Створення продуцентів та розробка технології отримання препаратів флавінмононуклеотиду на основі дріжджів Candida famata

Сконструйовано штами дріжджів C.famata, що містили 5–6 копій гена FMN1 (кодує рибофлавінкіназу), і досліджено умови, оптимальні для синтезу флавінмононуклеотиду (ФМН) при періодичному та періодичному з підживленням культивуванні. Оптимізовано склад поживного середовища, а також інші параметри культ...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Опубліковано в: :	Наука та інновації
Дата:	2012
Автори:	Яцишин, В.Ю., Клюз, М., Федорович, Д.В., Сибірний, А.А.
Формат:	Стаття
Мова:	Ukrainian
Опубліковано:	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України 2012
Теми:	Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/114248
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Створення продуцентів та розробка технології отримання препаратів флавінмононуклеотиду на основі дріжджів Candida famata / В.Ю. Яцишин, М. Клюз, Д.В. Федорович, А.А. Сибірний // Наука та інновації. — 2012. — Т. 8, № 5. — С. 72-78. — Бібліогр.: 25 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-114248
record_format	dspace
spelling	Яцишин, В.Ю. Клюз, М. Федорович, Д.В. Сибірний, А.А. 2017-03-04T15:28:25Z 2017-03-04T15:28:25Z 2012 Створення продуцентів та розробка технології отримання препаратів флавінмононуклеотиду на основі дріжджів Candida famata / В.Ю. Яцишин, М. Клюз, Д.В. Федорович, А.А. Сибірний // Наука та інновації. — 2012. — Т. 8, № 5. — С. 72-78. — Бібліогр.: 25 назв. — укр. 1815-2066 DOI: doi.org/10.15407/scin8.05.072 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/114248 Сконструйовано штами дріжджів C.famata, що містили 5–6 копій гена FMN1 (кодує рибофлавінкіназу), і досліджено умови, оптимальні для синтезу флавінмононуклеотиду (ФМН) при періодичному та періодичному з підживленням культивуванні. Оптимізовано склад поживного середовища, а також інші параметри культивування для максимального виходу цільового продукту – ФМН. Сконструированы штаммы дрожжей C. famata, содержащие 5–6 копий гена FMN1 (кодирует рибофлавинкиназу), и исследованы условия, оптимальные для синтеза флавинмононуклеотида (ФМН) при периодическом и периодическом с подпиткой культивировании. Оптимизирован состав питательной среды, а также другие пара- метры культивирования для максимального выхода целевого продукта – ФМН. The strains of the yeast Candida famata containing 5-6 copies of FMN1 gene (encoding riboflavin kinase) were constructed. The optimal conditions for flavin mononucleotide (FMN) synthesis under batсh and feed-batсh cultivation were investigated. The medium components and cultivation conditions for maximal accumulation of product – FMN were optimized. uk Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Наука та інновації Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України Створення продуцентів та розробка технології отримання препаратів флавінмононуклеотиду на основі дріжджів Candida famata Создание продуцентов и разработка технологии получения препаратов флавинмононуклеотида на основе дрожжей Сandida famata Construction of the Overproducers and Development of Technology for Flavin Mononucleotide Production Based on Yeast Candida famata Article published earlier
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
title	Створення продуцентів та розробка технології отримання препаратів флавінмононуклеотиду на основі дріжджів Candida famata
spellingShingle	Створення продуцентів та розробка технології отримання препаратів флавінмононуклеотиду на основі дріжджів Candida famata Яцишин, В.Ю. Клюз, М. Федорович, Д.В. Сибірний, А.А. Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України
title_short	Створення продуцентів та розробка технології отримання препаратів флавінмононуклеотиду на основі дріжджів Candida famata
title_full	Створення продуцентів та розробка технології отримання препаратів флавінмононуклеотиду на основі дріжджів Candida famata
title_fullStr	Створення продуцентів та розробка технології отримання препаратів флавінмононуклеотиду на основі дріжджів Candida famata
title_full_unstemmed	Створення продуцентів та розробка технології отримання препаратів флавінмононуклеотиду на основі дріжджів Candida famata
title_sort	створення продуцентів та розробка технології отримання препаратів флавінмононуклеотиду на основі дріжджів candida famata
author	Яцишин, В.Ю. Клюз, М. Федорович, Д.В. Сибірний, А.А.
author_facet	Яцишин, В.Ю. Клюз, М. Федорович, Д.В. Сибірний, А.А.
topic	Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України
topic_facet	Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України
publishDate	2012
language	Ukrainian
container_title	Наука та інновації
publisher	Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
format	Article
title_alt	Создание продуцентов и разработка технологии получения препаратов флавинмононуклеотида на основе дрожжей Сandida famata Construction of the Overproducers and Development of Technology for Flavin Mononucleotide Production Based on Yeast Candida famata
description	Сконструйовано штами дріжджів C.famata, що містили 5–6 копій гена FMN1 (кодує рибофлавінкіназу), і досліджено умови, оптимальні для синтезу флавінмононуклеотиду (ФМН) при періодичному та періодичному з підживленням культивуванні. Оптимізовано склад поживного середовища, а також інші параметри культивування для максимального виходу цільового продукту – ФМН. Сконструированы штаммы дрожжей C. famata, содержащие 5–6 копий гена FMN1 (кодирует рибофлавинкиназу), и исследованы условия, оптимальные для синтеза флавинмононуклеотида (ФМН) при периодическом и периодическом с подпиткой культивировании. Оптимизирован состав питательной среды, а также другие пара- метры культивирования для максимального выхода целевого продукта – ФМН. The strains of the yeast Candida famata containing 5-6 copies of FMN1 gene (encoding riboflavin kinase) were constructed. The optimal conditions for flavin mononucleotide (FMN) synthesis under batсh and feed-batсh cultivation were investigated. The medium components and cultivation conditions for maximal accumulation of product – FMN were optimized.
issn	1815-2066
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/114248
citation_txt	Створення продуцентів та розробка технології отримання препаратів флавінмононуклеотиду на основі дріжджів Candida famata / В.Ю. Яцишин, М. Клюз, Д.В. Федорович, А.А. Сибірний // Наука та інновації. — 2012. — Т. 8, № 5. — С. 72-78. — Бібліогр.: 25 назв. — укр.
