Применение метода ДНК-комет для оценки повреждения ДНК, вызваных различными агентами окружающей среды
Длительное воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды сопровождается накоплением повреждений ДНК и изменением активности системы репарации, что может привести к возникновению мутаций и злокачественной трансформации клетки. В последние годы было разработано много методов, позволяющих регис...
Saved in:
| Date: | 2008 |
|---|---|
| Main Authors: | , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Iнститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького
2008
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/11933 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Применение метода ДНК-комет для оценки повреждения ДНК, вызваных различными агентами окружающей среды / У.Б. Сорочинская, В.М. Михайленко // Онкологія. — 2008. — 10, N 3. — С. 303-309. — Бібліогр.: 78 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859916946057723904 |
|---|---|
| author | Сорочинская, У.Б. Михайленко, В.М. |
| author_facet | Сорочинская, У.Б. Михайленко, В.М. |
| citation_txt | Применение метода ДНК-комет для оценки повреждения ДНК, вызваных различными агентами окружающей среды / У.Б. Сорочинская, В.М. Михайленко // Онкологія. — 2008. — 10, N 3. — С. 303-309. — Бібліогр.: 78 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| description | Длительное воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды сопровождается накоплением повреждений ДНК и изменением активности системы репарации, что может привести к возникновению мутаций и злокачественной трансформации клетки. В последние годы было разработано много методов, позволяющих регистрировать повреждения ДНК, а также исследовать процессы репарации. Однако не все они обладают достаточной чувствительностью и специфичностью, необходимой для мониторинга широкого спектра повреждений ДНК, вызванных факторами окружающей среды. Цель обзора состоит в оценке эффективности метода гельэлектрофореза лизированных единичных клеток (метод ДНК-комет) для детекции повреждений ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды. Метод обладает чувствительностью, необходимой для регистрации повреждений и репарации ДНК на уровне отдельной клетки, и может быть применен для оценки интегральной целостности генома.
The extended exposure to adverse
environmental factors is accompanied by DNA
damage increase and alters the repair system activity
that can lead to initiation of mutations and malignant
transformation in cells. During the last years, many
analytical techniques have been developed to estimate
DNA damage and investigate processes of DNA repair.
However, not all of them possess sufficient sensitivity
and specificity for monitoring variety of DNA damages
caused by environmental factors. The aim of this
review consists in efficiency evaluation of a Single
Cells Gel Electrophoresis assay («Comet Assay») for
DNA damages detection after exposure to different
environmental agents. The assay possesses sensitivity
necessary for registration of DNA damage and repair
occurring on a single cell level and may be used for
assessment of genome integrity.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:06:01Z |
| format | Article |
| fulltext |
Обз Ор
303О Н К О Л О Г И Я • Т. 1 0 • № 3 • 2 0 0 8
Геном живых организмов подвергается постоян-
ной атаке различных физических (ультрафиолетовая
и ионизирующая радиация) и химических (геноток-
сические и канцерогенные вещества) факторов как
окружающей среды, так и продуктов собственного
метаболизма (свободные радикалы), которые могут
повреждать ДНК клеток. Не будучи репарированны-
ми, повреждения ДНК могут инициировать каскад
биологических реакций на клеточном, органном,
организменном и популяционном уровне. Повы-
шение уровня загрязнения окружающей среды ге-
нотоксическими веществами, равно как и использо-
вание ДНК-повреждающих агентов в химиотерапии
приводит к накоплению повреждений ДНК, угнете-
нию систем репарации, что в свою очередь приводит
к возникновению мутаций и онкогенезу.
Образование повреждений ДНК является важ-
ным инициирующим событием в канцерогенезе.
В течение последних 20 лет, было разработано мно-
го методов для мониторинга повреждений ДНК,
обусловленных физическими и химическими фак-
торами, среди которых высокоэффективная жид-
костная хроматография, газовая хроматография,
масс-спектрометрия, капиллярный электрофорез,
ряд молекулярно биологических и иммунологиче-
ских методов, позволяющих изучать процессы ре-
парации ДНК [1].
Цель обзора состоит в том, чтобы оценить эф-
фективность метода ДНК-комет для детекции по-
вреждений ДНК, вызванных различными агента-
ми окружающей среды, в том числе при длительном
воздействии на организм повреждающих факторов
в низких дозах.
Метод ДНК-комет («DNA-comet assay»), впер-
вые описанный Ostling и Johansson в 1984 г. [2], яв-
ляется быстрым и весьма чувствительным методом
регистрации повреждений ДНК и изучения репа-
рации ДНК на уровне одиночных клеток. Усовер-
шенствования и модификации метода ДНК-комет
позволили значительно повысить его чувствитель-
ность и расширить сферу применения, однако прак-
тически не затронули основные принципы, поло-
женные в его основу [3].
Метод ДНК-комет применим в системах in vivo
и in vitro. В настоящее время метод широко исполь-
зуется в исследованиях генотоксичности фармацев-
тических препаратов [4] и промышленных химиче-
ских веществ [5], репарации ДНК [6], апоптоза [7–9],
клинических исследованиях по пренатальной диа-
гностике [10], предрасположенности к онкологиче-
ским заболеваниям, терапии при раке [11–13], ката-
ракте [14]. Метод ДНК-комет постепенно становится
неотъемлемой частью программ по биомониторин-
гу — оценке влияния пищевого рациона [15], фак-
торов внешней среды [16], изменений метаболизма
и физиологического состояния [17], старения орга-
низма [16, 18] на накопление и репарацию поврежде-
ний ДНК; по изучению механизмов радиопротектор-
ных воздействий [19, 20], формирования радиоадап-
тивного ответа [21, 22]; исследований по экологии
[23–26]. Использование метода ДНК-комет позво-
ляет учитывать гетерогенность сложных популяций,
изучать выход повреждений ДНК и репарацию прак-
тически в любых эукариотических клетках [27–29].
При этом для анализа необходимо всего несколько
тысяч клеток исследуемого образца.
