Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як ка талітичні складові ензиматичного набору "Аргітест" для аналізу L-аргініну
На сьогодні скринінгові тест-системи для моніторингу L-аргініну у біологічних рідинах, зокрема, у крові, в арсеналі засобів вітчизняної клінічної діагностики відсутні. Ензиматичний набір «Аргітест» базується на розробленому
 ензиматично-хімічному методі кількісного аналізу L-аргініну з викор...
Saved in:
| Published in: | Наука та інновації |
|---|---|
| Date: | 2017 |
| Main Authors: | , , , , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2017
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/124896 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як ка талітичні складові ензиматичного набору "Аргітест" для аналізу L-аргініну / Н.Є. Стасюк, Г.З. Гайда, А.Є. Закальський, О.М. Закальська, Л.Р. Фаюра, О.І. Вовк, О.В. Стасик, А.А. Сибірний, М.В. Гончар // Наука та інновації. — 2017. — Т. 13, № 4. — С. 64—72. — Бібліогр.: 23 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860269188198694912 |
|---|---|
| author | Стасюк, Н.Є. Гайда, Г.З. Закальський, А.Є. Закальська, О.М. Фаюра, Л.Р. Вовк, О.І. Стасик, О.В. Сибірний, А.А. Гончар, М.В. |
| author_facet | Стасюк, Н.Є. Гайда, Г.З. Закальський, А.Є. Закальська, О.М. Фаюра, Л.Р. Вовк, О.І. Стасик, О.В. Сибірний, А.А. Гончар, М.В. |
| citation_txt | Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як ка талітичні складові ензиматичного набору "Аргітест" для аналізу L-аргініну / Н.Є. Стасюк, Г.З. Гайда, А.Є. Закальський, О.М. Закальська, Л.Р. Фаюра, О.І. Вовк, О.В. Стасик, А.А. Сибірний, М.В. Гончар // Наука та інновації. — 2017. — Т. 13, № 4. — С. 64—72. — Бібліогр.: 23 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Наука та інновації |
| description | На сьогодні скринінгові тест-системи для моніторингу L-аргініну у біологічних рідинах, зокрема, у крові, в арсеналі засобів вітчизняної клінічної діагностики відсутні. Ензиматичний набір «Аргітест» базується на розробленому
ензиматично-хімічному методі кількісного аналізу L-аргініну з використанням різних форм рекомбінантної аргінази І печінки людини та аргініндеімінази. Метод є високоселективним, економічно вигідним, простим та швидким у виконанні, відзначається стабільністю препаратів ензимів та продукту реакції. У статті доведено можливість використання препаратів рекомбінантних аргініно-селективних ензимів у складі набору «Aргітест». В результаті досліджень вивчено каталітичні та аналітичні характеристики цих препаратів та показано, що кожен з них може бути використано як складову ензиматичного набору.
For the time, no screening test kits for L-arginine monitoring
in biological fluids, including the blood, have been available
in the arsenal of domestic clinical diagnostics. The Argitest
enzymatic kit is based on the enzymatic-chemical me thod
of L-arginine quantitative analysis developed using different
forms of recombinant human liver arginase I (arginase)
and arginine deiminase. The method is highly selective,
cheap, simple, and fast. It is remarkable for stability of
enzy mes and final products. The article demonstrates the
possibi lity of using recombinant arginine-selective enzymes
in com po si tion of Argitest kit. The catalytic and
analytic characteristics of the se enzymes have been studied.
It has been shown that each enzyme can be used as a component of enzymatic kit.
В настоящее время скрининговые тест-системы для
мониторинга L-аргинина в биологических жидкостях, в
том числе, в крови, в отечественной клинической диагностике отсутствуют. Энзиматический набор «Аргитест» базируется на разработанном энзиматическо-химическом методе количественного анализа L-аргинина с
использованием разных форм рекомбинантной аргиназы І печени человека и аргининдеиминазы. Метод является высокоселективным, экономично выгодным, простым и быстрым в исполнении, отличается стабильностью
энзиматических препаратов и продукта реакции. В статье продемонстрирована возможность использования
препаратов рекомбинантных аргинин-селективных энзимов в составе набора «Aргитест». В результате исследований определены каталитические и аналитические характеристики энзиматических препаратов и показано,
что каждый из них может быть использован как компонент энзиматического набора.
|
| first_indexed | 2025-12-07T19:04:30Z |
| format | Article |
| fulltext |
64
Н.Є. Стасюк, Г.З. Гайда, А.Є. Закальський, О.М. Закальська,
Л.Р. Фаюра, О.І. Вовк, О.В. Стасик, А.А. Сибірний, М.В. Гончар
Інститут біології клітини НАН України, вул. Драгоманова, 14/16, Львів, 79005, Україна
Teл. +380 32 261 2108, факс +380 32 261 2148, е-mail: galina.gayda@gmail.com
РЕКОМБІНАНТНІ ФОРМИ АРГІНАЗИ ТА АРГІНІНДЕІМІНАЗИ
ЯК КАТАЛІТИЧНІ СКЛАДОВІ ЕНЗИМАТИЧНОГО НАБОРУ
«АРГІТЕСТ» ДЛЯ АНАЛІЗУ L-АРГІНІНУ
© Н.Є. СТАСЮК, Г.З. ГАЙДА, А.Є. ЗАКАЛЬСЬКИЙ,
О.М. ЗАКАЛЬСЬКА, Л.Р. ФАЮРА, О.І. ВОВК,
О.В. СТАСИК, А.А. СИБІРНИЙ, М.В. ГОНЧАР, 2017
На сьогодні скринінгові тест-системи для моніторингу L-аргініну у біологічних рідинах, зокрема, у крові, в арсе-
налі засобів вітчизняної клінічної діагностики відсутні. Ензиматичний набір «Аргітест» базується на розробленому
ензиматично-хімічному методі кількісного аналізу L-аргініну з використанням різних форм рекомбінантної аргінази І
печінки людини та аргініндеімінази. Метод є високоселективним, економічно вигідним, простим та швидким у ви-
конанні, відзначається стабільністю препаратів ензимів та продукту реакції. У статті доведено можливість викорис-
тання препаратів рекомбінантних аргініно-селективних ензимів у складі набору «Aргітест». В результаті досліджень
вивчено каталітичні та аналітичні характеристики цих препаратів та показано, що кожен з них може бути використано
як складову ензиматичного набору.
К л ю ч о в і с л о в а: L-aргінін, aргіназа І, aргініндеіміназа, 2,3-бутандіонмонооксим, уреаза, ензиматичний набір
«Аргітест».
ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13(4): 64—72 doi: https://doi.org/10.15407/scin13.03.065
Амінокислота L-аргінін (далі — Arg) — по-
передник L-орнітину, L-цитруліну, L-глутатіо-
ну, γ-аміномасляної кислоти, спермідину та ін-
ших сполук — одна із найбільш поляризованих,
позитивно заряджених амінокислот [1]. Мета-
болізм Arg йде, як мінімум, двома альтерна-
тивними шляхами: 1) окисним (за участі NO-
синтази) з утворенням L-цитруліну та NO; 2)
неокисним (за участю арrінази І) з утворен-
ням L-орнітину та сечовини. Можливе і одно-
часне протікання цих двох процесів [2]. Прак-
тично весь ланцюг перетворень Arg в по хідні
сполуки відбувається в трьох органах — киш-
ківнику, печінці та нирках [3].
Вміст Arg зазвичай визначають методами іоно-
обмінної хроматографії, флуориметрії, спектро-
фотометрії, капілярного електрофорезу, поля-
рографії, проточно-інжекційного аналізу, ла-
зерної флуоресцентної спектроскопії та ін.
[4—5]. Найбільшого поширення набули хро-
матографічні методи кількісного аналізу Arg,
зокрема, високоефективна рідинна хромато-
графія (ВЕРХ). ВЕРХ ґрунтується на поперед-
ній обробці зразків дериватизуючими реаген-
тами з подальшим розділенням цих похідних
хроматографічними методами та визначенням
цих сполук за допомогою тандемної мас-спек-
трометрії (ТМС) та флуоресцентної детекції
(ФЛ). Хоча метод ВЕРХ є достатньо чутли-
вим, відтворюваним і дає змогу визначати весь
набір амінокислот (в 15—20 мкл плазми крові),
проте він має і низку недоліків, які обмежують
його широке використання, насамперед, у екс-
прес-діагностиці. Перш за все, ВЕРХ вимагає
високовартісного обладнання та реактивів, що
65ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13 (4)
Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як каталітичні складові ензиматичного набору «Аргітест»
65 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13 (4)
робить відповідні аналізи недешевими для ру-
тин ного клінічного аналізу. Метод потребує
значної кількості органічних розчинників ви-
сокої якості та дорогих дериватизуючих реа-
гентів. По-друге, час підготовки та аналізу
зразка є три валим і становить 1—2 доби від
мо менту дериватизації до одержання кількіс-
них даних [5].
В галузі аналітичної біотехнології існує об-
межена кількість даних щодо ензиматичних
методів визначення Arg. Найперспективні-
шими для розробки таких методів є ензими
метаболізму Arg, зокрема, аргіназа І, аргінін-
деі міназа (АДІ), аргініндекарбоксилаза. Існу-
ючі комерційні ензиматичні тест-системи (ви-
робництва Sigma, EnzytecTM, Elisa, Megazyme
та ін.) є, переважно, мультиензимними із спек-
трофотометричним (СФ) детектуванням кін-
цевого продукту реакції [6—8]. Мультиензимні
методи визначення Arg мають низку недоліків,
зокрема, неабсолютну селективність до цільо-
вого аналіту, спричинену позитивною реак-
цією на гуанідинові сполуки. Необхідність ви-
користання каскаду із кількох (3—5) ензимів і
екзогенних ко-факторів підвищує вартість ме-
тодів та ускладнює процедуру аналізу.
У попередніх дослідженнях авторами було
запропоновано біосенсорні підходи [9] та еко-
номічно вигідні ензиматично-хімічні методи
визначення Arg [9—16] із використанням од-
ного або двох ензимів. На рис. 1 зображено прин-
ципові схеми розроблених нами методів, а в
табл. 1 наведено їхні аналітичні характеристи-
ки, порівняно з аналогічними параметрами ві-
домих мультиензимних методів.
Вказані на рис. 1 методи базуються на вико-
ристанні рекомбінантних аргініно-гідролізую-
чих ензимів — аргінази І печінки людини
(аргіназа1) та бактерійної аргініндеімінази,
одержаних за власними технологіями з клітин
мікробних рекомбінантних штамів-продуцен-
тів, створених авторами статті (табл. 2).
Як видно з таблиці 1, метод «Аргіназа-ДМО»
має низку переваг порівняно з іншими метода-
ми, зокрема, це висока чутливість та широкий
діапазон тестованих концентрацій Arg. Цей
метод не потребує попереднього відокремлен-
ня Arg з досліджуваних зразків, є простим у
виконанні, високоселективним, надійним і ко-
мерційно доступним; можливість його прак-
тичного застосування було продемонстровано
на зразках промислових фармацевтичних пре-
паратів та комерційних вин [9, 11].
На сьогодні тест-системи для моніторингу
Arg у біологічних рідинах, зокрема в крові, в
арсеналі засобів вітчизняної клінічної діагнос-
тики відсутні. У 2015 р. авторами було викона но
проект науково-дослідної роботи за науково-
технічною програмою НАН України «Розроб-
ка, тестування та випуск пробної серії ензима-
тичного набору «Aргітест» для аналізу аргіні ну
в клінічних зразках. Розділ 1. Оптимізація
скла ду набору, умов проведення аналізу та
розробка науково-технічної документації». У
результаті виконання цього проекту метод «Ар-
гіназа-ДМО» було успішно протестовано на
зразках крові. На основі ензиматично-хіміч-
ного методу «Аргіназа-ДМО» створено ензи-
матичний набір «Аргітест» для визначення
Arg і розроблено науково-технічну документа-
цію на зазначений набір.
Одним із завдань вищевказаного проекту
НДР було визначити оптимальну ензиматич-
Рис.1. Ензиматично-хімічні методи аналізу Arg
Флуорометрія (ФЛ) Спектрофотометрія (СФ)
* ДМО — 2,3-бутандіонмонооксим; ** ОФА — о-фталевий
альдегід
Аргіназа
Аргіназа + уреаза
або АДІ
Карбамід Цитрулін
Продукт хімічної реакції
АДІ
ДМО
NH4
+
ДМО*
Arg
ОФА**
66 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13 (4)
Н.Є. Стасюк, Г.З. Гайда, А.Є. Закальський, О.М. Закальська, Л.Р. Фаюра, О.І. Вовк, О.В. Стасик, А.А. Сибірний, М.В. Гончар
ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13 (4)
ну складову набору «Aргітест». Об’єктами
дослідження слугували рекомбінантні аргіні-
но-гідролізуючі ензими (табл. 2), виділені та
охарактеризовані авторами статті.
МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕНЬ
У роботi використано рекомбінантні штами
мікроорганізмів з музею Інституту біології
клітини НАН України. Рекомбінантні клітини
дріжджів та бактерій було створено у поперед-
ніх дослідженнях та застосовано як джерела
цільових рекомбінантних ензимів (табл. 2).
Питому активність рекомбінантних ензимів
(далі — ензими) виражали в мкмоль продукту,
утвореного за 1 хв в перерахунку на 1 мг про-
теїну (мкмоль · хв—1 · мг—1) за стандартних умов
реакції. Активність аргінази визначали за швид-
кістю утворення сечовини [17–19]. Аналіз ак-
тивності АДІ виконували у два етапи, визна-
чаючи швидкість утворення аміаку [20, 21].
