Применение клеток фетальной печени как один из возможных путей модификации иммунореактивности криоконсервированного алломиелотрансплантата

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:2008
Hauptverfasser: Мацевитая, И.Ю., Останков, М.В.
Format: Artikel
Sprache:Russian
Veröffentlicht: Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2008
Schriftenreihe:Проблемы криобиологии и криомедицины
Schlagworte:
Online Zugang:http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68864
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Применение клеток фетальной печени как один из возможных путей модификации иммунореактивности криоконсервированного алломиелотрансплантата / И.Ю. Мацевитая, М.В. Останков // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 1. — С. 68-72. — Бібліогр.: 6 назв. — рос., англ.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id irk-123456789-68864
record_format dspace
spelling irk-123456789-688642014-10-01T03:01:52Z Применение клеток фетальной печени как один из возможных путей модификации иммунореактивности криоконсервированного алломиелотрансплантата Мацевитая, И.Ю. Останков, М.В. Краткие сообщения 2008 Article Применение клеток фетальной печени как один из возможных путей модификации иммунореактивности криоконсервированного алломиелотрансплантата / И.Ю. Мацевитая, М.В. Останков // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 1. — С. 68-72. — Бібліогр.: 6 назв. — рос., англ. 0233-7673 http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68864 611.36.013:615.361.018.46.014.41 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
topic Краткие сообщения
Краткие сообщения
spellingShingle Краткие сообщения
Краткие сообщения
Мацевитая, И.Ю.
Останков, М.В.
Применение клеток фетальной печени как один из возможных путей модификации иммунореактивности криоконсервированного алломиелотрансплантата
Проблемы криобиологии и криомедицины
format Article
author Мацевитая, И.Ю.
Останков, М.В.
author_facet Мацевитая, И.Ю.
Останков, М.В.
author_sort Мацевитая, И.Ю.
title Применение клеток фетальной печени как один из возможных путей модификации иммунореактивности криоконсервированного алломиелотрансплантата
title_short Применение клеток фетальной печени как один из возможных путей модификации иммунореактивности криоконсервированного алломиелотрансплантата
title_full Применение клеток фетальной печени как один из возможных путей модификации иммунореактивности криоконсервированного алломиелотрансплантата
title_fullStr Применение клеток фетальной печени как один из возможных путей модификации иммунореактивности криоконсервированного алломиелотрансплантата
title_full_unstemmed Применение клеток фетальной печени как один из возможных путей модификации иммунореактивности криоконсервированного алломиелотрансплантата
title_sort применение клеток фетальной печени как один из возможных путей модификации иммунореактивности криоконсервированного алломиелотрансплантата
publisher Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate 2008
topic_facet Краткие сообщения
url http://dspace.nbuv.gov.ua/handle/123456789/68864
citation_txt Применение клеток фетальной печени как один из возможных путей модификации иммунореактивности криоконсервированного алломиелотрансплантата / И.Ю. Мацевитая, М.В. Останков // Проблемы криобиологии. — 2008. — Т. 18, № 1. — С. 68-72. — Бібліогр.: 6 назв. — рос., англ.
