Оценка фенотипических характеристик фетальных нервных клеток после криоконсервирования с использованием различных режимов замораживания
Проанализировано влияние трех различных режимов криоконсервирования на субпопуляционный состав фетальных нервных клеток (ФНК) 11 суток гестации. К действию физико-химических факторов криоконсервирования, реализуемых при использовании данных режимов замораживания, различные субпопуляции ФНК проявляли...
Збережено в:
| Дата: | 2012 |
|---|---|
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2012
|
| Назва видання: | Проблемы криобиологии |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68477 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Оценка фенотипических характеристик фетальных нервных клеток после криоконсервирования с использованием различных режимов замораживания / Е.А. Порожан, М.В. Останков, Н.Н. Бабенко, А.Н. Гольцев // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 1. — С. 39-48. — Бібліогр.: 25 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
irk-123456789-68477 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
irk-123456789-684772014-09-26T03:01:43Z Оценка фенотипических характеристик фетальных нервных клеток после криоконсервирования с использованием различных режимов замораживания Порожан, Е.А. Останков, М.В. Бабенко, Н.Н. Гольцев, А.Н. Теоретическая и экспериментальная криобиология Проанализировано влияние трех различных режимов криоконсервирования на субпопуляционный состав фетальных нервных клеток (ФНК) 11 суток гестации. К действию физико-химических факторов криоконсервирования, реализуемых при использовании данных режимов замораживания, различные субпопуляции ФНК проявляли разную чувствительность. Установлен факт большей криостабильности глиальных и стволовых клеток в гетерогенном составе биоматериала независимо от режима замораживания. Показано, что при использовании одного из режимов в общем пуле ФНК увеличивается количество мультипотентных прогениторных клеток с фенотипом CD133 и nestin за счет гибели более дифференцированных предшественников нейронов. Доказано селективное влияние определенных режимов криоконсервирования на гетерогенный состав ФНК. В роботі проаналізовано вплив трьох різних режимів кріоконсервування на субпопуляційний склад фетальних нервових клітин (ФНК) 11 діб гестації. До дії фізико-хімічних факторів кріоконсервування, що реалізуються при використанні даних режимів заморожування, різні субпопуляції ФНК проявляли різну чутливість. Встановлено факт більшої кріостабільності гліальних і стовбурових клітин в гетерогенному складі біоматеріалу незалежно від режиму заморожування. Показано, що при використанні одного з режимів в загальному пулі ФНК збільшується кількість мультипотентних прогеніторних клітин з фенотипом CD133 і nestin за рахунок загибелі більш диференційованих попередників нейронів. Доведено селективний вплив певних режимів кріоконсервування на гетерогенний склад ФНК. In the paper the effect of three different cryopreservation regimens on subpopulation composition of fetal neural cells (FNCs) of 11 gestation days was analyzed. FNC subpopulations revealed different sensitivity to the effect of physical and chemical factors of cryopreservation, implemented when using these freezing regimens. The fact of higher cryostability of glial and stem cells in biomaterial of heterogenous composition independently on freezing regimen was found. It has been shown that using one of the regimens in general pool of FNCs the number of multipotent progenitor cells with CD133 and nestin phenotype increases due to the death of more differentiated neuron precursors. Selective effect of certain cryopreservation regimens on heterogenous content of FNCs was proved. 2012 Article Оценка фенотипических характеристик фетальных нервных клеток после криоконсервирования с использованием различных режимов замораживания / Е.А. Порожан, М.В. Останков, Н.Н. Бабенко, А.Н. Гольцев // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 1. — С. 39-48. — Бібліогр.: 25 назв. — рос., англ. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68477 612.647.08.014.3:615.014.41 ru Проблемы криобиологии Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Порожан, Е.А. Останков, М.В. Бабенко, Н.Н. Гольцев, А.Н. Оценка фенотипических характеристик фетальных нервных клеток после криоконсервирования с использованием различных режимов замораживания Проблемы криобиологии |
| description |
Проанализировано влияние трех различных режимов криоконсервирования на субпопуляционный состав фетальных нервных клеток (ФНК) 11 суток гестации. К действию физико-химических факторов криоконсервирования, реализуемых при использовании данных режимов замораживания, различные субпопуляции ФНК проявляли разную чувствительность. Установлен факт большей криостабильности глиальных и стволовых клеток в гетерогенном составе биоматериала независимо от режима замораживания. Показано, что при использовании одного из режимов в общем пуле ФНК увеличивается количество мультипотентных прогениторных клеток с фенотипом CD133 и nestin за счет гибели более дифференцированных предшественников нейронов. Доказано селективное влияние определенных режимов криоконсервирования на гетерогенный состав ФНК. |
| format |
Article |
| author |
Порожан, Е.А. Останков, М.В. Бабенко, Н.Н. Гольцев, А.Н. |
| author_facet |
Порожан, Е.А. Останков, М.В. Бабенко, Н.Н. Гольцев, А.Н. |
| author_sort |
Порожан, Е.А. |
| title |
Оценка фенотипических характеристик фетальных нервных клеток после криоконсервирования с использованием различных режимов замораживания |
| title_short |
Оценка фенотипических характеристик фетальных нервных клеток после криоконсервирования с использованием различных режимов замораживания |
| title_full |
Оценка фенотипических характеристик фетальных нервных клеток после криоконсервирования с использованием различных режимов замораживания |
| title_fullStr |
Оценка фенотипических характеристик фетальных нервных клеток после криоконсервирования с использованием различных режимов замораживания |
| title_full_unstemmed |
Оценка фенотипических характеристик фетальных нервных клеток после криоконсервирования с использованием различных режимов замораживания |
| title_sort |
оценка фенотипических характеристик фетальных нервных клеток после криоконсервирования с использованием различных режимов замораживания |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2012 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68477 |
| citation_txt |
Оценка фенотипических характеристик фетальных нервных клеток после криоконсервирования с использованием различных режимов замораживания / Е.А. Порожан, М.В. Останков, Н.Н. Бабенко, А.Н. Гольцев // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 1. — С. 39-48. — Бібліогр.: 25 назв. — рос., англ. |
| series |
Проблемы криобиологии |
| work_keys_str_mv |
AT porožanea ocenkafenotipičeskihharakteristikfetalʹnyhnervnyhkletokposlekriokonservirovaniâsispolʹzovaniemrazličnyhrežimovzamoraživaniâ AT ostankovmv ocenkafenotipičeskihharakteristikfetalʹnyhnervnyhkletokposlekriokonservirovaniâsispolʹzovaniemrazličnyhrežimovzamoraživaniâ AT babenkonn ocenkafenotipičeskihharakteristikfetalʹnyhnervnyhkletokposlekriokonservirovaniâsispolʹzovaniemrazličnyhrežimovzamoraživaniâ AT golʹcevan ocenkafenotipičeskihharakteristikfetalʹnyhnervnyhkletokposlekriokonservirovaniâsispolʹzovaniemrazličnyhrežimovzamoraživaniâ |
| first_indexed |
2025-07-05T18:18:45Z |
| last_indexed |
2025-07-05T18:18:45Z |
| _version_ |
1836832025491800064 |
| fulltext |
39
Обоснованность применения метода тканевой
и клеточной терапии в современной медицине [18]
объясняется присутствием во вводимом материа-
ле клеток стволового компартмента различного
уровня дифференцировки, а также широкого спект-
ра продуцируемых ими биологически активных
веществ, которые обладают высокой терапевти-
ческой эффективностью [15].