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА
ДНК-КОМЕТ ДЛЯ ОЦЕНКИ
ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК, ВЫЗВАННЫХ
РАЗЛИЧНЫМИ АГЕНТАМИ
ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
Резюме. Длительное воздействие неблагоприятных факторов окружающей
среды сопровождается накоплением повреждений ДНК и изменением ак-
тивности системы репарации, что может привести к возникновению му-
таций и злокачественной трансформации клетки. В последние годы было
разработано много методов, позволяющих регистрировать повреждения
ДНК, а также исследовать процессы репарации. Однако не все они облада-
ют достаточной чувствительностью и специфичностью, необходимой для
мониторинга широкого спектра повреждений ДНК, вызванных факторами
окружающей среды. Цель обзора состоит в оценке эффективности метода
гель электрофореза лизированных единичных клеток (метод ДНК-комет) для
детекции повреждений ДНК, вызванных различными агентами окружающей
среды. Метод обладает чувствительностью, необходимой для регистрации
повреждений и репарации ДНК на уровне отдельной клетки, и может быть
применен для оценки интегральной целостности генома.
У.Б. Сорочинская
В.М. Михайленко
Институт экспериментальной
патологии, онкологии
и радиобиологии
им. Р.Е. Кавецкого
НАН Украины, Киев, Украина
Ключевые слова: повреждение
ДНК, репарация ДНК, метод
ДНК-комет, канцерогенные
факторы окружающей среды.
Обз Ор
304 О Н К О Л О Г И Я • Т. 1 0 • № 3 • 2 0 0 8
Основные процедуры метода ДНК-комет, опи-
санные в первоначальном варианте метода [2], за-
ключались в иммобилизации облученных клеток
в низкоплавкой агарозе, нанесенной на предмет-
ное стекло для микроскопии. Обработка образцов
в буфере с высоким содержанием соли приводила
к лизису клеточных мембран и экстракции белков.
Молекулы ДНК разделяли электрофорезом, тре-
ки ДНК визуализировали посредством окрашива-
ния флуоресцентным красителем, после чего об-
разцы изучали микроскопически. При наличии
разрывов ДНК нарушается структурная организа-
ция хроматина и утрачивается сверхспирализация
ДНК, что приводит к релаксации этой биомакро-
молекулы, формируются фрагменты ДНК, не свя-
занные с клеткой. В электрическом поле релаксиро-
ванные петли и фрагменты ДНК вытягиваются по
направлению к аноду, что и придает наблюдаемым
объектам вид «комет» (отсюда и произошло назва-
ние «comet assay», ставшее общеупотребительным).
Количество ДНК, мигрировавшей по направлению
к аноду и определяемое микрофотометром, может
использоваться в качестве показателя, характери-
зующего уровень повреждений ДНК в изучаемых
клетках. «Кометы» анализируют либо путем визу-
ального наблюдения и дифференциации «комет»
по степени поврежденности ДНК, либо с использо-
ванием компьютерных программных средств обра-
ботки изображений. Последний метод анализа «ко-
мет» особенно необходим для объективной оценки
влияния небольшой концентрации повреждающего
агента, или для выявления незначительных разли-
чий между субпопуляциями клеток [6, 7, 9].
В 1988 г. был описан новый вариант метода ДНК-
комет, предполагающий проведение после лизиса
клеток контролируемой денатурации ДНК и элек-
трофорез в щелочной среде, что позволило детек-
тировать однонитевые разрывы ДНК и щелочела-
бильные сайты (разрывы ДНК в них образуются в
щелочных условиях), а также повысить чувствитель-
ность метода и воспроизводимость результатов [30].
Щелочная обработка препаратов лизированных кле-
ток вызывает расплетение дуплекса ДНК и позво-
ляет отдельным нитям независимо мигрировать в
электрическом поле.
Стандартизация метода ДНК-комет. В настоящее
время большинство лабораторий, внедривших дан-
ный методический подход в исследования, разрабо-
тали многочисленные вариации протокола, в част-
ности продолжительности и условий лизиса клеток,
денатурации, электрофореза и окрашивания ДНК.
Подсчитывают 100–500 клеток на одном стекле в
двух повторах. Результаты эксперимента являют-
ся достоверными при повторении не менее 6 раз.
Анализ «ДНК-комет» может проводиться визуально
или с помощью программно-аппаратного комплек-
са. При визуальном анализе «ДНК-кометы» ранжи-
руются на пять условных типов с соответствующим
числовым значением от 0 до 4.
Степень поврежденности ДНК при этом выра-
жается как индекс «ДНК-комет» (ИДК), определяе-
мый по формуле:
ИДК = (0n0 + 1n1 + 2n2 + 3n3 + 4n4) / Σ,
где n0-n4 — число «ДНК-комет» каждого типа,
Σ — сумма подсчитанных «ДНК-комет» [31].
Программно-аппаратный комплекс включает со-
вмещенную с микроскопом высокочувствительную
камеру и специализированное программное обеспе-
чение, что позволяет проводить цифровую регистра-
цию и обработку параметров «ДНК-комет», харак-
теризующих целостность структуры ДНК — длину
«кометы», длину «хвоста», диаметр «головы», про-
центное содержание ДНК в «голове или хвосте». На
сегодня разработано около десятка программ для
анализа «ДНК-комет», несколько из которых нахо-
дятся в свободном доступе. В зависимости от имею-
щегося программного обеспечения анализ параме-
тров «ДНК-комет» проводится в режиме «реального
времени» либо с сохраненных цифровых изображе-
ний. В качестве показателя поврежденности ДНК,
чаще всего используют длину «хвоста», %ДНК в
«хвосте» или их произведение — так называемый
момент «хвоста» [32–34].
Для калибровки метода ДНК-комет использова-
ли облучение от инкорпорированного 125I, при этом
предполагали, что один распад 125I приводит к фор-
мированию одного двунитевого разрыва ДНК [35].
Данные экспериментов свидетельствуют о том, что
в результате рентгеновского облучения в дозе 1 Гр в
диплоидных клетках фибробластов китайского хо-
мячка формируется 23 двунитевых разрыва ДНК,
что хорошо согласуется с данными, полученными
методом импульсного гель-электрофореза [36].
Детекция однонитевых и двунитевых разрывов
ДНК. Использование щелочного варианта метода
ДНК-комет позволяет оценивать, главным образом
выход однонитевых разрывов и щелочелабильных
сайтов, так как при использовании данного прото-
кола двунитевые разрывы составляют менее 5% об-
щего выхода повреждений ДНК [37].
