Стовбурові клітини нервової тканини людини in vitro
Предметом дослідження були особливості росту в культурі фракції Nest-позитивних клітин головного мозку ембріонів людини. Наші дані демонструють вірогідне підвищення процентного вмісту Nest-позитивних клітин в клітинній популяції з 44,1 до 62,5 % у відповідь на наявність EGF та bFGF в поживному серед...
Збережено в:
| Дата: | 2012 |
|---|---|
| Автори: | , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Ukrainian |
| Опубліковано: |
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
2012
|
| Назва видання: | Цитология и генетика |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/126457 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Стовбурові клітини нервової тканини людини in vitro / В.І. Цимбалюк, І.Г. Васильєва, Н.П. Олексенко, Н.Г. Чопик, О.І. Цюбко, О.С. Галанта, Н.Д. Сніцар // Цитология и генетика. — 2012. — Т. 46, № 1. — С. 71-74. — Бібліогр.: 6 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-126457 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1264572025-02-23T19:36:16Z Стовбурові клітини нервової тканини людини in vitro Стволовые клетки нервной ткани человека in vitro Human nerve stem cells in vitro Цимбалюк, В.І. Васильєва, І.Г. Олексенко, Н.П. Чопик, Н.Г. Цюбко, О.І. Галанта, О.С. Сніцар Н.Д. Оригинальные работы Предметом дослідження були особливості росту в культурі фракції Nest-позитивних клітин головного мозку ембріонів людини. Наші дані демонструють вірогідне підвищення процентного вмісту Nest-позитивних клітин в клітинній популяції з 44,1 до 62,5 % у відповідь на наявність EGF та bFGF в поживному середовищі із термоінактивованою сироваткою. Подальше диференціювання в культурі призводить до зменшення чисельності Nest-позитивних клітин. Стимуляція нейроіндукції з використанням ретиноєвої кислоти викликає зниження процентного вмісту цих клітин в популяції до 14,1 %. Результати роботи дозволять отримувати популяцію нервових клітин, більш ефективну для використання як матеріалу при клітинній терапії. Предметом исследования были особенности роста в культуре фракции Nest-положительных клеток головного мозга эмбрионов человека. Наши данные демонстрируют достоверное повышение процентного содержания Nest-положительных клеток в клеточной популяции с 44,1 до 62,5 % в ответ на присутствие EGF и bFGF в культуральной среде с термоинактивированной сывороткой. Дальнейшая дифференцировка в культуре приводит уменьшению количества Nest-положительных клеток. Стимуляция нейроиндукции с использованием ретиноевой кислоты вызывает падение процентного содержания этих клеток в популяции до 14,1 %. Результаты работы позволят получать популяцию нервных клеток, более эффективную для использования в качестве материала при клеточной терапии. The expansion of Nest-positive nerve stem cells fraction in the culture of human fetal brain was investigated in this work. Our results demonstrated the valuable increase of the percentage of Nest-positive cells from 44.1 to 62.5 % of cell population at the response to the presence of EGF and bFGF and using the heat-inactivated serum in the culture medium. Further differentiation in culture tended to decrease of Nest-positive cell amount. Stimulation of the neuroinduction with retinoic acid resulted in decrease of the percentage of these cells in the population to 14.1 %. This data allowed obtaining the nerve cell population more effective for using as a graft material in cell therapy. 2012 Article Стовбурові клітини нервової тканини людини in vitro / В.І. Цимбалюк, І.Г. Васильєва, Н.П. Олексенко, Н.Г. Чопик, О.І. Цюбко, О.С. Галанта, Н.Д. Сніцар // Цитология и генетика. — 2012. — Т. 46, № 1. — С. 71-74. — Бібліогр.: 6 назв. — укр. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/126457 611-018.46(048.8):612.82:611–018.82 uk Цитология и генетика application/pdf Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Оригинальные работы Оригинальные работы |
| spellingShingle |
Оригинальные работы Оригинальные работы Цимбалюк, В.І. Васильєва, І.Г. Олексенко, Н.П. Чопик, Н.Г. Цюбко, О.І. Галанта, О.С. Сніцар Н.Д. Стовбурові клітини нервової тканини людини in vitro Цитология и генетика |
| description |
