб
enivoB
mreps
31 ÷ 25 69 ÷ 852 02 ÷ 07 66 ÷ 002 3,1 ÷ 5,1
ыноирбмЭ
ишым
eniruM
soyrbme
25 ÷ 68
13( ÷ )08
04 ÷ 69
05( ÷ )941
36 ÷ 39
46( ÷ )38
03 ÷ 63
83( ÷ )64
3,1 ÷ 7,2
3,1( ÷ )2,3
Таблица 3. Воспроизводимость сохранности биообъекта (S) и
эффективности его криоконсервирования (W), обусловленная
выбором технологии (различным начальным состоянием)
Table 3. Reproducibility of integrity of S bioobject and W efficiency of
its cryopreservation, due to the technology selected
(various initial state)
Примечание: см. табл. 1.
Note: see Table 1.
(6) установлено увеличение в 1,2–3,8
раза воспроизводимости результатов
опытов при использовании показателей
эффективности (3) относительно сохран-
ности (1). Такое расхождение получен-
ных величин объясняется влиянием
разного начального состояния биообъек-
та, с одной стороны, и особенностями
последовательно применяемых мето-
дов криоконсервирования, с другой, на
состояние исследуемой системы крио-
консервирования.
Выявлена следующая закономер-
ность: чем больше разброс сохраннос-
ти, тем выше чувствительность показа-
теля эффективности к оценке состоя-
ния анализируемого способа криокон-
сервирования. Различное начальное
состояние эмбрионов дает более высо-
кие показатели коэффициентов вариа-
ции, оцененные по сохранности (50–
149%) и эффективности (38–46%), чем
выбор способа криоконсервирования
Use of quite similar initial motility of bovine spermato-
zoa 70–80% and different methods of cryopreser-vation
provides the range of their integrity indices of 13–52%,
and efficiency of 20–70%.
The transition to the efficiency indices enables the
double decrease of murine embryo quality influence
(from satisfactory to excellent) on the estimation of
chosen cryopreservation protocol stages: application
of cryoprotectant gave 77–95% and cooling-thawing
regimen does 73–93%. State of embryos was assessed
by morphological indices and in vitro development [5,
6]. When varying the initial state of murine embryos
(from satisfactory to excellent) the dispersion of fro-
zen-thawed object integrity made 31–80% which is in
1.4 times (see Table 2) higher than the integrity disper-
sion of 52–86% due to selection of cryopreservation
method. When using the indices of bioobject cryopre-
servation efficiency the dispersion decreased in 1.6
times as for integrity and made 64–83 and 63–93%,
correspondingly.
For study of integrity and efficiency indices’ varia-
tion the values of its variation coefficients were analy-
zed (Table 3). After the correlation of variation coeffi-
cients (6) the increase of experimental results’ repro-
ducibility in 1.2–3.8 times was established when using
the efficiency indices (3) relative to integrity (1). This
difference of the obtained values is explained by the
effect of different initial states of bioobject on the one
hand, and peculiarities of sequentially applied cryopre-
servation methods on the state of cryopreservation stud-
ied system, on another hand.
The following regularity was found: the higher is
integrity variation, the higher is the sensitivity of effi-
ciency index to the estimation of analyzed cryopreser-
253 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
(40–96 и 30–36% соответственно). Влияние различ-
ного качества эмбрионов мыши на вариацию со-
хранности биообъекта в 1,3–3,2 раза больше, чем
выбор способа криоконсервирования.
Таким образом, применение в качестве инстру-
мента научного исследования методов математичес-
кого моделирования повышает воспроизводимость
результатов криобиологического эксперимента.
Данная модель позволяет определить эффективность
выбранного способа криоконсервирования и его со-
ставляющих этапов. Показано, что на оценку сохран-
ности спермиев и эмбрионов животных оказывают
влияние начальное состояние биообъекта и особен-
ности этапов выбранного способа криоконсервиро-
вания. Низкая воспроизводимость результатов
сохранности деконсервированных спермиев и эмб-
рионов животных, а также отсутствие возможности
их сопоставления при использовании разных методов
проведения эксперимента обусловили необходимость
применения предложенных критериев оценки эффек-
тивности разных этапов криоконсервирования. При
переходе к показателям эффективности повышается
воспроизводимость опытов в среднем в 1,5 раза, что
обеспечивает условие сопоставимости результатов,
полученных в разных опытах. Поэтому учет состоя-
ния биообъекта и выбранного способа криоконсер-
вирования посредством описанной модели может
быть основой многофакторного исследования меха-
низмов криоповреждения объекта с целью дальней-
шего повышения эффективности криоконсервиро-
вания спермиев и эмбрионов животных.
Выводы
1. Повышение воспроизводимости результатов
исследования обеспечивается учетом начального
состояния биологического материала и эффектив-
ности этапов его криоконсервирования.
2. Применение предложенной математической
модели повышает воспроизводимость результатов
исследования до 5 раз, что дает возможность полу-
чить достоверный результат при снижении расхода
биологического материала до 25 раз.
3. Экспериментальная проверка предложенной
модели показала высокую сходимость полученных
результатов. Переход к предложенным показате-
лям оценки эффективности криоконсервирования
спермиев быка и карпа, эмбрионов мыши повы-
шает воспроизводимость результатов в среднем
в 1,5 раза, что дает возможность сопоставлять
результаты, полученные в разных опытах.
vation method state. Different initial state of embryos
provides higher indices of variation coefficients during
estimationd of integrity (50–149%) and efficiency (38–
46%) if compared with the effect of chosen cryopre-
servation method (40–96 and 30–36%, correspond-
ingly). Effect of various quality of murine embryos on
variation of bioobject's integrity is 1.3–3.2 times higher
than effect of cryopreservation method selection.