Методом ДНК-комет, проводимым в нейтраль-
ных условиях среды, детектируют преимуществен-
но двунитевые разрывы ДНК [38].
Метод ДНК-комет используется для биомони-
торинга генотоксических факторов окружающей
среды. С помощью этого метода показано, что по
прошествии 20 лет аварии на Чернобыльской АЭС
степень поврежденности ДНК лейкоцитов детей,
проживающих в Белоруссии на загрязненных ра-
дионуклидами территориях, достоверно превыша-
ет контрольные значения, причем наблюдается пря-
мая корреляция выхода повреждений ДНК и дозы
радиоактивного загрязнения [39].
Оценка методом ДНК-комет генотоксичности
ионизирующего излучения проводилась и на рас-
тительных объектах — бобах [40], табаке [41], семе-
нах 5 видов растений. Показана пригодность мето-
да для выявления продуктов питания, подвергших-
Обз Ор
305О Н К О Л О Г И Я • Т. 1 0 • № 3 • 2 0 0 8
ся радиа ционной стерилизации, когда повреждения
ДНК регистрировались при дозах облучения сухих
семян в 25 Гр и выше [42]. Наблюдалась прямая за-
висимость «момента хвоста кометы» от дозы и вре-
мени облучения. Процессы репарации ДНК эли-
минировали все радиационно-индуцированные по-
вреждения, детектируемые методом ДНК-комет,
в течение 24 ч от момента облучения [43]. Следует
также отметить, что значительная часть поврежде-
ний ДНК, формируемых алкилирующими соедине-
ниями, такими как нитрозомочевина, остаются не-
репарированными, по крайней мере в течение 1 мес
после обработки растений мутагенами [41].
Детекция апоптотических клеток. Известно, что
в клетках, гибнущих по механизму апоптоза, ДНК,
как правило, претерпевает межнуклеосомную де-
градацию, являющуюся характерным маркером
процесса. Апоптотические клетки имеют вид сла-
бо флуоресцирующих «ДНК-комет» с широким
диффузным «хвостом» и практически отсутствую-
щей «головой». Использование метода ДНК-комет
для регистрации апоптотических клеток в популя-
циях особенно актуально в случае, когда доступ-
ным является только небольшое количество образ-
ца. С помощью метода ДНК-комет удается полу-
чать информацию не только о содержании ДНК в
апоптотических клетках, но и о размерах фрагмен-
тов ДНК, вышедших из клетки при действии элек-
трического поля.
В ряде работ было показано, что использова-
ние метода ДНК-комет оказывается полезным для
разделения субпопуляций апоптотических клеток
и клеток на ранних стадиях некроза. При некрозе
нарушение целостности клеточных мембран пред-
шествует деградации ДНК, а при апоптозе деграда-
ция ДНК развивается раньше процесса разрушения
клеточной мембраны. Поэтому метод ДНК-комет не
менее информативен, чем другие методы, основан-
ные на оценке степени деградации ДНК, такие как
электрофоретическое выявление «лестницы» ДНК-
фрагментов и проточная цитометрия [7–9, 37, 44].
Детекция повреждений оснований ДНК и сшивок
ДНК-ДНК. Межнитевые сшивки ДНК-ДНК, фор-
мируемые многими терапевтическими средствами,
также регистрируются методом ДНК-комет, прово-
димом в щелочных условиях [45–47]. Поперечные
сшивки препятствуют расхождению нитей ДНК при
щелочной денатурации, поэтому с увеличением чис-
ла таких сшивок количество ДНК, способной сво-
бодно мигрировать в электрическом поле, уменьша-
ется. Значительное количество повреждений ДНК
в клетках приводит к формированию фрагментов
ДНК, диффундирующих из геля во время лизиса и
электрофореза, а фрагменты ДНК с размерами ме-
нее 50 тыс. пар нуклеотидов могут быть трудно ви-
зуализируемы. Поэтому регистрация методом ДНК-
комет незначительного количества сшивок на фоне
значительного количества разрывов ДНК представ-
ляется затруднительной.
Регистрация субпопуляций гипоксических клеток в
опухолях методом ДНК-комет. Известно, что клетки
опухолей в состоянии гипоксии по крайней мере в
3 раза более резистентны к образованию разрывов
ДНК по сравнению с клетками, хорошо снабжаю-
щимися кислородом. Показано, что по количеству
индуцированных облучением разрывов ДНК и сши-
вок ДНК белком можно судить о процентном соот-
ношении гипоксических клеток в исследуемых опу-
холях [48]. В случаях, когда опухолевые клетки бы-
стро восстанавливаются после облучения в дозах
4 Гр и более, метод ДНК-комет может быть исполь-
зован для идентификации гипоксических популя-
ций клеток. Такое применение метода становится
возможным благодаря тому, что кислород являет-
ся одним из определяющих эндогенных факторов,
значительно модифицирующим выход одноните-
вых разрывов в ДНК [49, 50].
Метод ДНК-комет может быть полезен для оцен-
ки эффективности терапевтических воздействий,
направленных на повышение уровня снабжения
опухолевых клеток кислородом, или на избиратель-
ное поражение гипоксических клеток [50]. В частно-
сти, зафиксирован отчетливый генотоксический эф-
фект тирапазамина и RSU-1069, избирательно по-
вреждающих гипоксические клетки, при этом было
установлено, что цитотоксическое действие тира-
пазамина опосредуется индукцией большого коли-
чества однонитевых разрывов ДНК, в то время как
RSU-1069 вызывает в гипоксических клетках нако-
пление сшивок ДНК-ДНК [50].
Применение метода ДНК-комет в изучении ме-
ханизмов биологического действия ультрафиолето-
вого, ультразвукового излучения и высокочастот-
ного электромагнитного поля. Было показано, что
ультразвуковое воздействие приводит к формиро-
ванию разрывов ДНК, которые частично репари-
руются [51–53]. Методом ДНК-комет, проводимого
в щелочных условиях, было показано, что электро-
магнитные колебания (2,4 ГГц) индуцируют обра-
зование однонитевых разрывов ДНК в клетках го-
ловного мозга крыс [54, 55].