Механизм действия применяемых фетальных
нервных клеток (ФНК) определяется их структур-
ными и функциональными особенностями. Крио-
консервирование – один из этапов технологичес-
кого процесса применения ФНК в клинической
практике – позволяет хранить сертифицированный
Expediency of applying the tissue and cell therapy
in contemporary medicine [18] is explained by the pre-
sence in the administered material of the stem compart-
ment cells of different differentiation rate, as well as a
wide spectrum of the produced by them biologically
active substances, possessing a high therapeutic effi-
ciency [15].
The action mechanism of applied fetal neural cells
(FNCs) is determined by their structural and functional
peculiarities. Cryopreservation is one of the stages of
technological process of applying the FNC in clinic, it
allows the storage of certified biomaterial during dif-
ferent time at low temperature banks and its application
when the need arise [13].
УДК 612.647.08.014.3:615.014.41
Е.А. ПОРОЖАН*, М.В. ОСТАНКОВ, Н.Н. БАБЕНКО, А.Н. ГОЛЬЦЕВ
Оценка фенотипических характеристик фетальных нервных клеток
после криоконсервирования с использованием
различных режимов замораживания
UDC 612.647.08.014.3:615.014.41
YE.A. POROZHAN*, M.V. OSTANKOV, N.N. BABENKO, A.N. GOLTSEV
Assessment of Phenotype Characteristics of Fetal Neural Cells
After Cryopreservation Using Different Freezing Regimens
В работе проанализировано влияние трех различных режимов криоконсервирования на субпопуляционный состав
фетальных нервных клеток (ФНК) 11 суток гестации. К действию физико-химических факторов криоконсервирования,
реализуемых при использовании данных режимов замораживания, различные субпопуляции ФНК проявляли разную
чувствительность. Установлен факт большей криостабильности глиальных и стволовых клеток в гетерогенном составе
биоматериала независимо от режима замораживания. Показано, что при использовании одного из режимов в общем пуле ФНК
увеличивается количество мультипотентных прогениторных клеток с фенотипом CD133 и nestin за счет гибели более
дифференцированных предшественников нейронов. Доказано селективное влияние определенных режимов криоконсервиро-
вания на гетерогенный состав ФНК.
Ключевые слова: фетальные нервные клетки, криоконсервирование, стволовые клетки.
В роботі проаналізовано вплив трьох різних режимів кріоконсервування на субпопуляційний склад фетальних нервових
клітин (ФНК) 11 діб гестації. До дії фізико-хімічних факторів кріоконсервування, що реалізуються при використанні даних
режимів заморожування, різні субпопуляції ФНК проявляли різну чутливість. Встановлено факт більшої кріостабільності
гліальних і стовбурових клітин в гетерогенному складі біоматеріалу незалежно від режиму заморожування. Показано, що при
використанні одного з режимів в загальному пулі ФНК збільшується кількість мультипотентних прогеніторних клітин з
фенотипом CD133 і nestin за рахунок загибелі більш диференційованих попередників нейронів. Доведено селективний вплив
певних режимів кріоконсервування на гетерогенний склад ФНК.
Ключові слова: фетальні нервові клітини, кріоконсервування, стовбурові клітини.
In the paper the effect of three different cryopreservation regimens on subpopulation composition of fetal neural cells (FNCs) of
11 gestation days was analyzed. FNC subpopulations revealed different sensitivity to the effect of physical and chemical factors of
cryopreservation, implemented when using these freezing regimens. The fact of higher cryostability of glial and stem cells in biomaterial
of heterogenous composition independently on freezing regimen was found. It has been shown that using one of the regimens in general
pool of FNCs the number of multipotent progenitor cells with CD133 and nestin phenotype increases due to the death of more
differentiated neuron precursors. Selective effect of certain cryopreservation regimens on heterogenous content of FNCs was proved.
Key words: fetal neural cells, cryopreservation, stem cells.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38
057) 373-57-89, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:
janepor@yandex.ru
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 57
89, fax: +380 57 373 3084, e-mail: janepor@yandex.ru
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
40
биоматериал на протяжении различного времени
в условиях низкотемпературных банков и использо-
вать его по мере востребованности [13].
Установлено, что криоконсервирование оказы-
вает многовекторное влияние на структуру и функ-
цию биообъекта [14]. При замораживании-оттаива-
нии происходит угнетение жизнедеятельности
тканей и клеток, изменяются их функциональные
свойства, так как при этом замедляются процессы
восстановления и удлиняется рефрактерный пе-
риод [6]. В настоящее время интенсивно проводят-
ся экспериментальные исследования природы
криолабильности и криорезистентности клеточных
суспензий [5]. Сведения о морфологической и функ-
циональной сохранности криоконсервированных
ФНК (кФНК), включая и элементы стволового
компартмента, весьма противоречивы, что можно
объяснить широким спектром методических под-
ходов к реализации процесса замораживания-
оттаивания [3, 24, 25]. Кроме того, степень его влия-
ния определяется не только воздействием физико-
химических факторов, но и исходным состоянием
биообъекта [4].
Учитывая гетерогенный клеточный состав тка-
ни фетального мозга с определенной функциональ-
ной активностью для каждого типа клеток, особое
значение приобретает сохранение при заморажива-
нии-оттаивании клеточных популяций.
Цель данной работы – исследовать влияние
различных режимов криоконсервирования на суб-
популяционный состав ФНК.
Материалы и методы
Объектом исследования были клетки феталь-
ного мозга крыс 11 суток гестации. Эксперименты
проводили в соответствии с «Общими принципами
экспериментов на животных», одобренными III
Национальным конгрессом по биоэтике (Киев,
2007 г.) и согласованными с положениями «Евро-
пейской конвенции о защите позвоночных живот-
ных, используемых для экспериментальных и дру-
гих научных целей» (Страсбург, 1986 г).
Извлеченные плоды крыс 11 суток гестации [2]
трижды промывали в стерильном растворе Хенкса
(ПанЭко, Россия) и переносили в чашку Петри для
препарирования. С помощью пинцета и глазных
ножниц извлекали головной мозг, освобождали его
от мезенхимной оболочки и разрезали на фрагмен-
ты [1]. Для получения суспензии ФНК ткань мозга
гомогенизировали в 3 мл раствора Хенкса, содер-
жащего 10% эмбриональной телячьей сыворотки
(ЭТС) («БиоЛек», Россия). Все манипуляции про-
водили при 4°C.
Используемые режимы (Р) замораживания:
Р1: охлаждение со скоростью 1 град/мин до –5°С
с последующей инициацией кристаллообразования,
Cryopreservation has been found to render a multi-
vector effect on bioobject structure and function [14].
During freeze-thawing the suppression of vital activity
of tissues and cells takes place, their functional proper-
ties change since herewith the recovery processes
slow-down and refractory period extends [6]. Now-
adays, experimental studies of the origin of cryolability
and cryoresistance of cell suspensions have been inten-
sively carried-out [5]. Data on morphological and
functional integrity of cryopreserved FNCs (cFNCs)
including also the elements of stem compartment are
very contradictory, which can be explained by a wide
range of methods to perform freeze-thawing [3, 24,
25]. In addition, the extent of its effect is determined
not only by physical and chemical factors, but also with
initial state of bioobject [4].