series Проблемы криобиологии и криомедицины
work_keys_str_mv AT macevitaâiû primeneniekletokfetalʹnojpečenikakodinizvozmožnyhputejmodifikaciiimmunoreaktivnostikriokonservirovannogoallomielotransplantata
AT ostankovmv primeneniekletokfetalʹnojpečenikakodinizvozmožnyhputejmodifikaciiimmunoreaktivnostikriokonservirovannogoallomielotransplantata
first_indexed 2025-07-05T18:37:22Z
last_indexed 2025-07-05T18:37:22Z
_version_ 1836833196846612480
fulltext 68 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 18, 2008, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 18, 2008, №1 УДК 611.36.013:615.361.018.46.014.41 И.Ю. МАЦЕВИТАЯ, М.В. ОСТАНКОВ* Применение клеток фетальной печени как один из возможных путей модификации иммунореактивности криоконсервированного алломиелотрансплантата UDC 611.36.013:615.361.018.46.014.41 I.YU. MATSEVITAYA, M.V. OSTANKOV* Application of Fetal Liver Cells as One of Possible Ways for Modification of Cryopreserved Allomyelotransplant Immune Reactivity * Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию: ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38 (057) 373-57-89, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта: cryo@online.kharkov.ua * To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 5789, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na- tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков There has been experimentally proved the pos- sibility to reduce the immune reactivity of allogenic bone marrow (BM) as “graft versus host” response (GVHR) by changing in it a balanced content of the accessory-regulatory cells of hemopoietic microenvi- ronment with cryopreservation under certain regimens [2, 3]. However along with a decrease in the immune reactivity the cryopreserved material reduced hemo- poietic potential as well. The possibility to change a myelotransplant’s immune competent composition and its functional potential not with elimination, but addi- tional introduction with it of cells with regulatory acti- vity, determined the need in searching for a cotrans- planted material with these characteristics. Nowadays there has been accumulated the infor- mation about a manifested immune modulating ability of products of fetoplacental complex (PFPC) [4]. Of a special interest is their tropism towards cells with a suppressive function. Fetal liver (FL), for example, within all gestation term produces α-fetoprotein: most important trigger factor of T-lymphocytes with a suppressive activity. Fetal liver possesses a high hemopoietic activity as well and, as a result, may be used as a co-transplant of allogenic cryopreserved bone marrow (cBM), being capable of simultaneous aug- mentation of hemopoietic function and minimisation of immune conflict development. This research was targeted to experimentally sub- stantiate the possibilities for fetal liver cells (FLCs) usage as a modulator of immune and hemopoietic activities of allogenic cBM and an increase in its pro- tective potential. Materials and methods Balb/c and CBA 4 months’ mice of 18-20 g’ weight were used in the research. BM and FL cells (13 gestation days) were derived with medium 199, supplemented by 3% fetal calf serum and 5% sodium Экспериментально подтверждена возможность снижения иммунореактивности аллогенного костного мозга (КМ) в виде болезни “трансплантат против хозяина” (БТПХ) изменением сбалансиро- ванного содержания в нем акцессорно-регулятор- ных клеток кроветворного микроокружения криоконсервированием при определенных режи- мах [2, 3]. Однако наряду со снижением иммуно- реактивности криоконсервированный миелотранс- плантат снижал и гемопоэтический потенциал. Возможность изменения компонентного состава миелотрансплантата и его функционального потенциала не элиминацией, а дополнительным введением с ним клеток, обладающих регулятор- ной активностью, определила необходимость поиска сотрансплантируемого материала с такими характеристиками. К настоящему времени накоплена информация о выраженной