Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека

Разработан высокоэффективный и недорогой лабораторный способ получения и очистки поликлональных антител против поверхностного клеточного маркера CD34 человека. Показано, что клонированный в клетки E. coli негликозилированный рекомбинантный белок, содержащий внеклеточный фрагмент антигена CD34 челове...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2011
Автори:	Николаев, Ю.С., Гильчук, П.В., Горбатюк, О.Б., Фляк, А.И., Лабынцев, А.Ю., Иродов, Д.М., Колибо, Д.В., Кордюм, В.А.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2011
Назва видання:	Цитология и генетика
Теми:	Оригинальные работы
Онлайн доступ:	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66837
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека / Ю.С. Николаев, П.В. Гильчук, О.Б. Горбатюк, А.И. Фляк, А.Ю. Лабынцев, Д.М. Иродов, Д.В. Колибо, В.А. Кордюм // Цитология и генетика. — 2011. — Т. 45, № 3. — С. 3-14. — Бібліогр.: 14 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	irk-123456789-66837
record_format	dspace
spelling	irk-123456789-668372014-07-24T03:01:22Z Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека Николаев, Ю.С. Гильчук, П.В. Горбатюк, О.Б. Фляк, А.И. Лабынцев, А.Ю., Иродов, Д.М. Колибо, Д.В. Кордюм, В.А. Оригинальные работы Разработан высокоэффективный и недорогой лабораторный способ получения и очистки поликлональных антител против поверхностного клеточного маркера CD34 человека. Показано, что клонированный в клетки E. coli негликозилированный рекомбинантный белок, содержащий внеклеточный фрагмент антигена CD34 человека, при выделении из бактерий сохраняет необходимые антигенные детерминанты и при иммунизации индуцирует продукцию специфических поликлональных антител, способных распознавать нативный антиген на поверхности клеток. Полученные антитела могут быть использованы для фенотипирования CD34+ клеток методами иммуноцитохимии и проточной цитометрии. Розроблено високоефективний та недорогий лабораторний спосіб одержання та очищення поліклональних антитіл проти поверхневого клітинного маркера CD34 людини. Показано, що клонований в клітини E. coli неглікозильований рекомбінантний білок, що містить зовнішньоклітинний фрагмент антигена CD34 людини, при виділенні з бактерій зберігає необхідні антигенні детермінанти та при імунізації індукує продукування специфічних поліклональних антитіл, що здатні розпізнавати нативний антиген на поверхні клітин. Одержані антитіла можуть бути використані для фенотипування CD34+ клітин методами імуноцитохімії та проточної цитометрії. An efficient and inexpensive laboratory approach for the generation and the purification of polyclonal antibodies to human antigen CD34 was developed. It was shown that cloned refolded and purified from Escherichia coli recombinant extracellular fragment of CD34 antigen retained immunogenic determinants of cell-surface expressed CD34. Immunization of mice with unglycosylated truncated recombinant protein elicit polyclonal antibodies specific for the native human antigen CD34. The antibodies generated are applicable for phenotyping of CD34+ cells using immunocytochemistry and flow cytometry assays. 2011 Article Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека / Ю.С. Николаев, П.В. Гильчук, О.Б. Горбатюк, А.И. Фляк, А.Ю. Лабынцев, Д.М. Иродов, Д.В. Колибо, В.А. Кордюм // Цитология и генетика. — 2011. — Т. 45, № 3. — С. 3-14. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. 0564-3783 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66837 57.083.3 ru Цитология и генетика Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Оригинальные работы Оригинальные работы
spellingShingle	Оригинальные работы Оригинальные работы Николаев, Ю.С. Гильчук, П.В. Горбатюк, О.Б. Фляк, А.И. Лабынцев, А.Ю., Иродов, Д.М. Колибо, Д.В. Кордюм, В.А. Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека Цитология и генетика
description	Разработан высокоэффективный и недорогой лабораторный способ получения и очистки поликлональных антител против поверхностного клеточного маркера CD34 человека. Показано, что клонированный в клетки E. coli негликозилированный рекомбинантный белок, содержащий внеклеточный фрагмент антигена CD34 человека, при выделении из бактерий сохраняет необходимые антигенные детерминанты и при иммунизации индуцирует продукцию специфических поликлональных антител, способных распознавать нативный антиген на поверхности клеток. Полученные антитела могут быть использованы для фенотипирования CD34+ клеток методами иммуноцитохимии и проточной цитометрии.
format	Article
author	Николаев, Ю.С. Гильчук, П.В. Горбатюк, О.Б. Фляк, А.И. Лабынцев, А.Ю., Иродов, Д.М. Колибо, Д.В. Кордюм, В.А.
author_facet	Николаев, Ю.С. Гильчук, П.В. Горбатюк, О.Б. Фляк, А.И. Лабынцев, А.Ю., Иродов, Д.М. Колибо, Д.В. Кордюм, В.А.
author_sort	Николаев, Ю.С.
title	Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека
title_short	Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека
title_full	Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека
title_fullStr	Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека
title_full_unstemmed	Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека
title_sort	поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера cd34 человека
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
publishDate	2011
topic_facet	Оригинальные работы
url	http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/66837
citation_txt	Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека / Ю.С. Николаев, П.В. Гильчук, О.Б. Горбатюк, А.И. Фляк, А.Ю. Лабынцев, Д.М. Иродов, Д.В. Колибо, В.А. Кордюм // Цитология и генетика. — 2011. — Т. 45, № 3. — С. 3-14. — Бібліогр.: 14 назв. — рос.
