Одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та Fc-фрагментів антитіл, методом злиття scFv-антитіл із стафілококовим білком A
Мета. Розробити підхід для детекції scFv та їхніх комплексів з антигенами. Методи. Сконструювано гібридні білки, які містять послідовності scFv до субодиниці В дифтерійного токсину і стафілококового білка А, та з використанням імунохімічних методів охарактеризовано отримані біфункціональні молекули....
Збережено в:
| Дата: | 2009 |
|---|---|
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Ukrainian |
| Опубліковано: |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України
2009
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/5654 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та Fc-фрагментів антитіл, методом злиття scFv-антитіл із стафілококовим білком A / О.С. Олійник, А.А. Кабернюк, Т.А. Редчук, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко // Біополімери і клітина. — 2009. — Т. 25, № 3. — С. 245–249. — Бібліогр.: 16 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-5654 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-56542010-02-02T12:01:25Z Одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та Fc-фрагментів антитіл, методом злиття scFv-антитіл із стафілококовим білком A Олійник, О.С. Кабернюк, А.А. Редчук, Т.А. Колибо, Д.В. Комісаренко, С.В. Короткі повідомлення Мета. Розробити підхід для детекції scFv та їхніх комплексів з антигенами. Методи. Сконструювано гібридні білки, які містять послідовності scFv до субодиниці В дифтерійного токсину і стафілококового білка А, та з використанням імунохімічних методів охарактеризовано отримані біфункціональні молекули. Результати. Показано, що scFv, злиті з білком А, та їхні комплекси з антигеном можна ефективно виявляти міченими імуноглобулінами довільної антигенної специфічності. Виснов ки. Злиття з фрагментом білка А є перспективним підходом, що дозволяє підвищити ефективність застосування scFv в імуноферментному аналізі. Отримані scFv, об’єднані із білком А, можуть бути використані при створенні тест-систем для виявлення дифтерійного токсину. Aim. To develop approach for detection of scFv and their complexes with antigens. Methods. The fusion proteins, which include sequences of scFv and staphylococcal protein A, were constructed and the obtained bifunctional molecules were immunochemically analysed. Results. It was shown, that scFv fused with protein A and their complexes with antigens are effectively recognized by labelled immunoglobulins with unrestricted antigenic specificity. Conclusions. The fusion of scFv with protein A fragment is a perspective approach to increase the efficiency of application in ELISA. The obtained scFv, fused with protein A, could be used for development of test-systems for the detection of diphtheria toxin. 2009 Article Одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та Fc-фрагментів антитіл, методом злиття scFv-антитіл із стафілококовим білком A / О.С. Олійник, А.А. Кабернюк, Т.А. Редчук, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко // Біополімери і клітина. — 2009. — Т. 25, № 3. — С. 245–249. — Бібліогр.: 16 назв. — укр. 0233-7657 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/5654 577.27:616.097 uk Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Короткі повідомлення Короткі повідомлення |
| spellingShingle |
Короткі повідомлення Короткі повідомлення Олійник, О.С. Кабернюк, А.А. Редчук, Т.А. Колибо, Д.В. Комісаренко, С.В. Одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та Fc-фрагментів антитіл, методом злиття scFv-антитіл із стафілококовим білком A |
| description |
Мета. Розробити підхід для детекції scFv та їхніх комплексів з антигенами. Методи. Сконструювано гібридні білки, які містять послідовності scFv до субодиниці В дифтерійного токсину і стафілококового білка А, та з використанням імунохімічних методів охарактеризовано отримані біфункціональні молекули. Результати. Показано, що scFv, злиті з білком А, та їхні комплекси з антигеном можна ефективно виявляти міченими імуноглобулінами довільної антигенної специфічності. Виснов ки. Злиття з фрагментом білка А є перспективним підходом, що дозволяє підвищити ефективність застосування scFv в імуноферментному аналізі. Отримані scFv, об’єднані із білком А, можуть бути використані при створенні тест-систем для виявлення дифтерійного токсину. |
| format |
Article |
| author |
Олійник, О.С. Кабернюк, А.А. Редчук, Т.А. Колибо, Д.В. Комісаренко, С.В. |
| author_facet |
