Генетическая трансформация растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) химерным геном GFP-TUA6 для визуализации микротрубочек
Представлены результаты по агробактериальной трансформации ряда сортов льна-долгунца, районированных в Республике Беларусь и Украине, плазмидой, которая содержит химерный ген GFP-TUA6 и селективный ген nptII. При проведении экспериментов учитывали факторы, влияющие на эффективность трансформации, а...
Saved in:
| Published in: | Цитология и генетика |
|---|---|
| Date: | 2013 |
| Main Authors: | , , , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
2013
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/126526 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Генетическая трансформация растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) химерным геном GFP-TUA6 для визуализации микротрубочек / Е.Н. Шиша, В.И. Корховой, Г.Я. Баер, Е.В. Гузенко, В.А. Лемеш, Н.А. Картель, А.И. Емец, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2013. — Т. 47, № 2. — С. 3-11. — Бібліогр.: 36 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-126526 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Шиша, Е.Н. Корховой, В.И. Баер, Г.Я. Гузенко, Е.В. Лемеш, В.А. Картель, Н.А. Емец, А.И. Блюм, Я.Б. 2017-11-25T19:09:36Z 2017-11-25T19:09:36Z 2013 Генетическая трансформация растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) химерным геном GFP-TUA6 для визуализации микротрубочек / Е.Н. Шиша, В.И. Корховой, Г.Я. Баер, Е.В. Гузенко, В.А. Лемеш, Н.А. Картель, А.И. Емец, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2013. — Т. 47, № 2. — С. 3-11. — Бібліогр.: 36 назв. — рос. 0564-3783 DOI: 10.3103/S0095452713020096 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/126526 633.52:577.21:632.165 Представлены результаты по агробактериальной трансформации ряда сортов льна-долгунца, районированных в Республике Беларусь и Украине, плазмидой, которая содержит химерный ген GFP-TUA6 и селективный ген nptII. При проведении экспериментов учитывали факторы, влияющие на эффективность трансформации, а именно оптическую плотность, время инокуляции эксплантов с агробактерией и условия кокультивирования. На селективной среде, содержащей канамицин в концентрации 100 мг/л, отобраны линии, трансгенная природа которых подтверждена с помощью ПЦР-анализа. Экспрессию химерного гена GFP-TUA6 изучали с помощью конфокальной лазерной микроскопии. Полученные нами линии в дальнейшем могут быть использованы для углубленного изучения роли микротрубочек в формировании волокон, а также механической устойчивости к полеганию у льна-долгунца. Представлено результати з агробактеріальної трансформації ряду сортів льону-довгунця, районованих на територіях Білорусі та України, за допомогою плазміди, що містила химерний ген GFP-TUA6 та селективний маркерний ген nptII, який несе стійкість до канаміцину. При проведенні трансформації враховували фактори, що впливають на ефективність трансформації, а саме оптичну щільність, оптимальний проміжок часу інокуляції експлантів з агробактерією та умови кокультивування. На селективному середовищі, що містило канаміцин в концентрації 100 мг/л, відібрано лінії, трансгенна природа яких була підтверджена за допомогою ПЛР-аналізу. Експресію химерного гена GFP-TUA6 детектовано за допомогою лазерної скануючої конфокальної мікроскопії. Отримані в ході наших досліджень лінії в подальшому можуть бути використані для поглибленого вивчення ролі мікротрубочок в процесах формування волокна, а також механічної стійкості до полягання у льону-довгунця. The data of Agrobacterium-mediated transformation of some Linum usitatissimum cultivars zoned on the territories of Belarus and Ukraine with the plasmid carrying chimeric GFP-TUA6 gene and nptII gene as selectable marker conferring resistance to kanamycin are presented in this study. Transformation was affected by a number of factors including optical density (OD600), time of inoculation of explants with Agrobacterium and co-culture conditions. Transgenic nature of obtained lines was confirmed by PCR analysis. Expression of GFP-TUA6 gene was detected with confocal laser scanning microscopy. The obtained transgenic lines can be used for further functional studies the role of microtubules in the processes of building the flax fibres and resistance to wind. Работа выполнена при поддержке совместных грантов с Республикой Беларусь и Государственного фонда фундаментальних исследований Украины, гранты № 14.4/023 (2007–2008) и № 29.4/016 (2009–2010). ru Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України Цитология и генетика Оригинальные работы Генетическая трансформация растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) химерным геном GFP-TUA6 для визуализации микротрубочек Генетична трансформація рослин льону-довгунця (Linum usitatissimum L.) хімерним геном GFP-TUA6 для візуалізації мікротрубочок Genetic transformation of flax (Linum usaitatissimum L.) with the chimeric GFP-TUA6 gene for the visualization of microtubules Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Генетическая трансформация растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) химерным геном GFP-TUA6 для визуализации микротрубочек |
| spellingShingle |
Генетическая трансформация растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) химерным геном GFP-TUA6 для визуализации микротрубочек Шиша, Е.Н. Корховой, В.И. Баер, Г.Я. Гузенко, Е.В. Лемеш, В.А. Картель, Н.А. Емец, А.И. Блюм, Я.Б. Оригинальные работы |
| title_short |
Генетическая трансформация растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) химерным геном GFP-TUA6 для визуализации микротрубочек |
| title_full |
Генетическая трансформация растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) химерным геном GFP-TUA6 для визуализации микротрубочек |
| title_fullStr |
Генетическая трансформация растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) химерным геном GFP-TUA6 для визуализации микротрубочек |
| title_full_unstemmed |
Генетическая трансформация растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) химерным геном GFP-TUA6 для визуализации микротрубочек |
| title_sort |
генетическая трансформация растений льна-долгунца (linum usitatissimum l.) химерным геном gfp-tua6 для визуализации микротрубочек |
| author |
Шиша, Е.Н. Корховой, В.И. Баер, Г.Я. Гузенко, Е.В. Лемеш, В.А. Картель, Н.А. Емец, А.И. Блюм, Я.Б. |
| author_facet |
Шиша, Е.Н. Корховой, В.И. Баер, Г.Я. Гузенко, Е.В. Лемеш, В.А. Картель, Н.А. Емец, А.И. Блюм, Я.Б. |
| topic |
Оригинальные работы |
| topic_facet |
Оригинальные работы |
| publishDate |
2013 |
| language |
Russian |
| container_title |
Цитология и генетика |
| publisher |
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Генетична трансформація рослин льону-довгунця (Linum usitatissimum L.) хімерним геном GFP-TUA6 для візуалізації мікротрубочок Genetic transformation of flax (Linum usaitatissimum L.) with the chimeric GFP-TUA6 gene for the visualization of microtubules |
| description |
Представлены результаты по агробактериальной трансформации ряда сортов льна-долгунца, районированных в Республике Беларусь и Украине, плазмидой, которая содержит химерный ген GFP-TUA6 и селективный ген nptII. При проведении экспериментов учитывали факторы, влияющие на эффективность трансформации, а именно оптическую плотность, время инокуляции эксплантов с агробактерией и условия кокультивирования. На селективной среде, содержащей канамицин в концентрации 100 мг/л, отобраны линии, трансгенная природа которых подтверждена с помощью ПЦР-анализа. Экспрессию химерного гена GFP-TUA6 изучали с помощью конфокальной лазерной микроскопии. Полученные нами линии в дальнейшем могут быть использованы для углубленного изучения роли микротрубочек в формировании волокон, а также механической устойчивости к полеганию у льна-долгунца.