series	Цитология и генетика
work_keys_str_mv	AT nikolaevûs poliklonalʹnyeantitelaprotivpoverhnostnogokletočnogomarkeracd34čeloveka AT gilʹčukpv poliklonalʹnyeantitelaprotivpoverhnostnogokletočnogomarkeracd34čeloveka AT gorbatûkob poliklonalʹnyeantitelaprotivpoverhnostnogokletočnogomarkeracd34čeloveka AT flâkai poliklonalʹnyeantitelaprotivpoverhnostnogokletočnogomarkeracd34čeloveka AT labyncevaû poliklonalʹnyeantitelaprotivpoverhnostnogokletočnogomarkeracd34čeloveka AT irodovdm poliklonalʹnyeantitelaprotivpoverhnostnogokletočnogomarkeracd34čeloveka AT kolibodv poliklonalʹnyeantitelaprotivpoverhnostnogokletočnogomarkeracd34čeloveka AT kordûmva poliklonalʹnyeantitelaprotivpoverhnostnogokletočnogomarkeracd34čeloveka
first_indexed	2025-07-05T17:00:18Z
last_indexed	2025-07-05T17:00:18Z
_version_	1836827088960618496
fulltext	УДК 57.083.3 Ю.С. НИКОЛАЕВ 1, П.В. ГИЛЬЧУК 2, О.Б. ГОРБАТЮК 3, А.И. ФЛЯК 3, А.Ю. ЛАБЫНЦЕВ 4, Д.М. ИРОДОВ 2, Д.В. КОЛИБО 4, В.А. КОРДЮМ 2 1 Институт генетической и регенеративной медицины АМН Украины, Киев 2 Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев 3 Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко 4 Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев ПОЛИКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ПОВЕРХНОСТНОГО КЛЕТОЧНОГО МАРКЕРА CD34 ЧЕЛОВЕКА Разработан высокоэффективный и недорогой лабо� раторный способ получения и очистки поликлональных антител против поверхностного клеточного маркера CD34 человека. Показано, что клонированный в клетки E. coli негликозилированный рекомбинантный белок, со� держащий внеклеточный фрагмент антигена CD34 че� ловека, при выделении из бактерий сохраняет необходи� мые антигенные детерминанты и при иммунизации ин� дуцирует продукцию специфических поликлональных ан� тител, способных распознавать нативный антиген на поверхности клеток. Полученные антитела могут быть использованы для фенотипирования CD34+ клеток методами иммуноцитохимии и проточной цитометрии. Введение. Поверхностный клеточный мар� кер CD34 является гликопротеином с молеку� лярной массой �110 кДа, который представлен на поверхности гематопоэтических стволовых клеток и клеток эндотелия сосудов микроцир� куляторного русла, на клетках внутренних ор� ганов эмбриона, клетках�предшественниках стромы костного мозга, на опухолевых клетках миелоидной и лимфоидной природы, а также опухолях, имеющих эпителиальное происхож� дение [1]. В связи с интенсивным изучением гематопоэтических стволовых клеток, их ис� пользованием в медицине, а также разработкой новых способов диагностики раковых заболе� ваний широкое распространение получили системы идентификации и выделения популя� ции CD34+ клеток с использованием специфи� ческих моноклональных антител [2]. В составе внеклеточного фрагмента CD34 идентифицированы девять потенциальных сай� тов гликозилирования по остаткам аспарагина, а также сайты гликозилирования по остаткам серина и треонина. Семь из девяти сайтов N� гликозилирования, большинство сайтов О�гли� козилирования локализированы на N�конце� вом домене внеклеточного фрагмента CD34 [1]. Кроме того, в составе внеклеточного фрагмен� та CD34 присутствует С�концевой домен, име� ющий глобулярную природу. Такая структура антигена обусловливает разнообразие эпитопов, к которым потенциально могут быть получены моноклональные антитела. На сегодня описано более двух десятков различных моноклональ� ных антител против CD34, которые условно разделяют на три класса по их эпитопной спе� цифичности. Антитела 1�го класса распознают эпитопы внеклеточного фрагмента, подвергающиеся гидролизу при обработке как нейраминидазой из Vibrio cholera, гидролизующей кетозидные связи концевых остатков сиаловой кислоты в олигосахаридах, так и О�сиалогликопротеин эндопептидазой (гликопротеазой) из Pasteurella haemolytica. Соответственно, антитела 1�го клас� са распознают эпитопы, имеющие в своем сос� таве сиалилированные О�гликаны. Антитела 2�го класса способны распознавать CD34 пос� ле обработки нейраминидазой, однако теряют это свойство после обработки антигена глико� протеазой. Это позволяет предположить нали� чие соответствующих эпитопов на высокогли� козилированном N�концевом домене внекле� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 3 3 Оригинальные работы © Ю.С. НИКОЛАЕВ, П.В. ГИЛЬЧУК, О.Б. ГОРБАТЮК, А.И. ФЛЯК, А.Ю. ЛАБЫНЦЕВ, Д.М. ИРОДОВ, Д.В. КОЛИБО, В.А. КОРДЮМ, 2011 точного фрагмента CD34 по соседству с чувст� вительными к действию нейраминидазы эпи� топами 1�го класса. В то же время антитела 3�го класса сохраняют способность распознавать CD34 после его обработки двумя упомянуты� ми ферментами. Эпитопы распознавания ан� тител 3�го класса, предположительно, распо� ложены на глобулярном домене в С�концевой части внеклеточного фрагмента CD34 [1]. Различная эпитопная специфичность анти� тел против CD34 определяет их применимость для тех или иных методов иммунологического анализа. Значительная гетерогенность характе� ра гликозилирования антигена CD34 на клет� ках разных тканей и клетках с различной сте� пенью дифференцировки ограничивает при� менение антител 1�го и 2�го классов. Так, в связи с высокой полиморфностью гликозил� содержащих эпитопов CD34 для цитофлюори� метрического анализа и фракционирования популяции CD34+ клеток в большинстве слу� чаев используют антитела 3�го класса, которые распознают эпитопы, удаленные от сайтов гликозилирования. В то же время распознавае� мые антителами 3�го класса эпитопы являются конформационными, поэтому в методах анали� за, связанных с денатурацией CD34 (вестерн� блот, ИФА, парафиновые срезы тканей), как правило, применяют антитела 1�го и 2�го клас� сов. При этом использование антител 2�го класса кажется предпочтительным вследствие их более высокой аффинности. Впервые CD34 был детектирован на поверх� ности клеток миелобластоидной линии KG1a моноклональными антителами My10, получен� ными путем иммунизации мышей