Taking into account heterogenous cell composition
of fetal brain tissue with certain functional activity for
each cell type, of special value is the preserving of
cell populations during freeze-thawing.
The research aim was to study the effect of different
cryopreservation regimens on subpopulation compo-
sition of FNCs.
Materials and methods
Research objects were the cells of rat fetal brain
of 11 gestation days. The experiments were performed
in accordance with the General principles of expe-
riments in animals approved by the 3rd National
Congress on Bioethics (Kiev, 2007) and coordinated
with the statements of European Convention on the
Protection of Vertebrate Animals Used for Experimen-
tal and Other Scientific Purposes (Strasbourg, 1986).
The derived fetuses of rats of 11 gestation days [2]
were thrice washed in sterile Hanks’ solution (PanEco,
Russia) and transferred to Petri dish for dissection.
By means of forceps and ophthalmic scissors the brain
was excised, the mesenchyme membrane was remo-
ved and tissue was cut into fragments [1]. To obtain
the suspension of FNC the brain tissue was homo-
genized in 3 ml of Hanks’ solution, containing 10%
fetal bovine serum (FBS) (BioLek, Russia). All the
manipulations were performed at 4°C.
The used regimens (R) of freezing were as follows:
R1: cooling with the rate of 1 deg/min down to
–5°C with following initiation of crystal formation, then
cooling with the rate of 2 deg/min down to –60°C and
plunging into liquid nitrogen [8];
R2: cooling with the rate of 1 deg/min down to
–80°C and plunging into liquid nitrogen [24];
R3: cooling with the rate of 1 deg/min down to
–9°C, stop for 10 min, then cooling with the rate of
1 deg/min down to –25°C, 10 deg/min down to –60°C
and plunging into liquid nitrogen [9];
Fetal neural cells were frozen in the presence of
dimethyl sulfoxide (DMSO) (Galichfarm, Ukraine) in
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
41
затем охлаждение со скоростью 2 град/мин до
–60°С и погружение в жидкий азот [8];
Р2: охлаждение со скоростью 1 град/мин до
–80°С и погружение в жидкий азот [24];
Р3: охлаждение со скоростью 1 град/мин до
–9°С, остановка в течение 10 мин, затем охлажде-
ние со скоростью 1 град/мин до –25°С, 10 град/мин
до –60°С и погружение в жидкий азот [9].
Фетальные нервные клетки замораживали с ди-
метилсульфоксидом (ДМСО) (АО «Галичфарм»,
Украина) в конечной концентрации 7% (для Р1 и Р2)
и 10% (для Р3). В качестве среды криоконсервиро-
вания использовали раствор Хенкса с добавлением
0,6% глюкозы, 10% ЭТС, 0,2 Ед/мл инсулина. Раст-
вор ДМСО добавляли к суспензии ФНК через
инъекционную иглу по каплям в соотношении 1:1
(по объему) при постоянном легком перемешива-
нии суспензии. Экспозиция с криопротектором сос-
тавляла 10 мин при 4°С.
Суспензию ФНК с концентрацией 5×106кл/мл
замораживали на программном замораживателе
УОП-6 (СКТБ с ОП ИПКиК НАН Украины) в плас-
тиковых ампулах («Nunc», Германия) объемом
1,8 мл. Замороженные ФНК хранили при темпера-
туре –196°С в условиях низкотемпературного бан-
ка ИПКиК НАН Украины 2 месяца. Образцы ото-
гревали на водяной бане при температуре 37°С
в течение 50 с при постоянном встряхивании ампул
[2] (до исчезновения твердой фазы). Для отмыва-
ния клеток от ДМСО однократно медленно добав-
ляли равный объем раствора Хенкса, содержащего
20% ЭТС, затем центрифугировали (1000 об/мин,
10 мин). Сохранность ФНК до и после криоконсер-
вирования определяли методом суправитального
окрашивания трипановым синим (ТС) и раствором
пропидия йодида (РI) (5 мкг/мл в фосфатно-соле-
вом буфере) («Sigma», США).
Для оценки экспрессии фенотипических марке-
ров ФНК применяли метод проточной цитофлуори-
метрии с использованием первичных моноклональ-
ных антител (МАТ) к внутриклеточным антигенам
nestin (клон RAT401, кат. №556309), GFAP (клон
2Е1, кат. №556329), β-tubulin III (клон 5Н1, кат.
№556321) и вторичных МАТ, меченных Fluorescein
isothiocyanate (FITC): для nestin – IgG1,κ (клон R3-
34, кат. №553924), для GFAP – IgG2,b (клон A95-1,
кат. №553988), для β-tubulin III – Ig Specific Polyclo-
nal Antibody (Multiple Adsorption) (кат. №554001).
В качестве изотипов использовали FITC-меченныe
IgG1,κ (клон MOPC-31, кат. №550616), IgG2,b (клон
MPC-11, кат. № 559532), IgMκ (клон G155-228, кат.
№551448) соответственно (все «BD Pharmingen»,
США). Перед инкубацией с МАТ для внутрикле-
точных антигенов, как описано в протоколе фирмы-
производителя, клетки предварительно пермеаби-
лизировали с использованием реактивов Cytofix/
final concentration of 7% (for R1 and R2) and 10%
(for R3). Hanks’ solution supplemented with 0.6% glu-
cose, 10% FBS and 0.2 units/ml insulin was used as
medium. DMSO solution was added to the suspen-
sion of FNCs via injection needle dropwise in 1:1 (v/v)
ratio at constant slight shaking of the suspension. Ex-
posure with cryoprotectants lasted 10 min at 4°C.
FNCs suspension with concentration of 5×106 cells
per ml was frozen with programmable freezer UOP-6
(Special Design and Technical Bureau with Experi-
mental Unit of the IPC&C of the National Academy of
Sciences of Ukraine) in 1.8 ml plastic ampoules (Nunc,
Germany). Frozen FNCs were stored at –196°C at
low temperature bank of the IPC&C of the National
Academy of Sciences of Ukraine for 2 months. The
samples were thawed in water bath at 37°C for 50 s
at constant shaking [2] (up to disappearance of solid
phase). To remove DMSO from cell suspension an
equal volume of Hanks’ solution containing 20% FBS
was added slowly once, thereafter it was centrifuged
(1,000 rpm, 10 min). Integrity of FNCs prior to and
after cryopreservation was found by supravital staining
with trypan blue (TB) and solution of propidium iodide
(PI) (5 µg/ml in phosphate saline buffer) (Sigma, USA).
To estimate the expression of phenotype markers
of FNCs the flow cytometry was applied using primary
monoclonal antibodies (MABs) to intracellular antigens
nestin (clone RAT401, cat. Nr. 556309), GFAP (clone
2E1, cat. Nr. 556329), β-tubulin III (clone 5H1, cat.
Nr. 556321) and secondary MABs, labeled with Fluo-
rescein isothiocyanate (FITC): for nestin – IgG1,κ
(clone R3-34, cat. Nr. 553924) for GFAP – IgG2,b
(clone A95-1, cat. Nr. 553988), for β-tubulin III – Ig
Specific Polyclonal Antibody (Multiple Adsorption) (cat.