Представлено результати з агробактеріальної трансформації ряду сортів льону-довгунця, районованих на територіях Білорусі та України, за допомогою плазміди, що містила химерний ген GFP-TUA6 та селективний маркерний ген nptII, який несе стійкість до канаміцину. При проведенні трансформації враховували фактори, що впливають на ефективність трансформації, а саме оптичну щільність, оптимальний проміжок часу інокуляції експлантів з агробактерією та умови кокультивування. На селективному середовищі, що містило канаміцин в концентрації 100 мг/л, відібрано лінії, трансгенна природа яких була підтверджена за допомогою ПЛР-аналізу. Експресію химерного гена GFP-TUA6 детектовано за допомогою лазерної скануючої конфокальної мікроскопії. Отримані в ході наших досліджень лінії в подальшому можуть бути використані для поглибленого вивчення ролі мікротрубочок в процесах формування волокна, а також механічної стійкості до полягання у льону-довгунця.
The data of Agrobacterium-mediated transformation of some Linum usitatissimum cultivars zoned on the territories of Belarus and Ukraine with the plasmid carrying chimeric GFP-TUA6 gene and nptII gene as selectable marker conferring resistance to kanamycin are presented in this study. Transformation was affected by a number of factors including optical density (OD600), time of inoculation of explants with Agrobacterium and co-culture conditions. Transgenic nature of obtained lines was confirmed by PCR analysis. Expression of GFP-TUA6 gene was detected with confocal laser scanning microscopy. The obtained transgenic lines can be used for further functional studies the role of microtubules in the processes of building the flax fibres and resistance to wind.
|
| issn |
0564-3783 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/126526 |
| citation_txt |
Генетическая трансформация растений льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) химерным геном GFP-TUA6 для визуализации микротрубочек / Е.Н. Шиша, В.И. Корховой, Г.Я. Баер, Е.В. Гузенко, В.А. Лемеш, Н.А. Картель, А.И. Емец, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2013. — Т. 47, № 2. — С. 3-11. — Бібліогр.: 36 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT šišaen genetičeskaâtransformaciârasteniilʹnadolguncalinumusitatissimumlhimernymgenomgfptua6dlâvizualizaciimikrotruboček AT korhovoivi genetičeskaâtransformaciârasteniilʹnadolguncalinumusitatissimumlhimernymgenomgfptua6dlâvizualizaciimikrotruboček AT baergâ genetičeskaâtransformaciârasteniilʹnadolguncalinumusitatissimumlhimernymgenomgfptua6dlâvizualizaciimikrotruboček AT guzenkoev genetičeskaâtransformaciârasteniilʹnadolguncalinumusitatissimumlhimernymgenomgfptua6dlâvizualizaciimikrotruboček AT lemešva genetičeskaâtransformaciârasteniilʹnadolguncalinumusitatissimumlhimernymgenomgfptua6dlâvizualizaciimikrotruboček AT kartelʹna genetičeskaâtransformaciârasteniilʹnadolguncalinumusitatissimumlhimernymgenomgfptua6dlâvizualizaciimikrotruboček AT emecai genetičeskaâtransformaciârasteniilʹnadolguncalinumusitatissimumlhimernymgenomgfptua6dlâvizualizaciimikrotruboček AT blûmâb genetičeskaâtransformaciârasteniilʹnadolguncalinumusitatissimumlhimernymgenomgfptua6dlâvizualizaciimikrotruboček AT šišaen genetičnatransformacíâroslinlʹonudovguncâlinumusitatissimumlhímernimgenomgfptua6dlâvízualízacíímíkrotrubočok AT korhovoivi genetičnatransformacíâroslinlʹonudovguncâlinumusitatissimumlhímernimgenomgfptua6dlâvízualízacíímíkrotrubočok AT baergâ genetičnatransformacíâroslinlʹonudovguncâlinumusitatissimumlhímernimgenomgfptua6dlâvízualízacíímíkrotrubočok AT guzenkoev