work_keys_str_mv	AT âcišinvû stvorennâproducentívtarozrobkatehnologííotrimannâpreparatívflavínmononukleotidunaosnovídríždžívcandidafamata AT klûzm stvorennâproducentívtarozrobkatehnologííotrimannâpreparatívflavínmononukleotidunaosnovídríždžívcandidafamata AT fedorovičdv stvorennâproducentívtarozrobkatehnologííotrimannâpreparatívflavínmononukleotidunaosnovídríždžívcandidafamata AT sibírniiaa stvorennâproducentívtarozrobkatehnologííotrimannâpreparatívflavínmononukleotidunaosnovídríždžívcandidafamata AT âcišinvû sozdanieproducentovirazrabotkatehnologiipolučeniâpreparatovflavinmononukleotidanaosnovedrožžeisandidafamata AT klûzm sozdanieproducentovirazrabotkatehnologiipolučeniâpreparatovflavinmononukleotidanaosnovedrožžeisandidafamata AT fedorovičdv sozdanieproducentovirazrabotkatehnologiipolučeniâpreparatovflavinmononukleotidanaosnovedrožžeisandidafamata AT sibírniiaa sozdanieproducentovirazrabotkatehnologiipolučeniâpreparatovflavinmononukleotidanaosnovedrožžeisandidafamata AT âcišinvû constructionoftheoverproducersanddevelopmentoftechnologyforflavinmononucleotideproductionbasedonyeastcandidafamata AT klûzm constructionoftheoverproducersanddevelopmentoftechnologyforflavinmononucleotideproductionbasedonyeastcandidafamata AT fedorovičdv constructionoftheoverproducersanddevelopmentoftechnologyforflavinmononucleotideproductionbasedonyeastcandidafamata AT sibírniiaa constructionoftheoverproducersanddevelopmentoftechnologyforflavinmononucleotideproductionbasedonyeastcandidafamata
first_indexed	2025-11-27T05:41:31Z
last_indexed	2025-11-27T05:41:31Z
_version_	1850799602016452608
fulltext	72 © В.Ю. ЯЦИШИН, М. КЛЮЗ, Д.В. ФЕДОРОВИЧ, А.А. СИБІРНИЙ, 2012 Наука та інновації. 2012. Т. 8. № 5. С. 72—78. В.Ю. Яцишин 1, М. Клюз 2, Д.В. Федорович 1, А.А. Сибірний 1,2 1 Інститут біології клітини НАН України, Львів 2 Ряшівський університет, Польща СТВОРЕННЯ ПРОДУЦЕНТІВ ТА РОЗРОБКА ТЕХНОЛОГІЇ ОТРИМАННЯ ПРЕПАРАТІВ ФЛАВІНМОНОНУКЛЕОТИДУ НА ОСНОВІ ДРІЖДЖІВ CANDIDA FAMATA Сконструйовано штами дріжджів C.famata, що містили 5–6 копій гена FMN1 (кодує рибофлавінкіназу), і дослідже- но умови, оптимальні для синтезу флавінмононуклеотиду (ФМН) при періодичному та періодичному з підживленням культивуванні. Оптимізовано склад поживного середовища, а також інші параметри культивування для максималь- ного виходу цільового продукту – ФМН. К л ю ч о в і с л о в а: флавінмононуклеотид (ФМН), дріжджі, Candida famata, надсинтез, штами-продуценти. Рибофлавін (РФ, вітамін В2) біологічно ак- тивний лише у вигляді коферментних похід- них – ФМН та ФАД [1, 2, 3]. Відомі сотні фла- вопротеїнів, і кожного року описують нові флавіновмісні білки [4]. Від 1 до 3 % генів бак- терійних та еукаріотичних геномів кодують білки, що містять флавіни [5]. Флавоензими, що містять ФМН та ФАД як простетичні гру- пи, каталізують реакції, надзвичайно важливі для основних метаболічних процесів (фото- синтез, аеробне та анаеробне дихання, денітри- фікація). Зараз виявлено нові, раніше неві домі функції флавінів [4, 6]. Флавіни, задіяні у фо- торепарацію ДНК та регуляцію каспазонеза- леж ного апоптозу, є важливим компонентом фоторецепторів (криптохромів), що реагують на блакитне світло, залучених у регуляцію біо- логічних годинників та у генерацію світла при бактерійній біолюмінесценції. Оскільки флавіни беруть участь у метабо- лізмі багатьох сполук, а також у процесах гене- рації енергії, порушення в обміні флавінових коферментів призводять до серйозних змін на клітинному та тканинному рівнях [7]. При недостатньому забезпеченні флавінами у ссавців погіршується апетит, припиняється ріст, знижується ефективність засвоєння кор- мів, розвиваються ураження слизових оболо- нок, порушується сутінковий зір, а також функ- ції печінки і травного тракту. Важлива роль флавопротеїнів у обміні ре- човин обумовлює широке використання пре- паратів вітаміну В2 у медичній практиці. Як лікарський засіб ФМН використовують для лікування захворювань серцево-судинної сис- теми, печінки, кишківника, а також для норма- лізації діяльності центральної нервової систе- ми. Флавінові нуклеотиди застосовуються у вигляді ін’єкцій при арибофлавінозі, різнома- нітних дерматозах, захворюваннях очей, а та- кож як підтримуючий засіб при порушеннях харчування [1, 8]. Компонент мультивітамін- них сумішей – ФМН має у 200 разів кращу роз- чинність у воді, ніж РФ [9, 10], що дозволяє застосовувати його парентерально. Крім того, 73ISSN 1815-2066. Наука та інновації. T. 8, № 5, 2012 Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України терапевтичний потенціал ФМН при лікуванні деяких захворювань вищий, ніж у РФ [11]. Різноманітність функцій флавопротеїнів, пот- реба людей і тварин у флавінах, здатність дея- ких мікроорганізмів до надсинтезу цього віта- міну вказує на важливе значення з’ясу ван ня закономірностей утворення флавінів та меха- нізмів регуляції процесу флавіногенезу не ли- ше для розкриття фундаментальних проблем біології, а й для сучасної біотехнології вироб- ництва флавінів медичного призначення та біл- ково-вітамінних препаратів для використання як кормових добавок у тваринництві та пта- хівництві [12]. 