Олійник, О.С. Кабернюк, А.А. Редчук, Т.А. Колибо, Д.В. Комісаренко, С.В. |
| author_sort |
Олійник, О.С. |
| title |
Одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та Fc-фрагментів антитіл, методом злиття scFv-антитіл із стафілококовим білком A |
| title_short |
Одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та Fc-фрагментів антитіл, методом злиття scFv-антитіл із стафілококовим білком A |
| title_full |
Одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та Fc-фрагментів антитіл, методом злиття scFv-антитіл із стафілококовим білком A |
| title_fullStr |
Одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та Fc-фрагментів антитіл, методом злиття scFv-антитіл із стафілококовим білком A |
| title_full_unstemmed |
Одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та Fc-фрагментів антитіл, методом злиття scFv-антитіл із стафілококовим білком A |
| title_sort |
одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та fc-фрагментів антитіл, методом злиття scfv-антитіл із стафілококовим білком a |
| publisher |
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України |
| publishDate |
2009 |
| topic_facet |
Короткі повідомлення |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/5654 |
| citation_txt |
Одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та Fc-фрагментів антитіл, методом злиття scFv-антитіл із стафілококовим білком A / О.С. Олійник, А.А. Кабернюк, Т.А. Редчук, Д.В. Колибо, С.В. Комісаренко // Біополімери і клітина. — 2009. — Т. 25, № 3. — С. 245–249. — Бібліогр.: 16 назв. — укр. |
| work_keys_str_mv |
AT olíjnikos oderžannâbífunkcíonalʹnihmolekulspecifíčnihdoantigenutafcfragmentívantitílmetodomzlittâscfvantitílízstafílokokovimbílkoma AT kabernûkaa oderžannâbífunkcíonalʹnihmolekulspecifíčnihdoantigenutafcfragmentívantitílmetodomzlittâscfvantitílízstafílokokovimbílkoma AT redčukta oderžannâbífunkcíonalʹnihmolekulspecifíčnihdoantigenutafcfragmentívantitílmetodomzlittâscfvantitílízstafílokokovimbílkoma AT kolibodv oderžannâbífunkcíonalʹnihmolekulspecifíčnihdoantigenutafcfragmentívantitílmetodomzlittâscfvantitílízstafílokokovimbílkoma AT komísarenkosv oderžannâbífunkcíonalʹnihmolekulspecifíčnihdoantigenutafcfragmentívantitílmetodomzlittâscfvantitílízstafílokokovimbílkoma |
| first_indexed |
2025-07-02T08:42:22Z |
| last_indexed |
2025-07-02T08:42:22Z |
| _version_ |
1836524139290034176 |
| fulltext |
Îäåð æàí íÿ á³ôóíêö³îíàëü íèõ ìî ëå êóë, ñïå öèô³÷íèõ
äî àí òè ãå íó òà Fc-ôðàã ìåíò³â àí òèò³ë, ìå òî äîì
çëèò òÿ scFv-àí òèò³ë ³ç ñòàô³ëî êî êî âèì á³ëêîì A
Î. Ñ. Îë³éíèê, À. À. Êà áåð íþê, Ò. À. Ðåä ÷óê, Ä. Â. Êî ëè áî, Ñ. Â. Êîì³ñà ðåíêî
²íñòè òóò á³îõ³ì³¿ ³ì. Î. Â. Ïàë ëàä³íà ÍÀÍ Óêðà¿ íè
Âóë. Ëå îí òî âè ÷à, 9, Êè¿â, Óêðà¿ íà, 01601
lenaoliinyk@mail.ru
Ìåòà. Ðîç ðî áè òè ï³äõ³ä äëÿ äå òåêö³¿ scFv òà ¿õí³õ êîì ïëåêñ³â ç àí òè ãå íà ìè. Ìå òî äè. Ñêî íñòðó þ âà -
íî ã³áðèäí³ á³ëêè, ÿê³ ì³ñòÿòü ïîñë³äîâ íîñò³ scFv äî ñóá îäè íèö³  äèô òåð³éíî ãî òîê ñè íó ³ ñòàô³ëî -
êî êî âî ãî á³ëêà À, òà ç âè êî ðèñ òàí íÿì ³ìó íîõ³ì³÷íèõ ìå òîä³â îõà ðàê òå ðè çî âà íî îò ðè ìàí³ á³ôóíê-
ö³îíàëüí³ ìî ëå êó ëè. Ðå çóëü òà òè. Ïî êà çà íî, ùî scFv, çëèò³ ç á³ëêîì À, òà ¿õí³ êîì ïëåê ñè ç àí òè ãå íîì
ìîæ íà åôåê òèâ íî âè ÿâ ëÿ òè ì³÷å íè ìè ³ìó íîã ëî áóë³íàìè äîâ³ëüíî¿ àí òè ãåí íî¿ ñïå öèô³÷íîñò³. Âèñ -
íîâ êè. Çëèò òÿ ç ôðàã ìåí òîì á³ëêà À º ïåð ñïåê òèâ íèì ï³äõî äîì, ùî äîç âî ëÿº ï³äâè ùè òè åôåê -
òèâí³ñòü çà ñòî ñó âàí íÿ scFv â ³ìó íî ôåð ìåí òíî ìó àíàë³ç³. Îòðè ìàí³ scFv, îá’ºäíàí³ ³ç á³ëêîì À,
ìî æóòü áóòè âè êî ðèñ òàí³ ïðè ñòâî ðåíí³ òåñò-ñèñ òåì äëÿ âè ÿâ ëåí íÿ äèô òåð³éíî ãî òîê ñè íó.
Êëþ ÷îâ³ ñëî âà: scFv, äèô òåð³éíèé òîê ñèí, á³ôóíêö³îíàëüí³ ìî ëå êó ëè.
Âñòóï. Îäíî ëàí öþ ãîâ³ âàð³àáåëüí³ ôðàã ìåí òè
(scFv – â³ä àíãë. single chain variable fragment) àí -
òèò³ë ì³ñòÿòü âàð³àáåëüí³ äî ìå íè âàæ êî ãî òà ëåã êî -
ãî ³ìó íîã ëî áóë³íî âèõ ëàí öþã³â, îá’ºäíàí³ ãíó÷ êèì
ë³íêå ðîì. scFv çà çâè ÷àé âî ëîä³þòü òà êè ìè æ ñïå -
öèô³÷í³ñòþ òà àô³íí³ñòþ, ÿê ³ âèõ³äí³ ïî âíî -
ðîçì³ðí³ àí òèò³ëà [1], õî÷à íå ì³ñòÿòü CL, CH1 òà
Fc-ôðàã ìåíò³â ³ìó íîã ëî áóë³í³â.
scFv çíàé øëè ñâîº çà ñòî ñó âàí íÿ ó áà ãàòü îõ ïðè -
êëàä íèõ ³ ôóí äà ìåí òàëü íèõ íà ïðÿì êàõ, çîê ðå ìà, ÿê
ïî âíî ðîçì³ðí³ àí òèò³ëà, ¿õ òà êîæ àê òèâ íî âè êî ðèñ -
òî âó þòü â ³ìó íîä³àã íîñ òèö³. Íà æàëü, äîñ³ íå ³ñíóº
óí³âåð ñàëü íèõ ñèñ òåì äëÿ äå òåêö³¿ scFv òà ¿õí³õ
êîìïëåêñ³â ç àí òè ãå íîì. Öÿ ïðî áëå ìà ³ íà ðàç³ çà ëè -
øàºòüñÿ àê òó àëü íîþ, õî÷à é çà ïðî ïî íî âà íî íèç êó
ìå òî äè÷ íèõ ï³äõîä³â äëÿ ñïðî ùåí íÿ äå òåêö³¿ scFv.