Внутрішньоклітинні ензими виділяли з без-
клітинних екстрактів (БЕ), секретований ензим
(аргіназу3) — із культуральної рідини відповід-
них рекомбінантних мікробних продуцентів з
подальшим очищенням шляхом колонкової
хроматографії за розробленими схемами (див.
посилання в табл. 2).
Для виділення аргінази1 використовували
синтезований власноруч афінний сорбент «Ар-
гінін-макропористе скло». Препарати ензиму
із питомою активністю 1500—2600 Од/мг про-
теїну було одержано із 40—60-кратною очист-
кою, із 42%-им виходом у найбільш вдалих
фракціях. Препарати зберігали при –10 °С у
50 мМ Трис-HCl буфері (ТБ), з рН 8,0, що міс-
тив 1М NaCl, 1 мМ MnCl2 та 10%-й гліцерол.
Таблиця 1
Порівняльна характеристика ензиматично-хімічних методів визначення Arg
Метод Фермент
Лінійний
діапазон, μM
Чутливість,
μM
Джерело
Відомі ензиматичні методи
Мультиензимний, СФ, λ = 340 нм Аргіназа, уреаза, глутаматде гід-
рогеназа
До 470 2,0 [6]
Мультиензимний, СФ, λ = 340 нм Аргіназа, уреаза, глутаматде гід-
рогеназа
2,9—100 2,1 [7]
Мультиензимний, СФ, λ = 555 нм AДI, аргініносукцинатсинтаза;
піруватфосфатдикіназа; піруват
оксидаза, пероксидаза хрону
До 100 — [8]
Методи, розроблені авторами даної публікації
ДMO-СФ, λ = 480 нм Аргіназа 7—100 5,0 [9—11]
ДMO-ФЛ, λзб = 360 нм, λем = 510 нм Аргіназа 0,06—200 0,04 [9, 11, 12]
OФA-СФ, λ = 362 нм Аргіназа-уреаза 0,9—60,0 0,85 [13]
OФA-ФЛ, λзб = 364 нм, λем = 425 нм Аргіназа-уреаза 0,09—6,0 0,08 [14]
OФA-ФЛ, λзб = 364 нм, λем = 415 нм AДІ 0,35—24 0,25 [15]
OФA-СФ, λ = 340 нм AДІ 0,7—50 0,55 [16]
ДMO – 2,3-бутандіонмонооксим; СФ — спектрофотометрична детекція кінцевого продукту; ФЛ — флуорометрична
детекція кінцевого продукту; OФA — о-фталевий альдегід.
67ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13 (4)
Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як каталітичні складові ензиматичного набору «Аргітест»
67 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13 (4)
Вони не втрачали своєї активності протягом
року, а через 3 роки зберігання їх ензиматична
активність знижувалася лише вдвічі.
Виділення препаратів аргінази2 та аргінази3
здійснювали шляхом афінної хроматографії
на сорбенті Ni-NTA-Superflow (Qiagen). Вихід
ензимів з найвищою активністю складав 70 %
(6 мг/л культури) та 35 % (5 мг/л культураль-
ної рідини) відповідно. Препарати аргінази2 і
аргінази3 зберігали при –20 °С без втрати ак-
тивності протягом року в Трис-фосфатному
буфері з рН 8,0 та в фосфатному буфері, рН 7,2
відповідно. Обидва буфери містили 0,15 М NaCl
та 20%-й гліцерол.
Аргініндеіміназу (АДІ) виділяли з нероз-
чин них «тілець включення» та очищали за
допомогою аніонообмінної та гідрофобної хро-
матографії на сорбентах QAE-сефароза та фе-
ніл-сефаро за відповідно. Одержаний шляхом
електрофорезу гомогенний препарат АДІ збе-
рігали при +4 °С у 20 мМ фосфатному буфері
з рН 8,0, що містив 1 М NaCl, без втрати ак-
тивності упродовж 20 місяців.
Було вивчено каталітичні та аналітичні ха-
рактеристики високоочищених ензимів. Опти-
мальні умови проведення ензиматичної та
хі міч ної реакцій, а також процедури реєстра-
ції кінцевих продуктів докладно описано в по-
передніх публікаціях [9—11]. Як результат,
створено калібрувальні графіки залежності ана-
літичного сигналу (інтенсивності випроміню-
ван ня або світлопоглинання реакційної сумі-
ші), тобто відповіді на ензиматичне перетво-
рення субстрату, від концентрації Arg. Для
побудови калібрувальних графіків в скляні
пробірки відбирали по 0,1 мл стандартних роз-
чинів Arg в 30 мМ ТБ з рН 8,8. Реакцію запус-
кали додаванням 0,01 мл розчину ензиму в
30 мМ ТБ з рН 8,8, до кінцевої концентрації
1,5–3,0 Од/мл. Інкубаційну суміш перемішу-
вали та витримували 10 хв при 37 °С. Надалі в
суміш додавали 3 мл 0,5%-го розчину 2,3-бу-
тандіонмонооксиму (ДМО) в 1,7 М H
2SO4 та
кип’ятили на водяній бані протягом 50 хв.
Реєстрували оптичну густину (на спектрофо-
тометрі SHI MAD ZU UV-1650 PC) або інтен-
сивність флуо ресценції кінцевого продукту
реакції (на флуориметрі TECAN Infinite H200
із хвилею збудження 360 нм) порівняно з кон-
трольною про бою (0,1 мл 30 мМ ТБ з рН 8,8
замість розчину Arg).
Досліди проводили у чотирьох–шести пов-
тореннях, а виміри — у 3-х паралелях. Для кож-
ної вибірки показників визначали середнє ариф-
метичне значення (М), дисперсію, стандартне
відхилення середнього результату, відносне
стандартне відхилення та довірчий інтервал.