иммуномодулирующей способнос- ти продуктов эмбриофетоплацентарного комплек- са (ПЭФПК) [4]. Особый интерес представляет их тропность в отношении клеток с супрессорной функцией. Фетальная печень (ФП), например, на протяжении почти всего срока гестации продуци- рует α-фетопротеин – важнейший триггерный фактор Т-лимфоцитов с супрессорной активнос- тью. Фетальная печень обладает также высокой гемопоэтической активностью и, следовательно, может быть использована как сотрансплантат аллогенного криоконсервированного костного мозга (кКМ), способный одновременно повышать кроветворную функцию и минимизировать разви- тие иммунного конфликта. Цель данной работы – экспериментальное обоснование возможности использования клеток фетальной печени (КФП) как модулятора иммуно- и гемопоэтической активности аллогенного кКМ и повышения его защитного потенциала. 69 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 18, 2008, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 18, 2008, №1 citrate. BM programmed freezing was realised by means of UOP-6 device (Special Designing and Technical Bureau with Experimental Unit, Kharkov), using the following regimen: 1°C/min down to –25°C with further immersion into liquid nitrogen, then thawing at 41°C on water bath. Bone marrow was cryopreserved under 7.5% dimethyl sulfoxide protec- tion. Cryopreserved BM in 5×106/mouse dose (synge- neic system) was intravenously injected to the lethally irradiated CBA mice. Balb/c mouse, irradiated with the same dose received intravenously the cBM and FLCs co-transplantation of CBA mice of 13 gestation days (allogenic system) in dose of 5×105/mouse. The intensity of GVHR progress was evaluated by the spleen index, number of nucleated thymus cells and animal survival. Biochemical and immunological studies such as: C-reactive protein (CRP) content (CRP-Latex), sialic acids (resorcinol method), seromu- coids (turbometric method) were carried-out [6]. Experimental data were statistically processed using the Fisher-Student’s method by Microsoft Excel 2000. software Results and discussion There were performed the biochemical and immu- nological studies, which enabled to obtain the new qualitative characteristics of GVHR development and a comparative estimation of inflammatory process, proceeding during allogeneic cBM and cBM with FL introduction. The CRP, being a central component of acute inflammatory phase, started to increase even after the 7th day of allogeneic cBM introduction. There is a direct link between the changes in its severity level and the dynamics of clinical signs of inflammation. Higher is CRP concentration, the more severe is inflammatory process [6]. CRP content was increased up to the 50th day, meanwhile under combined introduction of allogenic cBM with FLCs a decrease in inflammatory process with slightly positive results and negative ones was observed even to the 30th and 70th days, correspondingly (Fig. 1). An increase in sial acid content within 50 days, observed under some other AID, accompanied with inflammatory processes, testifies to the immune conflict development as well [6]. Under BM and cFL combined introduction such an increase was observed only up to the 30th day and to the 70th one the index approached the control (Fig . 2). Determination of seromucoids (specific glyco- protein) is of the most diagnostic value to find-out the slow inflammatory processes, which growth testifies to their activation even if clinical symptoms have not been manifested yet [6]. In this experiment when only cBM was introduced an increase in seromucoids was noted up to and including the 50th day, but slight decrease was only to the 70th one. When introducing Материалы и методы В работе использованы 4-месячные мыши Balb/с и CBA массой 18-20 г. Клетки КМ и ФП (13 суток гестации) получали на среде 199 с добав- лением 3%-й эмбриональной телячьей сыворотки и 5%-го цитрата натрия. Программное заморажи- вание КМ проводили на установке УОП-6 (СКТБ с ОП ИПКиК НАН Украины, г. Харьков), используя