Øè ðî êî ïî øè ðå íèì ï³äõî äîì º îò ðè ìàí íÿ
scFv, çëè òèõ ç áàê òåð³àëü íîþ ëóæ íîþ ôîñ ôà òà çîþ
[2, 3]. Òàê³ ìî ëå êó ëè ì³ñòÿòü îä íî ÷àñ íî ³ ôðàã ìåíò
àí òèò³ëà, ³ ôåð ìåíò, ÿêèé êà òàë³çóº ðå àêö³þ, âíà-
ñë³äîê ÷î ãî â³çó àë³çó þòü ñÿ ðå çóëü òà òè àíàë³çó òà
ñòຠìîæ ëè âèì âè ÿâ ëåí íÿ àí òè ãå íó â ïðÿ ìî ìó ³ìó -
íî ôåð ìåí òíî ìó àíàë³ç³. Ö³êà âèé ï³äõ³ä ðîç ðîá ëå íî
àâ òî ðà ìè [4] – âîíè îò ðè ìàëè scFv, ì³÷åí³ ñòðåï -
òàâ³äèí-çâ’ÿ çó âàëü íèì á³ëêîì, ùî äîç âî ëè ëî âè êî -
ðèñ òî âó âà òè äëÿ äå òåêö³¿ êî ìåðö³éíî äîñ òóï íèé
êîí ’þ ãàò ñòðåï òàâ³äè íó ç ïå ðîê ñè äà çîþ. Îäåð æà íî
é scFv, çëèò³ ³ç ñòðåï òàâ³äè íîì. Ó öüîìó ðàç³ äëÿ äå -
òåêö³¿ çà ñòî ñî âà íî á³îò èí³ëüî âà íó ïå ðîê ñè äà çó [5].
Âàð òî çãà äà òè òà êîæ scFv, îá’ºäíàí³ â ð³çíèõ
êîìá³íàö³ÿõ ³ç êîí ñòàí òíè ìè äî ìå íà ìè [6], òà
ã³áðè äè scFv ³ç ôëó î ðåñ öåí òíè ìè á³ëêà ìè [7]. Â
ïåð øî ìó âè ïàä êó äëÿ äå òåêö³¿ âè êî ðèñ òî âó þòü êî -
ìåðö³éíî äîñ òóïí³ ì³÷åí³ àí òèò³ëà, ñïå öèô³÷í³ äî
Fc-ôðàã ìåíò³â, ó äðó ãî ìó – ïðî âî äÿòü ïðÿ ìèé ôëó -
î ðåñ öåí òíèé àíàë³ç.
Äëÿ ñïðî ùåí íÿ äå òåêö³¿ scFv â ³ìó íî ôåð ìåíò-
íî ìó àíàë³ç³ â äàí³é ðî áîò³ çà ïðî ïî íî âà íî îá’ºä-
245
ISSN 0233-7657. Biopolymers and Cell. 2009. Vol. 25. N 3
Ó Institute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine, 2009
íà òè scFv ç ôðàã ìåí òîì á³ëêà À Staphylococcus
aureus. Êîæ íèé ç äî ìåí³â ñòàô³ëî êî êî âî ãî á³ëêà À
çäàò íèé çâ’ÿ çó âà òè ñÿ ç êîí ñòàí òíè ìè ä³ëÿí êà ìè
³ìó íîã ëî áóë³í³â áà ãàòü îõ âèä³â ññàâö³â [8], ùî ðî -
áèòü éî ãî ïåð ñïåê òèâ íèì «ô’þ æèí»-ïàð òíå ðîì
äëÿ ïî çáàâ ëå íèõ êîí ñòàí òíèõ äî ìåí³â scFv. Òàê, íà
ïî ÷àò êó 90-õ ðîê³â ìè íó ëî ãî ñòîë³òòÿ áó ëî ïî êà çà -
íî, ùî ïîä³áí³ ã³áðè äè scFv òà ïî âíî ðîçì³ðíî ãî
á³ëêà À óñï³øíî ïðà öþ þòü ó ðå àêö³¿ ïîäâ³éíî¿ ³ìó -
íî äè ôó糿 â ãåë³ [9] òà â ³ìó íîá ëî òèí ãó [10]. Îñ-
ê³ëüêè á³ëîê À ðå à ãóº ç ä³ëÿí êà ìè àí òèò³ë, ðîç òà øî -
âà íè ìè ïî çà àê òèâ íèì öåí òðîì, àí òè ãåí íà ñïå -
öèô³÷í³ñòü àí òèò³ëà º íå ñóòòºâîþ äëÿ çâ’ÿ çó âàí íÿ ç
á³ëêîì À. Îòæå, äëÿ äå òåêö³¿ scFv-àí òèò³ë, çëè òèõ ç
ôðàã ìåí òîì á³ëêà À, ïðèäàòíèì º øèðîêèé ñïåêòð
ì³÷åíèõ ³ìóíîãëîáóë³í³â.
Ìà òåð³àëè ³ ìå òî äè. Ñòâî ðåí íÿ ðå êîìá³íàí-
òíèõ ïëàçì³ä äëÿ åêñïðåñ³¿ ã³áðèä íî ãî á³ëêà
SpA-scFv â Escherichia coli. Äëÿ àìïë³ô³êàö³¿ ïî -
ñë³äîâ íîñò³, ùî êî äóº ôðàã ìåíò á³ëêà À (éî ãî E-,
D-, A- òà Â-äî ìå íè) âè êî ðèñ òà íî ïà ðó ïðàé ìåð³â ç
íà âå äå íîþ ïîñë³äîâí³ñòþ –
ñåí ñî âèé:
GTGTGCGGCCGCAGCTGCGCAACACGATGAAGC;
àí òè ñåí ñî âèé:
GTGGTGCTCGAGTTGTTTTGGTGC.
Ó ïî ñë³äîâ íîñò³ ïðàé ìåð³â ï³äêðåñ ëå íî ñàé òè
äëÿ åí äî íóê ëå àç ðåñ òðèêö³¿ NotI òà XhoI. ÏËÐ-
àìïë³ô³êàö³þ ïðî âî äè ëè â òà êî ìó ðå æèì³:
5 õâ – äå íà òó ðàö³ÿ çà t = 94 °Ñ, 30 öèêë³â çà ñõå -
ìîþ: 30 ñ – 94 °Ñ, 30 ñ – 63 °Ñ, 30 ñ – 72 °Ñ ³ íà -
ñàìê³íå öü äî áó äî âà ïðî òÿ ãîì 7 õâ çà t = 72 °Ñ.