Nr. 554001). As isotypes there were used FITC-label-
led IgG1,κ (clone MOPC-31, cat. Nr. 550616), IgG2,b
(clone MPC-11, cat. Nr. 559532) IgMκ (clone G155-
228, cat. Nr. 551448), correspondingly (all reagents from
BD Pharmingen, USA). Prior to incubation with MABs
for intracellular antigens as described in the protocol
of manufacturer, the cells were preliminarily permeabi-
lized using the reagents Cytofix/Cytoperm (Fixation/
Permeabilization Solution) (cat. Nr. 554722) and Perm/
Wash Buffer (cat. Nr. 554723) (BD Pharmingen).
To reveal surface antigen CD133 there were used
primary MAB (clone 133A2, cat. Nr. ab8980) and se-
condary Goat Polyclonal Secondary Antibodies to
Mouse IgG (cat. Nr. ab96879), isotype IgG3,κ (clone
ICIGG3, cat. Nr. ab91541) labelled with phycoerythrin
(PE) (Abcam, USA). For investigation of the expres-
sion of antigens the cells were incubated with MAB
for 30 min at 25°C in darkness; MABs were washed
out in 100 µl of colourless Hanks’ solution, centrifuged,
afterwards the sediment was diluted by 500 µl of
Hanks’ solution. The cells were analyzed (10,000 cells
per sample) with flow cytometer (FACS Calibur, BD,
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
42
Cytoperm (Fixation/Permeabili-zation Solution) (кат.
№ 554722) и Perm/Wash Buffer (кат. №554723) («BD
Pharmingen»).
Для определения поверхностного антигена
CD133 использовали первичные МАТ (клон 133A2,
кат. №ab8980) и вторичные – Goat Polyclonal Secon-
dary Antibody to Mouse IgG (кат. №ab96879),
изотип – IgG3,κ (клон ICIGG3, кат. №ab91541), ме-
ченных phycoerythrin (PE; «Abcam», США). Для
определения экспрессии антигенов клетки инкуби-
ровали с МАТ в течение 30 мин при 25°С в темноте;
МАТ отмывали в 100 мкл бесцветного раствора
Хенкса, центрифугировали, после чего к осадку до-
бавляли 500 мкл раствора Хенкса. Клетки анализи-
ровали (по 10000 клеток на образец) на проточном
цитофлуориметре («FACS Calibur», «BD», США).
Были проанализированы количество меченных
клеток и средняя интенсивность флуоресценции
(СИФ) исследуемых маркеров, отражающая плот-
ность присутствия антигенов, выраженная в услов-
ных единицах (у. е.).
Обработку результатов цитофлуориметричес-
кого анализа проводили с помощью программы
«WinMDI 2.9», а при статистической обработке
полученных в работе результатов использовали
программу «Stat 6».
Результаты и обсуждение
Проведенные исследования показали, что ФНК
чувствительны к процедуре выделения и получе-
ния клеточной суспензии. Так, сохранность натив-
ных ФНК (нФНК), оцененная по окрашиванию ТC
и PI составила 59,7 ± 5,1 и 63,0 ± 5,8% соответст-
венно. После экспозиции ФНК с криопротектором
изучаемые показатели достоверно не изменялись
и были приняты за 100% (контроль).
Замораживание с использованием Р1 привело
к уменьшению количества кФНК (таблица). При
этом сохранность по ТС составила от 72,8 ± 6,1, а
по PI – 78,8 ± 4,9% от контрольных значений. Замо-
раживание согласно Р2 достоверно снижало как
количество клеток, так и их сохранность. После
использования Р3 количество и сохранность ФНК
были самыми высокими (таблица).
Можно предположить, что низкие показатели
сохранности и количества клеток после исполь-
зования Р2 связаны с повреждающим действием
на клетки физико-химических факторов, зависи-
мых как от скорости замораживания, так и от вели-
чины переохлаждения образцов, поскольку Р1 и Р3
предусматривали снятие переохлаждения в образ-
цах перед началом кристаллизации.
Особенностями структурной организации раз-
личных типов клеток объясняется выбор протоко-
ла криоконсервирования с использованием опреде-
ленной скорости замораживания.
USA). The number of labelled cells and mean fluores-
cence intensity (MFI) of the studied markers reflecting
the density of present antigens, expressed in arbitrary
units (arb. units) were analyzed.
The results of cytofluorimetric analysis were pro-
cessed using WinMDI 2.9 and statistical processing
was performed with Stat 6 software.
Results and discussion
The performed studies have shown that FNCs were
sensitive to procedures of isolation and procurement
of cell suspension. The integrity of native (fresh/intact)
FNCs (nFNCs) assessed by TB and PI staining made
59.7 ± 5.1 and 63.0 ± 5.8%, correspondingly. After
exposure of FNCs with cryoprotectant the studied indi-
ces did not statistically and significantly change and
were assumed as 100% (the control).
Freezing using the R1 led to the lessening of the
post thaw number of cFNCs (Table). Herewith the
post thaw integrity by TB made 72.8 ± 6.1 and by PI it
was 78.8 ± 4.9% from the control values. Freezing
according to R2 statistically and significantly decreased
both the post thaw number of cells and their integrity.
After application of R3 the number of FNCs and
integrity were the highest (Table).
One can suppose that low indices of preservation
rate and number of cells after using R2 are related to
damaging effect on cells of physical and chemical fac-
tors depending both on cooling rate and on the level of
overcooling of the samples, because R1 and R3
Примечание: *– различия показателей достоверны по сравне-
нию с нФНК после экспозиции с криопротектором, р < 0,05
Notes: * – differences of indices are statistically significant if com-
pared with nFNCs after exposure with cryoprotectant, p < 0.05.
Влияние криоконсервирования с различными
режимами замораживания на показатели количества
и сохранности ФНК
Effect of cryopreservation with different regimens
of freezing on indices of number and preservation
rate of FNCs
мижеР
nemigeR
овтсечилоK
то%,котелк
ялортнок
,sllecforebmuN
ehtmorf%
lortnoc
ялортнокто%,ьтсоннархоС
lortnocehtmorf%,ytirgetnI
аксаркО
мывонапирт
минис
eulbnapyrT
gniniats
аксаркО
йидипорп
модидой
muidiporP
gniniatsedidoi
КНФеынвитаН
sCNFevitaN 001 001 001
1Р
1R *9,6±4,48 *1,6±8,27 *9,4±8,87
2Р
2R *1,3±2,84 *9,2±2,82 *1,3±2,23
3Р
3R 3,7±1,98 *9,1±7,87 *7,3±3,28
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
43
Режим Р1 предусматривает предотвращение
переохлаждения образца перед началом кристал-
лизации [3]. Данный факт особенно важен с учетом
того, что критическим этапом при криоконсерви-
ровании биоматериала является область фазовых
переходов, когда вероятность возникновения глубо-
ких криоповреждений консервированного материа-
ла наибольшая [6]. Предполагается, что при мед-
ленном охлаждении, используемом в Р2, свободная
вода успевает выйти из клетки и повреждающее
действие внутриклеточных кристаллов должно
было быть минимизировано [11]. Однако после ис-
пользования этого режима наблюдали минималь-
ную по сравнению с Р1 и Р3 жизнеспособность де-
консервированных ФНК, что может быть объяс-
нено повреждением мембран клеток вследствие
механического напряжения, вызванного избыточ-
ной дегидратацией и последующим уменьшением
объема клетки до критического уровня [6]. Режим
Р3 предусматривает остановку охлаждения при
–9°С для температурной адаптации клеток, мед-
ленное охлаждение до –25°С с последующим уве-
личением скорости охлаждения для преимущест-
венной сохранности функционально активных
недифференцированных предшественников [20, 21].