интактными клетками KG1a с последующим выделением соответствующей гибридомы [3]. В дальнейшем эта схема широко использовалась для получе� ния антител против CD34 наряду с иммуниза� цией трансфицированными клетками эукари� от, экспрессирующими ген полноразмерного CD34 [4]. Среди других подходов описаны им� мунизация внеклеточным фрагментом CD34, полученным экспрессией в клетках млекопи� тающих [5], и ДНК�иммунизация животных вектором, экспрессирующим внеклеточный фрагмент CD34 [6]. Указанные подходы позво� лили получить анти�CD34 антитела всех трех классов. Получение и отбор гибридом является дли� тельным процессом, а продукция и очистка моноклональных антител необходимой специ� фичности требует высоких затрат на среды и реактивы. Альтернативным способом является получение специфичных поликлональных ан� тител путем иммунизации животных. Послед� ний способ менее затратный, однако требует большого количества очищенного белка для иммунизации, что в свою очередь невозможно в случае использования клеточных экстрактов либо суспензий интактных CD34+ клеток. Использование для иммунизации внеклеточ� ного фрагмента CD34, полученного экспрес� сией в клетках эукариот, также имеет свои не� достатки. Среди них можно указать низкий уровень его синтеза клетками эукариот, дли� тельность культивирования, нестабильность трансфицированной клеточной линии, высо� кую стоимость питательных сред, сложность получения и очистки препаративных количеств антигена в условиях лаборатории. Гетерогенный характер присоединения гликозильных остат� ков к полипептидной цепи CD34 в случае его синтеза клетками трансфицированной линии эукариот изменяет антигенные свойства CD34, что в свою очередь усложняет его использова� ние в процедурах получения универсальных специфичных поли� и моноклональных анти� тел против белковых детерминант. В то же время генно�инженерные технологии позволяют клонировать гены эукариот и обес� печивать их высокоэффективную экспрессию в бактериях E. coli. Затем рекомбинантный белок может быть выделен из бактериальных клеток и очищен с иcпользованием методов колоноч� ной хроматографии. Таким способом реком� бинантный антиген CD34 может быть получен в количествах, необходимых для иммунизации животных, продуцирования специфичных поли� клональных антител и их очистки. Поскольку два класса антител против CD34 из трех описан� ных распознают белковые антигенные детер� минанты, нами было предложено использовать рекомбинантный белок на основе внеклеточно� го фрагмента антигена CD34 человека для по� лучения поликлональных антител. Такой спо� соб получения поликлональных антител кажет� ся более предпочтительным по сравнению со способами, описанными выше. ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 34 Ю.С. Николаев, П.В. Гильчук, О.Б. Горбатюк и др. Целью настоящей работы была разработка способа получения и очистки специфических поликлональных антител против белковых де� терминант поверхностного клеточного марке� ра CD34 человека, характеристика получен� ных антител, а также исследование возмож� ности их применения для иммунодетекции популяции CD34+ клеток. Материалы и методы. В работе использовали вектор экспрессии pET�24a+ («Novagen», Герма� ния), штаммы E. coli DH10B, BL21(DE3) и Rosetta 2(DE3) («Novagen», Германия). Дизайн праймеров для ПЦР осуществляли с помощью программы VectorNTI 5.0 («Invitrogen», США). Генно�инженерные манипуляции с ДНК про� водили согласно методам, описанным Sambrook et al. [7]. Клетки линии KG1 миелобластоидного происхождения (Российская коллекция клеточ� ных культур позвоночных, Институт цитологии РАН) культивировали в среде RPMI�1640 («Sigma», США), содержащей 20%�ную эмбрио� нальную бычью сыворотку («Invitrogen», США), как описано в работе [8]. Клонирование кДНК антигена CD34 челове� ка. Фракцию поли�А(+)РНК выделяли из клеток KG1 с использованием набора реакти� вов «QuickPrep Micro mRNA Purification Kit» («GE Healthcare», США) согласно рекоменда� циям производителя. Синтезировали кДНК в реакции обратной транскрипции с примене� нием вырожденных гексануклеотидных прай� меров и использовали как матрицу для ПЦР с праймерами Sense�СD34 (5'�ATC TGA ATT CAT ATG ATG AGT CTT GAC AAC AAC GG�3') и Antisense�СD34 (5'�TCA ATC TCG AGG GTC TTT TGG GAA TAG CTC T�3'), содержащими сайты эндонуклеаз рестрикции NdeI и XhoI. Амплификацию проводили при следующих условиях: 30 циклов при 95 °С – 30 с, 55 °С – 30 с, 72 °С – 60 с. Полученную ДНК гидроли� зовали соответствующими рестриктазами, ли� гировали с вектором pET�24a+ и использова� ли для трансформации E. coli BL21(DE3). Экспрессия рекомбинантного белка rhExCD34 в E. coli. Для этого использовали модифициро� ванный протокол аутоиндукции [9]. Бактерии инокулировали в среду 2хYT (17 г/л бактотрип� тона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl), содержащую 50 мкг/мл канамицина и 1%�ную глюкозу, и наращивали 14–16 ч при 37 °С. Ноч� ную культуру инокулировали в соотношении 1:1000 в среду 2хYT, содержащую 50 мкг/мл ка� намицина, 25 мM (NH4)2SO4, 50 мM KH2PO4, 50 мM Na2HPO4, 1 мM MgSO4, 0,05 % глюкозу, 0,2 % α�лактозу, 0,5 % глицерол. Ферментацию проводили 18–24 ч при 37 °С, затем клетки осаждали центрифугированием 20 мин при 3000 g. Для получения фракции растворимых и нерастворимых белков E. coli осадок клеток E. coli суспендировали в фосфатно�солевом буфере (ФСБ): 0,14 М NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мМ KH2PO4, pH 8,0. После одного цикла замораживания/размораживания клетки разрушали ультразвуком. Разделение фракций осуществляли центрифугированием 12000 g в течение 5 мин. Локализацию реком� бинантного белка в клетках определяли мето� дом электрофореза в ДСН�ПААГ с последую� щей детекцией иммуноблоттингом. Тельца включения выделяли с использованием ранее описанного метода [10]. Электрофоретический анализ белков проводили в 12%�ном поли� акриламидном геле с додецилсульфатом на� трия (ДСН�ПААГ) по Laemmli [11]. Количест� во белка и его чистоту определяли денситомет� рией гелей с помощью программы Image Master 1D Prime («Pharmacia», Швеция), ис� пользуя в качестве стандарта БСА с известной концентрацией. Очистка и ренатурация rhExCD34. Для очис� тки и ренатурации рекомбинантного белка ис� пользовали метод металл�аффинной хромато� графии. Тельца включения солюбилизировали в 20 мM Tрис�HCl буфере (pH 8,0), содержащем 6 M гуанидин�гидрохлорид, 100 мM Na2HPO4, 10 мM имидазол и 10 мM 2�меркаптоэтанол (ко� нечная концентрация rhExCD34 – 1–2 мг/мл). Очистку и рефолдинг рекомбинантного белка проводили на 1 мл колонке Ni2+�HiTrap («GE Healthcare», США) с использованием хромато� графа FPLC («Pharmacia», Швеция). Колонку уравновешивали ФСБ, содержащим 8 М моче� вину и 10 мM имидазол. Солюбилизированные тельца включения наносили на колонку из расчета 1 мг белка/мл сорбента, колонку про� мывали буфером с мочевиной для удаления неспецифически связавшихся белков. Рефол� динг белка проводили в линейном нисходящем градиенте мочевины при скорости потока 0,2 мл/мин в 15 объемах колонки. Для рефол� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 3 5 Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека динга использовали буфер ФСБ, содержащий 1 мМ окисленный и восстановленный глутати� он («Sigma», США). Ренатурированный белок элюировали буфером ФСБ, содержащим 0,3 М имидазол. Для препаративного рефолдинга rhExCD34 использовали колонку 26/20 XK («GE Helthcare», США), содержащую 20 мл сорбента Ni�NTA Superflow («Qiagen», Нидер� ланды). Рефолдинг проводили при скорости потока 2,7 мл/мин. Фракции элюции анализи� ровали электрофорезом в ПААГ. Иммунизация животных. Для иммунизации использовали самок мышей линии BALB/с возрастом 2,5 мес (n = 10) и самок кролей по� роды шиншилла возрастом 3 мес (n = 3). Очи� щенный растворимый rhExCD34 (для мышей доза составила 80 мкг) вводили подкожно при первом и втором введении, интерперитониаль� но при третьем введении согласно следующей схеме: первое введение осуществляли с пол� ным адъювантом Фрейнда («Sigma», США), второе – с неполным («Sigma», США), третье – без адъюванта, с интервалом соответственно 14 и 7 дней. Кролей иммунизировали под лопат� ки и подкожно вдоль позвоночника рекомби� нантным белком, который вводили с полным адъювантом Фрейнда в дозе 200 мкг, с непол� ным адъювантом и без адьюванта – 100 мкг с интервалами в 14 дней. По завершении имму� низации отбирали кровь и использовали для получения сыворотки, а также для определения титра специфических антител. Все манипуля� ции с животными осуществляли с использова� нием седативных и анастезирующих препара� тов согласно ветеринарному законодательству. Анализ связывания поликлональных антител с rhExCD34. В лунках полистиролового план� шета для ИФА MaxiSorp («Nunc», Дания) сор� бировали очищенный ренатурированный rhExCD34 (10 мкг/мл). Блокирование неспе� цифического связывания и промывки прово� дили буфером ФСБ, содержащим 0,1 % Твин 20 (ФСБТ). Гипериммунные сыворотки после� довательно разводили ФСБТ, вносили в соот� ветствующие лунки планшета и инкубировали 1 ч при 37 °С, после чего проводили инкуба� цию со вторичными антителами, конъюгиро� ванными с пероксидазой хрена против связав� шихся иммуноглобулинов. В качестве хромо� генного субстрата использовали 3,3',5,5'�тетра� метилбензидин («Sigma», США). После разви� тия окраски реакцию останавливали внесени� ем 1 М серной кислоты и измеряли величину адсорбции А450 на многоканальном фотометре Multiscan MCC/340 («Titertek», США). Для им� муноблотинга белки переносили на нитроцел� люлозную мембрану Hybond ECL («Amersham Biosciences», Германия) и проявляли с исполь� зованием описанной системы иммунореаген� тов. В качестве хромогенного субстрата исполь� зовали 4�хлоро�1�нафтол («Sigma», США). Очистка поликлональных антител против rhExCD34. Очищенный и ренатурированный антиген диализировали против буфера ФСБ и иммобилизировали на BrCN�активированной сефарозе 4 Fast Flow («GE Helthcare», США) для получения аффинного сорбента. Все мани� пуляции проводили согласно рекомендациям производителя. Для очистки фракции специ� фических поликлональных антител иммунную сыворотку разводили в 10 раз буфером ФСБ, наносили на уравновешенный соответствую� щим буфером сорбент и инкубировали 2 ч при постоянном перемешивании. Сорбент промы� вали буфером ФСБ, связанные антитела элюи� ровали буфером, содержащим 0,1 М глицин� HCl, 0,5 М NaCl, pH 2,0. Фракции элюции ней� трализировали 1 М Трис. Связывание антител с rhExCD34 анализировали методами ИФА и иммуноблотинга, с поверхностным клеточным CD34 – методами иммуноцитохимии и про� точной цитометрии. Для получения препаративного количества специфических поликлональных антител из сыворотки иммунных кролей использовали модифицированный метод металл�аффинной хроматографии. Иммуноглобулины из 5 мл ги� периммунной сыворотки осаждали 3,9 М суль� фатом аммония (рН 7,9), осадок иммуноглобу� линов растворяли в 5 мл буфера 1 (25 мM HEPES�Na, pH 7,9; 150 мM NaCl, 10 мM ими� дазол; 0,1 % тритон X�100; 10 % глицерол), вносили 1 мл сорбента Ni�NTA Superflow с иммобилизированным очищенным и рефолди� рованным rhExCD34 (см. очистка и ренатура� ция rhExCD34). Связывание иммуноглобули� нов с иммобилизированным рекомбинантным белком проводили в течение 16 ч при переме� шивании при +4 °С. Затем сорбент два раза промывали в 10 мл буфера 2 (25 мM HEPES�Na, ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 36 Ю.С. Николаев, П.В. Гильчук, О.