Ïîñë³äîâí³ñòü, ùî êî äóº ôðàã ìåíò á³ëêà À,
îá’ºäíó âà ëè ç ïî ñë³äîâí³ñòþ ðÅÒ-22b çà ñàé òà -
ìè äëÿ åí äî íóê ëå àç ðåñ òðèêö³¿ NotI òà XhoI.
Îòðè ìà íîþ ë³ãàç íîþ ñóì³øøþ òðàíñ ôîð ìó âà -
ëè êë³òè íè E. coli DH10B ³ â³äáè ðà ëè êî ëîí³¿ –
íîñ³¿ ñêî íñòðó éî âà íî¿ ïëàçì³äè pSpA22b.
Ïîñë³äîâ íîñò³ scFv ñóá êëî íó âà ëè ó âåê òîð
ðSpA22b çà ñàé òà ìè äëÿ åí äî íóê ëå àç NotI òà NcoI.
Ïðî äó öåí òîì ñëó ãó âàâ øòàì E. coli Rosetta. Óñ³
ïðî öå äó ðè ïðî âî äè ëè çã³äíî ç [11] òà ðå êî ìåí -
äàö³ÿìè âè ðîá íè êà. Âè êî ðèñ òî âó âà ëè ðå àê òè âè âè -
ðîá íèö òâà ô³ðìè «Fermentas» (Ëèòâà).
Î÷è ùåí íÿ çëè òèõ á³ëê³â SpA-scFv. Âèä³ëåí íÿ
ïðî âî äè ëè íà êî ëîíö³ îá’ºìîì 1 ìë ³ç ñî ðáåí òîì
Ni-NTA-àãà ðîçîþ ç ðîç ÷èí íî¿ òà íå ðîç ÷èí íî¿
ôðàêö³é.  îñòàí íüî ìó âè ïàä êó äëÿ ïå ðå âå äåí íÿ â
àê òèâ íó ôîð ìó çä³éñíþ âà ëè ðå ôîë äèíã çã³äíî ç ìå -
òî äè êîþ, îïè ñà íîþ ðàí³øå[12]. Î÷è ùåí³ á³ëêè
àíàë³çó âà ëè åëåê òðî ôî ðå çîì ó 10 %-ìó ÏÀÀà [13].
Îäðà çó ï³ñëÿ âèä³ëåí íÿ çðàç êè çì³øó âà ëè (1:1) ç
ãë³öå ðî ëîì ³ çáåð³ãà ëè çà t = –20 îC.
²ìó íî ôåð ìåí òíèé àíàë³ç. Âè êî ðèñ òî âó âà ëè
96-ëóí êîâ³ ïëàí øå òè âè ðîá íèö òâà «Spektar»
(Ñåðá³ÿ). Óñ³ ðîç ÷è íè äî äà âà ëè ïî 100 ìêë íà ëóí êó
òà ïî ñë³äîâ íî ³íêó áó âà ëè ïðî òÿ ãîì 1 ãîä çà t =
= 37 °Ñ, ï³ñëÿ êîæ íî¿ ³íêó áàö³¿ ëóí êè òðè÷³ ïðî ìè -
âà ëè. Àíòèãåíè (ðå êîìá³íà íòíà ñóá îäè íè öÿ  äèô -
òåð³éíî ãî òîê ñè íó [14] ÿê ñïå öèô³÷íèé àáî ñè ðî âàò -
êî âèé àëü áóì³í áè êà äëÿ íå ãà òèâ íî ãî êîí òðî ëþ)
íà íî ñè ëè â êîí öåí òðàö³¿ 10 ìêã/ìë ó ÇÔÐ (0,8 %
NaCl, 0,02 % KCl, 0,144 % Na2HPO4, 0,024 %
KH2PO4, pH 7,4). Ïîò³ì ³íêó áó âà ëè ðîç ÷èí 1 %-ãî
çíå æè ðå íî ãî ìî ëî êà ó ÇÔÐ. Î÷è ùåí³ SpA-scFv âíî -
ñè ëè â áó ôåð³ ÒÔÁ (ÇÔÐ, ùî ì³ñòèâ 0,04 % òâ³í-20).
Äëÿ äå òåêö³¿ SpA-scFv âè êî ðèñ òî âó âà ëè ïîë³êëî -
íàëüí³ àí òèò³ëà êðî ëÿ, êîí ’þ ãî âàí³ ç ïå ðîê ñè äà çîþ
õðî íó («Sigma», ÑØÀ) â áó ôåð³ ÒÔÁ (ðîç âå äåí íÿ
1:10000). ϳñëÿ öüî ãî äî äà âà ëè 100 ìêë ðîç ÷è íó,
ùî ì³ñòèâ 2 ìã îðòî ôåí³ëåíä³àì³íó, 5 ìë äèñ òèëü î -
âà íî¿ âî äè òà 5 ìêë ïå ðîê ñè äó âîä íþ. ×å ðåç 20 õâ
ðå àêö³þ çó ïè íÿ ëè, äî äà þ ÷è ïî 50 ìêë íà ëóí êó 2 Ì
Í2SO4. Ðå çóëü òà òè àíàë³çó âèì³ðþ âà ëè çà äî ïî ìî -
ãîþ ²ÔÀ-ðè äå ðà EL ́800 («Bio-Tech», ÑØÀ) çà äîâ -
æè íè õâèë³ 490 íì.
Äëÿ âèç íà ÷åí íÿ íå îáõ³äíî ãî ðîç âå äåí íÿ àí -
òèò³ë, êîí ’þ ãî âà íèõ ç ïå ðîê ñè äà çîþ, ÿê àí òè ãåí
âíî ñè ëè ðîç ÷èí SpA-scFv (5 ìêã/ìë ó ÇÔÐ), ³íêó áó -
âà ëè ïðî òÿ ãîì 1 ãîä çà t = 37 °Ñ, ï³ñëÿ ÷î ãî äî äà âà -
ëè êîí ’þ ãî âàí³ ç ïå ðîê ñè äà çîþ ïîë³êëî íàëüí³ àí -
òèò³ëà êðî ëÿ òà êî çè àáî ìî íîê ëî íàëüí³ IgM ìèø³
(«Sigma») ó áó ôåð³ ÒÔÁ, ïî ñë³äîâ íî çìåí øó þ ÷è
¿õíþ êîí öåí òðàö³þ âäâ³÷³.