Розрахунок статистичних показників і побу-
дову графіків здійснювали за допомогою про-
грами Origin 8.0. Лінеаризацію графіків про-
Таблиця 2
Aргініногідролізуючі ензими
Назва фермента Позначення
Властивості
фермента
Продуцент фермента Джерело
Природна аргіназа І печінки людини Аргіназа1 Mn2+-залежний,
внутрішньо-
клітинний
NCYC 495 Нansenula polymorpha
pGAP1-HsARG1 leu2car1:ScLEU2
17
(His)6-тагована аргіназа І печінки людини Аргіназа2 Mn2+-залежний,
внутрішньо-
клітинний
Saccharomyces cerevisiae 303/pYEX-
4-ARG1 (MATa leu2-3/112 ura3-1
trp1-1 his3-11/15 ade2-1 can1-100)
18
Модифікована аргіназа І печінки людини Аргіназа3 Со2+-залежний,
секретований
H. polymorpha pFDM-ScMFa-HIS6-
HsARG1
19
Аргініндеіміназа Mycoplasma hominis AДІ Внутрішньо-
клітинний
Escherichia coli BL-21(pET3d-ADI) 20, 21
68 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13 (4)
Н.Є. Стасюк, Г.З. Гайда, А.Є. Закальський, О.М. Закальська, Л.Р. Фаюра, О.І. Вовк, О.В. Стасик, А.А. Сибірний, М.В. Гончар
68ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13 (4)
водили за рівнянням регресії Y = A + BX (де A
і B — параметри рівняння), розраховували кое-
фіцієнт кореляції R та рівень достовірності
лінійного зв’язку р. Параметр В відповідає
тангенсу кута нахилу, за допомогою якого ви-
значають чутливість методу. Коефіцієнт А є
показником фонового впливу додаткових ін-
гредієнтів на ідентифікацію аргініну, тобто
вказує рівень селективності методу [22]. Па-
раметри та статистичні показники наведені на
рисунках та в таблицях.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Принципова схема реакцій, що лягли в осно-
ву ензиматично-хімічного методу визначення
Arg за використання аргінази, представлена
на рис. 2. Метод ґрунтується на ферментатив-
ному гідролізі Arg до L-орнітину та карбамі ду
(ензиматична реакція, стадія 1). Карбамід
взає модіє із ДМО на хімічній стадії реакції
(ста дія 2), із утворенням продукту, який кіль-
кісно оцінюється спектрофотометрично (СФ)
за оптичною густиною при λ = 480 нм або
флуорометрично (ФЛ) при 510 нм із хвилею
збудження 360 нм [11]. Кінцевим продуктом
хімічної реакції є (2Е)-бутан-2,3-діон-2-се мі-
карбазон та інші сполуки, зокрема, циклічні.
Застосування АДІ в ензиматичному методі
визначення Arg забезпечує високоселективну
та ефективну деградацію Arg до цитруліну.
Принципова схема реакцій, що лягли в основу
«АДІ-ДМО»-методу визначення Arg (за ут-
воренням цитруліну), представлена на рис. 3.
Концентрацію кінцевого продукту хімічної
реа кції визначали спектрофотометрично за
оп тич ною густиною при λ = 490 нм та флуо-
рометрично при 515 нм із хвилею збуджен-
ня 360 нм.
Вибір оптимального ензиму здійснювали,
порівнюючи аналітичні характеристики до-
сліджених ензимів (табл. 2) за оптимізованих
умов аналізу [11]. Для цього вивчали залеж-
ність інтенсивності флуоресценції та світлопо-
глинання реакційної суміші від концентрації
Arg у кінцевій пробі. На рис. 4 наведено гра-
фічні результати вивчення залежності інтен-
сивності флуоресценції (а, б) та світлопогли-
нання (в, г) реакційної суміші від концентрації
Рис. 2. Загальна схема реакцій при визначенні Аrg ензиматично-хімічним методом «Аргіназа-ДМО» за утворенням
карбаміду
Карбамід 2,3-бутандіонмонооксим (2Е)-бутан-2,3-діон-2-семікарбазон
H2N
HN
HN
H2N
H2N
H2N
NH2
NH2
NH2
CH2CH2 CH2
CH2 CH2
CH3O + CH3 CC
C
C
C C
C
C
COOH
NOH
Стадія 2
Стадія 1
H2SO4
L-орнітин
Aргіназа I
L-аргінін
Карбамід
COOH + H2O
O
O
O
O +
CH3
H3C
CH2
N
N
H
CH
CH
H2N
H2N
69ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13 (4)
Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як каталітичні складові ензиматичного набору «Аргітест»
69 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13 (4)
Arg за використання аргінази2. Аналогічні гра-
фіки отримували й при обробці експеримен-
тальних даних з використанням інших ензимів.
У табл. 3 підсумовано аналітичні характе-
ристики (лінійність калібрувального графіку
та порогова чутливість) ензиматично-хімічно-
го ДМО-методу для кожного досліджуваного
ензиму.
Як видно з наведених даних, властивості
ензимних препаратів при використанні їх в
ДМО-методі є близькими, особливо при ФЛ
реєстрації продуктів реакції. Як каталітичну
складову в аналітичному наборі «Аргітест»
було використано препарат аргінази2. Набір
«Аргітест» із спектрофотометричною та флуо-
рометричною детекцією продукту реакції було
Рис. 4. Основні аналітичні
ха рактеристики ДМО-мето-
ду за ви користання аргінази2.
За леж ність інтенсивності ви-
про мінювання реакційної су-
міші від концентрації Arg (а)
та діапазон лінійності ФЛ
методу (б). Залежність світ-
лопоглинання від концентра-
ції Arg у фотометрованій су-
міші (в) та діапазон лінійнос-
ті СФ методу (г)
Рис. 3. Загальна схема реакцій при визначенні Arg ензиматично-хімічним методом «АДІ-ДМО» за утворенням
цитруліну
H2N
HN
NH
NH2
CH(CH2)3C
АДІ
Стадія 1
L-аргінін
COOH + H2O
L-цитрулін
NH4 + H2N
OH
OO
+
NH2
N
H
2,3-бутандіонмонооксим 2-аміно-5-(4,5-диметил-2-
оксоімідазолідин-1-ил) пентаноат
O COO—C C
Стадія 1
H2SO4
L-цитрулін
NH2
H2N
OH + CH3
NOH
CH3
O
O
NH2
N
H
H3C
H3C
NH
N
515І 515І
1000
800
600
400
0
200
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
600
400
300
200
0
100
0,02 0,06 0,10
500
0,14
480D
0,6
0,4
0,3
0,2
0
0,1
0,01 0,03
Aрг, мМ
0,05
0,5
0,07
480D
0,6
0,4
0,3
0,2
0
0,1
0,05 0,10 0,15 0,20
Arg, мМ
0,25
0,5
0,7
0,30
А = 0,015 ± 0,008
В = 7,40 ± 0,3
А = 8,45 ± 5,8
В = 4560 ± 115
R = 0,997
SD = 16
N = 11
p <0,0001
R = 0,995
SD = 0,02
N = 8
p < 0,0001
а
в г
б
70 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13 (4)
Н.Є. Стасюк, Г.З. Гайда, А.Є. Закальський, О.М. Закальська, Л.Р. Фаюра, О.І. Вовк, О.В. Стасик, А.А. Сибірний, М.В. Гончар
Таблиця 3
Основні аналітичні характеристики ДМО-методу
за використання різних препаратів ензимів
Ензим
Параметр
лінійний діапазон, μM чутливість, μM
ФЛ СФ ФЛ СФ
Аргіназа1 0,06–280 7–100 0,04 5,0
Аргіназа2 0,28–140 1,1–70 0,15 0,28
Аргіназа3 0,55–140 0,55–140 0,30 0,30
АДІ 0,55–140 4,4–280 0,30 2,5
випробувано на реальних зразках сироватки
крові людини, та, як результат, встановлено
межі вмісту Аrg та середні значення для прак-
тично здорових людей, які добре корелюють із
літературними даними [23].