genetičnatransformacíâroslinlʹonudovguncâlinumusitatissimumlhímernimgenomgfptua6dlâvízualízacíímíkrotrubočok AT lemešva genetičnatransformacíâroslinlʹonudovguncâlinumusitatissimumlhímernimgenomgfptua6dlâvízualízacíímíkrotrubočok AT kartelʹna genetičnatransformacíâroslinlʹonudovguncâlinumusitatissimumlhímernimgenomgfptua6dlâvízualízacíímíkrotrubočok AT emecai genetičnatransformacíâroslinlʹonudovguncâlinumusitatissimumlhímernimgenomgfptua6dlâvízualízacíímíkrotrubočok AT blûmâb genetičnatransformacíâroslinlʹonudovguncâlinumusitatissimumlhímernimgenomgfptua6dlâvízualízacíímíkrotrubočok AT šišaen genetictransformationofflaxlinumusaitatissimumlwiththechimericgfptua6geneforthevisualizationofmicrotubules AT korhovoivi genetictransformationofflaxlinumusaitatissimumlwiththechimericgfptua6geneforthevisualizationofmicrotubules AT baergâ genetictransformationofflaxlinumusaitatissimumlwiththechimericgfptua6geneforthevisualizationofmicrotubules AT guzenkoev genetictransformationofflaxlinumusaitatissimumlwiththechimericgfptua6geneforthevisualizationofmicrotubules AT lemešva genetictransformationofflaxlinumusaitatissimumlwiththechimericgfptua6geneforthevisualizationofmicrotubules AT kartelʹna genetictransformationofflaxlinumusaitatissimumlwiththechimericgfptua6geneforthevisualizationofmicrotubules AT emecai genetictransformationofflaxlinumusaitatissimumlwiththechimericgfptua6geneforthevisualizationofmicrotubules AT blûmâb genetictransformationofflaxlinumusaitatissimumlwiththechimericgfptua6geneforthevisualizationofmicrotubules |
| first_indexed |
2025-11-26T00:18:48Z |
| last_indexed |
2025-11-26T00:18:48Z |
| _version_ |
1850599959645126656 |
| fulltext |
3
Îðèãèíàëüíûå ðàáîòû
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013 ¹ 2
© Å.Í. ØÈØÀ, Â.È. ÊÎÐÕÎÂÎÉ, Ã.ß. ÁÀÅÐ,
Å.Â. ÃÓÇÅÍÊÎ, Â.À. ËÅÌÅØ, Í.À. ÊÀÐÒÅËÜ,
À.È. ÅÌÅÖ, ß.Á. ÁËÞÌ, 2013
УДК 633.52:577.21:632.165
Е.Н. ШИША 1, В.И. КОРХОВОЙ 1, Г.Я. БАЕР 1,
Е.В. ГУЗЕНКО 2, В.А. ЛЕМЕШ 2, Н.А. КАРТЕЛЬ 2,
А.И. ЕМЕЦ 1, Я.Б. БЛЮМ 1
1 ГУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики
Национальной академии наук Украины», Киев
2 ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», Минск
E-mail: elenashysha@mail.ru
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ
РАСТЕНИЙ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА
(LINUM USITATISSIMUM L.)
ХИМЕРНЫМ ГЕНОМ GFP-TUA6 ДЛЯ
ВИЗУАЛИЗАЦИИ МИКРОТРУБОЧЕК
Ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû ïî àãðîáàêòåðèàëü-
íîé òðàíñôîðìàöèè ðÿäà ñîðòîâ ëüíà-äîëãóíöà, ðàé-
îíèðîâàííûõ â Ðåñïóáëèêå Áåëàðóñü è Óêðàèíå, ïëàç-
ìèäîé, êîòîðàÿ ñîäåðæèò õèìåðíûé ãåí GFP-TUA6
è ñåëåêòèâíûé ãåí nptII. Ïðè ïðîâåäåíèè ýêñïåðèìåí-
òîâ ó÷èòûâàëè ôàêòîðû, âëèÿþùèå íà ýôôåêòèâ-
íîñòü òðàíñôîðìàöèè, à èìåííî îïòè÷åñêóþ ïëîò-
íîñòü, âðåìÿ èíîêóëÿöèè ýêñïëàíòîâ ñ àãðîáàêòå-
ðèåé è óñëîâèÿ êîêóëüòèâèðîâàíèÿ. Íà ñåëåêòèâ-
íîé ñðåäå, ñîäåðæàùåé êàíàìèöèí â êîíöåíòðàöèè
100 ìã/ë, îòîáðàíû ëèíèè, òðàíñãåííàÿ ïðèðîäà
êîòîðûõ ïîäòâåðæäåíà ñ ïîìîùüþ ÏÖÐ-àíàëèçà.
Ýêñïðåññèþ õèìåðíîãî ãåíà GFP-TUA6 èçó÷àëè ñ
ïîìîùüþ êîíôîêàëüíîé ëàçåðíîé ìèêðîñêîïèè. Ïî-
ëó÷åííûå íàìè ëèíèè â äàëüíåéøåì ìîãóò áûòü èñ-
ïîëüçîâàíû äëÿ óãëóáëåííîãî èçó÷åíèÿ ðîëè ìèêðî-
òðóáî÷åê â ôîðìèðîâàíèè âîëîêîí, à òàêæå ìåõàíè-
÷åñêîé óñòîé÷èâîñòè ê ïîëåãàíèþ ó ëüíà-äîëãóíöà.
Ââåäåíèå. Ëåí âîçäåëûâàåòñÿ êàê òåõíè-
÷åñêàÿ êóëüòóðà â òå÷åíèå óæå ìíîãèõ òûñÿ÷
ëåò, è íåäàâíèå èññëåäîâàíèÿ ïîçâîëèëè îá-
íàðóæèòü ñëåäû ëüíÿíûõ âîëîêîí â ïåùåðàõ
Ãðóçèè åùå ïåðèîäà ïàëåîëèòà (30 òûñ. ëåò
òîìó íàçàä) [1]. Ëüíÿíîå âîëîêíî ÿâëÿåòñÿ
îäíèì èç ñàìûõ êðåïêèõ ðàñòèòåëüíûõ âîëî-
êîí, ïîýòîìó åãî èñïîëüçóþò â îñíîâíîì äëÿ
ïîëó÷åíèÿ òåêñòèëÿ è óñèëåíèÿ êîìïîçèöè-
îííûõ ìàòåðèàëîâ [2].