К настоящему времени выполнено много экс-
периментальных работ по изучению методом ко-
мет повреждений ДНК, индуцируемых ультрафи-
олетовым излучением [56]. Метод ДНК-комет по-
зволяет зарегистрировать однонитевые разрывы
ДНК, формируемые на эксцизионном этапе репа-
рации ДНК после УФ-облучения клеток, что мо-
жет найти применение в идентификации клеточ-
ных линий, дефектных по репарации ДНК. В част-
ности, клетки больных пигментной ксеродермой
дефектны по генам эксцизионной репарации ДНК,
по этому показатель «момент хвоста кометы» после
УФ-облучения клеток больных меньше, чем у нор-
мальных индивидуумов.
Следует отметить, что различные классы хи-
мических веществ могут стимулировать фототок-
сический эффект, поглощая световую энергию в
Обз Ор
306 О Н К О Л О Г И Я • Т. 1 0 • № 3 • 2 0 0 8
пределах диапазона длины волн солнечного све-
та. Исследование фотобезопасности — обязатель-
ный этап при создании новых препаратов. Десять
УФ-поглощающих соединений (кетопрофен, про-
мазин, хлорпромазин, дакарбазин, акридин, ломеф-
локсацин, 8-метоксипсорален, хлоргексидин, дву-
окись титана, октилметоксициннамат) были про-
верены на потенциальную фотогенотоксичность
в щелочном варианте метода ДНК-комет [56, 57].
Клетки лимфомы мыши культивировали с исследу-
емыми веществами в течении 20 мин и воздейство-
вали светом, имитирующим солнечный, в диапазо-
не от 280 до 800 нм. Доза УФ-излучения составля-
ла для УФ-А 600 мДж/cм2 и для УФ-Б 30 мДж/cм2.
При сочетанном действии УФ и веществ, фотоге-
нотоксичность которых известна (8-метоксипсо-
рален, акридин, хлорпромазин, дакарбазин, кето-
профен, ломефлоксацин), образовывались разры-
вы ДНК, выявляемые методом ДНК-комет. Кроме
того, были про анализированы четыре химических
вещества, абсорбирующих УФ, которые, как извест-
но, не являются фотогенотоксичными (промазин,
хлоргексидин, двуокись титана, октилметоксицин-
намат). Ни для одного из них не выявлено увеличе-
ния уровня повреждений ДНК. Приведенные дан-
ные свидетельствуют о том, что метод ДНК-комет
является надежной моделью для оценки фотохими-
ческой генотоксичности in vitro [58, 59].
Использование эндонуклеаз, формирующих од-
нонитевые разрывы ДНК возле пиримидиновых ди-
меров, позволяет значительно повысить чувстви-
тельность метода ДНК-комет для детекции по-
вреждений ДНК, индуцированных УФ-облучением.
В частности, зарегистрировано более чем двукратное
возрастание выхода повреждений ДНК после 12-ча-
совой экспозиции одноклеточных Rhodomonas sp.
к УФ-излучению А и Б [56, 60].
Метод ДНК-комет может использоваться для
пренатальной диагностики пигментной ксеродер-
мы и трихотиодистрофии [10]. Этот метод может
быть полезен при детекции генетических наруше-
ний репарации ДНК после облучения в лимфоци-
тах больных системным эритематозом и ревмато-
идным артритом.
Применение метода ДНК-комет в изучении гено-
токсического действия химических веществ.
Ежегодно в мире синтезируется или выделяет-
ся около 6 тыс. новых соединений [26, 56]. Среди
12 миллиардов известных веществ, 2,5 млн явля-
ются канцерогенными [61–63]. Вещества, которые
могут вызывать повреждения ДНК, принадлежат
к разным классам неорганических и органических
соединений. Наиболее активны и распространены
в окружающей среде: полициклические ароматиче-
ские углеводы, гетероциклические ароматические
углеводы, ароматические амины и амиды, амино-
азосоединения, N-нитросоединения, металлы и их
соединения (соединения никеля, хрома, бериллия,
железа) [61, 64–67].
Возможности метода ДНК-комет, его преимуще-
ства и недостатки наиболее наглядно продемонстри-
рованы в работе по исследованию генотоксичности
208 химических соединений, выбранных из различ-
ных групп канцерогенных веществ по классифика-
ции Международного агентства по исследованию
рака (МАИР) и Национальной токсикологической
программы США [61, 68]. Тестирование проводи-
лось на мышах (в 8 органах) и продемонстрировало
преимущества этого метода, в первую очередь свя-
занные с возможностью определять повреждения
ДНК в любом органе, независимо от степени мито-
тической активности в нем. Результаты тестирова-
ния показали, что метод обладает наибольшей эф-
фективностью при определении фрагментации мо-
лекул ДНК как вследствие однонитевых разрывов
индуцированных химическими веществами, так и
образующихся из щелочелабильных сайтов возни-
кающих при алкилировании оснований и образова-
нии аддуктов ДНК. Сравнение метода ДНК-комет с
тестом Эймса, который является общепризнанным
методом для скрининга генотоксичных веществ,
выявило высокую степень корреляции результа-
тов полученных при тестировании канцерогенных
и неканцерогенных соединений. При исследова-
нии канцерогенных веществ, которые в тесте Эйм-
са дали отрицательный результат, половина из них
оказалась генотоксичными при тестировании мето-
дом ДНК-комет. Последнее указывает на ограниче-
ния обоих методов, лишний раз свидетельствуя о
том, что методы которые рассчитаны на выявление
повреждений ДНК, мало подходят для идентифи-
кации негенотоксичных канцерогенов. Очевидно,
что не существует одного метода способного выяв-
лять все генотоксические воздействия. Поэтому об-
щепринятым является использование набора тестов
in vivo и in vitro. Сравнение метода ДНК-комет с дру-
гим традиционным тестом — образованием микро-
ядер показало, что 49 из 54 тестированных канце-
рогенов не индуцировали образование микроядер,
но давали позитивный ответ в методе ДНК-комет.
Таким образом, метод ДНК-комет может быть ис-
пользован для оценки in vivo генотоксичности хи-
мических соединений [4, 26, 55, 63, 68].