режим: 1°C/мин до –25°С с последующим погру- жением в жидкий азот, отогревали при 41°C на водяной бане. Костный мозг криоконсервировали под защитой криопротектора диметилсульфоксида (ДМСО) в концентрации 7,5%. Мышам линии СВА, облученным летальной до- зой, внутривенно вводили кКМ в дозе 5×106/мышь (сингенная система). Облученным в той же дозе мышам линии Ваlb/с внутривенно сотранспланти- ровали кКМ и КФП мышей линии СВА 13 дней гестации (аллогенная система) в дозе 5×106/мышь. Интенсивность развития БТПХ оценивали по индексу селезенки, количеству ядросодержащих клеток тимуса и выживаемости животных. Прово- дились биохимические и иммунологические ис- следования: содержания С-реактивного белка (CRP-Latex), сиаловых кислот (резорциновый метод), серомукоидов (турбометрический метод) [6]. Экспериментальные данные статистически обрабатывали по методу Фишера-Стьюдента в электронных таблицах Microsoft Excel 2000. Результаты и обсуждение Проведены биохимические и иммунологичес- кие исследования, которые позволили получить новые качественные характеристики развития БТПХ и сравнительную оценку воспалительного процесса, протекающего при введении аллогенно- го кКМ и кКМ с ФП. Уже с 7-х суток после введе- ния аллогенного кКМ начал увеличиваться СРБ, который является центральным компонентом ост- рой фазы воспаления. Существует прямая связь между изменением его уровня тяжести и динамики клинических проявлений воспаления. Чем выше концентрация СРБ, тяжелее протекает воспали- тельный процесс [6]. Содержание СРБ было повы- шено вплоть до 50-х суток, тогда как при сочетан- ном введении аллогенного кКМ с КФП уже на 30-е сутки отмечали снижение воспалительного про- цесса со слабоположительным результатом, а к 70-м – отрицательным (рис. 1). О развитии иммунного конфликта свидетельст- вует и повышение на протяжении 50 суток содер- жания сиаловых кислот, которое наблюдается и при ряде других АИЗ, сопровождающихся воспа- лительными процессами [6]. При сочетанном вве- дении кКМ и КФП такое увеличение наблюдалось только до 30-х суток, к 70-м – показатель прибли- жался к контролю (рис.2). 70 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 18, 2008, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 18, 2008, №1 cBM with CFL their increase was observed up to the 30th day then gradually decreasing from 40th to 70th days (Fig. 3). The performed biochemical and immunological studies confirmed the expedience for applying a combined introduction of CFL with allogenic cBM, which contributed to a decrease in inflammatory process manifestation at GVHR. CFL and allogenic Определение серомукоидов (особого вида гли- копротеидов) имеет наибольшее диагностическое значение для выявления вялотекущих воспали- тельных процессов, повышение которых свиде- тельствует об их активации, даже если клиничес- кие симптомы еще не проявились [6]. В данном эксперименте при введении только кКМ повыше- ние серомукоидов отмечали до 50-х суток включи- тельно, а незначительное снижение – только к 70-м суткам. При введении кКМ с КФП увеличение наблюдалось до 30-х суток, затем постепенно сни- жаясь с 40-х по 70-е сутки (рис. 3). Проведенные биохимические и иммунологи- ческие исследования подтвердили целесообраз- ность применения сочетанного введения КФП с аллогенным кКМ, которые способствовали сниже- нию выраженности воспалительного процесса при БТПХ. Сотрансплантация КФП с аллогенным кКМ cинхронно снижала показатели уже после 30-х су- ток, а к 70-м – возвращала показатели к контролю, тогда как без ФП показатели к 70-м суткам не восстанавливались (рис. 4). Признаками развития БТПХ также являются спленомегалия и гипоплазия тимуса. Полученные нами данные подтверждают снижение количества клеток в тимусе и увеличение массы селезенки (рис. 5, а). В этой же группе была отмечена боль- шая гибель животных (рис. 5, б). Сотрансплантация КФП с аллогенным кКМ полностью возвращала к норме показатель индекса селезенки, подчеркивая снижение ее массы у реци- пиентов аллогенного кКМ (рис. 5). Уже на 50-е сут- ки, после сотрансплантации КФП, наблюдалось 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 7 21 30 40 50 70 Время после трансплантации, сут Time after transplantation, days С РБ , е д SR P, u ni ts Рис. 1. Содержание СРБ после сотрансплантации крио- консервированного аллогенного КМ с клетками ФП: – сингенный кКМ; – кКМ; – кКМ+ФП. Fig. 1. CRP content after transplantation of cryopreserved allogeneic BM with FL cells: – syngeneic cBM; – cBM; – cBM+FL. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 7 21 30 40 50 70 Время после трансплантации, сут Time after transplantation, days С иа ло вы е ки сл от ы , м м ол ь/ л Si al a ci ds , m m ol /l Рис. 2. Содержание сиаловых кислот после сотранс- плантации криоконсервированного аллогенного КМ с клетками ФП: – сингенный кКМ; – кКМ; – кКМ+ФП. Fig. 2. Sial acid content after co-transplantation of cryopre- served allogeneic BM with FL cells: – syngeneic cBM; – cBM; – cBM+FL. 0 2 4 6 8 10 12 14 7 21 30 40 50 70 Рис. 3. Содержание серомукоидов после сотрансплан- тации криоконсервированного аллогенного КМ с клетками ФП: – сингенный кКМ; – кКМ; – кКМ+ФП. Fig. 3. Seromucoid content after co-transplantation of cryopreserved allogeneic BM with FL cells: – syngeneic cBM; – cBM; – cBM+FL. Время после трансплантации, сут Time after transplantation, days С иа ло вы е ки сл от ы , м м ол ь/ л Si al a ci ds , m m ol /l a a 71 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 18, 2008, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 18, 2008, №1 достоверное увеличение количества клеток в тимусе. Выживаемость реципиентов, являясь интег- ральным показателем оценки интенсивности проявления БТПХ, также подтвердила способ- ность КФП снижать иммунореактивность алло- миелотрансплантата, уменьшая смертность живот- ных данной группы к 70-м суткам. Выводы Проведенные исследования позволяют сделать важный вывод, что КФП при сотрансплантации с cBM co-transplantation decreased simultaneously the indices even after 30 days, but got back the indices to the control by the 70th one, meanwhile free of FL they did not recover to the 70th day (Fig. 4). Splenomegalia and thymus hypoplasia are also the signs of GVHR development. The data obtained confirm a decrease of cell number in thymus and spleen mass growth (Fig. 5, a). In the same group quite a high animal death rate was observed (Fig. 5, b). FLCs and allogenic cBM co-transplantation recovered the spleen index completely to the norm, by emphasising its mass decrease in recipients of 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 7 21 30 40 50 70 0 2 4 6 8 10 12 14 Время после трансплантации, сут Time after transplantation, days С од ер жа ни е си ал ов ы х ки сл от , С РБ Si al a ci d co nt en t, C R P С од ер жа ни е се ро м ук ои до в Se ro m uc oi ds c on te nt Сингенный кКМ Syngeneic cBM Рис. 4. Синхронность показателей воспаления в динамике проявления БТПХ: а – после трансплантации кКМ; б – сотрансплантации кКМ и ФП: – сиаловые кислоты; – – – серомукоиды; – – – СРБ. Fig. 4. Simultaneity of inflammation indices in dynamics of GVHR manifestation: a – after cBM transplantation; b – cBM and FL co-transplantation: – sial acids; – – – seromucoids; – – – CRP. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 7 21 30 40 50 70 0 2 4 6 8 10 12 Время после трансплантации, сут Time after transplantation, days С од ер жа ни е си ал ов ы х ки сл от , С РБ Si al a ci d co nt en t, C R P С од ер жа ни е се ро м ук ои до в Se ro m uc oi ds c on te nt Сингенный кКМ Syngeneic cBM 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 20 40 60 80 100 120 30 40 50 70Сингенный кКМ Syngeneic cBM С од ер жа ни е си ал ов ы х ки сл от , С РБ Si al a ci d co nt en t, C R P Ко ли че ст во я де рн ы х кл ет ок , 1 06 Se ro m uc oi ds c on te nt Аллогенный кКМ Allogeneic cBM кКМ + ФП CBM + FL Время после трансплантации, сут Time after transplantation, days С од ер жа ни е си ал ов ы х ки сл от , С РБ Si al a ci d co nt en t, C R P Рис. 5. Основные