5´-ФМН у промислових масштабах отриму- ють шляхом фосфорилювання РФ хімічними агентами (хлороксид фосфору, пірофосфорна кислота і суміш фенолу, хлороформу та фос- форного ангідриду), при цьому утворюються побічні продукти: ізомерні форми ФМН (2´- ФМН і 4´-ФМН), РФ-динуклеотиди (5´,4´- ФДН і 5´,3´-ФДН), а також РФ-поліфосфати. Очистка 5´-ФМН від цих сполук є доволі важ- кою процедурою [9]. Окрім того, препарати ФМН, отримані хімічним способом, досить дорогі, що знижує можливості їх практичного застосування. Спроби отримати штами мікро- організмів, здатні до утворення значних кіль- костей ФМН, із використанням класичних генетичних методів не мали успіху. Сконструйовано рекомбінантні штами бак- терії Corynebacterium ammoniagenes, які можуть продукувати значні кількості ФМН та ФАД внаслідок надекспресії гена, що кодує РФ кі- назу/ФАД-синтетазу [13], однак середовище для культивування містило надзвичайно до- рогі складники, зокрема 24 г/л АТФ [14]. Доброю моделлю для дослідження генетич- ного контролю біосинтезу флавінових нуклео- тидів та перспективними для отримання над- синтетиків ФМН є дріжджі С. famata, які во- лодіють величезним потенціалом як проду- центи РФ [3, 15]. Використання дріжджових продуцентів для промислового виробництва ФМН має ряд переваг: не потребує дорогих попередників, відсутність побічних продуктів, короткий час культивування, можливість ви- користання відходів та напівпродуктів харчо- вої промисловості. Нами розроблено схему генно-інженерного конструювання та вперше отримано штами дріжджів С. famata, здатні до нагромадження в культуральній рідині ФМН [16, 17, 18]. Заміна нативного промотора кло- нованого гена FMN1 дріжджів Debaryomyces hansenii на сильний промотор TEF1 (фактора елонгації трансляції α1) C. famata викликає підвищення (до 200 разів) питомої активності РФ-кінази (каталізує реакцію фосфорилюван- ня РФ) та зростання вмісту ФМН (до 1000 ра- зів) у культуральній рідині рекомбінантних шта мів C. famata. Показано, що рівень синтезу ФМН може бути підвищений за рахунок вве- дення додаткових копій гена FMN1. Для забез- печення РФ-кінази достатньою кількістю суб- страту (РФ) ген FMN1 було введено у штам дрі жджів C. famata – стабільний надсинтетик РФ. Проте продуктивність синтезу ФМН скон- струйованими штамами є недостатньою для промислового виробництва цього нуклеотиду. Раніше ми показали, що оптимізація лише складу середовища призводить до зростання продукції ФМН у 30 разів [19]. У роботі на- ведено дані про конструювання штаму C. fa- mata, що містить 5–6 копій гена FMN1, та до- сліджено умови, оптимальні для синтезу ФМН при періодичному та періодичному з піджив- ленням культивуванні. Оптимізовано склад поживного середовища, а також інші параме- три культивування (перемішування, темпера- тура, рН) для продукції ФМН сконструйова- ним штамом. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ Нами використовувався штам дріжджів Can- dida famata, здатний до надсинтезу ФМН Т-ОР 13-76, що містив 3–4 копії гена FMN1 під кон- тролем промотора TEF1 C. famata [18]. Дріжджі вирощували при 28–30 °С у багатому середо- вищі YPD (2 % глюкоза, 1 % бактопептон, 0,5 % дріжджовий екстракт) та модифікованому мі- 74 ISSN 1815-2066. Science and Innovation. T. 8, № 5, 2012 Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України неральному середовищі Беркгольдера (СБ) (са- хароза – 20; сечовина – 1; КH2PO4 – 5; MgSO4 × × 7H2O – 0,2; CaCl2 – 0,2; а також біотин – 1 мг/л; мікроелементи у кінцевій концентрації: 0,2 мкM CuSO4; 4,5 мкM MnSO4; 2,0 мкM NaMoO4; 0,75 мкM H3BO3; 17,5 мкM ZnSO4) та промис- лових середовищах різного складу. Дріжджі ку- льтивували в колбах на круговій качалці при 220 об./хв або у біореакторах об’ємом 1,3 та 7 л (New Brunswick Scientific). Генно-інженерні маніпуляції проводили за стандартною методикою, як описано в [20, 21]. Біомасу дріжджів визначали за оптичним по- глинанням розведених суспензій шляхом фо- тометрування на спектрофотометрі Helios Gam- ma UVG-100105 при довжині хвилі 590 нм у кюветі шириною 1 см; перерахунок на суху вагу проводили за стандартною кривою. Вміст різних форм флавінів визначали на флюоро- метрі Turner Quantech Digital Filter Fluorometer FM109510-33 після хроматографічного розді- лення у 2,5 % гідрофосфаті натрію. Вміст глю- кози в культуральному середовищі визначали ферментативним способом, використовуючи аналітичний набір «Діаглюк-2». Для виявлення компонентів середовища, важливих для продукції ФМН, застосовував- ся аналіз Плакета–Бермана [22]. Для підбору концентрації досліджуваних компонентів се- редовища було застосовано центральний ком- позиційний аналіз [23]. Статистичний аналіз математичних моделей здійснено за допомо- гою пакету статистики ANOVA. Для вищезга- даних процедур було використано програмний пакет Statistica® 6.0 Stat Soft, Inc. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ Конструювання продуцента ФМН Для введення додаткових копій гена FMN1 під контролем сильного промотора TEF1 у ге- ном сконструйованого нами рекомбінантного штаму Т-ОР 13-76 C. famata [18], який містив 3–4 копії гена FMN1 і синтезував близько 25 мг/л ФМН, було сконструйовано плазміду, що міс- тила ген резистентності до мікофенольної кис- лоти (рисунок). Цією плазмідою, попередньо лінеаризованою рестриктазою PstI, методом елек тропорації трансформували реципієнтний штам-надсинтетик ФМН C. famata Т-ОР 13-76. Було отримано колекцію стабільних, резис- тентних до мікофенольної кислоти рекомбі- нантних штамів, які, за результатами Сау зерн- блот аналізу, містили 5–6 копій гена FMN1. Отримані трансформанти мали вищу питому активність РФ-кінази (до 17 мОд/мг білка) і нагромаджували більшу кількість ФМН у ку- льтуральній рідині (понад 130 мг/л), порівняно Таблиця 1 Вміст флавінів у культуральній рідині рекомбінантних штамів C. famata, що містять додаткові копії гена FMN1 Штам Флавіни культуральної рідини ФМН, мг/л Сумарна кількість флавінів, мг/л ФМН, % AF-4 4,0 ± 0,2 35,9 ± 2,8 11,1 ± 0,9 Т-ОР 13-76 26,0 ± 1,9 44,5 ± 3,3 58,4 ± 5,5 Т-ОРМ 11 31,4 ± 2,4 48,7 ± 3,2 64,5 ± 5,5 Т-ОРМ 12 34,4 ± 2,9 52,1 ± 3,1 66,0 ± 6,7 Т-ОРМ 13 51,7 ± 1,9 138,3 ± 9,6 37,4 ± 3,2 Т-ОРМ 14 62,2 ± 4,9 248,3 ± 8,3 25,1 ± 1,9 Т-ОРМ 15 59,2 ± 2,1 82,3 ± 4,1 71,9 ± 6,8 Т-ОРМ 16 100,0 ± 6,8 210,0 ± 4,0 47,6 ± 4,8 Т-ОРМ 17 106,0 ± 5,3 226,0 ± 8,0 46,9 ± 2,1 Т-ОРМ 18 89,7 ± 0,6 138,1 ± 9,9 65,0 ± 2,0 Т-ОРМ 19 130,5 ± 7,7 208,2 ± 9,9 62,7 ± 1,9 Т-ОРМ 20 81,0 ± 2,3 260,4 ± 8,9 31,1 ± 1,0 Р < 0,05 Лінійна схема плазміди рIMH3_TFMN1. Сайти рестрик- ції: Sc, SacI; B, BamHI; Sl, SalI; P, PstI. 75ISSN 1815-2066. Наука та інновації. T. 8, № 5, 2012 Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України зі штамом дикого типу та реципієнтним штама- ми (табл. 1). Найбільш активний штам C. famata IMB Y-5028 було запатентовано [24] та вико- ристано для подальшої роботи. Оптимізація умов культивування для максимального виходу ФМН За умов періодичного культивування при засіві 0,10 мг/л тривалість культивування, яка забезпечує утворення ФМН, становить 48– 60 год. Для скорочення часу культивування для максимального нагромадження ФМН ви- рішили застосувати інкубацію густої суспензії клітин. Густину культури, найбільш сприятли- ву для синтезу ФМН штамом C. famata IMB Y-5028, визначали при інкубації клітин у рід- кому модифікованому СБ. Частота перемішу- вання становила 220 об./хв, температура – 28 °С, час інкубації – 21 год. Виявлено, що синтез ФМН за умов інкубації помітно зале- жить від початкової концентрації клітин у се- редовищі (табл. 2). Сумарний вміст флавінів зростав відповідно до зростання густини сус- пензії, однак вміст ФМН був максимальним при інкубації 3 мг/мл клітин протягом 21 год. При цьому відсотковий вміст ФМН також був найвищим при інкубації 3 мг/л клітин. Встановлено, що температура культивуван- ня має суттєвий вплив на рівень синтезу ФМН. Найкращою для продукції ФМН є тем пе ра- тура 24–28 °С. Зниження синтезу ФМН при вищих значеннях температури культивуван- ня, імовірно, пов’язане із суттєвим пригні- ченням росту досліджуваного штаму IMB Y-5028 C. fa mata при температурі, вищій, ніж 30 °С (дані не наведено). Вплив рН на синтез ФМН не є настільки суттєвим, як вплив тем- ператури. Оп тимальним значенням рН вия- вилося 5,5. Досліджено вплив окремих компонентів се- редовища та їх концентрацій на нагромаджен- ня ФМН сконструйованим рекомбінантним штамом. Для цього застосовано методи мате- матичного моделювання експериментів, зок- рема аналіз Плакета–Бермана. Для аналізу було взято компоненти середовища СБ та деякі мі- кроелементи, що, за даними літератури, впли- вають на біосинтез РФ флавіногенними мік- роорганізмами та фосфатазну активність [25]. Зокрема, використано 15 різних компонентів середовища: сахарозу, сечовину, КН2РО4, MgSO4, CaCl2, (NH4)6Mo7O24, ZnSO4, CuSO4, MnSO4, CoCl2, сіль Мора як джерело заліза, цитрат на- трію, BeSO4, NaF, дріжджовий екстракт. Згідно зі статистичним аналізом, факторами, що до- стовірно позитивно впливають на синтез ФМН, виявились: КН2РО4, CaCl2, (NH4)6Mo7O24, BeSO4 та дріжджовий екстракт. Подальшу оптиміза- цію середовища та можливі взаємодії між ком- понентами, що впливають на синтез ФМН, оці- нювали за допомогою аналізу «на поверхні від- зиву». Для перевірки даних центрального ком- позиційного аналізу 3 мг/мл клітин дріжджів інкубували у 100 мл колбах, що містили 10 мл середовища оптимізованого складу (згідно з прогнозованими даними моделі) (г/л): сахаро- за – 20; сечовина – 1; КH2PO4 – 4,999; MgSO4 × × 7H2O – 0,2; CaCl2 – 2,600; (NH4)6Mo7O24 × × 4H2O – 0,240; CuSO4 · 5H2O – 0,0013; дріж- джовий екстракт – 2,198; а також біотин – 1 мг/л; мікроелементи у кінцевій концентрації: 0,2 мкM CuSO4; 4,5 мкM MnSO4; 2,0 мкM NaMoO4; 0,75 мкM H3BO3; 17,5 мкM ZnSO4. Частота пе- ремішування становила 220 об./хв, температу- ра – 28 °С, час інкубації – 21 год, рН – 5,5. Результати, отримані в трьох окремих екс- периментах, були близькими до прогнозова- Таблиця 2 Вміст флавінів у культуральній рідині рекомбінантного штаму IMB Y-5028 C. famata при різній початковій густині клітин Густина клітин, мг/мл Сумарний вміст флавінів, мг/л ФМН, мг/л ФМН, % 2,0 155,6 ± 0,55 83,9 ± 0,22 53,9 ± 5,03 3,0 332,5 ± 0,53 195,5 ± 0,41 58,8 ± 2,38 5,0 328,7 ± 0,98 188,0 ± 0,81 57,2 ± 1,39 7,5 376,4 ± 1,00 176,9 ± 0,55 47,0 ± 4,73 Р < 0,05 76 ISSN 1815-2066. Science and Innovation. T. 8, № 5, 2012 Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України них. Передбачувана продукція ФМН станови- ла 328,25 мг/л, тоді як експериментально отримано 318,2 ± 7,411 мг/л ФМН. Це під- тверджує достовірність теоретичної моделі. Оптимізація умов культивування штаму C.famata IMB Y-5028 в біореакторах Для роботи було використано