Важным аспектом в исследованиях генотоксич-
ности и канцерогенности химических соединений
является их причастность к формированию ради-
кальных форм кислорода и азота, которые могут
инициировать канцерогенез благодаря своей спо-
собности реагировать с ДНК, вызывая мутации
[69–71]. Так, в ряде экспериментов показано, что
оксид азота (NO) и его производные могут содей-
ствовать процессу канцерогенеза. Генотоксичность
NO определяется как его концентрацией, так и ме-
ханизмами попадания в организм. NO и его реак-
тивный радикал пероксинитрит (ONOO-) индуци-
руют однонитевые разрывы ДНК, вызывают как
процессы репарации ДНК, так и гибели, путем не-
кроза или апоптоза. Кроме того, ускорение апопто-
Обз Ор
307О Н К О Л О Г И Я • Т. 1 0 • № 3 • 2 0 0 8
за в клетках является прямым ответом на проник-
новение NO. Это обстоятельство надо принимать
во внимание при разработке химиотерапевтических
препаратов, в составе которых содержатся NO и его
радикалы [1, 72–74]. Метод ДНК-комет позволяет
определять мутагенное действие экзогенного NO.
Количество повреждений ДНК росло пропорцио-
нально увеличению концентрации NO, как в нор-
мальных клетках, так и в клетках аденокарценомы
легкого [75]. Такие исследования подтверждают, что
метод ДНК-комет является надежным методом для
оценки генотоксичности химиопрепаратов in vitro
[4, 27, 75, 76].
Заключение. Основное преимущество метода
ДНК-комет перед другими методами регистрации
повреждений ДНК заключается в возможности де-
текции повреждений на уровне одиночных клеток
эукариот практически любого происхождения. Ре-
зультаты многих исследователей позволяют сде-
лать заключение, о том, что метод ДНК-комет в за-
висимости от тестируемого генотоксичного аген-
та [24, 26, 55, 56] по крайней мере сопоставим по
чувствительности с традиционными цитогенети-
ческими тестами и в некоторых случаях превосхо-
дит их [1, 23, 41, 68, 75–78]. Поскольку для анали-
за образца методом ДНК-комет необходимо нали-
чие всего нескольких тысяч клеток, то в случаях,
когда количество клеток является лимитирующим
фактором (биоптаты и т. п.), рассмотренный метод
может быть оптимальным для детекции поврежде-
ний ДНК. Привлекает быстрота проведения экспе-
риментов и относительная простота лабораторного
протокола. Однако, к сожалению, метод имеет ряд
недостатков. В некоторых случаях возникает опре-
деленная неясность относительно биологического
значения повреждений ДНК, выявляемых методом
ДНК-комет. Известно, что значительная часть таких
повреждений может быть элиминирована система-
ми репарации ДНК и не зафиксирована в геноме.
Несмотря на эти обстоятельства, метод ДНК-комет
дает адекватную информацию об общем уровне по-
вреждений ДНК клеток, а при исследовании через
определенные временные интервалы и об эффек-
тивности процессов репарации.
Метод может успешно применяться при иссле-
довании динамики действия генотоксических аген-
тов окружающей среды, когда низкие дозы сочета-
ются с большой длительностью воздействия фак-
тора. Кроме этого, он может быть использован для
определения групп повышенного риска на произ-
водстве, а также при контроле результатов лечения
и индивидуального подбора ДНК-тропных лекар-
ственных препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Методические рекомендации по исследованию кан-
церогенных свойств фармакологических и лекарственных
средств. Ведомости Фармакологического комитета 1998; 1:
21–4.
2. Ostling O, Johanson KJ. Microelectrophoretic study of
radiation-induced DNA damage in individual mammalian cells.
Biochem Biophys Res Commun 1984; 123: 291–8.
3. Olive PL, Banáth JP. The comet assay: a method to measure
DNA damage in individual cells. Nat Protoc 2006; 1 (1): 23–9.
4. Tice RR, Agurell E, Anderson D, Burlinson B. Single cell gel/
Comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology
testing. Environ Mol Mutagen 2000; 35: 206–21.
5. Жанатаев АК, Дурнев АД, Оганесянц ЛА. Метод гель-
электрофореза изолированных клеток (метод «ДНК-комет»)
в пищевой генотоксикологии. Хранение и переработка сель-
хозсырья 2007; 1: 15–20.
6. Collins AR. The comet assay for DNA damage and repair:
principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol 2004;
26 (3): 249–61.
7. Omidkhoda A, Mozdarani H, Movasaghpoor A, Fatholah AA.
Study of apoptosis in labeled mesenchymal stem cells with
superparamagnetic iron oxide using neutral comet assay. Toxicol
In Vitro. 2007; 21 (6): 1191–6.
8. Thiebault C, Carrière M, Milgram S, Simon A, et al. Uranium
Induces Apoptosis and Is Genotoxic to Normal Rat Kidney (NRK-
52E) Proximal Cells Toxicol Sci 2007; 98 (2): 479–87.
9. Singh NP. A Simple Method for Accurate Estimation of
Apoptotic Cells. Experimental Cell Research 2000; 256: 328–
37.
10. Alapetite C. The comet assay as a repair test for prenatal
diagnosis of Xeroderma pigmentosum and trichothiodystrophy.
J Invest Dermat 1997; 108: 154–9.
11. Tronov VA, Kramarenko II, Kozlova AD, et al. Sensitivity of
human lymphocytes to genotoxic effect of n-methyl-n-nitrosourea:
possible relation to gynecological cancers. Exp Oncol 2006; 28 (4):
314–8.
12. Anuszewska E, Chłopkiewicz B, Gruber B, et al. Estimation
of DNA damage and cytotoxicity of anthracycline analogs in
human melanoma cells on early and late passages. Acta Pol Pharm
2006; 63 (4): 321–4.
13. Kopjar N, Milas I, Garaj-Vrhovac V, Gamulin M. Alkaline
comet assay study with breast cancer patients: evaluation of baseline
and chemotherapy-induced DNA damage in non-target cells. Clin
Exp Med 2006; 6 (4): 177–90.
14. Kleiman NJ, Spector A. DNA single strand breaks in human
lens epithelial cells from patients with cataract. Current Eye Res
1993; 12: 423–31.