×ðåçâû÷àéíî äëèííûå âîëîêíà ëüíà îá-
ðàçóþòñÿ íà âíåøíèõ òêàíÿõ ñòåáëÿ ìåæäó
ôëîýìîé è ýïèäåðìèñîì è äîñòèãàþò äëèíû
îêîëî 7 ñì. Èçâåñòíî, ÷òî íàïðàâëåííûé ðîñò
ðàñòèòåëüíîé êëåòêè îáóñëîâëåí îòëîæåíèåì
è èçìåíåíèÿìè êîìïîíåíòîâ êëåòî÷íîé ñòåí-
êè ïîä äåéñòâèåì òóðãîðíîãî äàâëåíèÿ. Êëþ-
÷åâûì ðåãóëÿòîðíûì ýëåìåíòîì àíèçîòðîïíî-
ãî ðîñòà è, ñîîòâåòñòâåííî, êëåòî÷íîé ôîðìû
ÿâëÿåòñÿ íàïðàâëåííîå îòëîæåíèå öåëëþëîç-
íûõ ôèáðèëë [3]. Â îòëîæåíèè æå âîëîêîí
îïðåäåëÿþùóþ ðîëü èãðàåò öåëëþëîçîñèíòàç-
íûé êîìïëåêñ, ãåíû êîòîðîãî ñåé÷àñ èíòåí-
ñèâíî èçó÷àþòñÿ ó ëüíà [4]. Ïëàçìàòè÷åñ-
êèå öåëëþëîçîñèíòàçíûå êîìïëåêñû, ëîêà-
ëèçîâàííûå íà ìåìáðàíå è îáåñïå÷èâàþùèå
ñèíòåç ìèêðîôèáðèëë, ñâÿçûâàþòñÿ ñ ìèêðî-
òðóáî÷êàìè è äâèæóòñÿ âäîëü êîðòèêàëüíûõ
ìèêðîòðóáî÷åê [3]. Íà ïðîòÿæåíèè äîñòàòî÷-
íî äëèòåëüíîãî îòðåçêà âðåìåíè íàêîïëåíî
ìíîãî äîêàçàòåëüñòâ òîãî, ÷òî ìèêðîòðóáî÷êè,
áëàãîäàðÿ êîòîðûì îñóùåñòâëÿåòñÿ äîñòàâêà
ñòðîèòåëüíîãî ìàòåðèàëà öåëëþëîçíûõ âîëî-
êîí, â çíà÷èòåëüíîé ñòåïåíè îïðåäåëÿþò êîð-
ðåêòíîå îòëîæåíèå è îðèåíòàöèþ ïðî÷íûõ
öåëëþëîçíûõ ôèáðèëë â ðàñòåíèÿõ [5–7].
Ðåçóëüòàòû ïðîòåîìíîãî àíàëèçà âîëîêîí
ëüíà ïîäòâåðæäàþò òîò ôàêò, ÷òî â áåëêîâîì
ýêñòðàêòå âîëîêîí íàõîäèòñÿ íàìíîãî áîëü-
øå ñòðóêòóðíûõ êîìïîíåíòîâ öèòîñêåëåòà,
òàê æå êàê è áåëêîâ, îòâåòñòâåííûõ çà âåçè-
êóëÿðíûé òðàíñïîðò, ïî ñðàâíåíèþ ñ äðóãè-
ìè îêðóæàþùèìè òêàíÿìè [8]. Òàê, âîëîêíà
ïî ìåíüøåé ìåðå â 1,5 ðàçà áîëüøå îáîãàùå-
íû òóáóëèíîì è àêòèíîì. Ýòèõ áåëêîâ ìî-
æåò áûòü áîëüøå â âîëîêíàõ ïî ñðàâíåíèþ
ñ ôðàêöèåé íå ñîäåðæàùèõ èõ êëåòîê èç-çà
ðàçëè÷èé, â ÷àñòíîñòè â àðõèòåêòóðå è â ñî-
îòíîøåíèè ïîâåðõíîñòè/îáúåìà óêàçàííûõ
êëåòîê. Â äîïîëíåíèå ê ýòîìó îòíîñèòåëü-
íî ïîâûøåííîå ñîäåðæàíèå öèòîñêåëåòíûõ
áåëêîâ â âîëîêíàõ, ïðèâîäÿùåå ê óòîëùåíèþ
4
Å.Í. Øèøà, Â.È. Êîðõîâîé, Ã.ß. Áàåð è äð.
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. ¹ 2
êëåòî÷íîé ñòåíêè, ìîæåò óêàçûâàòü íà ðîëü
öèòîñêåëåòà â îòëîæåíèè öåëëþëîçû è äðó-
ãèõ êîìïîíåíòîâ êëåòî÷íîé ñòåíêè. Ïðåä-
ïîëàãàþò, ÷òî â ðàçâèâàþùèõñÿ âîëîêíàõ
ëüíà ñóùåñòâóåò òàêæå àêòèâíàÿ ñåêðåòîðíàÿ
ñèñòåìà, ó÷àñòâóþùàÿ â äîñòàâêå íåöåëëþ-
ëîçíûõ ïîëèñàõàðèäíûõ êîìïîíåíòîâ â êëå-
òî÷íóþ ñòåíêó; äîïóñêàþò, ÷òî îáîãàùåíèå
ìèîçèíîì, äèíàìèí-ïîäîáíûìè áåëêàìè è
èíãèáèòîðîì äèññîöèàöèè ÃÄÔ òàêæå ñîãëà-
ñóåòñÿ ñ ïðîöåññàìè ðàçâèòèÿ, êîòîðûå íàè-
áîëåå àêòèâíî âûðàæåíû â ýòèõ êëåòêàõ.