показатели БТПХ после сотрансплантации криоконсервированного аллогенного КМ с клетками ФП: а – индекс селезенки и количество ядерных клеток в тимусе; б – выживаемость реципиентов; – ИС; – – – количество ядерных клеток в тимусе (50 сутки); – – – кКМ; – – – кКМ+ФП; –– – сингенный КМ. Fig. 5. Main indices of GVHR after co-transplantation of cryopreserved allogeneic BM with FL cells: a is spleen index and a number of nucleated cells in thymus; b is recipients’ survival; – spleen index; – – – number of nucleated cells in thymus (50 days); – – – cBM; – – – cBM+FL; –– – syngeneic BM. a a б b б b 72 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 18, 2008, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 18, 2008, №1 криоконсервированным аллогенным КМ реализу- ют как минимум дуалистическую активность, а именно снижают его иммунореактивность и через дополнительную активацию стволового гемопоэ- тического компартмента повышают защитный потенциал. Литература Гольцев А.Н., Останкова Л.В., Луценко Е.Д., Дубрава Т.Г. и др. Функциональная активность криоконсервированных кроветворных клеток (КОЕс) в зависимости от компонент- ного состава миелотрансплантата // Пробл. криобиологии.– 1993.– №4.– С. 34–39. Гольцев А.Н., Луценко Е.Д., Останкова Л.В. и др. Возмож- ности криобиологии в решении иммуноконфликтных проблем при пересадке гистонесовместимого костного мозга // Пробл. криобиологии.– 1996.– №2.– С. 3–10. Мацевитая И.Ю., Останков М.В., Гольцев А.Н. Роль криоконсервирования в определении компонентного состава иммунореактивности костного мозга // Пробл. криобиологии.– 2006.– Т. 16, №1.– С. 66–75. Гольцев А.Н., Луценко Е.Д., Дубрава Т.Г. и др. Поиск альтернативных криоконсервированию путей модификации иммунореактивности алломиелотрансплантата. Часть II. Возможность сотрансплантации клеток эмбриональной печени // Пробл. криобиологии.– 2000.– №1.–- С. 10–21. Шевелев А.С. Реакция “трансплантат против хозяина” и трансплантационная болезнь.– М.: Медицина.– 1976.– 215 с. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник.– М.:Медицина.– 1987.– 364 с. Поступила 20.05.2008 allogeneic BM. Even to the 50th day after FLCs transplantation a statistically significant increase of cell number in thymus was observed. Recipients’ survival being an integral index of estimation of GVHR manifestation intensity also confirmed the FLC ability to reduce the immune reactivity of allomyelotransplant by reducing the death rate in this group of animals to the 70th day. Conclusions The research performed enables concluding about the realisation by FLCs under co-transplantation with cryopreserved allogenic BM of a minimum dual activity, namely they reduce its immune reactivity and increase a protective potential via additional activation of a stem hemopoietic compartment. 1. 2. 3. 4. 5. 6. References Goltsev A.N., Ostankova L.V., Lutsenko E.D., Dubrava T.G. The functional activity of cryopreserved hemopoietic cells (CFUs) as a function of the myelograft component composi- tion// Problems of Cryobiology.– 1993.– N4.– P. 34–39. Goltsev A.N., Lutsenko E.D., Ostankova L.V. et al. Application of cryobiology in solving immune-conflict problems when grafting a histoincompatible bone marrow // Problems of Cryobiology.– 1996.– N2.– P. 3–10. Matsevitaya I.Yu., Ostankov M.V., Goltsev A.N. Role of cryopreservation in determining component composition and immune reactivity of bone marrow // Problems of Cryobiology.– 2006.– Vol. 16, N1.– P. 66–75. Goltsev A.N., Dubrava T.G., Lutsenko E.D. et al. Search for the alternative to cryopreservation methods of modifying the immune reactivity of the allomyelotransplant. Part II. Possible co-transplantation of embryonic liver cells // Problems of Cryobiology.– 2000.– N1.– P. 10–21. Shevelev A.S. “Graft versus host” response and transplan- tation disease.– Moscow: Meditsina.– 1976.– 215 p. Menshikov V.V. Laboratory research methods in clinic: Reference book.– Moscow: Meditsina.– 1987.– 364 p. Accepted in 20.05.2008 1. 2. 3. 4. 5. 6.