15. Hwang ES, Bowen PE. DNA damage, a biomarker of
carcinogenesis: its measurement and modulation by diet and
environment. Crit Rev Food Sci Nutr 2007; 47 (1): 27–50.
16. Sauvaigo S, Bonnet-Duquennoy M, Odin F, et al. DNA
repair capacities of cutaneous fibroblasts: effect of sun exposure,
age and smoking on response to an acute oxidative stress. Br J
Dermatol 2007; 157 (1): 26–32.
17. Hartman A, Plappert U, Raddatz K, et al. Does physical
activity induce DNA damage? Mutagenesis 1994; 9: 269–72.
18. Singh NP, Danner DB, Tice RR, et al. Basal DNA damage
in individual human lymphocytes with age. Mutat Res 1991; 256:
1–6.
19. Vukovic V, Pheng SR, Stewart A, et al. Protection from
radiation-induced DNA single strand breaks by induction of
nuclear metallothionein. Int J Radiat Biol 2000; 76: 757–62.
20. Wardman P, Rothkamm K, Folkes LK, et al .
Radiosensitization by nitric oxide at low radiation doses. Radiat
Res 2007; 167 (4): 475–84.
21. Gajendiran N, Tanaka K, Kumaravel TS, Kamada N.
Neutron-induced adaptive response studied in go human
lymphocytes using the comet assay. J Radiat Res 2001; 42: 91–
101.
22. Wada S, Van Khoa T, Kobayashi Y, et al. Prediction of
cellular radiosensitivity from DNA damage induced by gamma-
rays and carbon ion irradiation in canine tumor cells. J Vet Med
Sci 2005; 67 (11): 1089–95.
Обз Ор
308 О Н К О Л О Г И Я • Т. 1 0 • № 3 • 2 0 0 8
23. Wirzinger G, Weltje L, Gercken J, Sordyl H. Genotoxic
damage in field-collected three-spined sticklebacks (Gasterosteus
aculeatus L.): a suitable biomonitoring tool? Mutat Res 2007; 628
(1): 19–30.
24. Møller P. Genotoxicity of environmental agents assessed
by the alkaline comet assay. Basic Clin Pharmacol Toxicol 2005;
96 (1): 1–2.
25. Hartl MG, Kilemade M, Sheehan D, et al. Hepatic
biomarkers of sediment-associated pollution in juvenile turbot,
Scophthalmus maximus L. Mar Environ Res 2007; 64 (2): 191–
208.
26. Wogan GN, Hecht SS, Felton JS, et al. Environmental
and chemical carcinogenesis. Semin Cancer Biol 2004; 14 (6):
473–86.
27. Green MH, Lowe JE, Delaney CA, Green IC. Comet assay
to detect nitric oxide-dependent DNA damage in mammalian cells.
Methods Enzymol 1996; 269: 243–66.
28. Desai SR, Verlecar XN, Nagarajappa A, Goswami U.
Genotoxicity of cadmium in marine diatom Chaetoceros
tenuissimus using the alkaline Comet assay. Ecotoxicology 2006;
15 (4): 359–63.
29. Palus J, Dziubałtowska E, Stańczyk M, et al. Biomonitoring
of cyanobacterial blooms in polish water reservoir and the
cytotoxicity and genotoxicity of selected cyanobacterial extracts.
Int J Occup Med Environ Health 2007; 20 (1): 48–65.
30. Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple
technique for quantitation of low levels of DNA damage in
individual cells. Exp Cell Res 1988; 175: 184–91.
31. Struwe M, Greulich KO, Suter W, Plappert-Helbig U. The
photo comet assay-A fast screening assay for the determination of
photogenotoxicity in vitro. Mutat Res 2007; 632 (1–2): 44–57.
32. Chaubey RC. Computerized image analysis software for the
comet assay. Methods Mol Biol 2005; 291: 97–106.
33. Francesconi A, Del Terra E, Meli A, Ambesi-Impiombato FS.
Standardization of the comet assay technique on FRTL5 cells. Phys
Med 2001; 17 (1): 232–4.
34. Статистическая обработка данных тестирования на
мутагенность. Методические указания. Вильнюс, 1989. 35 с
35. Olive PL, Banath JP. Induction and rejoining of radiation
induced DNA single-strand breaks: «tail moment» as a function
of position in the cell cycle. Mutat Res (DNA Repair) 1993; 294:
275–83.
36. Iliakis G. Measurement of DNA double-strand breaks in
CHO cells at various stages of the cell cycle using pulsed field gel
electrophoresis: calibration by means of 125I decay. Int J Radiat
Biol 1991; 59: 343–57.
37. Olive PL. DNA damage and repair in individual cells:
applications of the comet assay in radiobiology. Int J Radiat Biol
1999; 75: 395–405.
38. Xie H, Wise SS, Holmes AL, et al. Carcinogenic lead
chromate induces DNA double-strand breaks in human lung cells.
Mutat Res 2005; 586 (2): 160–72.
39. Frenzilli G, Bosco E, Antonelli A, et al. DNA damage
evaluated by alkaline single cell gel electrophoresis (SCGE) in
children of Chernobyl, 20 years after the disaster. Mutat Res 2006;
491: 139–49.
40. Koppen G, Varschaeve V. The alkaline comet test on plant
cells: a new genotoxicity test for DNA strand breaks in Vicia faba
root cells. Mutat Res 1996; 360: 193–200.
41. Gichner T, Ptácek O, Stavreva DA, et al. A comparison
of DNA repair using the comet assay in tobacco seedlings after
exposure to alkylating agents or ionizing radiation. Mut Res 2000;
470: 1–9.
42. Cerda H, Delincée H, Haine H, Rupp H. The DNA «comet
assay» as a rapid screening technique to control irradiated food.
Mut Res 1997; 375: 167–81.
43. Li BY, Tong J. Adverse effects attributed to long-term
radon inhalation in rats. J Toxicol Environ Health A 2007; 70
(11): 925–30.
44. Тронов ВА. Апоптоз нестимулированных лимфоцитов
человека и разрывы ДНК, индуцированные ингибитором то-
поизомеразы II этопозидом. Биохимия 1999; 64 (3): 412–20.
45. Hohannisyan GG, Haroutunyan TS, Arutyunyan RM.
Evaluation of cisplatin-DNA crosslinks formation with UV-C
application by the alkaline comet-assay. Exp Oncol 2004; 26 (3):
240–2.