Thus, application of the methods of mathematical
modeling as the scientific research tool increases the
reproducibility of the results of cryobiological experi-
ment. This model enables to determine the efficiency
of the selected method of cryopreservation and its par-
ticular stages. It has been shown that initial state of
bioobject and peculiarities of stages of the selected
cryopreservation method affect the estimation of in-
tegrity of animal spermatozoa and embryos. Low re-
producibility of the integrity results of frozen-thawed
animal spermatozoa and embryos and also the absence
of possibility of their correlation when using different
methods of carrying-out the experiment stipulated the
necessity of application of the suggested criteria of
efficiency estimation for various cryopreservation
stages. When transit to the efficiency indices the ex-
perimental reproducibility increases in average in 1.5
times providing condition of correlation of the results,
obtained in different experiments. Therefore, taking into
account the bioobject’s state and the selected method
of cryopreservation by means of described model may
be the base of multifactor research of the mechanisms
of bioobject's cryodamage for the further increase of
efficiency of animal spermatozoa and embryos cryopre-
servation .
Conclusions
1. Taking into account the initial condition of bio-
logical material and efficiency of its cryopreservation
stages provides an increased reproducibility of the re-
search results.
2. Using the suggested mathematical model in-
creases the reproducibility of results up to 5 times, ena-
bling to obtain significant result when reducing the us-
age of biological material to 25 times.
3. Experimental test of the suggested model showed
a high convergence of the obtained results. Transition
to the suggested indices for estimating the efficiency
of bovine, carp spermatozoa and murine embryos’
cryopreservation increase reproducibility of results in
average in 1.5 times, enabling the correlation of the
results obtained in various experiments.
References
Glants S. Medical-biological statistics.– Moscow: Praktika,
1998.– 459 p.
1.
Литература
Гланц С. Медико-биологическая статистика.– М.: Практи-
ка, 1998.– 459 с.
1.
254 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
Горбунов Л.В. Определение минимального количества
измерений, обеспечивающего достоверный научный
результат // Агроекологічний журнал.– 2002.– Вип. 1.–
С. 69–71.
Горбунов Л.В., Бучацкий Л.П. Криоконсервация половых
клеток и эмбрионов.– Киев, 2005.– 325 с.
Горбунов Л.В., Бучацький Л.П. Вплив різної якості еяку-
ляту на оцінку ефективності реалізації складових етапів
кріоконсервування сперміїв коропа // Рибне господарст-
во.– 2007.– Вип. 1.– С. 32–35.
Горбунов Л.В., Саліна А.С. Вплив різної якості ембріонів
мишей на оцінку способу кріоконсервування // НТБ ІБТ
УААН.– 2007.– Вип. 8, №1, 2.– С. 283–287.
Горбунов Л.В., Саліна А.С. Оценка эффективности
составляющих этапов способа криоконсервирования
эмбрионов млекопитающих // Наук. вісник Націон. аграр.
ун-ту.– 2007.– Вип. 114.– С. 57–64.
Лакин Б.Ф. Биометрия.– М.: Высш. шк., 1990.– 254 с.
Манк М. Биология развития млекопитающих. Методы.–
М.: Мир, 1990.– 406 с.
Орлов А.И. Высокие статистические технологии // Завод-
ская лаборатория.– 2003.– Т. 69, №11.– С. 55-60.
Осташко Ф.И. Биотехнология воспроизведения крупного
рогатого скота.– Киев: Наук. думка, 1995.– 195 с.
Цветкова Л.И., Савушкина С.И., Титарева Л.Н. и др.
Методическое пособие по криоконсервации спермы
карпа лососевых и осетровых видов рыб.– М., 1997.–
11 с.
Поступила 16.11.2009
Рецензент А.И. Осецкий
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Gorbunov L.V. Examining minimal number of measurings,
providing significant scientific result // Agroekologichnyy
zhurnal.– 2002.– Issue 1.– P. 69–71.
Gorbunov L.V., Buchatskiy L.P. Cryopreservation of sexual
cells and embryos.– Kiev, 2005.– 325 p.
Gorbunov L.V., Buchatskiy L.P. Effect of different ejaculate
quality on implementation efficiency estimation of the
cryopreservation comprising stages for carp spermatozoa //
Rybne Gospodarstvo.– 2007.– Issue 1.– P. 32–35.
Gorbunov L.V., Salina A.S. Effect of different quality of
murine embryos on estimation of cryopreservation method//
Scientific and Technical Bulletin of the Institute of Animal
Breeding Biology of Ukrainian Academy of Agrarian Scien-
ces.– 2007.– Issue 8, N1, 2.– P. 283–287.
Gorbunov L.V., Salina A.S. Efficiency estimation of the
comprising stages of cryopreservation method for mammalian
embryos // Nauk. Visnyk of National Agrarian University.–
2007.– Issue 114.– P. 57–64.
Lakin B.F. Biometriya.– Moscow: Vysshaya shkola, 1990.–
254 p.
Monk M. Mammalian development. A practical approach.–
Oxford: IRL Press, 1987.– 335 p.
Orlov A.I. High statistical technologies // Zavodskaya
Laboratoriya.– 2003.– Vol. 69, N11.– P. 55–60.
Ostashko F.I. Cattle reproduction biotechnology.– Kiev:
Naukova Dumka, 1995.– 195 p.
Tsvetkova L.I., Savushkina S.I., Titareva L.N. et al. Methodical
manual on cryopreservation of carp, salmon and sturgeon
spermatozoa.– Moscow, 1997.– 11 p.
Accepted in 16.11.2009
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
|