ВИСНОВКИ
Вперше досліджено аналітичні характерис-
тики рекомбінантних аргініно-гідролізуючих
ензимів як каталітичних складових аналітич-
ного набору «Аргітест». Принцип роботи на-
бору «Аргітест» полягає у ензиматичному
перетворенні L-аргініну і спектрофотометрич-
ному або флуорометричному детектуванні
кінцевого продукту хімічної реакції карбаміду
(за дії аргінази) або цитруліну (за дії аргінін-
деімінази) із диметилмонооксимом. Показано,
що кожен із досліджених ензимів може бути
використаний для визначення L-аргініну, але
як каталітичну складову при створенні набору
«Аргітест» було використано препарат (His)6-
тагованої аргінази І печінки людини (аргіна-
за2). Можна прогнозувати, що комерційний
випуск економічно вигідного аналітичного на-
бору «Аргітест» дасть можливість започатку-
вати моніторинг вмісту Arg в крові людини у
вітчизняній клінічній практиці та буде перс-
пективним, окрім медицини, також і для за-
стосування у ветеринарії, харчовій та фарма-
цевтичній промисловості.
Роботу виконано за фінансової підтримки
НАН України в рамках науково-технічної про-
грами «Розробка, тестування та випуск проб-
ної серії ензиматичного набору «Aргітест» для
аналізу аргініну в клінічних зразках». Розділ 1.
Оптимізація складу набору, умов проведення
аналізу та розробка науково-технічної доку-
ментації» (Проект 29-2015) у 2015 р., ком-
плексної науково-технічної програми «Сенсорні
прилади для медико-екологічних та промисло-
во-технологічних потреб: метрологічне забез-
печення та дослідна експлуатація» (Проект
№ 13-2017) у 2013—2017 рр. та стипендії
президента України для молодих вчених (Ста-
сюк Н.Є.) у 2016—2017 р.
ЛІТЕРАТУРА
1. Yokoro M., Suzuki M., Murota K. et al. Asymmetric di-
methylarginine, an endogenous NOS inhibitor, meta-
bolized in rat erythrocytes. Biosci. Biotechnol. Biochem.
2012. Vol. 76, no. 7. P. 1334—1342.
2. Marini J. Arginine and ornithine are the main precursors
for citrulline synthesis in mice. J. Nutr. 2012. Vol. 142,
no. 3. P. 572—580.
3. Yan X., Takahara M., Xie L. et al. Arginine metabolism in
soft tissue sarcoma. J. Dermatol. Sci. 2011. Vol. 61, no. 3.
P. 211—215.
4. Martens-Lobenhoffer J., Bode-Böger S.M.J. Chromato-
gra phic-mass spectrometric methods for the quantifi-
cation of L-arginine and its methylated metabolites in
biological fluids. Chromatography B. 2007. Vol. 851,
no. 1—2. P. 30—41.
5. Bhandare Pravin, Madhavan P., Rao B.M., Someswar
Rao N. Determination of arginine, lysine and histidine in
drug substance and drug product without derivatisation
by using HILIC column LC technique. J. Chem. Pharm.
Res. 2010. Vol. 2, no. 5. P. 0580—586.
6. Mira O.R.J. Quantitative determination of L-arginine
by enzymatic End-Point analysis. Agric. Food Chem.
2001. Vol. 49, no. 2. P. 549—552.
7. L-Arginine/Urea/Ammonia, UV method. URL: www.
nzytech.com/products-services/analytical-test-kits/
ak00171/ (дата звернення 20.04.2017).
8. Yasuhisa A., Masafumi K. Rapid enzymatic assays for L-
citrulline and L-arginine based on the platform of
pyrophosphate detection. Enz. Microb. Technol. 2014.
Vol. 57, no. 10. P. 36—41.
9. Гайда Г.З., Стасюк Н.Є., Гончар М.В. Методи аналізу
L-аргініну. Biotechnologia Acta. 2014. № 1. C. 31—39.
10. Стасюк Н.Є., Гайда Г.З., Гайда А.В., Гончар М.В., Ко-
вальчук Є.П. Ензиматичний метод визначення вміс-
ту L-аргініну за використання рекомбінантної аргі-
нази І людини. Ukr. Biorg. Acta. 2012. T. 1. C. 31—37.
71ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13 (4)
Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як каталітичні складові ензиматичного набору «Аргітест»
11. Stasyuk N., Gaida G., Gonchar M. L-arginine assay with
the use of arginase I. App. Biochem. Microbiol. 2013. No. 5.
P. 529—534.
12. Гайда Г., Стасюк Н., Сибірна Н., Гончар М. Визначен-
ня L-Aргініну у крові щурів ензиматичним методом.
Scientific Journal «ScienceRise». 2015. № 11/6 (16).
C. 33—38.
13. Стасюк Н.Є., Басс С.Р., Гайда Г. З., Єпремян Н.С.,
Гончар М.В. Новий ензиматичний метод визначення
L-аргініну за використання аргінази І людини та уреа-
зи. Scientific Journal «ScienceRise». 2015. № 6/1 (11).
C. 43—48.
14. Stasyuk N.Ye., Gayda G.Z., Yepremyan H.S., Gonchar M.V.
Simultaneous fluorometric arginase/urease-based assay
of L-arginine, urea and ammonium. Spectrochimica Acta,
Part A. 2017. Vol. 170. P. 184—190.
15. Stasyuk N., Gayda G., Fayura L., Boretskyy Y.R., Gon-
char M.V., Sibirny A.A. Novel arginine deiminase-based
method to assay L-Arginine in beverages. Food chemistry.
2016. Vol. 201. P. 320—326.
16. Патент України на корисну модель № 108773. Ста-
сюк Н.Є., Гайда Г.З., Фаюра Л.Р., Борецький Ю.Р.,
Сибірний А.А., Гончар М.В. Ензиматично-хімічний
метод визначення вмісту L-аргініну в харчових про-
дуктах та алкогольних напоях.
17. Стасюк Н.Є., Гайда Г.З., Ковальчук Є.П., Стасик О.В.,
Гончар М.В. Виділення та характеристика аргінази І
людини із рекомбінантних дріжджів Нansenula
polymorpha. Укр. біохім. журн. 2010. Т. 6. C. 14—21.
18. Zakalskiy A.E., Zakalska O.M., Rzhepetskyy Y.A., Sta-
syk O.V., Horak D., Gonchar M.V. Overexpression of (His)6-
tagged human arginase I in Saccharomyces cerevisiae and
enzyme purification using metal affinity chroma to-
graphy. Protein Expr. Purif. 2012. Vol. 81. Р. 63—68.
19. Stasyk O.V., Boretsky Y.R., Gonchar M.V., Sibirny A.A.
Recombinant arginine-degrading enzymes in metabolic
anticancer therapy and biosensorics. Cell Biol. Intern.