46. Almeida GM, Duarte TL, Steward WP, Jones GD.
Detection of oxaliplatin-induced DNA crosslinks in vitro and in
cancer patients using the alkaline comet assay. DNA Repair (Amst)
2006; 5 (2): 219–25.
47. Liu Y, Li CM, Lu Z, et al. Studies on formation and repair
of formaldehyde-damaged DNA by detection of DNA-protein
crosslinks and DNA breaks. Front Biosci 2006; 11: 991–7.
48. Zhang H, Koch CJ, Wallen CA, Wheeler KT. Radiation-
induced DNA damage in tumours and normal tissues. Oxygen
dependence of the formation of strand breaks and DNA-protein
crosslinks. Radiat Res 1995; 142: 163–8.
49. Wang J, Klem J, Wyrick JB, et al. Detection of hypoxia
in human brain tumor xenografts using a modified comet assay.
Neoplasia 2003; 5 (4): 288–96.
50. Sauer G, Weber KJ, Peschke P, Eble MJ. Measurement
of hypoxia using the comet assay correlates with preirradiation
microelectrode pO2 histography in R3327-AT rodent tumors.
Radiat Res 2000; 154 (4): 439–46.
51. Weston A, Plummer SM, Grafstrom RC, et al. Genotoxicity
of chemical and physical agents in cultured human tissues and cells.
Food Chem Toxicol 1986; 24 (6–7): 675–9.
52. Miller D. Comet assay reveals DNA strand breaks induced
by ultrasound cavitation in vivo. Ultrasound Med Biol 1995; 21:
841–8.
53. Vykhodtseva N, McDannold N, Hynynen K. Induction of
apoptosis in vivo in the rabbit brain with focused ultrasound and
Optison. Ultrasound Med Biol 2006; 32 (12): 1923–9.
54. Lai H, Singh NP. Acute low-intensity microwave
exposure increases DNA single-strand breaks in rat brain cells.
Bioelectromagnetics 1995; 16: 207–10.
55. Hartmann A, Schumacher M, Plappert-Helbig U, et al. Use
of the alkaline in vivo Comet assay for mechanistic genotoxicity
investigations. Mutagenesis 2004; 19 (1): 51–9.
56. Gocke E, Müller L, Guzzie PJ, et al. Considerations on
photochemical genotoxicity: Report of the International Workshop
on Genotoxicity. Env Mol Mutagenesis 2000; 35 (3): 173–84.
57. Rapp A, Greulich KO. After double-strand break induction
by UV-A, homologous recombination and nonhomologous end
joining cooperate at the same DSB if both systems are available.
J Cell Sci 2004; 117 (21): 4935–45.
58. Wischermann K, Boukamp P, Schmezer P. Improved
alkaline comet assay protocol for adherent HaCaT keratinocytes
to study UVA-induced DNA damage. Mutat Res 2007; 630 (1–
2): 122–8.
59. Chazal M, Roux E, Alapetite C, et al. Interexperimental
and interindividual variations of DNA repair capacities after UV-B
and UV-C irradiations of human keratinocytes and fibroblasts.
Photochem Photobiol 2004; 79 (3): 286–90.
60. Sastre M, Vernet M, Steinert S. Single-cell gel/comet
assay applied to the analysis of UV radiation-induced DNA damage
in Rhodomonas sp. (Cryptophyta). Photochem Photobiol 2001;
74: 55–60.
61. The National Toxicology Program, Report on Carcinogens.
2007; Eleventh edition.
62. Sanner T, Dybing E, Kroese D, et al. Potency grading in
carcinogen classification. Mol carcinog 1997; 20: 280–7.
63. Yamasaki H, Ashby J, Bignami M, et al. Nongenotoxic
carcinogens: development of detection methods based on
mechanisms: a European project. Mutat Res 1996; 353: 47–56.
64. Kulkarni M, Chaudhari A. Microbial remediation of nitro-
aromatic compounds. J Environ Manage 2007; 85 (2): 496–512.
Обз Ор
309О Н К О Л О Г И Я • Т. 1 0 • № 3 • 2 0 0 8
65. Nordling MM, Nygren J, Bergman J, et al. Toxicological
characterization of a novel in vivo benzo[a]pyrene metabolite,
7-oxo-benz[d]anthracene-3,4-dicarboxylic acid anhydride. Chem
Res Toxicol 2002; 15 (10): 1274–80.
66. Chico Galdo V, Massart C, Jin L, et al. Acrylamide, an
in vivo thyroid carcinogenic agent, induces DNA damage in rat
thyroid cell lines and primary cultures. Mol Cell Endocrinol 2006;
257–258: 6–14.
67. Wu K, Jiang L, Cao J, et al. Genotoxic effect and nitrative
DNA damage in HepG2 cells exposed to aristolochic acid. Mutat
Res 2007; 630 (1–2): 97–102.
68. Sasaki YF, Sekihashi K, Izumiyama F, et al. The comet
assay with multiple mouse organs: comparison of comet assay
results and carcinogenicity with 208 chemicals selected from the
IARC monographs and US NTP Carcinogenicity Database. Crit
Rev Toxicol 2000; 30 (6): 629–799.
69. Gröger M, Speit G, Radermacher P, Muth CM. Interaction
of hyperbaric oxygen, nitric oxide, and heme oxygenase on DNA
strand breaks in vivo. Mutat Res 2005; 572 (1–2): 167–72.
70. Weinberger B, Laskin DL, Heck DE, Laskin JD. The
toxicology of inhaled nitric oxide. Toxicol Sci 2001; 59 (1):
5–16.
71. Felley-Bosco E. Role of nitric oxide in genotoxicity:
implication for carcinogenesis. Cancer Metastasis Rev 1998;
17 (1): 25–37.
72. Sardas S, Izdes S, Ozcagli E, et al. The role of antioxidant
supplementation in occupational exposure to waste anaesthetic
gases. Int Arch Occup Environ Health 2006; 80 (2): 154–9.
73. Li CQ, Pang B, Kiziltepe T, et al. Threshold effects of nitric
oxide-induced toxicity and cellular responses in wild-type and
p53-null human lymphoblastoid cells. Chem Res Toxicol 2006;
19 (3): 399–406.