Б. Горбатюк и др. pH 7,9; 150 мM NaCl; 0,1 % Triton X�100; 10 % глицерол). Элюцию иммуноглобулинов с сор� бента проводили буфером 25 мM PIPES�Na, pH 6,8; 150 мM NaCl, 3,5 M MgCl2; 0,1 % три� тон X�100; 10 % глицерол. Элюированные анти� тела диализировали против буфера 2. Связы� вание очищенных антител с rhExCD34 анали� зировали методом ИФА как описано выше. Иммунохимическое окрашивание препаратов клеток. Суспензию клеток KG1 промывали два раза ФСБ, наносили на предметные стекла и фиксировали 2 мин в парах формалина. Эндогенную пероксидазу ингибировали путем помещения препаратов клеток в 3%�ный рас� твор H2O2 в ФСБ на 5 мин. В качестве первич� ных использовали аффинно очищенные по� ликлональные антитела (10 мкг/мл) и иммун� ную сыворотку в разных разведениях, которые наносили на препараты клеток и инкубирова� ли 1 ч при 37 °С. Специфичность связывания антител с поверхностным антигеном CD34 че� ловека определяли методом их конкурентного связывания в присутствии rhExCD34 в насы� щающей концентрации (100 мкг/мл). Препа� раты промывали ФСБ и инкубировали со вто� ричными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Для визуализации им� мунных комплексов использовали 3�амино�9� этилкарбазол. Проточная цитометрия с использованием аф� финно очищенных поликлональных антител про� тив rhExCD34. Клетки KG1 (5 · 105 на пробу) осаждали центрифугированием (300 g, 5 мин, 4 °С), ресуспендировали в буфере ФСБ, со� держащем 1 % БСА и 0,05 % азида натрия (ФСБ/БСА/ NaN3), и инкубировали 30 мин при 4 °С с аффинно очищенными поликлональны� ми антителами мыши при их концентрации 5, 10 и 20 мкг/мл. Клетки промывали буфером FACS и инкубировали с антителами против им� муноглобулинов мыши, конъюгированными с ФИТЦ (F (ab’)2�FITC, «Sigma», США). Связы� вание поликлональных антител с клетками ана� лизировали с использованием проточного цитофлюориметра EPICS XL («Beckman Coul� ter», США). В качестве контроля на автофлюо� ресценцию для канала ФИТЦ использовали неокрашенные клетки. Экспрессию маркера CD34 на KG1 определяли с использованием ФИТЦ�конъюгированных моноклональных антител против CD34 (клон 581, «Beckman Coulter», США). Специфичность связывания аффинно очищенных поликлональных антител с поверхностным антигеном CD34 человека определяли методом их конкурентного связыва� ния в присутствии rhExCD34 в насыщающей концентрации (50 мкг/мл), а также инкубацией клеток KG1 с антителами F (ab’)2�FITC в от� сутствие первичных антител. Анализ результа� тов проводили с использованием программно� го обеспечения указанного прибора. Результаты исследований и их обсуждение. Для клонирования использовали кДНК вне� клеточной части антигена CD34 человека (NCBI AAB25223) размером 783 пары нуклео� тидов, которую получали в реакции обратной транскрипции из фракции мРНК клеток KG1 ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 3 7 Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека Рис. 1. Электрофореграмма лизатов клеток E. coil в 15 % ДСН�ПААГ: 1 – фракция нерастворимых белков клетки (тельца включения) после индукции экспрес� сии ИПТГ; 2 – фракция растворимых белков клетки после индукции экспрессии ИПТГ; 3, 4 – фракции не� растворимых и растворимых белков клетки соответст� венно при культивировании без индуктора экспрессии. Количество белков на дорожках соответствуют 10 мкл клеточной суспензии E. coli. М – белки�маркеры мо� лекулярной массы (сверху вниз: 160, 110, 90, 70, 55, 45, 35, 25, 15, 10 кДа) миелобластоидного происхождения. Предва� рительный иммунофлюоресцентный анализ с использованием моноклональных антител про� тив CD34 человека показал, что более 80 % клеток KG1 экспрессируют целевой антиген. кДНК клонировали в вектор для бактериаль� ной экспрессии pET�24a+, содержащий силь� ный регулируемый промотор для ДНК�поли� меразы бактериофага Т7 и ген резистентности к канамицину. Уникальные сайты рестриктаз NdeI и XhoI, фланкирующие 5' и 3'�концы це� левого гена, были введены для возможности экспрессии рекомбинантного белка с первой аминокислоты, следующей за сигнальным пеп� тидом в последовательности нативного анти� гена, а также для совмещения с рамкой считы� вания последовательности аффинной «метки» 6His�tag, кодируемой вектором. Последователь� ности трансмембранного (а.к. 291–311) и цито� плазматического (а.к. 312–385) доменов CD34 были исключены при конструировании реком� бинантного антигена, что связано с их относи� тельной межвидовой инвариантностью, а также несущественным вкладом в антигенные свой� ства рекомбинантного белка в случае получения антител против CD34. Секвенированием было подтверждено соответствие последовательнос� ти клонированного гена ожидаемой. Для полу� чения рекомбинантного белка использовали вы� сокоэффективную систему экспрессии, осно� ванную на использовании штамма E. coli BL21 (DE3), содержащего ген ДНК�полимеразы бак� териофага Т7. Предварительный анализ кле� точных лизатов показал, что целевой белок при экспрессии в стандартных условиях нака� пливается в нерастворимой клеточной фрак� ции – тельцах включения (рис. 1). Оптимиза� ция условий ферментации (время инкубации, температура, концентрация индуктора изопро� пил�β�D�тиогалактопиранозида (ИПТГ)) не привели к накоплению белка в растворимой форме. Следует отметить, что последнее может быть связано как с необходимостью посттранс� ляционных модификаций (антиген CD34 че� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 38 Ю.С. Николаев, П.В. Гильчук, О.