Î÷åâèäíî, ÷òî è äðóãèå êîìïîíåíòû öèòî-
ñêåëåòà, à íå òîëüêî òå, êîòîðûå èãðàþò ñòðóê-
òóðíóþ ðîëü (íàïðèìåð, òóáóëèí è àêòèí), ìî-
ãóò ïðîÿâëÿòü äîïîëíèòåëüíûå ôóíêöèè, ñïå-
öèôè÷åñêè ñâÿçàííûå ñ ñåêðåöèåé è èíûìè
àñïåêòàìè îòëîæåíèÿ âòîðè÷íîé êëåòî÷íîé
ñòåíêè [9]. Ðåçóëüòàòû íåäàâíèõ èññëåäîâàíèé,
îáîáùåííûå â îáçîðå [3], ñâèäåòåëüñòâóþò î
òîì, ÷òî ðàíåå èäåíòèôèöèðîâàííûé ìóòàíò
àðàáèäîïñèñà pom2 êîäèðóåò áîëüøîé öåë-
ëþëîçîñèíòàçíûé âçàèìîäåéñòâóþùèé áåëîê
(CSI1), êîòîðûé ñïåöèôè÷åñêè ñâÿçûâàåò
ìèêðîòðóáî÷êè.
Äàëüíåéøèå ðàáîòû â íàïðàâëåíèè èçó÷å-
íèÿ êëåòî÷íûõ ìåõàíèçìîâ âçàèìîäåéñòâèÿ
öåëëþëîçîñèíòàçíîãî êîìïëåêñà è ìèêðîòðó-
áî÷åê, à òàêæå âçàèìîäåéñòâèÿ ïîñëåäíèõ ñ
ôîðìèðóþùèìèñÿ ìèêðîôèáðèëëàìè ëüíÿ-
íûõ âîëîêîí ìîãóò îòêðûòü íîâûå âîçìîæíî-
ñòè äëÿ ñîçäàíèÿ ñîðòîâ ëüíà ñ óñòîé÷èâîñòüþ
ê ïîëåãàíèþ. Ïîñêîëüêó ëåí ÿâëÿåòñÿ âàæíîé
òåõíè÷åñêîé êóëüòóðîé äëÿ Óêðàèíû, ðàíåå
íàìè áûëè ïðîâåäåíû ðàáîòû ïî ââåäåíèþ â
êóëüòóðó in vitro ðàçíûõ ñîðòîâ ëüíà-äîëãóíöà
îòå÷åñòâåííîé è çàðóáåæíîé ñåëåêöèè, õàðàê-
òåðèçóþùèõñÿ ðàçëè÷íîé óñòîé÷èâîñòüþ ê
ïîëåãàíèþ [10], è ýòîò ìàòåðèàë ìîæåò áûòü
ýôôåêòèâíî èñïîëüçîâàí äëÿ ïîäîáíîãî ðî-
äà èññëåäîâàíèé. Äëÿ ðàçðàáîòêè óäîáíûõ
ìîäåëåé íà îñíîâå èñïîëüçóåìîãî íàìè ìà-
òåðèàëà ñ öåëüþ óãëóáëåííîãî èçó÷åíèÿ ðî-
ëè ìèêðîòðóáî÷åê â ïðîöåññàõ îòëîæåíèÿ,
îðèåíòàöèè è ïîääåðæàíèÿ ñòðóêòóðû ëüíÿ-
íîãî âîëîêíà ìîæíî èñïîëüçîâàòü õèìåðíûé
ãåí òóáóëèíà, ñëèòûé ñ ðåïîðòåðíûì ãåíîì
çåëåíîãî ôëþîðåñöåíòíîãî áåëêà (GFP) èç
ìåäóçû Aequorea victoria [11], ýêñïðåññèÿ êî-
òîðîãî ïîçâîëÿåò âèçóàëèçèðîâàòü ðàçëè÷íûå
ïîñòðîåíèÿ ìèêðîòðóáî÷åê in vivo â ðàñòè-
òåëüíûõ êëåòêàõ [12, 13] è èçó÷àòü îñîáåííîñ-
òè èõ ôóíêöèîíèðîâàíèÿ [14]. Îäíàêî ñëå-
äóåò îòìåòèòü, ÷òî ñîîáùåíèÿ î ðàçðàáîòêå
óñïåøíûõ ìåòîäèê ãåíåòè÷åñêîé òðàíñôîðìà-
öèè ðàñòåíèé ëüíà-äîëãóíöà êîíñòðóêöèÿìè,
êîòîðûå ñîäåðæàò ãåí, êîäèðóþùèé GFP, â
ñâÿçêå ñ ãåíàìè, îòâå÷àþùèìè çà áèîñèí-
òåç äðóãèõ áåëêîâ, ïîêà íåìíîãî÷èñëåííû [15].
Ïîýòîìó öåëü íàñòîÿùåãî èññëåäîâàíèÿ –
ðàçðàáîòàòü ýôôåêòèâíûé ìåòîä ãåíåòè÷å-
ñêîé òðàíñôîðìàöèè íàèáîëåå ðåãåíåðàöèîí-
íî-ñïîñîáíûõ ñîðòîâ ëüíà-äîëãóíöà ñ ïîìî-
ùüþ Agrobacterium tumefaciens, êîòîðàÿ íåñåò
õèìåðíûé ãåí òóáóëèíà TUA6 èç Arabidopsis
thaliana, ñëèòûé ñ ðåïîðòåðíûì ãåíîì GFP,
ïîëó÷èòü òðàíñãåííûå ðàñòåíèÿ ñ öåëåâûì
ãåíîì, îñóùåñòâèòü èõ ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè-
÷åñêèé àíàëèç è èçó÷èòü ýêñïðåññèþ ïåðåíå-
ñåííîãî ãåíà â êëåòêàõ òðàíñãåííûõ ëèíèé.