Криоконсервирование может влиять на клеточ-
ный метаболизм различных субпопуляций ФНК,
вызывая изменения их интегрального функцио-
нального статуса [4]. Поэтому от используемого
режима замораживания может зависеть эффектив-
ность терапевтического применения биоматериа-
ла, в частности ФНК. Ранее были получены дан-
ные, касающиеся селективного влияния определен-
ных режимов замораживания на субпопуляционный
состав ФНК [2, 3, 7].
Каждый тип клеток имеет особый спектр цито-
скелетных белков, присутствующих в определен-
ном соотношении на различных стадиях развития
и расположенных специфически [22]. Изменение
структуры элементов цитоскелета приводит к зна-
чительным функциональным нарушениям в клет-
ках [23]. Предполагают, что после криоконсервиро-
вания могут меняться особенности цитоскелетной
организации клеток [17]. Поэтому изучение фено-
типических характеристик ФНК представляет осо-
бый интерес для понимания механизмов влияния
замораживания-оттаивания на субпопуляционный
состав фетального мозга.
Субпопуляционный состав ФНК наиболее полно
можно оценить цитофлуориметрически с использо-
ванием панели МАТ, специфичных к структурам
прогениторных нейроклеток, глиальных и нейро-
нальных предшественников. Наиболее ранние ней-
ральные стволовые клетки (НСК), которые яв-
ляются эндотелиальными прогениторами и способ-
ны в дальнейшем дифференцироваться в нейро-
involved the avoidance of overcooling in the samples
prior to crystallization onset.
The features of structural organization of different
cell types underlie the choice of the cryopreservation
protocol using certain freezing rate.
Regimen R1 involves the preventing of sample
overcooling prior to crystallization onset [3]. This fact
is especially important taking into account that the cri-
tical stage during biomaterial cryopreservation is the
zone of phase transitions, when the probability of ap-
pearance of severe cryoinjuries of preserved material
is the highest [6]. It is supposed that slow cooling used
in R2 allows free water to be released from a cell and
damaging effect of intracellular crystals should be mini-
mized [11]. However, after application of this regimen
the minimum viability of frozen-thawed FNCs was ob-
served if compared with R1 and R3, which may be
explained by the damage of cell membranes due to
mechanical tension, caused by surplus dehydration and
following reduction of cell volume down to critical level
[6]. R3 provides a pause in cooling at –9°C for tempe-
rature adaptation of cells, slow cooling down to –25°C
with following rise of cooling rate for predominant pre-
servation of functionally active non-differentiated pre-
cursors [20, 21].
Cryopreservation may affect cell metabolism of
different FNCs subpopulations, causing the changes
in their integral functional status [4]. Therefore, the
efficiency of therapeutic application of biomaterial, in
particular FNCs, may depend on the used freezing
regimen. Previously there have been obtained the data
concerning selective effect of certain freezing regimens
on subpopulation composition of FNCs [2, 3, 7].
Each type of cells has a special spectrum of cyto-
skeletal proteins of certain proportion , at various deve-
lopmental stages, and located specifically [22]. Change
in structure of cytoskeletal elements results in signi-
ficant functional impairments of cells [23]. It is suppo-
sed that after cryopreservation the peculiarities of cell
cytoskeletal organization may alter [17]. Therefore the
study of phenotype characteristics is of special interest
to understand the mechanisms of freeze-thawing effect
on subpopulation composition of fetal brain.
Subpopulation composition of FNCs can be more
adequately estimated by cytofluorimetry using MABs,
specific to the structures of progenitor neurocells, glial
and neuronal precursors. The earliest neural stem cells
(NSCs) being endothelial progenitors and capable of
further differentiation into neuronal cells, astrocytes
and oligodendrocytes, are identified by the presence
on their membrane of CD133 marker (prominin) [12].
Neural differentiation is accompanied with the rise
in expression of specific genes and correspondingly ap-
pearance in cells of such cytoskeletal proteins as nestin,
β-tubulin III, GFAP (glial fibrillary acidic protein), the
protein interacting with MAP2 microtubules (microtu-
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
44
нальные клетки, астроциты и олигодендроциты,
идентифицируются по наличию на их мембране
маркера CD133 (проминина) [12].
Нейральная дифференцировка сопровождается
повышением экспрессии специфичных генов и
соответственно появлением в клетке таких белков
цитоскелета, как nestin, β-tubulin III, GFAP (глиаль-
ный кислый фибриллярный белок), белок, взаимо-
действующий с микротрубочками МАР2 (microtu-
bule-associated protein 2), и некоторых других мар-
керов [22]. Одними из важнейших компонентов
цитоскелета являются промежуточные филамен-
ты. Они создают внутриклеточный каркас, обес-
печивают упругость клетки, поддерживают упоря-
доченность расположения компонентов цитоплаз-
мы, координируют связи между внеклеточным
матриксом, цитоплазмой и ядром. Промежуточные
филаменты цитоскелета являются специфичес-
кими маркерами уровня тканевой и клеточной диф-
ференцировки [10]. Один из стадиоспецифических
белков цитоскелета нейроэпителиальных стволо-
вых клеток nestin рассматривается как маркер
мультипотентных прогениторов, постмитотических
нейронов, ранних нейробластов [7]. Показано, что по
мере дифференцировки нервной ткани синтез nestin
подавляется [19], в дифференцирующихся астроци-
тах и нейронах начинают экспрессироваться GFAP
и β-tubulin III соответственно [22]. GFAP – специ-
фический маркер астроцитов, участвует в форми-
ровании глиальных филаментов и в молекулярных
механизмах нейрон-астроцитарных взаимодейст-
вий [7]. β-tubulin III является самым ранним из из-
вестных маркеров нейрональной дифференцировки
[12].
Важный компонент анализа состояния ФНК
методом проточной цитофлуориметрии – оценка
интенсивности флуоресценции того или иного мар-
кера с использованием показателя СИФ, который
отражает количество экспрессируемых антиген-
ных молекул и является объективным показателем
структурно-функционального состояния клеток [5].
Учитывая функциональную роль каждого оценивае-
мого маркера, изменение плотности рецепторных
структур на клетке переводит ее в иное функцио-
нальное состояние. Использование данного мето-
дического подхода показало, что криоконсервиро-
вание оказывало существенное влияние как на
субпопуляционный состав ФНК, так и функциональ-
ную активность клеток (судя по СИФ) в субпопу-
ляциях с определенными фенотипами.
Криоконсервирование с использованием Р1
(рисунок) позволило сохранить практически все
клеточные популяции фетального мозга на уровне
нативного контроля с некоторой тенденцией к обо-
гащению CD133+- и nestin+-клетками, относящи-
мися к стволовым, что соответствует данным, по-
лученным ранее [13].
bule-associated protein 2) and some other markers [22].