Предметом дослідження були особливості росту в культурі фракції Nest-позитивних клітин головного мозку ембріонів людини. Наші дані демонструють вірогідне підвищення процентного вмісту Nest-позитивних клітин в клітинній популяції з 44,1 до 62,5 % у відповідь на наявність EGF та bFGF в поживному середовищі із термоінактивованою сироваткою. Подальше диференціювання в культурі призводить до зменшення чисельності Nest-позитивних клітин. Стимуляція нейроіндукції з використанням ретиноєвої кислоти викликає зниження процентного вмісту цих клітин в популяції до 14,1 %. Результати роботи дозволять отримувати популяцію нервових клітин, більш ефективну для використання як матеріалу при клітинній терапії. |
| format |
Article |
| author |
Цимбалюк, В.І. Васильєва, І.Г. Олексенко, Н.П. Чопик, Н.Г. Цюбко, О.І. Галанта, О.С. Сніцар Н.Д. |
| author_facet |
Цимбалюк, В.І. Васильєва, І.Г. Олексенко, Н.П. Чопик, Н.Г. Цюбко, О.І. Галанта, О.С. Сніцар Н.Д. |
| author_sort |
Цимбалюк, В.І. |
| title |
Стовбурові клітини нервової тканини людини in vitro |
| title_short |
Стовбурові клітини нервової тканини людини in vitro |
| title_full |
Стовбурові клітини нервової тканини людини in vitro |
| title_fullStr |
Стовбурові клітини нервової тканини людини in vitro |
| title_full_unstemmed |
Стовбурові клітини нервової тканини людини in vitro |
| title_sort |
стовбурові клітини нервової тканини людини in vitro |
| publisher |
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України |
| publishDate |
2012 |
| topic_facet |
Оригинальные работы |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/126457 |
| citation_txt |
Стовбурові клітини нервової тканини людини in vitro / В.І. Цимбалюк, І.Г. Васильєва, Н.П. Олексенко, Н.Г. Чопик, О.І. Цюбко, О.С. Галанта, Н.Д. Сніцар // Цитология и генетика. — 2012. — Т. 46, № 1. — С. 71-74. — Бібліогр.: 6 назв. — укр. |
| series |
Цитология и генетика |
| work_keys_str_mv |
AT cimbalûkví stovburovíklítininervovoítkaninilûdiniinvitro AT vasilʹêvaíg stovburovíklítininervovoítkaninilûdiniinvitro AT oleksenkonp stovburovíklítininervovoítkaninilûdiniinvitro AT čopikng stovburovíklítininervovoítkaninilûdiniinvitro AT cûbkooí stovburovíklítininervovoítkaninilûdiniinvitro AT galantaos stovburovíklítininervovoítkaninilûdiniinvitro AT snícarnd stovburovíklítininervovoítkaninilûdiniinvitro AT cimbalûkví stvolovyekletkinervnojtkaničelovekainvitro AT vasilʹêvaíg stvolovyekletkinervnojtkaničelovekainvitro AT oleksenkonp stvolovyekletkinervnojtkaničelovekainvitro AT čopikng stvolovyekletkinervnojtkaničelovekainvitro AT cûbkooí stvolovyekletkinervnojtkaničelovekainvitro AT galantaos stvolovyekletkinervnojtkaničelovekainvitro AT snícarnd stvolovyekletkinervnojtkaničelovekainvitro AT cimbalûkví humannervestemcellsinvitro AT vasilʹêvaíg humannervestemcellsinvitro AT oleksenkonp humannervestemcellsinvitro AT čopikng humannervestemcellsinvitro AT cûbkooí humannervestemcellsinvitro AT galantaos humannervestemcellsinvitro AT snícarnd humannervestemcellsinvitro |
| first_indexed |
2025-11-24T16:25:48Z |
| last_indexed |
2025-11-24T16:25:48Z |
| _version_ |
1849689687794384896 |
| fulltext |
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2012. ¹ 1 71
© Â.². ÖÈÌÁÀËÞÊ, ².Ã. ÂÀÑÈËܪÂÀ, Í.Ï. ÎËÅÊÑÅÍÊÎ,
Í.Ã. ×ÎÏÈÊ, Î.². ÖÞÁÊÎ, Î.Ñ. ÃÀËÀÍÒÀ, Í.Ä. ÑͲÖÀÐ,
2012
УДК 611-018.46(048.8):612.82:611–018.82
В.І. ЦИМБАЛЮК, І.Г. ВАСИЛЬЄВА, Н.П. ОЛЕКСЕНКО,
Н.Г. ЧОПИК, О.І. ЦЮБКО, О.С. ГАЛАНТА, Н.Д. СНІЦАР
ДУ «Інститут нейрохірургії ім. А.П. Ромоданова АМН України», Київ
E-mail: N.Oleksenko@gmail.com
СТОВБУРОВІ КЛІТИНИ НЕРВОВОЇ
ТКАНИНИ ЛЮДИНИ IN VITRO
Ïðåäìåòîì äîñë³äæåííÿ áóëè îñîáëèâîñò³ ðîñ-
òó â êóëüòóð³ ôðàêö³¿ Nest-ïîçèòèâíèõ êë³òèí ãî-
ëîâíîãî ìîçêó åìáð³îí³â ëþäèíè. Íàø³ äàí³ äåìîí-
ñòðóþòü â³ðîã³äíå ï³äâèùåííÿ ïðîöåíòíîãî âì³ñòó
Nest-ïîçèòèâíèõ êë³òèí â êë³òèíí³é ïîïóëÿö³¿ ç 44,1
äî 62,5 % ó â³äïîâ³äü íà íàÿâí³ñòü EGF òà bFGF â
ïîæèâíîìó ñåðåäîâèù³ ³ç òåðìî³íàêòèâîâàíîþ ñèðî-
âàòêîþ. Ïîäàëüøå äèôåðåíö³þâàííÿ â êóëüòóð³ ïðè-
çâîäèòü äî çìåíøåííÿ ÷èñåëüíîñò³ Nest-ïîçèòèâíèõ
êë³òèí. Ñòèìóëÿö³ÿ íåéðî³íäóêö³¿ ç âèêîðèñòàííÿì
ðåòèíîºâî¿ êèñëîòè âèêëèêຠçíèæåííÿ ïðîöåíòíîãî
âì³ñòó öèõ êë³òèí â ïîïóëÿö³¿ äî 14,1 %. Ðåçóëüòàòè
ðîáîòè äîçâîëÿòü îòðèìóâàòè ïîïóëÿö³þ íåðâîâèõ
êë³òèí, á³ëüø åôåêòèâíó äëÿ âèêîðèñòàííÿ ÿê ìà-
òåð³àëó ïðè êë³òèíí³é òåðàﳿ.
Âñòóï. Âëàñòèâîñò³ ïîïóëÿö³¿ íåðâîâèõ
êë³òèí â êóëüòóð³ çàëåæàòü â³ä íàÿâíîñò³ â
í³é ñòîâáóðîâèõ êë³òèí òà ¿õíüî¿ çàãàëüíî¿
÷èñåëüíîñò³ â³äíîñíî ³íøèõ êë³òèííèõ åëå-
ìåíò³â.  óìîâàõ in vitro öåé ïîêàçíèê âè-
çíà÷ຠçäàòí³ñòü äî íàðîùóâàííÿ êë³òèííî¿
ìàñè, ôîðìóâàííÿ íåéðîñôåð, íàïðàâëåíîãî
äèôåðåíö³þâàííÿ ï³ä âïëèâîì íåéðî³íäóê-
òîð³â.  óìîâàõ in vivo íàÿâí³ñòü äîñòàòíüî¿
ê³ëüêîñò³ âëàñíèõ àáî òðàíñïëàíòîâàíèõ ñòîâ-
áóðîâèõ íåðâîâèõ êë³òèí çàáåçïå÷óº ðåãåíå-
ðàö³þ óøêîäæåíèõ ôóíêö³é íåðâîâî¿ ñèñòåìè.