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû. Â ðàáîòå èñïîëü-
çîâàëè 11 ñîðòîâ ëüíà-äîëãóíöà îòå÷åñòâåí-
íîé è çàðóáåæíîé ñåëåêöèè. Ñåìåíà ñîðòîâ
Âðó÷èé, Çîðÿ 87, Ðóøíû÷oê, Ñâèòàíîê, Òîì-
ñêèé 16, Óêðàèíñêèé 3 ëþáåçíî ïðåäîñòàâ-
ëåíû Èíñòèòóòîì ëóáÿíûõ êóëüòóð è ôèòî-
ôàðìàöåâòè÷åñêîãî ñûðüÿ ÍÀÀÍ Óêðàèíû,
ñåìåíà ñîðòîâ Âåñíà, Âèòà, Äàøêîâñêèé, Ê-65
è Íèâà – Èíñòèòóòîì öèòîëîãèè è ãåíåòèêè
ÍÀÍ Áåëàðóñè. Ìåòîäèêè ââåäåíèÿ â êóëüòó-
ðó in vitro, ðåãåíåðàöèè ïîáåãîâ èç ñåãìåí-
òîâ ãèïîêîòèëåé ëüíà, èõ ðîñòà è óêîðåíå-
íèÿ, à òàêæå âñå íåîáõîäèìûå äëÿ ýòèõ ïðî-
öåññîâ ñðåäû ðàçðàáîòàíû è îïèñàíû íàìè
ðàíåå [10].
Äëÿ ãåíåòè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè ëüíà-
äîëãóíöà èñïîëüçîâàëè ñóïåðâèðóëåíòíûé
øòàìì Agrobacterium tumefaciens LBA4404, íå-
ñóùèé áèíàðíûé âåêòîð pBI121, Ò-ÄÍÊ êî-
òîðîãî ñîäåðæàëà õèìåðíûé ãåí GFP-TUA6
ïîä êîíòðîëåì 35S ïðîìîòîðà âèðóñà ìîçàè-
êè öâåòíîé êàïóñòû (CaMV).  êà÷åñòâå ñå-
ëåêòèâíîãî ìàðêåðíîãî ãåíà âåêòîðíàÿ êîíñò-
ðóêöèÿ ñîäåðæàëà ãåí nptII, îáåñïå÷èâàþùèé
óñòîé÷èâîñòü ê êàíàìèöèíó [12]. Êîíñòðóê-
öèÿ (ðèñ. 1) ëþáåçíî ïðåäîñòàâëåíà ä-ðîì
T. Õàøèìîòî (Èíñòèòóò íàóêè è òåõíîëîãèè
Íàðà, ßïîíèÿ).
Äëÿ ïîäáîðà óñëîâèé ñ öåëüþ îáåñïå÷åíèÿ
ýôôåêòèâíîé ãåíåòè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè
5
Ãåíåòè÷åñêàÿ òðàíñôîðìàöèÿ ðàñòåíèé ëüíà-äîëãóíöà (Linum usitatissimum L.)
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. ¹ 2
ëüíà ñíà÷àëà ïðîâåëè ýêñïåðèìåíòû ïî îïðå-
äåëåíèþ ñåëåêòèâíîé êîíöåíòðàöèè êàíàìè-
öèíà êàê ñåëåêòèâíîãî àãåíòà. Ñ ýòîé öåëüþ
â ñðåäó äëÿ ðåãåíåðàöèè ïîáåãîâ ëüíà äîáàâ-
ëÿëè êàíàìèöèí â ðàçëè÷íûõ êîíöåíòðàöèÿõ
(50–200 ìã/ë) è ðàçìåùàëè íà íåé ýêñïëàí-
òû øåñòèñóòî÷íûõ àñåïòè÷åñêèõ ïðîðîñòêîâ
ñåìÿí ëüíà-äîëãóíöà.  êà÷åñòâå êîíòðîëÿ
èñïîëüçîâàëè ñðåäó áåç ñåëåêòèâíîãî àãåíòà.
Ýêñïëàíòû èíêóáèðîâàëè â óñëîâèÿõ ðàñ-
ñåÿííîãî ñâåòà â òå÷åíèå òðåõ íåäåëü ïðè
16-÷àñîâîì ñâåòîâîì ïåðèîäå è òåìïåðàòóðå
24–26 °Ñ. Äëÿ êàæäîé îòäåëüíîé êîíöåíòðà-
öèè ïðîâîäèëè îïûòû â òðåõ ïîâòîðíîñòÿõ.
Äëÿ òðàíñôîðìàöèè ýêñïëàíòû ãèïîêîòè-
ëåé øåñòèñóòî÷íûõ ïðîðîñòêîâ ëüíà èíêóáè-
ðîâàëè â ñóñïåíçèè êëåòîê íî÷íîé êóëüòóðû
Agrobacterium tumefaciens. Ñ ýòîé öåëüþ áàêòå-
ðèè íàðàùèâàëè â ñðåäå LB [16] c äîáàâëåíè-
åì 50 ìã/ë êàíàìèöèíà è 100 ìã/ë ðèôàìïè-
öèíà íà îðáèòàëüíîì øåéêåðå (200 îá./ìèí)
ïðè òåìïåðàòóðå 28 °Ñ. Çàòåì èõ öåíòðèôóãè-
ðîâàëè 15 ìèí ïðè 4000 îá./ìèí, ñóïåðíàòàíò
óäàëÿëè, îñàäîê ðåñóñïåíäèðîâàëè â æèäêîé
ñðåäå ÌÑ áåç äîáàâëåíèÿ ñàõàðîçû è ôèòî-
ãîðìîíîâ. Äëÿ êîêóëüòèâèðîâàíèÿ ñ ýêñïëàí-
òàìè èñïîëüçîâàëè àãðîáàêòåðèàëüíóþ ñóñ-
ïåíçèþ ñ îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòüþ (OD600)
0,3–0,5. Èíîêóëÿöèþ ýêñïëàíòîâ àãðîáàêòå-
ðèåé ïðîâîäèëè â òå÷åíèå 1 ÷, ïîñëå ÷åãî èõ
ïåðåíîñèëè íà ìîäèôèöèðîâàííóþ ñðåäó ÌÑ,
ñîäåðæàùóþ 200 ìã/ë ìèî-èíîçèòîëà, 250 ìã/ë
ÌÅS, 20 ã/ë ñàõàðîçû. Âðåìÿ êîêóëüòèâèðî-
âàíèÿ àãðîáàêòåðèè è ýêñïëàíòîâ ñîñòàâëÿëî
îò 1 äî 3 ñóò.