One of the most important cytoskeletal components
are intermediate filaments. They form intracellular ske-
leton, provide cell elasticity, maintain the ordered dispo-
sition of cytoplasm components, coordinate the rela-
tions between extracellular matrix, cytoplasm and nuc-
leus. Intermediate filaments of cytoskeleton are specific
markers of tissue and cell differentiation level [10].
One of stage-specific cytoskeletal proteins of neuroepi-
thelial stem cells, nestin, is considered as the marker
of multipotent progenitors, post-mitotic neurons, early
neuroblasts [7]. It has been shown that along with the
differentiation of nerve tissue the nestin synthesis is
suppressed [19], in differentiating astrocytes and neu-
rons correspondingly GFAP and β-tubulin III are ex-
pressed, [22]. GFAP is a specific marker of astrocytes,
participates in the formation of glial filaments and in
molecular mechanisms of neuron-astrocyte interactions
[7]. Beta-tubulin III is the earliest among the known
markers of neuronal differentiation [12].
An important component of analysis of FNC state
by means of flow cytometry is the estimation of fluo-
rescence intensity of any given marker using MFI,
reflecting the amount of expressed antigen molecules
and is an intrinsic index of structural and functional
state of cells [5]. Taking into account a functional role
of each marker to be studied, the change in density of
receptor structures on a cell transfers it into other func-
tional state. The use of this methodical approach has
shown that cryopreservation affected strongly both the
subpopulation composition of FNCs and functional
activity of cells (judging on MFI) in the subpopulations
with certain phenotypes.
Cryopreservation using R1 (Figure) enabled to pre-
serve virtually all cell populations of fetal brain at the
level of native control with a tendency to enrichment
by CD133+ and nestin+ cells, referred to stem cells,
that corresponded to the data obtained previously [13].
Regimen R2 manifested a certain ‘aggression’ in
respect of neuroblasts and neuron precursors judging
on a significant reduction of the number of β-tubulin
III+ cells (Figure). However the relative amount of
glial elements considering GFAP+ cells vice versa
increased significantly. In this case we likely observed
the redistribution of FNC populations due to higher
cryoresistance of glial elements.
Regimen 3 resulted in predominant preservation of
subpopulations referred to the elements with multi-
potent differentiation potential. The number of CD133+
cells increased thrice with simultaneous rise in
2.4 times of the content of nestin+ cells if compared
with nFNCs. The cells of stem compartment had higher
expression rate of CD133 and nestin markers (rise in
MFI in 2.5 and 1.4 times, correspondingly if compared
with nFNCs).
These changes were stipulated with the peculiarities
of membrane lipid composition of progenitor cells, ma-
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
45
CD133+ nestin+ β-tubulin III+ GFAP+
Нативные ФНК Native FNCs
Режим 1 Regimen 1
Режим 2 Regimen 2
Режим 3 Regimen 3
����������������
����������������
���������������������
���������������������
����������������������������������������
����������������������������������������
�����������������������������������
�����������������������������������7,44
9,13
17,55
15,50
1,66
0,57
0,77
1,18
10,21
5,37
17,81 7,01 8,18
2,9
19,81
1,73
P3/R3
P2/R2
P1/R1
нФНК/nFNC
% клеток
СD133+
Nestin+
����
B-tubulin III+
GFAP+
CD133+
nestin+
β-tubulin III+
GFAP+
Иммунофенотип нативных и криокон-
сервированных с использованием разных
режимов замораживания ФНК 11 суток
гестации. На гистограммах указано со-
держание клеток в общей популяции в
процентах (жирным шрифтом) и соответ-
ствующая СИФ в условных единицах
(курсивом).
Immune phenotype of native and cryopre-
served according to different regimens
FNCs of 11 gestation days. Histograms show
content of cell population in total sus-
pension, percents, (bold) and MFI in
arbitrary units (italic).
0,57%
127,1
7,44%
629,6
15,5%
105,6
1,73%
311,2
0,77%
93,3
10,21%
394,7
17,55%
92,7
2,9%
229,4
1,18%
42,3
5,37%
309,8
9,13%
81,1
19,81%
118,6
1,66%
302,4
17,87%
728
7,01%
98,5
8,18%
212,6
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
46
Режим Р2 проявлял определенную «агрессив-
ность» по отношению к нейробластам и предшест-
венникам нейронов, судя по значительному сни-
жению количества β-tubulin III+ – клеток (рисунок).
При этом относительное количество глиальных эле-
ментов, с учетом количества GFAP+-клеток, на-
против, существенным образом возрастало. Оче-
видно, в данном случае мы имеем дело с перерас-
пределением клеточных популяций ФНК за счет
большей криоустойчивости глиальных элементов.
Режим Р3 обеспечивал преимущественную со-
хранность субпопуляций, относящихся к элемен-
там с мультипотентным дифференцировочным по-
тенциалом. Так, количество CD133+-клеток увели-
чивалось в 3 раза с одновременным повышением
в 2,4 раза содержания nestin+-клеток по сравнению
с нФНК. Клетки стволового компартмента имели
более высокую степень экспрессии маркеров
CD133 и nestin (увеличение СИФ в 2,5 и 1,4 раза
соответственно по сравнению с нФНК).
Такого рода изменения обусловлены особеннос-
тями компонентного состава липидов мембран
прогениторных клеток, которые проявляют при ис-
пользовании определенных режимов криоконсерви-
рования большую криоустойчивость по сравнению
с другими клетками. Использование Р3 приводило
к гибели значительного числа клеток, дифференци-
рованных в нейрональном направлении, судя по
снижению содержания клеток, экспрессирующих
маркер β-tubulin III.
Существенно, что после использования всех ре-
жимов криоконсервирования ФНК, СИФ практи-
чески всех исследуемых маркеров была более
низкая, чем в нативе (за исключением CD133 и
nestin при Р3).
Данный факт, по-видимому, можно объяснить
модификацией цитоскелета, а также различных
белков и липидного матрикса клеточной мембраны
под действием факторов криоконсервирования,
а именно, изменением состояния белок-фосфоли-
пидного матрикса. Основой таких изменений мо-
жет быть, например, осмотический и термальный
шок, которым подвергаются клетки в процессе
криоконсервирования и которые сопровождаются
шеддингом, агрегацией или интернализацией мем-
бранных структур клеток [16]. В итоге это приво-
дит к нарушению интегральной функциональной
активности ФНК [2, 3].
Ведется интенсивная работа по совершенство-
ванию методологических и методических подхо-
дов к терапии нейродегенеративных заболеваний
аутоиммунного генеза, в том числе с применением
кФНК. В связи с этим полученные данные могут
быть учтены при оптимизации такого рода терапии.
Особую значимость имеет установленный эффект
возможности использования определенных режи-
nifesting higher cryoresistance if compared with other
cells in certain cryopreservation regimens. Use of regi-
men R3 led to the death of a large amount of cells
differentiated into neuronal lineage judging on the
reduced content of cells, expressing β-tubulin III.
It is important that after use of all the regimens for
FNCs cryopreservation the MFI of virtually all the
studied markers was lower than in native cells (exclu-
ding CD133 an nestin at R3).