74. Wu X, Takenaka K, Sonoda E, et al. Critical roles for
polymerase zeta in cellular tolerance to nitric oxide-induced DNA
damage. Cancer Res 2006; 66 (2): 748–54.
75. Frenzilli G, Scarcelli V, Fornai F, et al. The comet assay as
a method of assessment of neurotoxicity: usefulness for drugs of
abuse. Ann N Y Acad Sci 2006; 1074: 478–81.
76. Kassie F, Parzefall W, Knasmüller S. Single cell gel
electrophoresis assay: a new technique for human biomonitoring
studies. Mut Res 2000; 463: 13–31.
77. de Oliviera E, Suzuki MF, do Nascimento PA, et al.
Evaluation of the effect of 90Sr beta-radiation on human blood
cells by chromosome aberration and single cell gel electrophoresis
(comet assay) analysis. Mut Res 2001; 476: 109–21.
78. Hughes CM, McKelvey-Martin VJ, Lewis SE. Human
sperm DNA integrity assessed by the comet and ELISA assays.
Mutagenesis 1999; 14: 71–75.
APPLICATION OF THE COMET ASSAY FOR
THE DNA DAMAGE ASSESSMENT CAUSED
BY DIFFERENT ENVIRONMENTAL AGENTS
J.B. Sorochinska, V.M. Mikhailenko
Summary. The extended exposure to adverse
environmental factors is accompanied by DNA
damage increase and alters the repair system activity
that can lead to initiation of mutations and malignant
transformation in cells. During the last years, many
analytical techniques have been developed to estimate
DNA damage and investigate processes of DNA repair.
However, not all of them possess sufficient sensitivity
and specificity for monitoring variety of DNA damages
caused by environmental factors. The aim of this
review consists in efficiency evaluation of a Single
Cells Gel Electrophoresis assay («Comet Assay») for
DNA damages detection after exposure to different
environmental agents. The assay possesses sensitivity
necessary for registration of DNA damage and repair
occurring on a single cell level and may be used for
assessment of genome integrity.
Key Words: DNA damage, DNA repair, Comet
Assay, carcinogenic environmental factors.
Адрес для переписки:
Сорочинская У.Б.
03022, Киев, ул. Васильковская, 45
Институт экспериментальной патологии,
онкологии и радиобиологии
им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины
E-mail: j.sorochinska@hotmail.com
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-11933 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1562-1774,0204-3564 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:06:01Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Iнститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького |
| record_format | dspace |
| spelling | Сорочинская, У.Б. Михайленко, В.М. 2010-09-08T12:58:00Z 2010-09-08T12:58:00Z 2008 Применение метода ДНК-комет для оценки повреждения ДНК, вызваных различными агентами окружающей среды / У.Б. Сорочинская, В.М. Михайленко // Онкологія. — 2008. — 10, N 3. — С. 303-309. — Бібліогр.: 78 назв. — рос. 1562-1774,0204-3564 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/11933 Длительное воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды сопровождается накоплением повреждений ДНК и изменением активности системы репарации, что может привести к возникновению мутаций и злокачественной трансформации клетки. В последние годы было разработано много методов, позволяющих регистрировать повреждения ДНК, а также исследовать процессы репарации. Однако не все они обладают достаточной чувствительностью и специфичностью, необходимой для мониторинга широкого спектра повреждений ДНК, вызванных факторами окружающей среды. Цель обзора состоит в оценке эффективности метода гельэлектрофореза лизированных единичных клеток (метод ДНК-комет) для детекции повреждений ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды. Метод обладает чувствительностью, необходимой для регистрации повреждений и репарации ДНК на уровне отдельной клетки, и может быть применен для оценки интегральной целостности генома. The extended exposure to adverse environmental factors is accompanied by DNA damage increase and alters the repair system activity that can lead to initiation of mutations and malignant transformation in cells. During the last years, many analytical techniques have been developed to estimate DNA damage and investigate processes of DNA repair. However, not all of them possess sufficient sensitivity and specificity for monitoring variety of DNA damages caused by environmental factors. The aim of this review consists in efficiency evaluation of a Single Cells Gel Electrophoresis assay («Comet Assay») for DNA damages detection after exposure to different environmental agents. The assay possesses sensitivity necessary for registration of DNA damage and repair occurring on a single cell level and may be used for assessment of genome integrity. ru Iнститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького Обзор Применение метода ДНК-комет для оценки повреждения ДНК, вызваных различными агентами окружающей среды Application of the comet assay for the dna damage assessment caused by different environmental agents Article published earlier |
| spellingShingle | Применение метода ДНК-комет для оценки повреждения ДНК, вызваных различными агентами окружающей среды Сорочинская, У.Б. Михайленко, В.М. Обзор |
| title | Применение метода ДНК-комет для оценки повреждения ДНК, вызваных различными агентами окружающей среды |
| title_alt | Application of the comet assay for the dna damage assessment caused by different environmental agents |
| title_full | Применение метода ДНК-комет для оценки повреждения ДНК, вызваных различными агентами окружающей среды |
| title_fullStr | Применение метода ДНК-комет для оценки повреждения ДНК, вызваных различными агентами окружающей среды |
| title_full_unstemmed | Применение метода ДНК-комет для оценки повреждения ДНК, вызваных различными агентами окружающей среды |
| title_short | Применение метода ДНК-комет для оценки повреждения ДНК, вызваных различными агентами окружающей среды |
| title_sort | применение метода днк-комет для оценки повреждения днк, вызваных различными агентами окружающей среды |
| topic | Обзор |
| topic_facet | Обзор |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/11933 |
| work_keys_str_mv | AT soročinskaâub primeneniemetodadnkkometdlâocenkipovreždeniâdnkvyzvanyhrazličnymiagentamiokružaûŝeisredy AT mihailenkovm primeneniemetodadnkkometdlâocenkipovreždeniâdnkvyzvanyhrazličnymiagentamiokružaûŝeisredy AT soročinskaâub applicationofthecometassayforthednadamageassessmentcausedbydifferentenvironmentalagents AT mihailenkovm applicationofthecometassayforthednadamageassessmentcausedbydifferentenvironmentalagents |