Ìàðêåðè êë³òèííèõ òèï³â íåðâîâî¿ ñèñòå-
ìè º äîñòàòíüî âèâ÷åíèìè. Ñòîâáóðîâ³ êë³òè-
íè âèçíà÷àþòüñÿ ÿê íåñòèí-ïîçèòèâí³ (Nest+)
[1]. Çàãàëüíîâèçíàíèì ìàðêåðîì íåéðîáëàñ-
ò³â º -òóáóë³í. Îáèäâà ìàðêåðè íàëåæàòü
äî á³ëê³â ïðîì³æíèõ ô³ëàìåíò³â, ùî çàáåç-
ïå÷óþòü çâ’ÿçîê ì³æ ïîçàêë³òèííèì ìàòðèê-
ñîì, öèòîïëàçìîþ òà ÿäðîì. Çì³íà òèïó ïðî-
ì³æíèõ ô³ëàìåíò³â â³äîáðàæóº çì³íó ôóíê-
ö³é êë³òèíè òà ïîòðåá êë³òèííîãî òðàíñïîðòó.
Ìåòîþ íàøî¿ ðîáîòè áóëî äîñë³äèòè ÷è-
ñåëüí³ñòü çãàäàíèõ êë³òèííèõ òèï³â ó ñóñïåí-
ç³éí³é êóëüòóð³ êë³òèí åìáð³îíàëüíî¿ íåðâî-
âî¿ ñèñòåìè ëþäèíè òà ïðîàíàë³çóâàòè çì³íó
¿õíüîãî ñï³ââ³äíîøåííÿ ï³ä âïëèâîì ôàêòî-
ð³â-ì³òîãåí³â òà ³íäóêòîð³â äèôåðåíö³þâàííÿ.
Ñï³ââ³äíîøåííÿ ì³æ ñòîâáóðîâèìè Nest+
êë³òèíàìè òà äèôåðåíö³éîâàíèìè -òóáóë³í+
íåéðîáëàñòàìè, íà íàø ïîãëÿä, º âàæëèâèì
ïîêàçíèêîì, ùî âèçíà÷ຠïëàñòè÷í³ñòü ïî-
ïóëÿö³¿ íåðâîâèõ êë³òèí ³ äîçâîëÿº ïåðåä-
áà÷èòè åôåêòèâí³ñòü ¿¿ çàñòîñóâàííÿ ÿê ìà-
òåð³àëó äëÿ íåéðîòðàíñïëàíòàö³¿ òà ³íøèõ
ïîòðåá.
Ìàòåð³àëè òà ìåòîäè. Êóëüòèâóâàííÿ êë³-
òèí. Äëÿ êóëüòèâóâàííÿ âèêîðèñòîâóâàëè
ñóñïåíç³þ íåðâîâèõ êë³òèí åìáð³îíàëüíîãî
ìîçêó. Çàá³ð àáîðòèâíîãî ìàòåð³àëó çä³éñíþ-
âàëè íà ï³äñòàâ³ äîãîâîðó ¹ 17 â³ä 01.01.05
ì³æ ²íñòèòóòîì íåéðîõ³ðóð㳿 ÀÌÍ Óêðà¿-
íè òà Êè¿âñüêîþ ì³ñüêîþ êë³í³÷íîþ ë³êàð-
íåþ ¹ 16. Òêàíèíó ñóñïåíäóâàëè ó ðîç÷è-
í³ Õåíêñà («ÏàíÝêî», ÐÔ) øëÿõîì ìåõàí³÷-
íîãî ï³ïåòóâàííÿ, äîâîäèëè êîíöåíòðàö³þ
êë³òèí äî 1–3•106 â 1 ìë. Ñóñïåíç³þ ðîçëè-
âàëè ó ñòåðèëüí³ ÷àøêè Ïåòð³ íà ñêåëüöÿ,
âêðèò³ ïîë³åòèëåí³ì³íîì.
72 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2012. ¹ 1
Â.². Öèìáàëþê, ².Ã. Âàñèëüºâà, Í.Ï. Îëåêñåíêî òà ³í.
Âïðîäîâæ îäíîãî òèæíÿ çðàçêè êóëüòè-
âóâàëè íà ñåðåäîâèù³ ²ãëà («ÏàíÝêî», ÐÔ)
³ç äîäàâàííÿì òåðìî³íàêòèâîâàíî¿ ñèðîâàòêè
âåëèêî¿ ðîãàòî¿ õóäîáè («Á³îëîÒ», ÐÔ), çáà-
ãà÷åíîìó ôàêòîðàìè EGF òà bFGF â êîí-
öåíòðàö³¿ 20 íã/ìë («Sigma», ÑØÀ) [2].
Ñòèìóëÿö³þ íàïðàâëåíîãî äèôåðåíö³þ-
âàííÿ êë³òèí çä³éñíþâàëè äîäàâàííÿì ðå-
òèíîºâî¿ êèñëîòè («Sigma», ÑØÀ) â êîí-
öåíòðàö³¿ 1 ìêÌ [3]. Ïðè öüîìó êîíòðîëüí³
çðàçêè êóëüòèâóâàëè íà ñòàíäàðòíîìó ñå-
ðåäîâèù³, çáàãà÷åíîìó 10 % ñèðîâàòêè âå-
ëèêî¿ ðîãàòî¿ õóäîáè (ÑÂÐÕ). Çàì³íó ñåðåäî-
âèùà çä³éñíþâàëè ÷åðåç 3–4 äîáè.
Íà 9-òó ³ 11-òó äîáó êóëüòóðàëüí³ çðàçêè
ô³êñóâàëè äëÿ ïîäàëüøèõ äîñë³äæåíü.
Çàãàëüíó ê³ëüê³ñòü êë³òèí ï³äðàõîâóâàëè
â ãåìîöèòîìåòð³ çà äîïîìîãîþ çàáàðâëåííÿ
0,2%-íèì ðîç÷èíîì òðèïàíîâîãî ñèíüîãî
(«Janssen Chemica», Áåëüã³ÿ).