This fact can be apparently explained by modifica-
tion of cytoskeleton, as well as of various proteins and
lipid matrix of cell membrane under the effect of
cryopreservation factors, namely the protein-phospho-
lipid matrix modification. The basis of these changes
can be for example osmotic and thermal shocks, to
those the cells are subjected during freeze-thawing and
which are accompanied with shedding, aggregation or
internalization of cell membrane structures [16]. Finally
this leads to the impairment of integral functional
activity of FNCs [2, 3].
Intensive investigations on improving the methods
and approaches to therapy of neurodegenerative disea-
ses of autoimmune nature including those with applica-
tion of cFNCs are in progress. In this connection the
findings may be taken into account when optimizing
this type of therapy. Of value is the established effect
about possible use of certain cryopreservation regimens
as the way to enrich FNCs pool with stem cells.
The data obtained as a result of this research
corroborate the hypotheses about the mechanisms of
action of freeze-thawing on FNCs.
Conclusions
1. There was revealed different sensitivity of fetal
brain subpopulations to the effect of physical and
chemical factors of cryopreservation, implemented
when using the freeze-thawing regimens with different
parameters.
2. Independently on cryopreservation regimen the
most resistant are glial and multipotent stem precursors,
that is explained by composition of their membranes.
3. When using R3 there has been established the
fact of the highest enrichment of FNC population with
stem cells due to the death of more differentiated neu-
ron precursors. This confirms the selective effect of
cryopreservation on heterogenous composition of cell
suspensions.
References
1. Bozhkova V.P., Brezhestovsky P.D., Buravlev V.P. et al. Manual
on culturing of nerve tissue. Methods. Technique. Problems. –
Moscow: Nauka, 1988. – 318p.
2. Goltsev A.M., Babenko N.M., Ostankova L.V. et al. Study of
functional activity of cryopreserved embryonic neuronal cells
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
47
мов криоконсервирования как способа обогащения
пула ФНК стволовыми клетками.
Данные, полученные в работе, дополняют пред-
ставления о механизмах действия процесса замо-
раживания-оттаивания на ФНК.
Выводы
1. Выявлена различная чувствительность суб-
популяций фетального мозга к действию физико-
химических факторов криоконсервирования, реали-
зуемых при использовании режимов заморажи-
вания-оттаивания с различными параметрами.
2. Независимо от режима криоконсервирования
наиболее устойчивыми являются глиальные и
мультипотентные стволовые предшественники,
что объясняется компонентным составом их мем-
бран .
3. При использовании Р3 установлен факт наи-
большего обогащения популяции ФНК стволовыми
клетками за счет гибели более дифференцирован-
ных предшественников нейронов. Это подтвер-
ждает селективное влияние криоконсервирования
на гетерогенный состав клеточных суспензий.
Литература
1. Божкова В.П., Брежестовский П.Д., Буравлев В.П. и др.
Руководство по культивированию нервной ткани. Методы.
Техника. Проблемы. – М.: Наука, 1988. – 318 с.
2. Гольцев А.М., Бабенко Н.М., Останкова Л.В. та ін.
Вивчення функціональної активності кріоконсервованих
ембріональних нервових клітин щурів в системі in vitro та
in vivo // Трансплантологія. – 2004. – Т. 6, № 2. – С. 46 – 56.
3. Гольцев А.Н., Гурина Т.М., Бабенко Н.Н., Останков М.В.
Влияние различных режимов криоконсервирования на не-
которые характеристики эмбриональных нервных кле-
ток // Проблемы криобиологии. – 2003. – № 1. – С. 46–50.
4. Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г, Гаевская Ю.А. и др. Криобио-
логические технологии как компонент оптимизированных
методов лечения аутоиммунных заболеваний // Клінічна
імунологія. Алергологія. Інфектологія. – 2009. – №1, 2. –
С. 46–51.
5. Гольцев А.Н., Сафранчук О.В., Бондарович Н.А. и др. Влия-
ние факторов криоконсервирования на уровень экспрес-
сии маркеров стволовых раковых клеток в аденокарци-
номе Эрлиха // Биол. вестник. – 2009. – Т. 13, №1–2. –
С. 13–16.
6. Криоконсервирование клеточных суспензий / Под ред. А.А.
Цуцаевой. – Киев: Наук. думка, 1983. – 240 с.
7. Останков М.В., Лебединец Д. В., Порожан Е.А., Гольцев А.Н.
Влияние факторов криоконсервирования на цитоморфо-
логические и структурные характеристики фетальных
нервных клеток // Проблемы криобиологии. – 2009. – Т. 19,
№4. – С. 431– 438.
8. Патент № 4523, Україна, МПК А01N1/02. Спосіб кріокон-
сервування суспензії клітин ембріональної нервової ткани-
ни / В.І. Грищенко, А.М. Гольцев, Т.М. Гуріна, Н.М. Бабенко;
заявник: ІПКіК НАН України; заявл. 24.05.2004; опубл.
17.01.2005. Бюл. №1.
9. Патент № 59206, Україна, МПК А01N1/02. Спосіб кріокон-
сервування суспензії фетальних нервових клітин /
А.М. Гольцев, Є.О. Порожан, Н.М. Бабенко; М.В. Останков;
of rats in vitro and in vivo // Transplantologiya. – 2004. – Vol. 6,
N2. – P. 46–56.
3. Goltsev A.N., Gurina T.M., Babenko N.N., Ostankov M.V.
Effect of different cryopreservation regimens on some charac-
teristics of embryonic neuronal cells// Problems of Cryobiolo-
gy. – 2003. – N1. – P. 46–50.
4. Goltsev A.N., Dubrava T.G., Gaevskaya Yu.A. et al. Cryo-
biological technologies as component of optimized methods of
treatment of autoimmune diseases// Klinicheskaya Imunologiya.
Alergologiya. Infektologiya. – 2009. – N1, 2. – P. 46–51.
5. Goltsev A.N., Safranchuk O.V., Bondarovich N.A. et al. Effect
of cryopreservation factors on expression level of markers of
stem cancer cells in Ehrlich carcinoma // Biol. Vestnyk. – 2009. –
Vol.13, N1, 2. – P. 13–16.
6. Cryopreservation of cell suspensions / Ed. by A.A. Tsutsaye-
va. – Kiev: Naukova Dumka, 1983. – 240p.
7. Ostankov M.V., Lebedinets D.V., Porozhan E.A., Goltsev A.N.
Effect of cryopreservation factors on cytomorphologic and
structural characteristics of fetal nerve cells // Problems of
Cryobiology. – 2009. – Vol. 19, N4. – P. 431–438.
8. Patent N4523, Ukraine, IPC A01N1/02. Method of cryopre-
servation of embryonic nerve tissue cell suspension / V.I. Gri-
schenko, A.M. Goltsev, T.M. Gurina, N.M. Babenko, applied by
IPC&C of the National Academy of Sciences of Ukraine. – appl.
24.05.2004; Publ. 17.01.2005, Bul. N1.
9. Patent N59206, Ukraine, IPC A01N1/02. Method of cryo-
preservation of fetal neural cell suspension / A.M. Goltsev,
E.O. Porozhan, N.M. Babenko, M.V. Ostankov, applied by IPC&C
of the National Academy of Sciences of Ukraine. – appl.
04.10.2010; Publ. 10.05.2011, Bul. N9.
10.Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical As-
pects / Ed. by G.J. Siegel, B.W. Agranoff, R.W. Albers et al. –
Philadelphia: Lippincott–Raven; 1999. – 1380 p.