Ðå çóëü òà òè ³ îá ãî âî ðåí íÿ. Ñòâî ðåí íÿ ðå -
êîìá³íà íòíèõ ïëàçì³ä äëÿ åêñïðåñ³¿ ã³áðèä íî ãî
á³ëêà SpA-scFv â E. coli. Îòðè ìà íî êî íñòðóêö³¿ äëÿ
åêñïðåñ³¿ ã³áðèä íèõ á³ëê³â, ùî ì³ñòÿòü ó ñâîºìó
ñêëàä³ ïî ñë³äîâí³ñòü scFv-àí òèò³ëà òà ôðàã ìåí òà
ñòàô³ëî êî êî âî ãî á³ëêà À. Àì³íî êèñ ëîò íó ïî -
ñë³äîâí³ñòü êëî íî âà íî ãî ôðàã ìåí òà á³ëêà À íà âå äå -
íî íà ðèñ. 1. Ïîñë³äîâ íîñò³ scFv â³ä³áðà íî ç ³ìóí íî¿
246
Î˲ÉÍÈÊ Î. Ñ. ÒÀ ²Í.
á³áë³îò å êè ³ìó íîã ëî áóë³íî âèõ ãåí³â ìèø³. Óñ³ â³ñ³ì
scFv áó ëè ñïå öèô³÷íè ìè äî ñóáîäèíèö³  äèô -
òåð³éíîãî òîêñèíó [12].
Ìå òîþ îá’ºäíàí íÿ scFv-àí òèò³ë òà ñòàô³ëî êî êî -
âî ãî á³ëêà À áó ëî îäåð æàí íÿ á³ôóíêö³îíàëü íî ãî
ã³áðèä íî ãî á³ëêà, çäàò íî ãî â ³ìó íî ôåð ìåí òíî ìó
àíàë³ç³ ðîçï³çíà âà òè àí òè ãåí ³ äå òåê òó âà òè ñÿ ì³÷å -
íè ìè àí òèò³ëà ìè äîâ³ëüíî¿ àí òè ãåí íî¿ ñïå -
öèô³÷íîñò³. Äî äàò êî âî ïå ðå äáà ÷à ëî ñÿ äîñë³äè òè, ÿê
âïëè íå ôðàã ìåíò á³ëêà À íà åêñïðåñ³þ ö³ëüî âî ãî
á³ëêà, çîê ðå ìà, íà âèõ³ä ðîç ÷èí íî ãî ïðî äóê òó,
îñê³ëüêè îá’ºäíàí íÿ ç îäíèì àáî ê³ëüêî ìà äî ìå íà -
ìè á³ëêà À ÷àñòî äîçâîëÿº ï³äâèùèòè ðîç÷èíí³ñòü
ö³ëüîâîãî á³ëêà [15].
Ö³ëüî âèé á³ëîê âèä³ëÿ ëè ïà ðà ëåëü íî ³ ç ðîç ÷èí -
íî¿, ³ ç íå ðîç ÷èí íî¿ ôðàêö³é (â îñòàí íüî ìó âè ïàä -
êó – ç ïîä àëü øèì ðå ôîë äèí ãîì). ˳çà òè ïðî äó -
öåíò³â SpA-scFv òà îò ðè ìàí³ ï³ñëÿ ìå òà ëî àô³ííî¿
õðî ìà òîã ðàô³¿ åëþ à òè àíàë³çó âà ëè åëåê òðî ôî ðå çîì
ó ÏÀÀà (ðèñ. 2). ßê âèä íî ç öüî ãî ðè ñóí êà, ö³ëüî -
âèé á³ëîê åêñïðå ñó âàâ ñÿ ïå ðå âàæ íî ó íå ðîç ÷èíí³é
ôîðì³, à âèä³ëåí³ ç ðîç ÷èí íî¿ ôðàêö³¿ á³ëêè ì³ñòè ëè
âå ëè êó ê³ëüê³ñòü äîì³øîê, â³ðîã³äíî, ÷å ðåç íèç ü êèé
ïè òî ìèé âíå ñîê ö³ëüî âî ãî á³ëêà. Ïðî òå äëÿ êëîí³â
SpA-scFv61, SpA-scFv120 ³ SpA-scFv94 ïîä àëü øà
îïòèì³çàö³ÿ óìîâ âèä³ëåí íÿ, ³ìîâ³ðíî, äîç âî ëèòü
âèä³ëÿòè ç ðîç÷èííî¿ ôðàêö³¿ ïðîäóêò äîñòàòíüîãî
ñòóïåíÿ ÷èñòîòè.