Ïîáåãè ðåãåíåðèðîâàëè íà ñåëåêòèâíîé
ñðåäå, ñîäåðæàùåé 100 ìã/ë êàíàìèöèíà, à
òàêæå 400 ìã/ë êàðáåíèöèëëèíà äëÿ ýëèìè-
íàöèè àãðîáàêòåðèè. Óêîðåíåíèå îòñåëåêòè-
ðîâàííûõ ïîáåãîâ îñóùåñòâëÿëè íà ñðåäå äëÿ
ðîñòà è ðàçâèòèÿ ðàñòåíèé ëüíà-äîëãóíöà [10]
â ïðèñóòñòâèè 10 ìã/ë êàíàìèöèíà. ×àñòîòó
òðàíñôîðìàöèè îïðåäåëÿëè êàê ïðîöåíòíîå
ñîîòíîøåíèå êîëè÷åñòâà ýêñïëàíòîâ ñ ðåãå-
íåðèðîâàâøèìè íà ñåëåêòèâíîé ñðåäå ïîáå-
ãàìè ê îáùåìó ÷èñëó âçÿòûõ äëÿ ýêñïåðèìåí-
òà ýêñïëàíòîâ.
Äëÿ ïîäòâåðæäåíèÿ íàëè÷èÿ ïåðåíåñåííûõ
÷óæåðîäíûõ ãåíîâ ó îòîáðàííûõ è óêîðåíèâ-
øèõñÿ íà ñåëåêòèâíûõ ñðåäàõ ðàñòåíèé ëüíà-
äîëãóíöà è ó èõ ïîòîìñòâà Ò1 áûë ïðîâåäåí
ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷åñêèé àíàëèç ñ ïîìî-
ùüþ ïîëèìåðàçíîé öåïíîé ðåàêöèè (ÏÖÐ).
ÄÍÊ èç ðàñòåíèé âûäåëÿëè, èñïîëüçóÿ íà-
áîð Plant DNA Isolation Kit («Sigma», Ãåðìà-
íèÿ). Äëÿ ïðîâåðêè èíòåãðàöèè õèìåðíîãî
ãåíà GFP-TUA6 â ãåíîì îòîáðàííûõ ëèíèé
èñïîëüçîâàëè ïðàéìåðû ê ôðàãìåíòó ïîñëå-
äîâàòåëüíîñòè 35S-ïðîìîòîðà, ñèíòåçèðîâàí-
íûå â Èí-òå ïèùåâîé áèîòåõíîëîãèè è ãå-
íîìèêè â êîíöåíòðàöèè 1 ìêÌ: 5 -GCTC-
CTACAAATGCCATCA-3 è 5 -GATAGTGGG-
ATTGTGCGTCA-3 . Ðàçìåð àìïëèôèöèðîâàí-
íîãî ôðàãìåíòà ñîñòàâëÿë 195 ï.í. Â ñîñòàâ
ðåàêöèîííîé ñìåñè äëÿ ÏÖÐ (îáúåìîì 25 ìêë)
âõîäèëî 500 íã ãåíîìíîé ÄÍÊ, 0,1 åä. Taq-
ïîëèìåðàçû («Fermentas», Ëèòâà), 5×ÏËÐ-
áóôåð ñ ñóëüôàòîì àììîíèÿ («Õåëèêîí», ÐÔ),
200 ìêÌ êàæäîãî äÍÒÔ («Õåëèêîí», ÐÔ)
è ïðàéìåðû â óïîìÿíóòîé êîíöåíòðàöèè. Ðå-
àêöèþ ïðîâîäèëè íà àìïëèôèêàòîðå PCR
Applied Biosystem 2720 (ÑØÀ) ïðè ñîáëþ-
äåíèè ñëåäóþùèõ óñëîâèé: ïåðâè÷íàÿ äåíà-
òóðàöèÿ – 4 ìèí ïðè 94 °C; äàëåå 25 öèê-
ëîâ: 30 ñ – 94 °C, 40 ñ – 54 °C, 1 ìèí –
72 °C, êîíå÷íàÿ ýëîíãàöèÿ – 7 ìèí ïðè
72 °C. Ïðîäóêòû ÏÖÐ ðàçäåëÿëè ñ ïîìîùüþ
ýëåêòðîôîðåçà â 1%-íîì àãàðîçíîì ãåëå.
Ïàðàëëåëüíî ïðîâîäèëè ÏÖÐ-àíàëèç íå-
êîòîðûõ îòñåëåêòèðîâàííûõ ðàñòåíèé ñ öå-
ëüþ ïðîâåðêè íàëè÷èÿ â èõ ãåíîìå êîäèðó-
þùåé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ñåëåêòèâíîãî ìàð-
êåðíîãî ãåíà nptII. Äëÿ àìïëèôèêàöèè ó÷àñòêà
ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ýòîãî ãåíà èñïîëüçîâàëè
äâå ïàðû ïðàéìåðîâ: 1) 5 -AATGAACTCCA-
GGACGAGGCA-3 è 5 -GCTCTAGATCCAG-
AGTCCCGCTCAGAAG-3 , äàþùèå ôðàãìåíò
âåëè÷èíîé 622 ï.í.; 2) 5 -GAGGCTATTCG-
GCTATGAT-3 è 5 -AATCTCGTGATGGCA-
GGTTG-3 (840 ï.í.). Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü ñî-
äåðæàëà 500 íã èññëåäóåìîé ÄÍÊ, 0,5 åä.
Taq-ÄÍÊ ïîëèìåðàçû («Fermentas», Ëèòâà),
5×ÏËÐ-áóôåð ñ ñóëüôàòîì àììîíèÿ («Õåëè-
êîí», ÐÔ), 200 ìêÌ êàæäîãî äÍÒÔ («Õåëè-
Ðèñ. 1. Ñõåìà êîíñòðóêöèè pBI121 ñ õèìåðíûì
ãåíîì GFP-TUA6
6
Å.Í. Øèøà, Â.È. Êîðõîâîé, Ã.ß. Áàåð è äð.