11.Fang J., Zhang Z.X. Cryopreservation of embryonic cerebral
tissue of rat // Cryobiology. – 1992. – Vol. 29, N2. – P. 267 –
273.
12.Gage F.H. Mammalian neural stem cells // Science. – 2000. –
Vol. 287, N5457. – P. 1433 – 1438.
13.Goltsev A.N., Babenko N.N., Dubrava T.G., Gurina T.M.
Cryopreservation as selective method of enrichment with stem
elements of embryonic neuronal cell population // Abstract Book
of the Word Congress of Cryobiology and Cryomedicine. –
Hamburg, Germany, 2006. – P.137.
14.Goltsev A.N., Grischenko V.I., Sirous M.A. et al. Cryopre-
servation: an optimizing factor for therapeutic potential of
fetoplacental complex products // Biopreservation and
Biobanking. – 2009. – Vol. 7, N1. – P. 29–38.
15.Hess D.C., Borlongan C.V. Stem cells and neurological
diseases // Cell Prolif. – 2008. – Vol. 41, N 1. – P. 94–114.
16.Higgins A.Z., Cullen D.K., LaPlaca M.C., Karlsson J.O.
Effects of freezing profile parameters on the survival of
cryopreserved rat embryonic neural cells // J. Neurosci.
Methods. – 2011. – Vol. 30, N1. – P. 9–16.
17.Ladewig J., Koch P., Endl E. et al. Lineage selection of
functional and cryopreservable human embryonic stem cell–
derived neurons // Stem Cells. – 2008. – Vol. 26. – P. 1705–1712.
18.Liras A. Future research and therapeutic applications of human
stem cells: general, regulatory, and bioethical aspects //
J. Transl. Med. – 2010. – Vol. 10, N8. – Р. 131–146.
19.Messam C.A., Hou J., Major E.O. Coexpression of nestin in
neural and glial cells in the developing human CNS defined by
a human-specific anti-nestin antibody // Exp. Neurol. – 2000. –
Vol. 161. – P. 585–596.
20.Milosevic J., Storch A., Schwarz J. Cryopreservation does
not affect proliferation and multipotency of murine neural pre-
cursor cells // Stem Cells. – 2005. – Vol. 23, N5. – P. 681–688.
21.Norton W.T., Poduslo S.E. Neuronal perikarya and astroglia
of rat brain: chemical composition during myelination // Journal
of Lipid Research. – 1971. – Vol. 12. – P. 84–90.
22.Petros T.J., Tyson J.A., Anderson S.A. Pluripotent stem cells
for the study of CNS development // Front. Mol. Neurosci. –
2011. – Vol. 4. – P. 30–39.
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
48
заявник : ІПКіК НАН України ; заявл . 4.10.2010;
опубл.10.05.2011. Бюл.№9.
10.Basic Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical As-
pects / Ed. by G.J. Siegel, B.W. Agranoff, R.W. Albers et al. –
Philadelphia: Lippincott-Raven; 1999. – 1380 p.
11.Fang J., Zhang Z.X. Cryopreservation of embryonic cerebral
tissue of rat // Cryobiology. – 1992. – Vol. 29, №2. – P. 267 –
273.
12.Gage F.H. Mammalian neural stem cells // Science. – 2000. –
Vol. 287, №5457. – P. 1433 – 1438.
13.Goltsev A.N., Babenko N.N., Dubrava T.G., Gurina T.M.
Cryopreservation as selective method of enrichment with stem
elements of embryonic neuronal cell population // Cryobiology. –
2006. – Vol. 53, N3. – P. 409.
14.Goltsev A.N., Grischenko V.I., Sirous M.A. et al. Cryopre-
servation: an optimizing factor for therapeutic potential of
fetoplacental complex products // Biopreservation and
Biobanking. – 2009. – Vol. 7, №1. – P. 29–38.
15.Hess D.C., Borlongan C.V. Stem cells and neurological
diseases // Cell Prolif. – 2008. – Vol. 41, № 1. – P. 94–114.
16.Higgins A.Z., Cullen D.K., LaPlaca M.C., Karlsson J.O.
Effects of freezing profile parameters on the survival of
cryopreserved rat embryonic neural cells // J. Neurosci
Methods. – 2011. – Vol. 30, №1. – P. 9–16.
17.Ladewig J., Koch P., Endl E. et al. Lineage selection of functio-
nal and cryopreservable human embryonic stem cell–derived
neurons // Stem Cells. – 2008. – Vol. 26, N7. – P. 1705–1712.
18.Liras A. Future research and therapeutic applications of human
stem cells: general, regulatory, and bioethical aspects //
J. Transl. Med. – 2010. – Vol. 10, №8. – Р. 131–146.
19.Messam C.A., Hou J., Major E.O. Coexpression of nestin in
neural and glial cells in the developing human CNS defined by
a human-specific anti-nestin antibody // Exp. Neurol. – 2000. –
Vol. 161. – P. 585–596.
20.Milosevic J., Storch A., Schwarz J. Cryopreservation does
not affect proliferation and multipotency of murine neural pre-
cursor cells // Stem Cells. – 2005. – Vol. 23, №5. – P. 681–688.
21.Norton W.T., Poduslo S.E. Neuronal perikarya and astroglia
of rat brain: chemical composition during myelination // J. Lipid
Res. – 1971. – Vol. 12, N1. – P. 84–90.
22.Petros T.J., Tyson J.A., Anderson S.A. Pluripotent stem cells
for the study of CNS development // Front. Mol. Neurosci. –
2011. – Vol. 4. – P.30–39.
23.Robilotto A.T., Baust J.M, Van Buskirk R., Baust J.G.
Involvement of the cysteine protease calpain family in cell death
after cryopreservation // Cell Preservation Technology. – 2006. –
Vol. 4, №1. – P. 17–30.
24.Tan F. C., Lee K. , Gouk S. S. et al. Optimization of cryo-
preservation of stem cells cultured as neurospheres: compa-
rison between vitrification, slow-cooling and rapid cooling free-
zing protocols // Cryo Letters. – 2007. – Vol. 28, №6. – P. 445–
460.
25.Wagh V., Meganathan K., Jagtap S. et al. Effects of сryopre-
servation on the transcriptome of human embryonic stem cells
after thawing and culturing // Stem Cell Reviews and Reports. –
2011. – Vol. 7, №3. – P. 506 – 517.
Поступила 28.02.2012
23.Robilotto A.T., Baust J.M, Van Buskirk R., Baust J.G. Invol-
vement of the cysteine protease calpain family in cell death
after cryopreservation // Cell Preservation Technology. – 2006. –
Vol. 4, N1. – P. 17–30.
24.Tan F. C., Lee K. , Gouk S. S. et al. Optimization of cryo-
preservation of stem cells cultured as neurospheres: compa-
rison between vitrification, slow-cooling and rapid cooling free-
zing protocols // Cryo Letters. – 2007. – Vol. 28, N6. – P. 445–
460.
25.Wagh V., Meganathan K., Jagtap S. et al. Effects of сryopre-
servation on the transcriptome of human embryonic stem cells
after thawing and culturing // Stem Cell Reviews and Reports. –
2011. – Vol. 7, N3. – P. 506 – 517.
Accepted 28.02.2012
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
|