²ìóíîã³ñòîõ³ì³ÿ. Äëÿ ïîäàëüøîãî ïðîâå-
äåííÿ ³ìóíîã³ñòîõ³ì³÷íèõ ðåàêö³é êóëüòó-
ðàëüí³ çðàçêè ô³êñóâàëè 4%-íèì ïàðàôîð-
ìàëüäåã³äîì («Janssen Chemica», Áåëüã³ÿ) ïðè
4 Ñ. Áóëè âèêîðèñòàí³ ïåðâèíí³ àíòèò³ëà
äî íåñòèíó òà -òóáóë³íó («Dako», Äàí³ÿ) ó
ðîçâåäåíí³ 1 : 200 òà 1 : 50 â³äïîâ³äíî òà
âòîðèíí³ àíòèò³ëà äî ìèøèíèõ òà êðîëÿ-
÷èõ á³ëê³â («Dako», Äàí³ÿ). ³çóàë³çàö³þ
çâ’ÿçóâàííÿ ïðîâîäèëè çà äîïîìîãîþ ñèñ-
òåìè Multivision Polymer Detection («Dako»,
Äàí³ÿ). Ïîäàëüøèé àíàë³ç ïðåïàðàò³â çä³é-
ñíþâàëè çà äîïîìîãîþ ñâ³òëîâîãî ì³êðî-
ñêîïó. Îá÷èñëåííÿ âì³ñòó êë³òèí ð³çíèõ òè-
ï³â ïðîâîäèëè çà ðåçóëüòàòàìè ï³äðàõóíê³â
¿õíüî¿ ÷èñåëüíîñò³ â 10 ïîëÿõ çîðó.
Ðåçóëüòàòè äîñë³äæåíü òà ¿õ îáãîâîðåííÿ.
Çàãàëüíèé ï³äðàõóíîê ÷èñåëüíîñò³ òà âèç-
íà÷åííÿ æèòòºçäàòíîñò³ êë³òèí â êóëüòóð³
íå äîçâîëÿº â ïîâí³é ì³ð³ ïåðåäáà÷èòè âëàñ-
òèâîñò³ êë³òèííî¿ ïîïóëÿö³¿. Ñó÷àñí³ ïîòðå-
áè êë³òèííî¿ òåðàﳿ âèìàãàþòü õàðàêòåðè-
ñòèêè êë³òèííèõ òèï³â, ÿê³ ïðèñóòí³ â í³é,
çîêðåìà ñòîâáóðîâèõ êë³òèí.
 ðîáîò³ ìè âèêîðèñòîâóâàëè ñóñïåíç³éíó
êóëüòóðó êë³òèí ãîëîâíîãî ìîçêó åìáð³îí³â
ëþäèíè 9–10 òèæ ãåñòàö³¿ ç 12 çðàçê³â åìá-
ð³îíàëüíîãî ìàòåð³àëó. Ñï³ââ³äíîøåííÿ ñòîâ-
áóðîâèõ êë³òèí íåðâîâî¿ ñèñòåìè òà íåéðî-
áëàñò³â îö³íþâàëè â óìîâàõ ìîäåëþâàííÿ
ì³òîãåíåçó òà íàïðàâëåíîãî äèôåðåíö³þâàí-
íÿ çà íåéðîíàëüíèì òèïîì.
Çà íàøèìè äàíèìè, ùî íàâåäåí³ â òàáëè-
ö³, íà ìîìåíò îòðèìàííÿ òêàíèíè â í³é ì³ñ-
òèëèñÿ íåðâîâ³ åëåìåíòè â òàêîìó ñï³ââ³ä-
íîøåíí³: Nest+ êë³òèíè ñòàíîâèëè 44,1 %,
-òóáóë³í+ êë³òèíè – 17,1 %.
óñòîëîã³÷íèé àíàë³ç ïðåïàðàò³â ïîêàçàâ,
ùî íåðâîâ³ êë³òèíè ï³ñëÿ ñóñïåíäóâàííÿ ïðî-
òÿãîì ïåðøî¿ äîáè â êóëüòóð³ ôîðìóâàëè
àãðåãàòè çì³øàíî¿ ñòðóêòóðè. Nest+ åëå-
ìåíòè áóëè ðîçòàøîâàí³ ãðóïàìè ³ ÿâëÿëè
ñîáîþ ìàë³ òà ñåðåäí³ îêðóãë³ êë³òèíè ç âå-
ëèêèì ñâ³òëèì öåíòðàëüíî ðîçòàøîâàíèì
ÿäðîì òà âóçüêèì îá³äêîì öèòîïëàçìè (ðèñ. 1,
äèâ. âêëåéêó â ê³íö³ íîìåðà). Nest+ àê-
òèâí³ñòü áóëà äîáðå âèðàæåíà òà çîñåðåä-
æåíà ïî ïåðèôå𳿠êë³òèíè. -òóáóë³í+ êë³-
òèíè òàêîæ ìàëè îêðóãëó ôîðìó òà âåëèêå
íåçàáàðâëåíå ÿäðî (ðèñ. 1). Òàêèé ôåíîòèï
âëàñòèâèé êë³òèíàì, ùî íå äîñÿãëè ê³í-
öåâèõ åòàï³â äèôåðåíö³þâàííÿ, âíàñë³äîê
÷îãî çäàòí³ äî ïîä³ëó òà ì³ãðàö³¿.
Äëÿ çá³ëüøåííÿ ÷èñåëüíîñò³ â êë³òèíí³é
ïîïóëÿö³¿ ñòîâáóðîâèõ êë³òèí òà êë³òèí –
ïîïåðåäíèê³â íåéðîãåíåçó ¿¿ ï³ääàâàëè âïëè-
âó ôàêòîð³â-ì³òîãåí³â EGF òà bFGF, âèêî-
ðèñòîâóþ÷è ïîæèâíå ñåðåäîâèùå ç òåðìî-
³íàêòèâîâàíîþ ñèðîâàòêîþ. Çà îäèí òèæ-
äåíü ÷èñåëüí³ñòü êë³òèííî¿ ïîïóëÿö³¿ çá³ëü-
øèëàñÿ â 12–14 ðàç³â, à âì³ñò æèâèõ êë³òèí
äîñÿã 92 % (òàáëèöÿ). Ìîæëèâî ö³ ïðîöåñè
ñòàëè ðåçóëüòàòîì ³íòåíñèâíîãî ðîçìíîæåí-
íÿ æèòòºçäàòíèõ êë³òèí ³, ðóéíóâàííÿ êë³-
òèí, íå çäàòíèõ äî ³ñíóâàííÿ â êóëüòóð³.