2015. Vol. 39 (3). P. 246—252.
20. Fayura L.R., Boretsky Y.R., Pynyaha Y.V., Wheatley D.N.,
Sibirny A.A. Improved method for expression and iso-
lation of the Mycoplasma hominis arginine deiminase
from the recombinant strain of Escherichia coli. J. Bio-
technol. 2013. Vol. 4. P. 420—426.
21. Фаюра Л.Р., Борецький Ю.Р., Пиняга Ю.В., Марти-
нюк Н.Б., Скороход В.В., Сибірний А.А. Розробка
тех нології культивування рекомбінантного штаму-
про дуцента Escherichia coli з метою отримання aр-
гініндезімінази Mycoplasma hominis. Наука та іннова-
ції. 2014. № 4. С. 32—39.
22. Дерффель К. Статистика в аналитической химии.
Москва, 1994. 267 с.
23. Патент України на корисну модель № 107543. Ста-
сюк Н.Є., Гайда Г.З., Закальський А.Є., Закальська О.М.,
Гончар М.В. Ензиматичний метод визначення L-ар-
гініну в крові людини.
Стаття надійшла до редакції 21.12.16
REFERENCES
1. Yokoro M., Suzuki M., Murota K., Otsuka C., Yamashita H.,
Takahashi Y., Tsuji H., Kimoto M. Asymmetric dime-
thylarginine, an endogenous NOS inhibitor, metabolized
in rat erythrocytes. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2012.
76(7): 1334—1342.
2. Marini J. Arginine and ornithine are the main precursors
for citrulline synthesis in mice. J. Nutr. 2012. 142(3):
572—580.
3. Yan X., Takahara M., Xie L., Gondo C., Setsu N., Oda Y.,
Takeuchi S., Tu Y., Moroi Y., Furue M. Arginine metabo-
lism in soft tissue sarcoma. J. Dermatol. Sci. 2011. 61(3):
211–215.
4. Martens-Lobenhoffer J., Bode-Böger S.M. Chromato-
gra phic-mass spectrometric methods for the quanti fica-
tion of L-arginine and its methylated metabolites in
biological fluids. J. Chromatography B. 2007. 851(1—2):
30—41.
5. Bhandare Pravin, Madhavan P., Rao B.M., Someswar
Rao N. Determination of arginine, lysine and histidine in
drug substance and drug product without derivatisation
by using HILIC column LC technique. J. Chem. Pharm.
Res. 2010. 2(5): 580—586.
6. Mira O.R.J. Quantitative determination of. L-arginine
by enzymatic End-Point analysis. Agric. Food Chem.
2001. 49(2): 549—552.
7. L-Arginine/Urea/Ammonia, UV method. URL: https://
www.nzytech.com/products-services/analytical-test-
kits/ak00171/ (Last accessed: 20.04.2017).
8. Yasuhisa A., Masafumi K. Rapid enzymatic assays for L-
citrulline and L-arginine based on the platform of py ro-
phosphate detection. Enz. Microb. Technol. 2014. 57(10):
36—41.
9. Gayda G.Z., Stasyuk N.Ye., Gonchar M.V. Methods for
L-arginine assay. Biotechnologia Acta. 2014. 1: 31—39 [in
Ukrainian].
10. Stasyuk N.Ye., Gayda G.Z., Gayda A.V., Gonchar M.V.,
Kovalchuk Ye.P. Enzymatic method for L-arginine assay
by the use of recombinant human liver arginase I. Ukr.
Biorg. Acta. 2012. 1: 31—37 [in Ukrainian].
11. Stasyuk N., Gayda G., Gonchar M. L-arginine assay with
the use of arginase I. App. Biochem. Microbiol. 2013.
49(5): 529—534.
12. Gayda G., Stasyuk N., Sybirna M., Gonchar M. Enzy-
matic method of L-arginine determination in rat serum.
Scientific Journal "ScienceRise". 2015. 11/6(16): 33–38
[in Ukrainian].
13. Stasyuk N.Ye., Bass S.R., Gayda G.Z., Yepremyan H.S.,
Gonchar M.V. New enzymatic method for L-arginine as-
say based on human arginase I and urease. Scientific Jour-
nal «ScienceRise». 2015. 6/1(11): 43—48 [in Ukrainian].
14. Stasyuk N.Ye., Gayda G.Z., Yepremyan H.S., Gonchar M.V.
Simultaneous fluorometric arginase/urease-based assay
of L-arginine, urea and ammonium. Spectrochimica Acta,
Part A. 2017. 170: 184—190.
72 ISSN 1815-2066. Nauka innov. 2017, 13 (4)
Н.Є. Стасюк, Г.З. Гайда, А.Є. Закальський, О.М. Закальська, Л.Р. Фаюра, О.І. Вовк, О.В. Стасик, А.А. Сибірний, М.В. Гончар
15. Stasyuk N., Gayda G., Fayura L., Boretskyy Y.R.,
Gonchar M.V., Sibirny A.A. Novel arginine deiminase-
based method to assay L-Arginine in beverages. Food
chemistry. 2016. 201: 320—326.
16. Patent of Ukraine No. 108773. Stasyuk N., Gayda G.,
Fayura L., Boretskyy Y.R., Sibirny A.A., Gonchar M.V.
Enzymatic-chemical method for L-arginine assay in
foods and alcoholic beverages [іn Ukrainian].
17. Stasyuk N., Gayda G., Kovalchuk Ye., Stasyk O., Gon-
char M. Isolation and characterization of arginase I
from the recombinant yeast Нansenula polymorpha. Ukr.
Biochem. J. 2010. 82(6): 14—21 [іn Ukrainian].
18. Zakalskiy A.E., Zakalska O.M., Rzhepetskyy Y.A., Sta-
syk O.V., Horak D., Gonchar M.V. Overexpression of
(His)6-tagged human arginase I in Saccharomyces cerevi-
siae and enzyme purification using metal affinity chroma-
to graphy. Protein Expr. Purif. 2012. 81:63—68.
19. Stasyk O.V., Boretsky Y.R., Gonchar M.V., Sibirny A.A.
Recombinant arginine-degrading enzymes in metabolic
anticancer therapy and biosensorics. Cell Biol. Intern.
2015. 39(3): 246—252.
20. Fayura L.R., Boretsky Y.R., Pynyaha Y.V., Wheatley D.N.,
Sibirny A.A. Improved method for expression and
isolation of the Mycoplasma hominis arginine deiminase
from the recombinant strain of Escherichia coli. J.
Biotechnol. 2013. 167(4): 420—426.
21. Fayura L., Boretsky Y., Pynyaha Y., Martynyuk N.,
Skorohod V., Sibirny A. Development of cultivation
technology for the Escherichia coli recombinant strain
producing arginine deiminase of Mycoplasma hominis.
Nauka i innovacii (Science and Innovation). 2014. 10(4):
32—39 [іn Ukrainian].
22. Derffel K. Statistics in Analytical Chemistry. Moscow,
1994. 267 p. [іn Russian].