²ìó íîõ³ì³÷íà õà ðàê òå ðèñ òè êà îò ðè ìà íèõ çëè -
òèõ á³ëê³â SpA-scFv. Ùîá äîñë³äè òè, ÿê îò ðè ìàí³
çëèò³ á³ëêè ìî æóòü âçàºìîä³ÿòè ç ³ìó íîã ëî áóë³íà ìè
ð³çíèõ òâà ðèí, ìè âè êî ðèñ òà ëè êîí ’þ ãî âàí³ ç ïå -
ðîê ñè äà çîþ õðîíó ïîë³êëî íàëüí³ àí òèò³ëà êðî ëÿ,
ñïå öèô³÷í³ äî ³ìó íîã ëî áóë³í³â ìèø³, ïîë³êëî íàëü-
247
ÎÄÅÐ ÆÀÍ Íß Á²ÔÓÍÊÖ²ÎÍÀËÜ ÍÈÕ ÌÎ ËÅ ÊÓË, ÑÏÅ ÖÈÔ²×ÍÈÕ ÄÎ ÀÍ ÒÈ ÃÅ ÍÓ ÒÀ Fc-ÔÐÀà ÌÅÍҲ ÀÍ ÒÈÒ²Ë
Ðèñ. 1. Àì³íî êèñ ëîò íà ïîñë³äîâí³ñòü êëî íî âà -
íî ãî ôðàã ìåí òà á³ëêà À Staphylococcus aureus
(çã³äíî ç ðå çóëü òà òà ìè ñåê âå íó âàí íÿ íóê ëå î -
òèä íî¿ ïîñë³äîâ íîñò³, ïðî âå äå íî ãî ó â³ää³ëåíí³
ìî ëå êó ëÿð íî¿ ä³àã íîñ òè êè Óêð à¿íñüêî¿ ëà áî ðà -
òî𳿠ÿêîñò³ ³ áåç ïå êè ïðî äóêö³¿ àã ðîï ðî ìèñ ëî -
âî ãî êîì ïëåê ñó Íàö³îíàëü íî ãî àã ðàð íî ãî
óí³âåð ñè òå òó)
Ðèñ. 2. Àíàë³ç êë³òèí íèõ ë³çàò³â òà
âèä³ëå íèõ SpA-scFv: 1 – òî òàëü íèé
ë³çàò; 2 – ðîç ÷èí íà ôðàêö³ÿ á³ëê³â; 3 –
á³ëêè, âèä³ëåí³ ç ðîç ÷èí íî¿ ôðàêö³¿;
4 – íå ðîç ÷èí íà ôðàêö³ÿ á³ëê³â; 5 –
á³ëêè, âèä³ëåí³ ç íå ðîç ÷èí íî¿ ôðàê-
ö³¿; Ì – ìàð êå ðè ìî ëå êó ëÿð íî¿ ìàñè
(170, 130, 95, 72, 55, 43, 34, 26, 17,
10 êÄà); 6 – ñè ðî âàò êî âèé àëü áóì³í
áèêà (0,5 ìêã). Íàç âó êëîí³â ï³äïè ñà -
íî íàä ô³ãóð íè ìè äóæ êà ìè
í³ àí òèò³ëà êî çè, ñïå öèô³÷í³ äî ³ìó íîã ëî áóë³í³â
ëþ äè íè, òà ìî íîê ëî íàëüí³ ìè øà÷³ àí òèò³ëà êëà ñó
Ì, ùî âòðà òè ëè çäàòí³ñòü ðîçï³çíà âà òè àí òè ãåí
(Ò7-tag). Êîí ’þ ãà òè ³ìó íîã ëî áóë³í³â öèõ âèä³â òâà -
ðèí øè ðî êî âè êî ðèñ òî âó þòü äëÿ ³ìó íî ôåð ìåí òíî -
ãî àíàë³çó ³ âî íè º â³äíîñ íî äîñ òóï íè ìè. Âàð òî çà -
çíà ÷è òè, ùî àô³íí³ñòü á³ëêà À ñòî ñîâ íî àí òèò³ë
ð³çíèõ êëàñ³â òà ï³äêëàñ³â âàð³þº [8]. Àô³íí³ ñîð-
áåí òè ç ³ììîá³ë³çî âà íèì á³ëêîì À äîç âî ëÿ þòü
âèä³ëè òè á³ëüøå 90 % àí òèò³ë ³ç ñè ðî âà òîê êðî ëÿ òà
ìèø³, áëèçü êî 80 % – ³ç ñè ðî âà òîê ëþ äè íè òà êî íÿ ³
áëèçü êî 30 % – ³ìó íîã ëî áóë³í³â ³ç ñèðîâàòîê êîçè
÷è â³âö³ [16].
Íà ðèñ. 3 ïðåä ñòàâ ëå íî ðå çóëü òà òè ³ìó íî ôåð -
ìåí òíî ãî àíàë³çó, â ÿêî ìó ÿê àí òè ãå íè âè êî ðèñ òà íî
âèä³ëåí³ SpA-scFv30 òà ñè ðî âàò êî âèé àëü áóì³í áè -
êà (íå ãà òèâ íèé êîí òðîëü). Óñ³ êîí ’þ ãà òè ðîçï³çíà -
âà ëè SpA-scFv, ïðè öüî ìó åôåê òèâí³ñòü ðî áî òè
êîí ’þãàò³â áó ëà íå íè æ÷îþ, í³æ ïðè äå òåêö³¿ ñïå -
öèô³÷íèõ àí òè ãåí³â. Äëÿ ïîð³âíÿí íÿ: êîí ’þ ãàò ìè -
øà ÷èõ ìî íîê ëî íàëü íèõ àí òèò³ë âçà ãàë³ íå ðîçï³çíà -
âàâ àí òè ãåí, äî ÿêî ãî â³í áóâ ñïå öèô³÷íèì, àëå çáå-
ð³ãàâ ïå ðîê ñè äàç íó àê òèâí³ñòü. Ðî áî ÷å ðîç âå äåí íÿ
êîí ’þ ãî âà íèõ ³ìó íîã ëî áóë³í³â êî çè ïðè âèç íà ÷åíí³
àí òèò³ë ëþ äè íè ñòà íî âèòü 1:15000, à êðî ëÿ ÷èõ àí -
òè ìè øà ÷èõ ³ìó íîã ëî áóë³í³â – 1:3000. Îòðè ìàí³ ðå -
çóëü òà òè ï³äòâåð äè ëè, ùî çëèò³ á³ëêè SpA-scFv
çäàòí³ âçàºìîä³ÿòè ç ì³÷å íè ìè ³ìó íîã ëî áóë³íà ìè.
Ïî êà çà íî, ùî äëÿ äå òåêö³¿ ìîæ íà âè êî ðèñ òî -
âóâà òè íàâ³òü êîí ’þ ãà òè àí òèò³ë, ÿê³ âòðà òè ëè àí òè -
ãåíçâ’ÿ çó âàëü íó àê òèâí³ñòü. Êð³ì òî ãî, âñòà íîâ ëå -
íî, ùî äëÿ äå òåêö³¿ SpA-scFv ö³ëêîì ïðèäàòí³
ì³÷åí³ àí òèò³ëà êîçè ïîïðè òå, ùî îñòàíí³ íå º
«îïòè ìàëü íè ìè ïàðòíåðàìè» äëÿ ñòàô³ëî êîêî âî ãî
á³ëêà À.