Íàéïåðøå ì³ñöå ñåðåä êë³òèííèõ òèï³â,
çäàòíèõ ðîçìíîæóâàòèñÿ â òàêèõ óìîâàõ,
íàëåæèòü Nest+ êë³òèíàì. Ñòàòèñòè÷íî â³-
ðîã³äíå çá³ëüøåííÿ ÷èñåëüíîñò³ ç 42,1 äî
62, 5 % ñâ³ä÷èòü ïðî çíà÷íå çðîñòàííÿ ¿õ-
íüîãî âì³ñòó â êë³òèíí³é ïîïóëÿö³¿ (òàáëè-
öÿ). Çã³äíî ç ë³òåðàòóðíèìè äàíèìè ï³ä
âïëèâîì bFGF â³äáóâàºòüñÿ àêòèâíèé ïî-
ä³ë ñòîâáóðîâèõ íåéðîíàëüíèõ êë³òèí [4].
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2012. ¹ 1 73
Ñòîâáóðîâ³ êë³òèíè íåðâîâî¿ òêàíèíè ëþäèíè in vitro
Ñë³ä òàêîæ çàçíà÷èòè, ùî ñïîñòåð³ãàëàñÿ
òåíäåíö³ÿ äî çá³ëüøåííÿ ÷èñåëüíîñò³ âæå
ñôîðìîâàíèõ íåéðîí³â ( -òóáóë³í+) (òàáëè-
öÿ). Ðåçóëüòàòè íàøèõ äîñë³äæåíü ï³äòâåðä-
æóþòüñÿ äàíèìè ë³òåðàòóðè. Çîêðåìà, Sham-
bra et al. [5] ïîêàçàëè íàÿâí³ñòü ô³ãóð ì³-
òîçó â õîë³íåðã³÷íèõ íåéðîíàõ in vivo. ³-
ðîã³äíî, ùî ïîä³áí³ ïðîöåñè ìàþòü ì³ñöå
â óìîâàõ in vitro, ³ ñôîðìîâàí³ íåéðîáëàñòè
äåÿêèé ÷àñ ï³ñëÿ äèôåðåíö³þâàííÿ çáåð³ãà-
þòü çäàòí³ñòü äî ïîä³ëó òà ì³ãðàö³¿.
Àíàë³ç ã³ñòîëîã³÷íèõ ïðåïàðàò³â ïîêàçàâ,
ùî Nest-ïîçèòèâí³ êë³òèíè áóëè ðîçòàøî-
âàí³ ìàëåíüêèìè ãðóïàìè ïî 2–6 êë³òèí,
ùî â ñâîþ ÷åðãó ôîðìóâàëè âåëèêèé êë³-
òèííèé àãðåãàò, ó ñêëàä ÿêîãî âõîäèëè ³íø³
êë³òèíí³ òèïè (ðèñ. 2, äèâ. âêëåéêó). ×àñòî
Nest+-êë³òèíè çíàõîäèëèñÿ ïî ïåðèôåð³¿
òàêîãî àãðåãàòó, ³ çîíà ðîñòó áóëà ñôîðìî-
âàíà ïåðåâàæíî íèìè. Âîíè çá³ëüøóâàëèñÿ
ó ðîçì³ðàõ, ìàëè âåëèêå ñâ³òëå ÿäðî, ÷àñòî
ðîçòàøîâàíå àñèìåòðè÷íî, òà ³íêîëè íà-
áóâàëè îâàëüíî¿ àáî ïîë³ãîíàëüíî¿ ôîðìè
(ðèñ. 2). Òàê³ ìîðôîëîã³÷í³ çì³íè ñâ³ä÷àòü
ïðî òå, ùî íåçâàæàþ÷è íà â³äñóòí³ñòü àãåí-
ò³â äèôåðåíö³þâàííÿ â ïîæèâíîìó ñåðåäî-
âèù³, â ïîïóëÿö³ÿõ ñòîâáóðîâèõ êë³òèí â³ä-
áóâàºòüñÿ íå ò³ëüêè àêòèâíèé ïîä³ë, à òà-
êîæ ðåàë³çóºòüñÿ ïðîãðàìà äèôåðåíö³àö³¿.
Äëÿ ñòèìóëÿö³¿ äèôåðåíö³þâàííÿ ïîäàëü-
øå êóëüòèâóâàííÿ çä³éñíþâàëè íà ïîâíîìó
ïîæèâíîìó ñåðåäîâèù³ ³ç 10 % ÑÂÐÕ òà
äîäàâàííÿì ðåòèíîºâî¿ êèñëîòè.
Ðåçóëüòàòè ïðîâåäåíèõ äîñë³äæåíü ïîêà-
çàëè, ùî âæå â êîíòðîëüí³é ãðóï³ çàì³íà ñå-
ðåäîâèùà ñïðè÷èíÿëà ð³çêå çíèæåííÿ âì³ñòó
Nest+ êë³òèí ³ç îäíî÷àñíèì çá³ëüøåííÿì -
òóáóë³í+ ôðàêö³¿ äî 34,7 % íà 9-òó äîáó òà äî
36,5 % íà 11-òó äîáó êóëüòèâóâàííÿ (òàáëè-
öÿ). Íà ã³ñòîëîã³÷íèõ ïðåïàðàòàõ ñïîñòåð³-
ãàëè çíà÷íå çíèæåííÿ ÷èñåëüíîñò³ Nest+ êë³-
òèí â çîíàõ ðîñòó, ÿê³ áóëè ñôîðìîâàí³ ïå-
ðåâàæíî -òóáóë³í+ íåéðîíàìè òà íåçàáàð-
âëåíèìè êë³òèíàìè ãë³àëüíîãî ðÿäó (ðèñ. 3,
äèâ. âêëåéêó).
Äîäàâàííÿ ðåòèíîºâî¿ êèñëîòè â êóëüòó-
ðàëüíå ñåðåäîâèùå ñïðè÷èíÿëî ùå á³ëüø
çíà÷íå çíèæåííÿ âì³ñòó Nest+ êë³òèí ç îäíî-
÷àñíèì ï³äâèùåííÿì ÷èñåëüíîñò³ -òóáó-
ë³í+ êë³òèí äî 44,8 % (òàáëèöÿ). ³äîìî, ùî
öÿ ñïîëóêà çä³éñíþº íåéðî³íäóêö³þ øëÿ-
õîì ðåãóëÿö³¿ ð³âíÿ òàêèõ á³ëê³â, ÿê ïðî-
ô³ë³í-1 òà ñòàòì³í, ÿê³ â ñâîþ ÷åðãó âïëè-
âàþòü íà ñòàí àêòèíîâèõ ô³ëàìåíò³â òà
ì³êðîòðóáî÷îê [6]. ʳíöåâèì ðåçóëüòàòîì
êàñêàäó ðåàêö³é, ÿê³ çàïóñêàþòüñÿ ïðè íà-
ÿâíîñò³ ðåòèíîºâî¿ êèñëîòè, º ðåîðãàí³çà-
ö³ÿ öèòîñêåëåòó òà ð³ñò àêñîí³â.