23. Patent of Ukraine No. 107543. Stasyuk N., Gayda G.,
Zakalskiy A.Ye., Zakalska O.M., Gonchar M.V. Enzymatic
method for L-arginine assay in human serum [іn
Ukrainian].
Recieved 21.12.16
Stasyuk, N., Gayda, G., Zakalskiy, A., Zakalska, O., Fayura, L.,
Vovk, O., Stasyk, O., Sibirny, A., and Gonchar, M.
Institute of Cell Biology, the NAS of Ukraine,
14/16, Drahomanov St., Lviv,
79005, Ukraine; tel.: +380 32 261 2108,
fax. +380 32 261 2148, E-mail: galina.gayda@gmail.com
RECOMBINANT FORMS OF ARGINASE
AND ARGININE DEIMINASE AS CATALYTIC
COMPONENTS OF ARGITEST ENZYMATIC KIT
FOR L-ARGININE ANALYSIS
For the time, no screening test kits for L-arginine moni-
toring in biological fluids, including the blood, have been avai-
lable in the arsenal of domestic clinical diagnostics. The Argi-
test enzymatic kit is based on the enzymatic-chemical me thod
of L-arginine quantitative analysis developed using differ-
ent forms of recombinant human liver arginase I (arginase)
and arginine deiminase. The method is highly selective,
cheap, simple, and fast. It is remarkable for stability of
enzy mes and final products. The article demonstrates the
possibi lity of using recombinant arginine-selective en-
zymes in com po si tion of Argitest kit. The catalytic and
analytic characteristics of the se enzymes have been stud-
ied. It has been shown that each enzyme can be used as a
component of enzymatic kit.
Keywords : L-arginine, arginase I, arginine deiminase,
2,3-butanedione monoxime, urease, and Argitest enzymatic kit.
Н.Е. Стасюк, Г.З. Гайда, А.Е. Закальский,
О.М. Закальска, Л.Р. Фаюра, Е.И. Вовк,
О.В. Стасык, А.А. Сибирный, М.В. Гончар
Институт биологии клетки НАН Украины,
ул. Драгоманова, 14/16, Львов, 79005, Украина,
Teл. +380 32 261 2108, факс +380 32 261 2148
E-mail: galina.gayda@gmail.com
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ФОРМЫ АРГИНАЗЫ
И АРГИНИНДЕИМИНАЗЫ
КАК КАТАЛИТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ
ЭНЗИМАТИЧЕСКОГО НАБОРА «АРГИТЕСТ»
ДЛЯ АНАЛИЗА L-АРГИНИНА
В настоящее время скрининговые тест-системы для
мо ниторинга L-аргинина в биологических жидкостях, в
том числе, в крови, в отечественной клинической диа-
гностике отсутствуют. Энзиматический набор «Арги-
тест» базируется на разработанном энзиматическо-хи-
мическом методе количественного анализа L-аргинина с
использованием разных форм рекомбинантной аргина-
зы І печени человека и аргининдеиминазы. Метод явля-
ется высокоселективным, экономично выгодным, прос-
тым и быстрым в исполнении, отличается стабильностью
энзиматических препаратов и продукта реакции. В ста-
тье продемонстрирована возможность использования
препаратов рекомбинантных аргинин-селективных эн-
зимов в составе набора «Aргитест». В результате иссле-
дований определены каталитические и аналитические
характеристики энзиматических препаратов и показано,
что каждый из них может быть использован как компо-
нент энзиматического набора.
Ключевые слова : L-aргинин, aргиназа І, aргининде-
иминаза, 2,3-бутандионмонооксим, уреаза, энзиматичес-
кий набор «Аргитест».
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-124896 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1815-2066 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T19:04:30Z |
| publishDate | 2017 |
| publisher | Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Стасюк, Н.Є. Гайда, Г.З. Закальський, А.Є. Закальська, О.М. Фаюра, Л.Р. Вовк, О.І. Стасик, О.В. Сибірний, А.А. Гончар, М.В. 2017-10-11T13:25:25Z 2017-10-11T13:25:25Z 2017 Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як ка талітичні складові ензиматичного набору "Аргітест" для аналізу L-аргініну / Н.Є. Стасюк, Г.З. Гайда, А.Є. Закальський, О.М. Закальська, Л.Р. Фаюра, О.І. Вовк, О.В. Стасик, А.А. Сибірний, М.В. Гончар // Наука та інновації. — 2017. — Т. 13, № 4. — С. 64—72. — Бібліогр.: 23 назв. — укр. 1815-2066 DOI: doi.org/10.15407/scin13.03.065 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/124896 На сьогодні скринінгові тест-системи для моніторингу L-аргініну у біологічних рідинах, зокрема, у крові, в арсеналі засобів вітчизняної клінічної діагностики відсутні. Ензиматичний набір «Аргітест» базується на розробленому
 ензиматично-хімічному методі кількісного аналізу L-аргініну з використанням різних форм рекомбінантної аргінази І печінки людини та аргініндеімінази. Метод є високоселективним, економічно вигідним, простим та швидким у виконанні, відзначається стабільністю препаратів ензимів та продукту реакції. У статті доведено можливість використання препаратів рекомбінантних аргініно-селективних ензимів у складі набору «Aргітест». В результаті досліджень вивчено каталітичні та аналітичні характеристики цих препаратів та показано, що кожен з них може бути використано як складову ензиматичного набору. For the time, no screening test kits for L-arginine monitoring
 in biological fluids, including the blood, have been available
 in the arsenal of domestic clinical diagnostics. The Argitest
 enzymatic kit is based on the enzymatic-chemical me thod
 of L-arginine quantitative analysis developed using different
 forms of recombinant human liver arginase I (arginase)
 and arginine deiminase. The method is highly selective,
 cheap, simple, and fast. It is remarkable for stability of
 enzy mes and final products. The article demonstrates the
 possibi lity of using recombinant arginine-selective enzymes
 in com po si tion of Argitest kit. The catalytic and
 analytic characteristics of the se enzymes have been studied.