Б. Горбатюк и др. Рис. 2. Очистка и ренатурация rhExCD34 на металл�аффинном сорбенте: а – хроматограмма очистки rhExCD34; по горизонтали – V, мл; по вертикали слева – А280, mAu; справа – концентрация мочевины, М; 1 – нанесение со� любилизированных телец включения; 2 – белки, не связавшиеся с сорбентом; 3 – элюция rhExCD34 0,3 М ими� дазолом; б – электрофореграмма фракций элюции rhExCD34 с металл�аффинной колонки: 1 – солюбилизиро� ванные тельца включения; 2 – белки, не связавшиеся с сорбентом; 3 – промывка колонки ФСБ, содержащим 100 мМ имидазол; 4, 5 – элюированный в присутствии 0,3 М имидазола rhExCD34; 6 – элюированный в присутст� вии 0,5 М имидазола rhExCD34; 7 – агрегировавший на колонке белок, элюированный в присутствии 8 М моче� вины и 0,5 М имидазола. Разделение белков в 12 % ДСН�ПААГ. М – белки�маркеры молекулярной массы (сверху вниз: 160, 110, 90, 70, 55, 45, 35, 25, 15, 10 кДа) ловека высокогликозилирован), так и со слож� ной третичной структурой CD34 (наличие не� скольких доменов во внеклеточной части, а также трех дисульфидных мостиков). В то же время экспрессия рекомбинантного белка в тельца включения обладает рядом преиму� ществ, среди которых можно указать высокий уровень его накопления продуцентом (до 50 % от суммарного белка E. coli), отсутствие протео� лиза, относительную простоту выделения те� лец включения и высокую чистоту целевого белка в этой фракции, а также возможностью выделения функционального и растворимого белка ренатурацией in vitro. Исходя из сказан� ного, упомянутая система экспрессии является перспективной для получения препаративного количества рекомбинантного антигена CD34. Дальнейшая работа была посвящена оптимиза� ции экспрессии rhExCD34 продуцентом, что включало ферментацию с использованием среды для аутоиндукции (см. «Материалы и методы»), а также экспрессию rhExCD34 в E. coli штамма Rosetta 2(DE3), содержащего тРНК для транс� ляции редких эукариотических кодонов. При аутоиндукции для ферментации ис� пользовали питательную среду, содержащую неорганические соли, глицерол как источник углерода, глюкозу и альфа�лактозу (индуктор экспрессии) в определенных концентрациях [9]. За счет пролонгирования экспоненциаль� ной фазы роста (18–24 ч) этот способ позволя� ет получать суспензионные культуры высокой плотности, что в случае использования регули� руемой Т7�системы экспрессии приводит к по� вышению выхода рекомбинантного белка. По данным литературы продуценты, культивируе� мые в среде для аутоиндукции, являются более стабильными и способны экспрессировать ре� комбинантный белок в течение 24 ч и более без применения специализированного обору� дования для ферментации. Учитывая также простоту применения в условиях лаборатории и невысокую стоимость используемых компо� нентов среды, мы рассматриваем описанный способ как наиболее предпочтительный для продукции rhExCD34. Электрофоретический анализ лизатов бактериальных клеток показал, что уровень экспрессии rhExCD34 относитель� но суммарных клеточных белков составляет около 20 %. ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 3 9 Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека Рис. 3. Формирование дисульфидных связей в rhExCD34 после ренатурации: 1 – ренатурированный белок rhExCD34 после восстановления дисульфидных связей в присутствии 100 мМ 2�меркаптоэтанола; 2 – ренатурированный белок rhExCD34 без восстановле� ния дисульфидных связей; а, б, в – высокомолекуляр� ные, димерная и мономерная формы rhExCD34. Раз� деление белков в 12 % ДСН�ПААГ; М – белки�маркеры молекулярной массы (сверху вниз: 160, 110, 90, 70, 55, 45, 35, 25, 15, 10 кДа) Рис. 4. Кривая связывания иммуноглобулинов из сыво� роток с rhExCD34, полученная с использованием мето� да ИФА: 1 – иммунная сыворотка; 2 – неиммунная сыворотка; по вертикали – оптическая плотность при длине волны 450 нм; по горизонтали – отрицательный десятичный логарифм разведения сыворотки. Приве� дены типичные результаты титрования иммунной сыворотки для группы из десяти иммунизированных rhExCD34 мышей Анализ последовательности мРНК реком� бинантного антигена показал наличие восьми кодонов для аминокислот Arg и Leu, которые плохо транслируются в E. coli – два AGG, два AGA, один CGA, три CUA – с частотами встре� чаемости в мРНК E. coli соответственно 0,14; 0,21; 0,31; 0,32 % [12]. Для исследования воз� можности дальнейшей оптимизации экспрес� сии плазмидой с кДНК rhExCD34 трансфор� мировали штамм E. coli Rosetta 2(DE3), который содержит тРНК, распознающие редкие кодоны. Количественный анализ экспрессии rhExCD34 показал одинаковый уровень его синтеза в клетках штаммов BL21(DE3) и Rosetta2(DE3) (данные не представлены). В дальнейшем экс� прессию rhExCD34 проводили в штамме BL21 (DE3). Поскольку процедуры иммунизации жи� вотных, выделения и характеристики фракции специфических поликлональных антител тре� буют больших количеств антигена в очищен� ной и растворимой форме, необходимым эта� пом является разработка и оптимизация спо� соба получения rhExCD34. Наличие последо� вательности шести гистидинов (6His�tag) в составе рекомбинантного белка позволяет проводить его высокоэффективную очистку в денатурирующих условиях после солюбили� зации телец включения. Ранее нами описан метод ренатурации рекомбинантных белков на металл�аффинной колонке, который по� зволяет автоматизировать процессы ренатура� ции и очистки, а также осуществлять их в одну стадию [13]. Принцип метода заключается в том, что рекомбинантный белок, солюбили� зированный из телец включения с использова� нием мочевины или гуанидингидрохлорида, иммобилизируется на металл�аффинной колон� ке, уравновешенной ионами Ni2+. Градиентное удаление мочевины с использованием автома� тизированного хроматографа приводит к рена� турации иммобилизированного белка. Ренату� рированный белок элюируют с колонки в не� денатурирующих условиях с использованием имидазола (рис. 2, а). Простота и технологич� ность, а также возможность оптимизации усло� вий ренатурации индивидуальных белков с учетом особенностей их структуры позволяет рассматривать описанный подход как универ� сальный для получения 6His�tag�содержащих ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 310 Ю.С. Николаев, П.В. Гильчук, О.