Íà ã³ñòîëîã³÷íèõ ïðåïàðàòàõ -òóáóë³í+
êë³òèíè çóñòð³÷àëèñÿ ÿê ó âèãëÿä³ àãðåãàò³â,
òàê ³ ïîîäèíö³ â ïðîöåñ³ ôîðìóâàííÿ â³ä-
ðîñòê³â ³ âñòàíîâëåííÿ êîíòàêò³â (ðèñ. 4,
²ìóíîã³ñòîõ³ì³÷íå âèÿâëåííÿ ð³çíèõ òèï³â íåðâîâèõ êë³òèí â êóëüòóð³ êë³òèí
åìáð³îíàëüíî¿ íåðâîâî¿ òêàíèíè ëþäèíè
Ñòðîê êóëüòèâóâàííÿ Ïîæèâíå ñåðåäîâèùå
ʳëüê³ñòü êë³òèí
â ïîë³ çîðó, %
Âì³ñò
æèâèõ
êë³òèí,
%Nest+ -òóáóëèí+
Âèõ³äíèé êîíòðîëü
Ôàçà ðîçìíîæåííÿ 7 ä³á
Ôàçà äèôåðåíö³þâàííÿ 9 ä³á
Ôàçà äèôåðåíö³þâàííÿ 11 ä³á
–
DMEM, 10 % òåðì. ÑÂÐÕ, EGF, bFGF
20 íã/ìë
Êîíòðîëü
Äîäàâàííÿ ðåòèíîºâî¿ êèñëîòè
Êîíòðîëü
Äîäàâàííÿ ðåòèíîºâî¿ êèñëîòè
44,1 ± 3,6
62,5 ± 3,6*
27,6 ± 9,2
17,5 ± 6,7
31,4 ± 4,4
14,1 ± 6,3*
17,1 ± 3,6
28,1 ± 6,8
34,7 ± 5,3
42,3 ± 5,0
36,5 ± 5,4
44,8 ± 5,0
80
92
90
91
87
90
* Ð < 0,05.
74 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2012. ¹ 1
Â.². Öèìáàëþê, ².Ã. Âàñèëüºâà, Í.Ï. Îëåêñåíêî òà ³í.
äèâ. âêëåéêó). Âîíè áóëè ïîë³ìîðôíèìè:
çóñòð³÷àëèñÿ îêðóãë³, çåðíîïîä³áí³ òà ïîë³-
ãîíàëüí³ ôîðìè êë³òèí. Îêðåì³ Nest+ êë³-
òèíè ðîçòàøîâóâàëèñÿ ïîîäèíö³, ³íòåíñèâ-
í³ñòü çàáàðâëåííÿ áóëà ñëàáêîþ, öåíòðàëü-
íà ÷àñòèíà öèòîïëàçìè ÷àñòî çàëèøàëàñÿ
íåçàáàðâëåíîþ (ðèñ. 4). Òàêà çì³íà ñï³ââ³ä-
íîøåííÿ êë³òèí íåðâîâî¿ òêàíèíè in vitro
ñâ³ä÷èòü ïðî ³íòåíñèâí³ ïðîöåñè äèôåðåí-
ö³þâàííÿ òà âñòàíîâëåííÿ ôóíêö³îíàëüíèõ
çâ’ÿçê³â ì³æ íèìè.
Îòæå, äîñë³äæåííÿ â êóëüòóð³ åìáð³î-
íàëüíî¿ íåðâîâî¿ òêàíèíè âì³ñòó Nest+ òà
-òóáóë³í+ êë³òèí, à òàêîæ ñï³ââ³äíîøåííÿ
ì³æ íèìè äîçâîëÿº îòðèìàòè ³íôîðìàö³þ
ñòîñîâíî ñòóïåíÿ äèôåðåíö³þâàííÿ êë³òèí-
íî¿ ïîïóëÿö³¿, ¿¿ ïëàñòè÷íîñò³ ³ ìîæëèâîñò³
âèêîðèñòàííÿ ÿê ìàòåð³àëó äëÿ íåéðîòðàíñ-
ïëàíòàö³¿.
V.I. Tsymbaluk, I.G. Vasilyeva, N.P. Olexenko,
N.G. Chopic, O.I. Tsybko, E.S. Galanta, N.D. Snitcar
HUMAN NERVE STEM CELLS IN VITRO
The expansion of Nest-positive nerve stem cells
fraction in the culture of human fetal brain was
investigated in this work. Our results demonstrated the
valuable increase of the percentage of Nest-positive
cells from 44.1 to 62.5 % of cell population at the
response to the presence of EGF and bFGF and using
the heat-inactivated serum in the culture medium.
Further differentiation in culture tended to decrease
of Nest-positive cell amount. Stimulation of the
neuroinduction with retinoic acid resulted in decrease
of the percentage of these cells in the population to
14.1 %. This data allowed obtaining the nerve cell
population more effective for using as a graft material
in cell therapy.
Â.È. Öûìáàëþê, È.Ã. Âàñèëüåâà, Í.Ï. Îëåêñåíêî,
Í.Ã. ×îïèê, Î.È. Öþáêî, Å.Ñ. Ãàëàíòà, Í.Ä. Ñíèöàð
ÑÒÂÎËÎÂÛÅ ÊËÅÒÊÈ ÍÅÐÂÍÎÉ ÒÊÀÍÈ
×ÅËÎÂÅÊÀ IN VITRO
Ïðåäìåòîì èññëåäîâàíèÿ áûëè îñîáåííîñòè ðî-
ñòà â êóëüòóðå ôðàêöèè Nest-ïîëîæèòåëüíûõ êëåòîê
ãîëîâíîãî ìîçãà ýìáðèîíîâ ÷åëîâåêà. Íàøè äàí-
íûå äåìîíñòðèðóþò äîñòîâåðíîå ïîâûøåíèå ïðî-
öåíòíîãî ñîäåðæàíèÿ Nest-ïîëîæèòåëüíûõ êëåòîê
â êëåòî÷íîé ïîïóëÿöèè ñ 44,1 äî 62,5 % â îòâåò íà
ïðèñóòñòâèå EGF è bFGF â êóëüòóðàëüíîé ñðåäå ñ
òåðìîèíàêòèâèðîâàííîé ñûâîðîòêîé. Äàëüíåéøàÿ
äèôôåðåíöèðîâêà â êóëüòóðå ïðèâîäèò óìåíüøå-
íèþ êîëè÷åñòâà Nest-ïîëîæèòåëüíûõ êëåòîê. Ñòè-
ìóëÿöèÿ íåéðîèíäóêöèè ñ èñïîëüçîâàíèåì ðåòè-
íîåâîé êèñëîòû âûçûâàåò ïàäåíèå ïðîöåíòíîãî
ñîäåðæàíèÿ ýòèõ êëåòîê â ïîïóëÿöèè äî 14,1 %.