 It has been shown that each enzyme can be used as a component of enzymatic kit. В настоящее время скрининговые тест-системы для
 мониторинга L-аргинина в биологических жидкостях, в
 том числе, в крови, в отечественной клинической диагностике отсутствуют. Энзиматический набор «Аргитест» базируется на разработанном энзиматическо-химическом методе количественного анализа L-аргинина с
 использованием разных форм рекомбинантной аргиназы І печени человека и аргининдеиминазы. Метод является высокоселективным, экономично выгодным, простым и быстрым в исполнении, отличается стабильностью
 энзиматических препаратов и продукта реакции. В статье продемонстрирована возможность использования
 препаратов рекомбинантных аргинин-селективных энзимов в составе набора «Aргитест». В результате исследований определены каталитические и аналитические характеристики энзиматических препаратов и показано,
 что каждый из них может быть использован как компонент энзиматического набора. Роботу виконано за фінансової підтримки
 НАН України в рамках науково-технічної програми «Розробка, тестування та випуск пробної серії ензиматичного набору «Aргітест» для аналізу аргініну в клінічних зразках». Розділ 1. Оптимізація складу набору, умов проведення аналізу та розробка науково-технічної документації» (Проект 29-2015) у 2015 р., комплексної науково-технічної програми «Сенсорні прилади для медико-екологічних та промислово-технологічних потреб: метрологічне забезпечення та дослідна експлуатація» (Проект № 13-2017) у 2013—2017 рр. та стипендії
 президента України для молодих вчених (Стасюк Н.Є.) у 2016—2017 р. uk Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Наука та інновації Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як ка талітичні складові ензиматичного набору "Аргітест" для аналізу L-аргініну Recombinant Forms of Arginase and Arginine Deiminase as Catalytic Components of Argitest Enzymatic Kit for L-arginine Analysis Рекомбинантные формы аргиназы и аргининдеиминазы как каталитические компоненты энзиматического набора «Аргитест» для анализа L-аргинина Article published earlier |
| spellingShingle | Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як ка талітичні складові ензиматичного набору "Аргітест" для аналізу L-аргініну Стасюк, Н.Є. Гайда, Г.З. Закальський, А.Є. Закальська, О.М. Фаюра, Л.Р. Вовк, О.І. Стасик, О.В. Сибірний, А.А. Гончар, М.В. Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України |
| title | Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як ка талітичні складові ензиматичного набору "Аргітест" для аналізу L-аргініну |
| title_alt | Recombinant Forms of Arginase and Arginine Deiminase as Catalytic Components of Argitest Enzymatic Kit for L-arginine Analysis Рекомбинантные формы аргиназы и аргининдеиминазы как каталитические компоненты энзиматического набора «Аргитест» для анализа L-аргинина |
| title_full | Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як ка талітичні складові ензиматичного набору "Аргітест" для аналізу L-аргініну |
| title_fullStr | Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як ка талітичні складові ензиматичного набору "Аргітест" для аналізу L-аргініну |
| title_full_unstemmed | Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як ка талітичні складові ензиматичного набору "Аргітест" для аналізу L-аргініну |
| title_short | Рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як ка талітичні складові ензиматичного набору "Аргітест" для аналізу L-аргініну |
| title_sort | рекомбінантні форми аргінази та аргініндеімінази як ка талітичні складові ензиматичного набору "аргітест" для аналізу l-аргініну |
| topic | Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України |
| topic_facet | Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/124896 |
| work_keys_str_mv | AT stasûknê rekombínantníformiargínazitaargíníndeímínaziâkkatalítičnískladovíenzimatičnogonaboruargítestdlâanalízulargínínu AT gaidagz rekombínantníformiargínazitaargíníndeímínaziâkkatalítičnískladovíenzimatičnogonaboruargítestdlâanalízulargínínu AT zakalʹsʹkiiaê rekombínantníformiargínazitaargíníndeímínaziâkkatalítičnískladovíenzimatičnogonaboruargítestdlâanalízulargínínu AT zakalʹsʹkaom rekombínantníformiargínazitaargíníndeímínaziâkkatalítičnískladovíenzimatičnogonaboruargítestdlâanalízulargínínu AT faûralr rekombínantníformiargínazitaargíníndeímínaziâkkatalítičnískladovíenzimatičnogonaboruargítestdlâanalízulargínínu AT vovkoí rekombínantníformiargínazitaargíníndeímínaziâkkatalítičnískladovíenzimatičnogonaboruargítestdlâanalízulargínínu AT stasikov rekombínantníformiargínazitaargíníndeímínaziâkkatalítičnískladovíenzimatičnogonaboruargítestdlâanalízulargínínu AT sibírniiaa rekombínantníformiargínazitaargíníndeímínaziâkkatalítičnískladovíenzimatičnogonaboruargítestdlâanalízulargínínu AT gončarmv rekombínantníformiargínazitaargíníndeímínaziâkkatalítičnískladovíenzimatičnogonaboruargítestdlâanalízulargínínu AT stasûknê recombinantformsofarginaseandargininedeiminaseascatalyticcomponentsofargitestenzymatickitforlarginineanalysis AT gaidagz recombinantformsofarginaseandargininedeiminaseascatalyticcomponentsofargitestenzymatickitforlarginineanalysis AT zakalʹsʹkiiaê recombinantformsofarginaseandargininedeiminaseascatalyticcomponentsofargitestenzymatickitforlarginineanalysis AT zakalʹsʹkaom recombinantformsofarginaseandargininedeiminaseascatalyticcomponentsofargitestenzymatickitforlarginineanalysis AT faûralr recombinantformsofarginaseandargininedeiminaseascatalyticcomponentsofargitestenzymatickitforlarginineanalysis AT vovkoí recombinantformsofarginaseandargininedeiminaseascatalyticcomponentsofargitestenzymatickitforlarginineanalysis AT stasikov recombinantformsofarginaseandargininedeiminaseascatalyticcomponentsofargitestenzymatickitforlarginineanalysis AT sibírniiaa recombinantformsofarginaseandargininedeiminaseascatalyticcomponentsofargitestenzymatickitforlarginineanalysis AT gončarmv recombinantformsofarginaseandargininedeiminaseascatalyticcomponentsofargitestenzymatickitforlarginineanalysis AT stasûknê rekombinantnyeformyarginazyiarginindeiminazykakkatalitičeskiekomponentyénzimatičeskogonaboraargitestdlâanalizalarginina AT gaidagz rekombinantnyeformyarginazyiarginindeiminazykakkatalitičeskiekomponentyénzimatičeskogonaboraargitestdlâanalizalarginina AT zakalʹsʹkiiaê rekombinantnyeformyarginazyiarginindeiminazykakkatalitičeskiekomponentyénzimatičeskogonaboraargitestdlâanalizalarginina AT zakalʹsʹkaom rekombinantnyeformyarginazyiarginindeiminazykakkatalitičeskiekomponentyénzimatičeskogonaboraargitestdlâanalizalarginina AT faûralr rekombinantnyeformyarginazyiarginindeiminazykakkatalitičeskiekomponentyénzimatičeskogonaboraargitestdlâanalizalarginina AT vovkoí rekombinantnyeformyarginazyiarginindeiminazykakkatalitičeskiekomponentyénzimatičeskogonaboraargitestdlâanalizalarginina AT stasikov rekombinantnyeformyarginazyiarginindeiminazykakkatalitičeskiekomponentyénzimatičeskogonaboraargitestdlâanalizalarginina AT sibírniiaa rekombinantnyeformyarginazyiarginindeiminazykakkatalitičeskiekomponentyénzimatičeskogonaboraargitestdlâanalizalarginina AT gončarmv rekombinantnyeformyarginazyiarginindeiminazykakkatalitičeskiekomponentyénzimatičeskogonaboraargitestdlâanalizalarginina |