ферментери об’ємом 1,3 та 7 л (New Brunswick Scientific). Для культивування у біореакторі об’ємом 1,3 л по- чаткова густина інокуляту становила 4–5 мг/мл. Режим перемішування у ферментері підтри- мувався на рівні 600 об./хв; температура – 26 °С. Для забезпечення потрібної оптичної густини культури інокулят вирощували у кол- бах в середовищі оптимізованого складу про- тягом 24–30 год, осаджували центрифугуван- ням при 2,5 тис. об./хв і вносили у фермента- ційне середовище. Встановлено, що іони Cu2+ та MoO24 2– стимулюють ріст та синтез ФМН штамом-надпродуцентом C. famata. Найвищого рівня синтез ФМН досягав на 48-ій годині інкубації у середовищі оптимізо- ваного складу з додаванням солей міді та мо- лібдату і становив 292,0 мг/л (табл. 3), однак вміст глюкози у середовищі був критично низьким, що, безперечно, негативно впливало на подальший ріст культури і, як наслідок, мо- гло негативно впливати на синтез ФМН. Тому наступні ферментації велися у режимі періо- дичного культивування з підживленням (під- живлення вели 50%-им розчином глюкози; її концентрацію підтримували на рівні 0,5–1,5 %), що стимулювало ріст і біосинтез ФМН куль- турою штаму-надпродуцента C. famata IMB Y-5028 (табл. 4). За таких умов на 73-ій годині інкубації було досягнуто синтезу 426 мг/л ФМН. У наступних експериментах було здій- снено підживлення культури не лише джере- лом вуглецю, але й концентрованим середови- щем культивування. Для цього під час інкуба- ції у ферментер вносили окрім глюкози (50 %) компоненти оптимізованого середовища з кін- цевою концентрацією (г/л): сечовина – 5; КH2PO4 – 25; MgSO4·7H2O – 1; (NH4)6Mo7O24 × × 4H2O – 1,25; CuSO4·5H2O – 0,0065; дріжджо- вий екстракт – 11; а також біотин – 5 мг/л; мі- кроелементи у кінцевій концентрації: CuSO4 – 1 мкM; MnSO4 – 22,5 мкM; NaMoO4 – 10 мкM; H3BO3 – 3,75 мкM; ZnSO4 – 87,5 мкM. Вста- Таблиця 3 Синтез ФМН та вміст глюкози в середовищі при періодичному типі вирощування штаму C. famata IMB Y-5028 у ферментері Час ін- ку ба ції, год Середовище інкубації – Cu2+ та MoO24 2– + Cu2+ та MoO24 2- ФМН, мг/л Глюкоза, % ФМН, мг/л Глюкоза, % 0 – 2,00 — 2,00 13,5 177,6 0,12 124,7 0,11 19,0 169,8 0,13 124,0 0,11 22,0 186,0 0,13 176,7 0,11 38,0 200,4 0,14 275,3 0,14 43,0 204,6 0,15 242,7 0,14 48,0 190,2 0,16 292,0 0,15 60,0 183,0 0,16 188,0 0,18 Таблиця 4 Ріст, синтез ФМН та вміст глюкози в середовищі при періодичному та періодичному з підживленням глюкозою типах вирощування штаму C. famata IMB Y-5028 у ферментері Час ін- куба- ції, год Тип культивування Періодичний Періодичний із підживленням Біома- са, мг/мл ФМН, мг/л Глюко- за, % Біома- са, мг/мл ФМН, мг/л Глюко- за, % 0 5,00 — 2,00 5,00 — 2,00 9,0 6,20 93,6 0,17 6,50 119,4 0,15 22,0 7,20 177,0 0,20 7,30 228,6 0,20 24,0 6,90 197,4 0,19 6,90 240,0 0,97 28,0 6,90 213,6 0,18 7,80 314,4 0,27 32,0 6,50 237,0 0,23 7,80 318,6 0,27 46,0 6,51 271,2 0,18 8,21 351,6 0,23 48,0 6,41 258,6 0,18 8,42 361,2 1,70 52,0 6,51 264,6 0,21 8,45 340,2 1,47 56,0 6,56 249,0 0,21 8,57 345,0 1,02 73,0 6,83 271,2 0,25 8,91 426,0 0,29 77ISSN 1815-2066. Наука та інновації. T. 8, № 5, 2012 Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України новлено, що при підживленні культури джере- лом вуглецю та концентрованим середовищем культивування рівень ФМН залишається ста- більно високим від 44-ої години інкубації (бі- льше 420 мг/л) і досягає максимуму – 485 мг/л на 104-ій годині інкубації. Зменшення густини засіву з 5 мг/л до 2 мг/л у ферментерах об’ємом 7 л призводило до зни- ження виходу ФМН (324 мг/л після 73 год культивування). Проведено масштабування процесу отриман- ня ФМН за допомогою високоактивного ста- більного продуцента у промислових умовах згідно з договором із приватним акціонерним товариством «Ензим» (м. Ладижин Він ницької обл.). Склад середовища (г/л): вода технічна, цукор неочищений – 30, дріжджовий автолі- зат (виготовлений на підприємстві «Ен зим») – 2,2, KH2PO4 – 5; MgSO4 х 7 H2O – 0,2; CaCl2 – 2; карбамід – 1; біотин – 1 мкг; суміш мікрое- лементів: CuSO4 – 2 мкM; MnSO4 – 4,5 мкM; NaMoO4 – 2,0 мкM; H3BO3 – 0,75 мкM; ZnSO4 – 17,5 мкM. Умови вирощування в біореакторі: засів – 1,3 г клітин/л, рН середови ща – 5–6, температура – 25 °С. Режим перемішування у ферментері підтримувався на рівні 250 об./хв. За цих умов нагромадження ФМН в культу- ральній рідині не перевищувало 180 мг/л. ВИСНОВКИ За допомогою методів метаболічної інженерії отримано штами дріжджів, здатні до надсинтезу ФМН внаслідок введення додаткових копій гена FMN1 під контролем промотора TEF1 у штам-надсинтетик ФМН. Підібрано умови мак симального виходу цільового продукту – ФМН – при вирощуванні селекціонованих штамів у лабораторних умовах. У ферментері, при використанні середовища оптимізованого складу та підібраних умов культивування при підживленні культури джерелом вуглецю та концентрованим середовищем, вда лося досяг- нути синтезу 463–485 мг/л ФМН. Результати проведеної роботи по масштабуванню процесу біосинтезу ФМН на ПрАТ «Ен зим» свідчать, що подальші зусилля повинні бути спрямовані на адаптацію штамів до промислових умов, що дасть можливість налагодити економічно вигід- не виробництво препаратів ФМН. ЛІТЕРАТУРА 1. Rivlin R.S. Riboflavin // Present Knowledge in Nutrition / Ed by E.K. Ziegler and L.J. Filer, International Life Sciences Institut, 1996. – P. 167–173. 