Ðåçóëüòàòû ðàáîòû ïîçâîëÿò ïîëó÷àòü ïîïóëÿöèþ
íåðâíûõ êëåòîê, áîëåå ýôôåêòèâíóþ äëÿ èñïîëü-
çîâàíèÿ â êà÷åñòâå ìàòåðèàëà ïðè êëåòî÷íîé òå-
ðàïèè.
ÑÏÈÑÎÊ Ë²ÒÅÐÀÒÓÐÈ
1. Âèêòîðîâ È.Â. Ñòâîëîâûå êëåòêè ìëåêîïèòà-
þùèõ: áèîëîãèÿ ñòâîëîâûõ êëåòîê in vivo è in
vitro // Èçâ. ÀÍ. Ñåð. áèîë. – 2001. – ¹ 6. –
Ñ. 645–655.
2. Vescovi A.L., Parati E.A., Gritti A. Isolation and
cloning of multipotential stem cells from the em-
bryonic human CNS and establishment of trans-
plantable human neural stem cell lines by epigene-
tic stimulation // Exp. Neurol. – 1999. – 156,
¹ 1. – Ð. 71–83.
3. Takahashi J., Palmer T.D., Gage F.H. Retinoic
acid and neurotrophins collaborate to regulate
neurogenesis in adult-derived NSC cultures // J.
Neurobiol. – 1999. – 38. – Ð. 65–81.
4. Ostenfeld T., Svendsen C.N. Requirement for
neurogenesis to proceed through the division of
neuronal progenitors following differentiation of
epidermal growth factor and fibroblast growth fac-
tor-2- – responsive human neural stem cells //
Stem Cells. – 2004. – 22, ¹ 5. – Ð. 798–811.
5. Schammbra U.B., Sulik K.K., Petrusz P., Lauder J.M.
Ontogeny of cholinergic neurons in the mouse
forebrain // J. Comp. Neurol. – 1989. – 288,
¹ 1. – Ð. 101–122.
6. Maltman D.J., Christie V.B., Collings J.C., Bar-
nard J.H., Fenyk S., Marder T.B., Whiting A.,
Przyborski S.A. Proteomic profiling of the stem
cells response to retinoic acid and synthetic re-
tinoid analogues: identification of major reti-
noic-inducible proteins // Mol. BioSyst. – 2009. –
5. – P. 458–471.
Íàä³éøëà 21.12.10
<<
/ASCII85EncodePages false
/AllowTransparency false
/AutoPositionEPSFiles true
/AutoRotatePages /None
/Binding /Left
/CalGrayProfile (Dot Gain 20%)
/CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1)
/CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2)
/sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1)
/CannotEmbedFontPolicy /Error
/CompatibilityLevel 1.4
/CompressObjects /Tags
/CompressPages true
/ConvertImagesToIndexed true
/PassThroughJPEGImages true
/CreateJobTicket false
/DefaultRenderingIntent /Default
/DetectBlends true
/DetectCurves 0.0000
/ColorConversionStrategy /CMYK
/DoThumbnails false
/EmbedAllFonts true
/EmbedOpenType false
/ParseICCProfilesInComments true
/EmbedJobOptions true
/DSCReportingLevel 0
/EmitDSCWarnings false
/EndPage -1
/ImageMemory 1048576
/LockDistillerParams false
/MaxSubsetPct 100
/Optimize true
/OPM 1
/ParseDSCComments true
/ParseDSCCommentsForDocInfo true
/PreserveCopyPage true
/PreserveDICMYKValues true
/PreserveEPSInfo true
/PreserveFlatness true
/PreserveHalftoneInfo false
/PreserveOPIComments false
/PreserveOverprintSettings true
/StartPage 1
/SubsetFonts true
/TransferFunctionInfo /Apply
/UCRandBGInfo /Preserve
/UsePrologue false
/ColorSettingsFile ()
/AlwaysEmbed [ true
]
/NeverEmbed [ true
]
/AntiAliasColorImages false
/CropColorImages true
/ColorImageMinResolution 300
/ColorImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleColorImages true
/ColorImageDownsampleType /Bicubic
/ColorImageResolution 1200
/ColorImageDepth -1
/ColorImageMinDownsampleDepth 1
/ColorImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeColorImages false
/ColorImageFilter /DCTEncode
/AutoFilterColorImages true
/ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG
/ColorACSImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/ColorImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/JPEG2000ColorACSImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/JPEG2000ColorImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/AntiAliasGrayImages false
/CropGrayImages true
/GrayImageMinResolution 300
/GrayImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleGrayImages true
/GrayImageDownsampleType /Bicubic
/GrayImageResolution 1200
/GrayImageDepth -1
/GrayImageMinDownsampleDepth 2
/GrayImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeGrayImages false
/GrayImageFilter /DCTEncode
/AutoFilterGrayImages true
/GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG
/GrayACSImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/GrayImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/JPEG2000GrayACSImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/JPEG2000GrayImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/AntiAliasMonoImages false
/CropMonoImages true
/MonoImageMinResolution 1200
/MonoImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleMonoImages true
/MonoImageDownsampleType /Bicubic
/MonoImageResolution 1200
/MonoImageDepth -1
/MonoImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeMonoImages false
/MonoImageFilter /CCITTFaxEncode
/MonoImageDict <<
/K -1
>>
/AllowPSXObjects false
/CheckCompliance [
/None
]
/PDFX1aCheck false
/PDFX3Check false
/PDFXCompliantPDFOnly false
/PDFXNoTrimBoxError true
/PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
]
/PDFXSetBleedBoxToMediaBox true
/PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
]
/PDFXOutputIntentProfile (None)
/PDFXOutputConditionIdentifier ()
/PDFXOutputCondition ()
/PDFXRegistryName ()
/PDFXTrapped /False
/CreateJDFFile false
/Description <<
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
/BGR <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>
/CHS <FEFF4f7f75288fd94e9b8bbe5b9a521b5efa7684002000410064006f006200650020005000440046002065876863900275284e8e9ad88d2891cf76845370524d53705237300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c676562535f00521b5efa768400200050004400460020658768633002>