Б. Горбатюк и др. Рис. 5. Электрофореграмма фракций элюции иммуно� глобулинов с аффинной колонки: 1 – наносимые на колонку белки сыворотки крови; 2 – белки, не связав� шиеся с сорбентом; 3 – элюированные иммуноглобу� лины. Разделение белков проводили в 12 % ДСН� ПААГ; М – белки�маркеры молекулярной массы (свер� ху вниз: 160, 110, 90, 70, 55, 45, 35, 25, 15 кДа) Рис. 6. Вестерн�блот анализ связывания очищенных поликлональных антител с rhExCD34 в лизатах кле� ток�продуцентов (а) и электрофореграмма лизатов клеток E. coil в 15 % ДСН�ПААГ (б): 1 – лизированные клетки�продуценты rhExCD34 после индукции экс� прессии ИПТГ; 2 – лизированные клетки�продуценты rhExCD34 после культивирования без индуктора экс� прессии. Количество белков на дорожках соответству� ют 10 мкл клеточной суспензии E. coil. М – белки� маркеры молекулярной массы (сверху вниз: 160, 110, 90, 70, 55, 45, 35, 25, 15, 10 кДа) белков в препаративных количествах. С учетом описанных особенностей третичной структуры антигена CD34 изначальный способ получения белка ренатурацией на металл�аффинном сор� бенте был модифицирован, что заключалось в следующем: при солюбилизации телец вклю� чения вносили 2�меркаптоэтанол для предотв� ращения спонтанного окисления SH�групп цистеина. В буфер для рефолдинга, который использовался для формирования нисходящего градиента мочевины, добавляли пару реагентов «глутатион окисленный/восстановленный» для образования дисульфидных связей, присут� ствующих в нативном CD34. Использование ступенчатого градиента имидазола позволило оптимизировать условия элюции ренатуриро� ванного белка и определить условия получе� ния растворимого rhExCD34 с чистотой выше 90 % (рис. 2, б). Поскольку одна из задач настоящей работы заключалась в получении рекомбинантного аналога CD34 человека, который сохраняет антигенные детерминанты, свойственные на� тивному антигену, важным этапом являлось определение содержания мономерной формы с корректно сформированными дисульфид� ными связями во фракции ренатурированного белка. Наличие таких детерминант в составе рекомбинантного антигена является необхо� димым условием получения специфических поликлональных антител против конформа� ционных эпитопов нативного антигена, в слу� чае использования описанной нами стратегии. Как было упомянуто ранее, антиген CD34 со� держит три дисульфидных мостика, которые, по�видимому, участвуют в формировании трех субдоменов во внеклеточной части молекулы. Методом электрофореза в ДСН�ПААГ в нере� дуцирующих условиях было показано, что �40 % rhExCD34 находится в мономерной фор� ме (рис. 3). Такой подход, основанный на опре� делении содержания мономерной формы [14], является одним из косвенных критериев успеш� ности ренатурации белка. Также было проде� монстрировано, что ренатурированный белок концентрацией 1–2 мг/мл не агрегирует дли� тельное время в условиях хранения при +4 °С. Очищенный ренатурированный белок ис� пользовали в процедурах иммунизации. Титр антител, специфичных к rhExCD34, в сыво� ротках иммунизированных животных опреде� ляли методом иммуноферментного анализа (ИФА) (рис. 4). Выделение фракции специфичных поликло� нальных антител против rhExCD34 из гипер� иммунных сывороток проводили с помощью аффинной хроматографии на BrCN�активиро� ванной сефарозе с иммобилизированным ре� комбинантным антигеном. Для получения препаративного количества поликлональных антител из сыворотки иммунных кролей ис� пользовали модифицированный метод ме� ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 3 11 Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека Рис. 7. Иммунохимическое окрашивание препаратов клеток KG1: а – окрашивание клеток с использованием поли� клональных антител; б – окрашивание клеток поликлональными антителами в присутствии rhExCD34 в качестве конкурентного антигена талл�аффинной хроматографии. rhExCD34 ре� натурировали на металл�аффинном сорбенте, как описано в «Материалах и методах». Указан� ный сорбент с иммобилизированным рекомби� нантным антигеном инкубировали с фракцией иммуноглобулинов, полученной из иммунных сывороток кролей, и промывали от несвязав� шихся белков. Элюцию специфических к rhExCD34 поликлональных антител проводили буфером, содержащим 3,5 M MgCl2. Указанные условия обеспечивают селективную десорбцию связавшихся с рекомбинантным антигеном анти� тел. Благодаря высокой емкости металл�аффин� ного сорбента, а также эффективности схем им� мобилизации и элюции специфичных поли� клональных антител, этот метод позволяет по� лучать антитела высокой степени чистоты в препаративном количестве (рис. 5). Связывание поликлональных антител с rhExCD34 анализи� ровали методом вестерн�блоттинга (рис. 6). Поскольку антитела были получены имму� низацией и последующей очисткой с исполь� зованием рекомбинантного антигена, важным этапом работы было исследование их связыва� ния с нативным антигеном CD34 на поверх� ности интактных и фиксированных клеток. Специфичность была показана в иммуноцито� химических экспериментах, которые включали конкурентное связывание аффинно очищенных антител, а также иммунных сывороток с фик� сированными препаратами клеток KG1 в при� сутствии насыщающей концентрации реком� бинантного антигена (рис. 7). Для оценки связывания поликлональных антител с интактными клетками, экспресси� рующими маркер CD34, использовали метод проточной цитометрии. Визуализацию обра� зовавшихся иммунных комплексов проводили вторичными ФИТЦ�мечеными антителами. Специфичность связывания поликлональных ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 312 Ю.С. Николаев, П.В. Гильчук, О.