2. Burgess C.M., Smid E.J., van Sinderen D. Bacterial vi ta- min B2, B11 and B12 overproduction: An overview // Intern. J. Food Microbiol. – 2009. – Vol. 133, № 1–2. – P. 1–7. 3. Abbas C.A., Sibirny A.A. Genetic control of biosynthesis and transport of riboflavin and flavin nucleotides and construction of robust biotechnological producers. Mic- robiol // Mol. Biol. Rev. – 2011. – Vol. 75, № 2. – P. 321– 360. 4. Massey V. The chemical and biological versatility of ri- bo flavin // Biochem. Soc. Trans. – 2000. – 28. – P. 283– 296. 5. DeColibus L., Mattevi A. New frontiers in structural fla- voenzymology // Curr.Opin.Struct. Biol. – 2006. – Vol. 16, № 4. – P. 722–728. 6. Яцишин В.Ю., Федорович Д.В., Сибирный А.А. Мик- роб ный синтез флавиновых нуклеотидов (обзор) // Прикл. биохим. микробиол. – 2009. – Т. 45, № 2. – С. 133–142. 7. Powers H.J. Riboflavin (vitamin B2) and health // Amer. J. Clin. Nutr. – 2003. – Vol. 77, № 6. – P. 1352–1360. 8. Борзенко И.А. Клинико-фармацевтические аспекты применения рибофлавина и рибофлавиновых кофер- ментов // Врачеб. дело. – 1983. – Т. 10, № 1. – С. 4–8. 9. Березовский В.М. Химия витаминов. — М.: Пищевая пром., 1973. – 632с. 10. Kroschwitz J.I., Howe-Grant M., Kirk R.E., Othmer D.F. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology: [in 27 volumes]. – New York: J. Wiley, 1998. – V. 25: Vi- tamins to zone refining. – 1998. – Р. 74–83. 11. Хамидова М.Х. Рибофлавинмононуклеотид в глаз- ной практике // Вестн. офтальмологии. – 1973. – Т. 1, № 2. – С. 41–42. 12. Сибірний А.А., Федорович Д.В., Борецький Ю.Р., Во- роновський А.Я. Мікробний синтез флавінів. — Київ: Наук. думка, 2006. – 191с. 13. Hagihara T., Fujio T., Aisaka K. Cloning of FAD syn the- tase gene from Corynebacterium ammoniagenes and its application to FAD and FMN production // Appl. Mic- robiol. Biotechnol. – 1995. – Vol. 42, № 5. – P. 724–729. 14. Pat. 5514574 US, C12N 009/12; C12N 009/02; C12P 021/06; C12P 019/30. Method of producing flavine nuc- leotides / K. Kitatsuji, S. Ishino, S. Teshiba, M. Ari mo- to – Filing date 25.07.1994; Publication date 07.05.1996. 78 ISSN 1815-2066. Science and Innovation. T. 8, № 5, 2012 Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України 15. Stahmann K.P., Revuelta J.L., Seulberger H. Three bio- technical processes using Ashbya gossypii, Candida fa- ma ta, or Bacillus subtilis compete with chemical ribo fla- vin production // Appl. Microbiol. and Biotechnol. – 2000. – Vol. 53, № 5. – P. 509–516. 16. Іщук О.П., Яцишин В.Ю., Дмитрук К.В. та ін. Генно- інженерне конструювання штамів флавіногенних дріжджів Candida famata з високою активністю ри- бофлавінкінази // Укр. біохім. журн. – 2006. – Т. 78, № 5. – С. 63–69. 17. Вороновський А.Я., Дмитрук К.В., Іщук О.П. та ін. // Пат. 87684 Україна, МПК C 12 P 25/00, C 12 N 15/00. Спосіб отримання флавінмононуклеотиду (5’-ФМН); заявник і власник Інститут біології клітини НАН Ук раїни. – № a200612203; заявл. 20.11.2006; опубл. 10.08.2009, бюл. № 15. 18. Yatsyshyn V. Y., Ischuk O. P., Voronovsky A. Y. et al. Pro- duction of flavin mononucleotide by metabolically en- gineered yeast Candida famata // Metabol. Eng. – 2009. – Vol. 11, № 3. – Р. 163–167. 19. Yatsyshyn V.Y., Fedorovych D.V., Sibirny A.А. Medium optimization for production of flavin mononucleotide by the recombinant strain of the yeast Candida famata using statistical designs // Biochem. Eng. J. – 2010. – Vol. 49, № 1. – P. 52–60. 20. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989. 21. Voronovsky A.A., Abbas C.A., Fayura L.R., Kshanovska B.V. et all. Development of a transformation system for the flavinogenic yeast Candida famata // FEMS Yeast Re- search. – 2002. – Vol. 2, № 3. – Р. 381–388. 22. Plackett R.L., Burman J.P. The design of optimum mul- tifactorial experiments // Biometrika. – 1946. – Vol. 33, № 4. – Р. 305–325. 23. Montgomery D. C. Design and Analysis of Experiments. – [4-th edn.]. – NY: Wiley, 1997. – 196 р. 24. Пат. 42499 Україна, МПК C 12 N 1/19. Штам дріж- джів Candida famata ІМВ У-5028 – продуцент фла- вінмононуклеотиду (5′-ФМН) / А.А. Сибірний, В.Ю. Яцишин, Д.В. Федорович, О.П. Іщук, А.Я. Во ронов- ський; заявник і власник Інститут біології клітини НАН України. – № u 2009 00725; заявл. 02.02.2009; опубл. 10.07.2009, бюл. № 13. 25. Струговщикова Л.П., Федорович І.П., Шавловський Г.М. Виявлення і деякі властивості фосфатаз Pichia gui- llie rmondi, які гідролізують флавінмононуклеотид // Укр. біохім. журн. – 1973. – Т. 45, № 2. – С. 198–203. В.Ю. Яцишин, М. Клюз, Д.В. Федорович, А.А. Сибирный СОЗДАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ И РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ФЛАВИНМОНОНУКЛЕОТИДА НА ОСНОВЕ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA FAMATA Сконструированы штаммы дрожжей C. famata, содер- жащие 5–6 копий гена FMN1 (кодирует рибофлавинки- назу), и исследованы условия, оптимальные для синтеза флавинмононуклеотида (ФМН) при периодическом и периодическом с подпиткой культивировании. Оптими- зирован состав питательной среды, а также другие пара- метры культивирования для максимального выхода це- левого продукта – ФМН. Ключевые слова: флавинмононуклеотид (ФМН), дрож жи, Candida famata, сверхсинтез, штаммы-проду- центы. V.Yu. Yatsyshyn, M. Kluz, D.V. Fedorovych, А.