/CHT <FEFF4f7f752890194e9b8a2d7f6e5efa7acb7684002000410064006f006200650020005000440046002065874ef69069752865bc9ad854c18cea76845370524d5370523786557406300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c4f86958b555f5df25efa7acb76840020005000440046002065874ef63002>
/CZE <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>
/DAN <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>
/DEU <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>
/ESP <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>
/ETI <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>
/FRA <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>
/GRE <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>
/HEB <FEFF05D405E905EA05DE05E905D5002005D105D405D205D305E805D505EA002005D005DC05D4002005DB05D305D9002005DC05D905E605D505E8002005DE05E105DE05DB05D9002000410064006F006200650020005000440046002005D405DE05D505EA05D005DE05D905DD002005DC05D405D305E405E105EA002005E705D305DD002D05D305E405D505E1002005D005D905DB05D505EA05D905EA002E002005DE05E105DE05DB05D90020005000440046002005E905E005D505E605E805D5002005E005D905EA05E005D905DD002005DC05E405EA05D905D705D4002005D105D005DE05E605E205D505EA0020004100630072006F006200610074002005D5002D00410064006F00620065002000520065006100640065007200200035002E0030002005D505D205E805E105D005D505EA002005DE05EA05E705D305DE05D505EA002005D905D505EA05E8002E05D005DE05D905DD002005DC002D005000440046002F0058002D0033002C002005E205D905D905E005D5002005D105DE05D305E805D905DA002005DC05DE05E905EA05DE05E9002005E905DC0020004100630072006F006200610074002E002005DE05E105DE05DB05D90020005000440046002005E905E005D505E605E805D5002005E005D905EA05E005D905DD002005DC05E405EA05D905D705D4002005D105D005DE05E605E205D505EA0020004100630072006F006200610074002005D5002D00410064006F00620065002000520065006100640065007200200035002E0030002005D505D205E805E105D005D505EA002005DE05EA05E705D305DE05D505EA002005D905D505EA05E8002E>
/HRV (Za stvaranje Adobe PDF dokumenata najpogodnijih za visokokvalitetni ispis prije tiskanja koristite ove postavke. Stvoreni PDF dokumenti mogu se otvoriti Acrobat i Adobe Reader 5.0 i kasnijim verzijama.)
/HUN <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>
/ITA <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>
/JPN <FEFF9ad854c18cea306a30d730ea30d730ec30b951fa529b7528002000410064006f0062006500200050004400460020658766f8306e4f5c6210306b4f7f75283057307e305930023053306e8a2d5b9a30674f5c62103055308c305f0020005000440046002030d530a130a430eb306f3001004100630072006f0062006100740020304a30883073002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee5964d3067958b304f30533068304c3067304d307e305930023053306e8a2d5b9a306b306f30d530a930f330c8306e57cb30818fbc307f304c5fc59808306730593002>
/KOR <FEFFc7740020c124c815c7440020c0acc6a9d558c5ec0020ace0d488c9c80020c2dcd5d80020c778c1c4c5d00020ac00c7a50020c801d569d55c002000410064006f0062006500200050004400460020bb38c11cb97c0020c791c131d569b2c8b2e4002e0020c774b807ac8c0020c791c131b41c00200050004400460020bb38c11cb2940020004100630072006f0062006100740020bc0f002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020c774c0c1c5d0c11c0020c5f40020c2180020c788c2b5b2c8b2e4002e>
/LTH <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>
/LVI <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>
/NLD (Gebruik deze instellingen om Adobe PDF-documenten te maken die zijn geoptimaliseerd voor prepress-afdrukken van hoge kwaliteit. De gemaakte PDF-documenten kunnen worden geopend met Acrobat en Adobe Reader 5.0 en hoger.)
/NOR <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>
/POL <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>
/PTB <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>
/RUM <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>
/RUS <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>
/SKY <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>
/SLV <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>
/SUO <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>
/SVE <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>
/TUR <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>
/UKR <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>
/ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents best suited for high-quality prepress printing. Created PDF documents can be opened with Acrobat and Adobe Reader 5.0 and later.)
>>
/Namespace [
(Adobe)
(Common)
(1.0)
]
/OtherNamespaces [
<<
/AsReaderSpreads false
/CropImagesToFrames true
/ErrorControl /WarnAndContinue
/FlattenerIgnoreSpreadOverrides false
/IncludeGuidesGrids false
/IncludeNonPrinting false
/IncludeSlug false
/Namespace [
(Adobe)
(InDesign)
(4.0)
]
/OmitPlacedBitmaps false
/OmitPlacedEPS false
/OmitPlacedPDF false
/SimulateOverprint /Legacy
>>
<<
/AddBleedMarks false
/AddColorBars false
/AddCropMarks false
/AddPageInfo false
/AddRegMarks false
/ConvertColors /ConvertToCMYK
/DestinationProfileName ()
/DestinationProfileSelector /DocumentCMYK
/Downsample16BitImages true
/FlattenerPreset <<
/PresetSelector /MediumResolution
>>
/FormElements false
/GenerateStructure false
/IncludeBookmarks false
/IncludeHyperlinks false
/IncludeInteractive false
/IncludeLayers false
/IncludeProfiles false
/MultimediaHandling /UseObjectSettings
/Namespace [
(Adobe)
(CreativeSuite)
(2.0)
]
/PDFXOutputIntentProfileSelector /DocumentCMYK
/PreserveEditing true
/UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged
/UntaggedRGBHandling /UseDocumentProfile
/UseDocumentBleed false
>>
]
>> setdistillerparams
<<
/HWResolution [2400 2400]
/PageSize [612.000 792.000]
>> setpagedevice
|