Б. Горбатюк и др. Рис. 8. Связывание поликлональных антител с клетками KG1, которые инкубировали с поликлональными мы� шиными антителами концентрацией 5, 10, 20 мкг/мл (а, б, в соответственно): по вертикали – количество событий; по горизонтали – интенсивность флюорес� ценции; 1 – гистограмма аутофлюоресценции клеток; 2 – флюоресценция клеток, окрашивание которых проводилось поликлональными антителами; 3 – флюо� ресценция клеток, окрашивание которых поликло� нальными антителами проводилось в присутствии ре� комбинантного антигена антител с клеточным CD34 анализировали методом конкурентного связывания в присут� ствии насыщающей концентрации рекомби� нантного антигена и различных концентраций поликлональных антител (рис. 8). Эксперимен� ты по конкурентному связыванию поликло� нальных антител в присутствии рекомбинант� ного антигена показали снижение флюорес� ценции вплоть до уровня отрицательного кон� троля (неокрашенные антителами клетки KG1), что подтверждает специфичность аф� финно очищенных поликлональных антител к белковым антигенным детерминантам натив� ного антигена CD34. Таким образом показано, что полученный нами негликозилированный рекомбинантный белок rhExCD34 сохраняет антигенные детер� минанты, свойственные нативному антигену CD34 человека, и при иммунизации индуци� рует продукцию специфических поликлональ� ных антител, способных распознавать поверх� ностный клеточный маркер CD34. Фракция индуцированных антигеном поликлональных антител может быть выделена в высокоочищен� ной форме. Полученные антитела распознают белковые антигенные детерминанты антигена CD34 и могут быть использованы в методах иммуноцитохимии и проточной цитометрии для детектирования CD34+ клеток. Кроме фе� нотипирования целевых субпопуляций клеток, полученные поликлональные антитела потен� циально могут быть использованы при разра� ботке систем обогащения и сепарации CD34+ клеток, альтернативных коммерческим, из та� ких источников, как костный мозг, перифери� ческая и пуповинная кровь. Iu.S. Nikolaiev, P.V. Gilchuk, O.B. Gorbatiuk, A.I. Flyak, A.J. Labyntsev, D.M. Irodov, D.V. Kolibo, V.A. Kordium POLYCLONAL ANTIBODIES AGAINST HUMAN CELL�SURFACE ANTIGEN CD34 An efficient and inexpensive laboratory approach for the generation and the purification of polyclonal antibod� ies to human antigen CD34 was developed. It was shown that cloned refolded and purified from Escherichia coli recombinant extracellular fragment of CD34 antigen retained immunogenic determinants of cell�surface expressed CD34. Immunization of mice with unglycosylat� ed truncated recombinant protein elicit polyclonal anti� bodies specific for the native human antigen CD34. The antibodies generated are applicable for phenotyping of CD34 + cells using immunocytochemistry and flow cytome� try assays. Ю.С. Ніколаєв, П.В. Гільчук, О.Б. Горбатюк, А.І. Фляк, А.Ю. Лабинцев, Д.М. Іродов, Д.В. Колібо, В.А. Кордюм ПОЛІКЛОНАЛЬНІ АНТИТІЛА ПРОТИ ПОВЕРХНЕВОГО КЛІТИННОГО МАРКЕРА СD34 ЛЮДИНИ Розроблено високоефективний та недорогий лабо� раторний спосіб одержання та очищення полікло� нальних антитіл проти поверхневого клітинного мар� кера CD34 людини. Показано, що клонований в клі� тини E. coli неглікозильований рекомбінантний білок, що містить зовнішньоклітинний фрагмент антигена CD34 людини, при виділенні з бактерій зберігає необ� хідні антигенні детермінанти та при імунізації індукує продукування специфічних поліклональних антитіл, що здатні розпізнавати нативний антиген на поверхні клітин. Одержані антитіла можуть бути використані для фенотипування CD34 + клітин методами імуноци� тохімії та проточної цитометрії. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Lanza F., Healy L., Sutherland D.R. Structural and func� tional features of the CD34 antigen: an update // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. – 2001. – 15(1). – P. 1–13. 2. Baech J., Johnsen H.E. Technical aspects and clinical impact of hematopoietic progenitor subset quantifica� tion // Stem Cells. – 2000. – 18(2). – P. 76–86. 3. Civin C.I., Strauss L.C., Brovall C., Fackler M.J., Schwartz J.F., Shaper J.H. Antigenic analysis of hematopoiesis. 3. A hematopoietic progenitor cell sur� face antigen defined by a monoclonal antibody raised against KG�1a cells // J. Immunol. – 1984. – 133(1). – P. 157–165. 4. Izawa K., Tani K., Nakazaki Y. Hematopoietic activity of common marmoset CD34 cells isolated by a novel monoclonal antibody MA24 // Exp. Hematol. – 2004. – 32(9). – P. 843–851. 5. Krause D.S., Ito T., Fackler M.J., Smith O.M., Collec� tor M.I., Sharkis S.J., May W.S. Characterization of murine CD34, a marker for hematopoietic progenitor and stem cells // Blood. – 1994. – 84(3). – P. 691–701. 6. Porada C.D., Harrison�Findik D.D., Sanada C., Valien� te V., Thain D., Simmons P.J., Almeida�Porada G., Zanjani E.D. Development and characterization of a novel CD34 monoclonal antibody that identifies sheep hematopoietic stem/progenitor cells // Exp. Hematol. – 2008. – 36(12). – P. 1739–1749. 7. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. – Cold Spring Harbor Laboratory Press. – 1989. – V. 1. ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 3 13 Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека 8. Furley A.J., Reeves B.R., Mizutani S., Altass L.J., Watt S.M., Jacob M.C., van den Elsen P., Terhorst C., Grea� ves M.F. Divergent molecular phenotypes of KG1 and KG1a myeloid cell lines // Blood. – 1986. – 68(5). – P. 1101–1107. 9. Studier F.W. Protein production by auto�induction in high density shaking cultures // Protein Exp. Purif. – 2005. – 41(1). – P. 207–234. 10. Горбатюк О.Б., Ніколаєв Ю.С., Іродов Д.М., Дубей І.Я., Гільчук П.В. Ренатурація химерного білка ScFv� CBD з тілець включення Escherichia coli // Біополі� мери і клітина. – 2008. – 24, № 1. – С. 51–59. 11. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – 227(5259). – P. 680–685. 12. Kane J.F. Effects of rare codon clusters on high�level expression of heterologous proteins in Escherichia coli // Curr. Opin. Biotechnol. – 1995. – 6(5). – P. 494–500. 13. Гильчук П.В., Окунев О.В., Иродов Д.М., Павло� ва М.В. Суперпродукция одноцепочечных антител к IFN�α2b человека в Escherichia coli и выделение их в биологически активной форме // Укр. биохим. журн. – 2006. – 78, № 1. – С. 163–171. 14. Kurucz I., Titus J.A., Jost C.R., Segal D.M. Correct disulfide pairing and efficient refolding of detergent� solubilized single�chain Fv proteins from bacterial inclusion bodies // Mol. Immunol. – 1995. – 32(17–18). – P. 1443–1452. Поступила 21.04.10 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 314 Ю.С. Николаев, П.В. Гильчук, О.Б. Горбатюк и др.

Поликлональные антитела против поверхностного клеточного маркера CD34 человека

Репозитарії

Схожі ресурси