А. Sibirny CONSTRUCTION OF THE OVERPRODUCERS AND DEVELOPMENT OF TECHNOLOGY FOR FLAVIN MONONUCLEOTIDE PRODUCTION BASED ON YEAST CANDIDA FAMATA The strains of the yeast Candida famata containing 5-6 copies of FMN1 gene (encoding riboflavin kinase) were con- structed. The optimal conditions for flavin mononucleotide (FMN) synthesis under batсh and feed-batсh cultivation were investigated. The medium components and cultivation conditions for maximal accumulation of product – FMN were optimized. Key words: flavin mononucleotide (FMN), yeast, Can- dida famata, oversynthesis, overproducers. Стаття надійшла до редакції 06.02.12 << /ASCII85EncodePages false /AllowTransparency false /AutoPositionEPSFiles true /AutoRotatePages /None /Binding /Left /CalGrayProfile (Dot Gain 20%) /CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2) /sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CannotEmbedFontPolicy /Error /CompatibilityLevel 1.4 /CompressObjects /Tags /CompressPages true /ConvertImagesToIndexed true /PassThroughJPEGImages true /CreateJobTicket false /DefaultRenderingIntent /Default /DetectBlends true /DetectCurves 0.0000 /ColorConversionStrategy /CMYK /DoThumbnails false /EmbedAllFonts true /EmbedOpenType false /ParseICCProfilesInComments true /EmbedJobOptions true /DSCReportingLevel 0 /EmitDSCWarnings false /EndPage -1 /ImageMemory 1048576 /LockDistillerParams false /MaxSubsetPct 100 /Optimize true /OPM 1 /ParseDSCComments true /ParseDSCCommentsForDocInfo true /PreserveCopyPage true /PreserveDICMYKValues true /PreserveEPSInfo true /PreserveFlatness true /PreserveHalftoneInfo false /PreserveOPIComments false /PreserveOverprintSettings true /StartPage 1 /SubsetFonts true /TransferFunctionInfo /Apply /UCRandBGInfo /Preserve /UsePrologue false /ColorSettingsFile () /AlwaysEmbed [ true ] /NeverEmbed [ true ] /AntiAliasColorImages false /CropColorImages true /ColorImageMinResolution 300 /ColorImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleColorImages true /ColorImageDownsampleType /Bicubic /ColorImageResolution 1200 /ColorImageDepth -1 /ColorImageMinDownsampleDepth 1 /ColorImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeColorImages false /ColorImageFilter /DCTEncode /AutoFilterColorImages true /ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG /ColorACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /ColorImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000ColorACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000ColorImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasGrayImages false /CropGrayImages true /GrayImageMinResolution 300 /GrayImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleGrayImages true /GrayImageDownsampleType /Bicubic /GrayImageResolution 1200 /GrayImageDepth -1 /GrayImageMinDownsampleDepth 2 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeGrayImages false /GrayImageFilter /DCTEncode /AutoFilterGrayImages true /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG /GrayACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /GrayImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000GrayACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000GrayImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasMonoImages false /CropMonoImages true /MonoImageMinResolution 1200 /MonoImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleMonoImages true /MonoImageDownsampleType /Bicubic /MonoImageResolution 1200 /MonoImageDepth -1 /MonoImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeMonoImages false /MonoImageFilter /CCITTFaxEncode /MonoImageDict << /K -1 >> /AllowPSXObjects false /CheckCompliance [ /None ] /PDFX1aCheck false /PDFX3Check false /PDFXCompliantPDFOnly false /PDFXNoTrimBoxError true /PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXSetBleedBoxToMediaBox true /PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXOutputIntentProfile (None) /PDFXOutputConditionIdentifier () /PDFXOutputCondition () /PDFXRegistryName () /PDFXTrapped /False /CreateJDFFile false /Description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> /CHS <FEFF4f7f75288fd94e9b8bbe5b9a521b5efa7684002000410064006f006200650020005000440046002065876863900275284e8e9ad88d2891cf76845370524d53705237300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c676562535f00521b5efa768400200050004400460020658768633002> /CHT <FEFF4f7f752890194e9b8a2d7f6e5efa7acb7684002000410064006f006200650020005000440046002065874ef69069752865bc9ad854c18cea76845370524d5370523786557406300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c4f86958b555f5df25efa7acb76840020005000440046002065874ef63002> /CZE <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> /DAN <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> /DEU <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> /ESP <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> /ETI <FEFF004b00610073007500740061006700650020006e0065006900640020007300e4007400740065006900640020006b00760061006c006900740065006500740073006500200074007200fc006b006900650065006c007300650020007000720069006e00740069006d0069007300650020006a0061006f006b007300200073006f00620069006c0069006b0065002000410064006f006200650020005000440046002d0064006f006b0075006d0065006e00740069006400650020006c006f006f006d006900730065006b0073002e00200020004c006f006f0064007500640020005000440046002d0064006f006b0075006d0065006e00740065002000730061006100740065002000610076006100640061002000700072006f006700720061006d006d006900640065006700610020004100630072006f0062006100740020006e0069006e0067002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020006a00610020007500750065006d006100740065002000760065007200730069006f006f006e00690064006500670061002e000d000a> /FRA <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> /GRE <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a stvaranje Adobe PDF dokumenata najpogodnijih za visokokvalitetni ispis prije tiskanja koristite ove postavke. Stvoreni PDF dokumenti mogu se otvoriti Acrobat i Adobe Reader 5.0 i kasnijim verzijama.) /HUN <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> /ITA <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> /JPN <FEFF9ad854c18cea306a30d730ea30d730ec30b951fa529b7528002000410064006f0062006500200050004400460020658766f8306e4f5c6210306b4f7f75283057307e305930023053306e8a2d5b9a30674f5c62103055308c305f0020005000440046002030d530a130a430eb306f3001004100630072006f0062006100740020304a30883073002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee5964d3067958b304f30533068304c3067304d307e305930023053306e8a2d5b9a306b306f30d530a930f330c8306e57cb30818fbc307f304c5fc59808306730593002> /KOR <FEFFc7740020c124c815c7440020c0acc6a9d558c5ec0020ace0d488c9c80020c2dcd5d80020c778c1c4c5d00020ac00c7a50020c801d569d55c002000410064006f0062006500200050004400460020bb38c11cb97c0020c791c131d569b2c8b2e4002e0020c774b807ac8c0020c791c131b41c00200050004400460020bb38c11cb2940020004100630072006f0062006100740020bc0f002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020c774c0c1c5d0c11c0020c5f40020c2180020c788c2b5b2c8b2e4002e> /LTH <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> /LVI <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> /NLD (Gebruik deze instellingen om Adobe PDF-documenten te maken die zijn geoptimaliseerd voor prepress-afdrukken van hoge kwaliteit. De gemaakte PDF-documenten kunnen worden geopend met Acrobat en Adobe Reader 5.0 en hoger.) /NOR <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> /POL <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> /PTB <FEFF005500740069006c0069007a006500200065007300730061007300200063006f006e00660069006700750072006100e700f50065007300200064006500200066006f0072006d00610020006100200063007200690061007200200064006f00630075006d0065006e0074006f0073002000410064006f0062006500200050004400460020006d00610069007300200061006400650071007500610064006f00730020007000610072006100200070007200e9002d0069006d0070007200650073007300f50065007300200064006500200061006c007400610020007100750061006c00690064006100640065002e0020004f007300200064006f00630075006d0065006e0074006f00730020005000440046002000630072006900610064006f007300200070006f00640065006d0020007300650072002000610062006500720074006f007300200063006f006d0020006f0020004100630072006f006200610074002000650020006f002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e0030002000650020007600650072007300f50065007300200070006f00730074006500720069006f007200650073002e> /RUM <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> /RUS <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> /SKY <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> /SLV <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> /SUO <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> /SVE <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> /TUR <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> /ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents best suited for high-quality prepress printing. Created PDF documents can be opened with Acrobat and Adobe Reader 5.0 and later.) /UKR <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> >> /Namespace [ (Adobe) (Common) (1.0) ] /OtherNamespaces [ << /AsReaderSpreads false /CropImagesToFrames true /ErrorControl /WarnAndContinue /FlattenerIgnoreSpreadOverrides false /IncludeGuidesGrids false /IncludeNonPrinting false /IncludeSlug false /Namespace [ (Adobe) (InDesign) (4.0) ] /OmitPlacedBitmaps false /OmitPlacedEPS false /OmitPlacedPDF false /SimulateOverprint /Legacy >> << /AddBleedMarks false /AddColorBars false /AddCropMarks false /AddPageInfo false /AddRegMarks false /ConvertColors /ConvertToCMYK /DestinationProfileName () /DestinationProfileSelector /DocumentCMYK /Downsample16BitImages true /FlattenerPreset << /PresetSelector /MediumResolution >> /FormElements false /GenerateStructure false /IncludeBookmarks false /IncludeHyperlinks false /IncludeInteractive false /IncludeLayers false /IncludeProfiles false /MultimediaHandling /UseObjectSettings /Namespace [ (Adobe) (CreativeSuite) (2.0) ] /PDFXOutputIntentProfileSelector /DocumentCMYK /PreserveEditing true /UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged /UntaggedRGBHandling /UseDocumentProfile /UseDocumentBleed false >> ] >> setdistillerparams << /HWResolution [2400 2400] /PageSize [612.000 792.000] >> setpagedevice

Створення продуцентів та розробка технології отримання препаратів флавінмононуклеотиду на основі дріжджів Candida famata

Репозитарії

Схожі ресурси