Íà íà ñòóï íî ìó åòàï³ ðî áî òè äîñë³äæó âà ëè àí -
òè ãå íçâ’ÿ çó âàëüí³ âëàñ òè âîñò³ îò ðè ìà íèõ çëè òèõ
á³ëê³â SpA-scFv. Âèõ³äí³ scFv áóëè ñïå öèô³÷íè ìè
äî ñóá îäè íèö³  äèô òåð³éíî ãî òîê ñè íó. ³äïîâ³äíî
çä³éñíèëè ³ìó íî ôåð ìåí òíèé àíàë³ç, äå ÿê àí òè ãå íè
âè êî ðèñ òî âó âà ëè ðå êîìá³íà íòíó ñóá îäè íè öþ Â
äèôòåð³éíî ãî òîê ñè íó (ïî çè òèâ íèé êîí òðîëü) òà
ñè ðî âàò êî âèé àëü áóì³í áè êà (íå ãà òèâ íèé êîí -
òðîëü). Óñ³ êëî íè ïðî äå ìî íñòðó âà ëè åôåê òèâ íå
ðîçï³çíà âàí íÿ ö³ëüîâî ãî àí òè ãå íó, ùî ñâ³ä÷èòü ïðî
çáå ðå æåí íÿ àí òè ãå íçâ’ÿ çó âàëü íî¿ ôóíêö³¿ ó scFv
ï³ñëÿ îá’ºäíàí íÿ ç ôðàã ìåí òîì á³ëêà À (ðèñ. 4), òà
íå ðîçï³çíàâàëè ñè ðî âàò êîâèé àëüáóì³í áèêà (äà-
íèõ íå íàâåäåíî).
Îäåð æàí³ ðå çóëü òà òè âêà çó þòü íà ïåð ñïåê -
òèâí³ñòü âè êî ðèñ òàí íÿ ã³áðèä íèõ á³ëê³â scFv–ñòà-
ô³ëî êî êî âèé á³ëîê À â ³ìó íî ôåð ìåí òíî ìó àíàë³ç³, à
òà êîæ ï³äòâåð äæó þòü, ùî scFv, â³ä³áðàí³ íà ìè
ðàí³øå ç ³ìóí íî¿ á³áë³îò å êè, ìîæ íà çà ñòî ñó âà òè ïðè
ñòâî ðåíí³ ³ìó íî ôåð ìåí òíèõ òåñò-ñèñ òåì äëÿ âè ÿâ-
ëåí íÿ äèôòåð³éíîãî òîêñèíó.
248
Î˲ÉÍÈÊ Î. Ñ. ÒÀ ²Í.
Ðèñ. 3. Ðîçï³çíà âàí íÿ îò ðè ìà íî ãî çëè òî ãî á³ëêà SpA-scFv30 àí -
òèò³ëàìè êîç ëà (1), êðî ëÿ (2) òà ìî íîê ëî íàëü íè ìè IgM ìèø³ (3),
êîí ’þ ãî âà íè ìè ç ïå ðîê ñè äà çîþ õðî íó; 4, 5, 6 – ðîçï³çíà âàí íÿ
ñè ðî âàò êî âî ãî àëü áóì³íó áèêà â³äïîâ³äíè ìè êîí ’þ ãà òà ìè (íå -
ãà òèâ íèé êîí òðîëü)
Ðèñ. 4. Ðîçï³çíà âàí íÿ àí òè ãå íó (ñóá îäè íèö³  äèô òåð³éíî ãî
òîêñèíó) î÷è ùå íè ìè SpA-scFv
O. S.Oliinyk, A. A.Kaberniuk, T. A.Redchuk, D. V. Kolibo,
S. V. Komisarenko
Construction of bifunctional molecules specific to antigen and
antibody’s Fc-fragment by fusion of scFv-antibodies with
staphylococcal protein A
Summary
Aim. To develop approach for detection of scFv and their com-
plexes with antigens. Methods. The fusion proteins, which include
sequences of scFv and staphylococcal protein A, were constructed
and the obtained bifunctional molecules were immunochemically
analysed. Results. It was shown, that scFv fused with protein A and
their complexes with antigens are effectively recognized by labelled
immunoglobulins with unrestricted antigenic specificity. Conclu-
sions. The fusion of scFv with protein A fragment is a perspective
approach to increase the efficiency of application in ELISA. The
obtained scFv, fused with protein A, could be used for development
of test-systems for the detection of diphtheria toxin.
Keywords: scFv, diphtheria toxin, bifunctional molecules.
Å. Ñ. Îëåé íèê, À. À. Êà áåð íþê, Ò. À. Ðåä ÷óê, Ä. Â. Êî ëè áî,
Ñ. Â.Êî ìè ñà ðåí êî
Ïî ëó ÷å íèå áè ôóí êöè î íàëü íûõ ìî ëå êóë, ñïå öè ôè÷ íûõ ê
àí òè ãå íó è Fc-ôðàã ìåí òó àí òè òåë, ìåòîäîì ñëè ÿ íèÿ scFv-
àí òè òåë ñî ñòà ôè ëî êîê êî âûì áåë êîì À
Ðå çþ ìå
Öåëü. Ðàç ðà áî òàòü ïîä õîä äëÿ äå òåêöèè scFv è èõ êîì ïëåêñîâ
ñ àí òè ãåíàìè. Ìå òî äû. Ñêî íñòðó è ðî âà íû ãèá ðèä íûå áåë êè,
ñî äåð æà ùèå ïî ñëå äî âà òåëü íîñ òè scFv ê ñóá ú å äè íè öå Â äèô -
òå ðèé íî ãî òîê ñè íà è ñòà ôè ëî êîê êî âî ãî áåë êà À, è ñ èñ ïîëü çî -
âà íè åì èì ìó íî õè ìè ÷åñ êèõ ìå òî äîâ îõà ðàê òå ðè çî âà íû ïî-
ëó ÷åí íûå áè ôóí êöè î íàëü íûå ìî ëå êó ëû. Ðå çóëü òà òû. Ïî êà çà -
íî, ÷òî scFv, ñëè òûå ñ áåë êîì À, è èõ êîì ïëåê ñû ñ àí òè ãå íîì
ýô ôåê òèâ íî ðàñ ïîç íà þò ñÿ ìå ÷å íû ìè èì ìó íîã ëî áó ëè íà ìè
ïðî èç âîëü íîé àí òè ãåí íîé ñïå öè ôè÷ íîñ òè. Âû âî äû. Ñëè ÿ íèå ñ
ôðàã ìåí òîì áåë êà À ÿâ ëÿ åò ñÿ ïåð ñïåê òèâ íûì ïîä õî äîì, ïî -
çâî ëÿ þ ùèì ïî âû ñèòü ýô ôåê òèâ íîñòü èñ ïîëü çî âà íèÿ scFv â
èì ìó íî ôåð ìåí òíîì àíà ëè çå. Ïî ëó ÷åí íûå scFv, îá ú å äè íåí íûå
ñ áåë êîì À, ìî ãóò áûòü èñ ïîëü çî âà íû ïðè ñî çäà íèè òåñò-ñèñ -
òåì äëÿ âû ÿâ ëå íèÿ äèô òå ðèé íî ãî òîê ñè íà.
Êëþ ÷å âûå ñëî âà: scFv, äèô òå ðèé íûé òîê ñèí, áè ôóí êöè î -
íàëü íûå ìî ëå êó ëû.
ÏÅÐÅË²Ê Ë²ÒÅÐÀÒÓÐÈ
1. Holliger Ph., Hudson P. J. Engineered antibody fragments
and the rise of single domains // Nat. Biotechnol.–2005.–23,
N 9.–P. 1126–1136.
2. Wang S. H., Zhang J. B., Zhang Z., P. Zhou Y. F., Yang R. F.,
Chen J., Guo Y. C., You F., Zhang X. E. Construction of single
chain variable fragment (ScFv) and BiscFv-alkaline phos-
phatase fusion protein for detection of Bacillus anthracis //
Anal. Chem.–2006.–78, N 4.–P. 997–1004.
3. Rau D., Kramer K., Hock B. Single-chain Fv antibody-alka-
line phosphatase fusion proteins produced by one-step clo-
ning as rapid detection tools for ELISA // J. Immunoas. Im-
munochem.–2002.–23, N 2.–P. 129–143.
4. Aubrey N., Devaux C., di Luccio E., Goyffon M., Rochat H.,
Billiald P. A recombinant scFv/streptavidin-binding peptide
fusion protein for the quantitative determination of the scor-
pion venom neurotoxin AahI // Biol. Chem.–2001.–382,
N 11.–P. 1621–1628.
5. Kipriyanov S. M., Breitling F., Little M., Dubel S. Single-
chain antibody streptavidin fusions: tetrameric bifunctional
scFv-complexes with biotin binding activity and enhanced
affinity to antigen // Hum. Antibodies Hybridomas.–1995.–6,
N 3.–P. 93–101.
6. Braren I., Greunke K., Umland O., Deckers S., Bredehorst R.,
Spillner E. Comparative expression of different antibody for-
mats in mammalian cells and Pichia pastoris // Biotechnol.
Appl. Biochem.–2007.–47, N 4.–P. 205–214.
7. Cao M., Cao P., Yan H., Ren F., Lu W., Hu Y., Zhang S. Cons-
truction and characterization of an enhanced GFP-tagged
anti-BAFF scFv antibody // Appl. Microbiol. Biotechnol.–
2008.–79, N 3.–P. 423–431.
8. Hobera S., Nordb K., Linhultc M. Protein A chromatography
for antibody purification // J. Chromatogr. B.–2007.–848,
N 1.–P. 40–47.
9. Tai M. S., Mudgett-Hunter M., Levinson D., Wu G. M., Haber
E., Oppermann H., Huston J. S. A bifunctional fusion protein
containing Fc-binding fragment B of staphylococcal protein
A amino terminal to antidigoxin single-chain Fv // Bioche-
mistry.–1990.–29, N 35.–P. 8024–8030.
10. Gandecha A., Owen M. R., Cockburn W., Whitelam G. C. An-
tigen detection using recombinant, bifunctional single-chain
Fv fusion proteins synthesised in Escherichia coli // Protein
Exp. Purif.–1994.–5, N 4.–P. 385–390.
11. Sambrook J., Fritsch E. F. Molecular cloning: À laboratory
manual.–New York: Cold Spring Harbor Lab., 2001.– 999 p.
12. Oliinyk O. S., Kaberniuk A. A., Redchuk T. A., Korotkevich N.
V., Labyntsev A. U., Romanyuk S. I., Kolibo D. V., Komisa-
renko S. V. Construction of immune library of murine immu-
noglobulin genes and screening of single chaine Fv-anti-
bodies to diphtheria toxin B subunit // Ukr. Biochem. J.–
2009.–81, N 2.–P. 60–71.
13. Schagger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of pro-
teins in the range from 1 to 100 kDa // Anal. Biochem.–
1987.–166.–P. 368–379.
14. Kaberniuk À. À., Oli³nyk O. S., Redchuk Ò. À., Romanyuk S. ²,
Kolibo D. V., Komisarenko S. V. Cloning and expression of
diphtheria toxin’s recombinant subunits of Corynebacterium
diphtheriae in Esherichia coli // Reports of the Nat. Acad. of
Sci. of Ukraine.–2008.–3.–P. 160–166.
15. Inouye S., Sahara Y. Soluble protein expression in E. coli
cells using IgG-binding domain of protein A as a solubilizing
partner in the cold induced system // Biochem. and Biophys.
Res. Communs.–2008.–376, N 3.–P. 448–453.
16. Verdoliva A., Pannone F., Rossi M., Catello S., Manfredi V.
Affinity purification of polyclonal antibodies using a new all-
D synthetic peptide ligand: comparison with protein A and
protein G // J. Immunol. Meth.–2002.–271, N 1–2.– P. 77–88.
ÓÄÊ 577.27:616.097
Íàä³éøëà äî ðå äàêö³¿ 01.04.09
249
ÎÄÅÐ ÆÀÍ Íß Á²ÔÓÍÊÖ²ÎÍÀËÜ ÍÈÕ ÌÎ ËÅ ÊÓË, ÑÏÅ ÖÈÔ²×ÍÈÕ ÄÎ ÀÍ ÒÈ ÃÅ ÍÓ ÒÀ Fc-ÔÐÀà ÌÅÍҲ ÀÍ ÒÈÒ²Ë
|