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. ¹ 2
êîí», ÐÔ). Ðåàêöèþ äëÿ ïåðâîé ïàðû ïðàé-
ìåðîâ îñóùåñòâëÿëè ïðè ñëåäóþùèõ óñëî-
âèÿõ: ïåðâè÷íàÿ äåíàòóðàöèÿ 5 ìèí ïðè
94 îC; äàëåå 25 öèêëîâ: 30 ñ – 94 îC, 45 ñ –
65 îC, 40 ñ – 72 îC, êîíå÷íàÿ ýëîíãàöèÿ
7 ìèí ïðè 72 îC; äëÿ âòîðîé ïàðû ïðàéìå-
ðîâ – ïåðâè÷íàÿ äåíàòóðàöèÿ 5 ìèí ïðè
94 îC; çàòåì 25 öèêëîâ: 30 ñ – 94 îC, 60 ñ –
60 îC, 40 ñ – 72 îC, êîíå÷íàÿ ýëîíãàöèÿ
7 ìèí ïðè 72 îC. Äàëåå ïðîäóêòû ðåàêöèè
ðàçäåëÿëè â 1%-íîì àãàðîçíîì ãåëå.
Èíòåãðàöèþ áåëêà TUA6-GFP â íàòèâíûå
ñòðóêòóðû ìèêðîòðóáî÷åê êëåòîê òðàíñãåí-
íûõ ëèíèé ëüíà èçó÷àëè ñ ïîìîùüþ êîíôî-
êàëüíîãî ëàçåðíîãî ñêàíèðóþùåãî ìèêðîñêî-
ïà LSM 510 META («Carl Zeiss», Ãåðìàíèÿ).
Ðåçóëüòàòû èññëåäîâàíèé è èõ îáñóæäåíèå.
 êà÷åñòâå ýêñïëàíòîâ äëÿ àãðîáàêòåðèàëü-
íîé òðàíñôîðìàöèè â ðàáîòå èñïîëüçîâàëè
ãèïîêîòèëè øåñòèñóòî÷íûõ ïðîðîñòêîâ ëüíà-
äîëãóíöà, ïîñêîëüêó îíè, êàê óñòàíîâëåíî
ðàíåå, ÿâëÿþòñÿ íàèáîëåå ïîäõîäÿùèì ìà-
òåðèàëîì äëÿ ïîäîáíîãî ðîäà ìàíèïóëÿöèé
[17–20]. Òàê êàê äëÿ îñóùåñòâëåíèÿ óñïåø-
íîé ãåíåòè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè ëþáîãî
âèäà ðàñòåíèé ïðåæäå âñåãî íåîáõîäèìî ïî-
äîáðàòü ñîîòâåòñòâóþùèå óñëîâèÿ äëÿ ýô-
ôåêòèâíîé ðåãåíåðàöèè ïîáåãîâ èëè ïîëíî-
öåííûõ ðàñòåíèé, íàìè áûëè ïîäîáðàíû
ñðåäû äëÿ ââåäåíèÿ â êóëüòóðó in vitro è ðå-
ãåíåðàöèè ðàñòåíèé. Õîðîøî èçâåñòíî, ÷òî
äëÿ L. usitatissimum â çíà÷èòåëüíîé ñòåïåíè
âûðàæåíà çàâèñèìîñòü ðåãåíåðàöèè ïîáåãîâ
îò âûáðàííîãî ãåíîòèïà [21–39]. Â ñâÿçè ñ
ýòèì äëÿ àãðîáàêòåðèàëüíîé òðàíñôîðìàöèè
èç ñîðòîâ ëüíà-äîëãóíöà ñ îõàðàêòåðèçîâàí-
íûìè ðàíåå îñîáåííîñòÿìè ìîðôîãåíåòè÷å-
ñêîãî îòâåòà [10] îòîáðàíû ñîðòà ñ ñàìûìè
âûñîêèìè ïîêàçàòåëÿìè ÷àñòîòû è ýôôåê-
òèâíîñòè ðåãåíåðàöèè ïîáåãîâ, à òàêæå èõ
óêîðåíåíèÿ – Òîìñêèé 16, Óêðàèíñêèé-3,
Ñâèòàíîê, Âðó÷èé, Ðóøíû÷îê, Âåñíà è Âèòà.
Äëÿ ýôôåêòèâíîãî îòáîðà òðàíñôîðìàí-
òîâ ëüíà-äîëãóíöà ïðåäâàðèòåëüíî ïðîâåäåíû
ýêñïåðèìåíòû ïî óñòàíîâëåíèþ ñåëåêòèâíîé
êîíöåíòðàöèè êàíàìèöèíà ïóòåì îöåíêè åãî
âëèÿíèÿ íà ðåãåíåðàöèþ è æèçíåñïîñîáíîñòü
ïîáåãîâ, èíäóöèðîâàííûõ èç ýêñïëàíòîâ ãè-
ïîêîòèëåé (ðèñ. 2). Îêàçàëîñü, ÷òî êàíàìè-
öèí ïðè âñåõ èñïîëüçóåìûõ êîíöåíòðàöèÿõ
(50–200 ìã/ë) èíãèáèðîâàë èíèöèàöèþ ïî-
áåãîâ íà ýêñïëàíòàõ ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíò-
ðîëåì. Íà ñðåäàõ, ñîäåðæàùèõ êàíàìèöèí â
êîíöåíòðàöèÿõ 50 è 75 ìã/ë, ïîñëå òðåõ íå-
äåëü êóëüòèâèðîâàíèÿ íàáëþäàëè îáðàçîâà-
íèå îäèíî÷íûõ, íî æèçíåñïîñîáíûõ ïîáåãîâ.
 äàëüíåéøåì ïîáåãè, ðåãåíåðèðîâàâøèå â
ïðèñóòñòâèè 50 ìã/ë êàíàìèöèíà, îñòàâàëèñü
æèçíåñïîñîáíûìè è ïðîäîëæàëè ñâîé ðîñò, â
òî âðåìÿ êàê íà ñðåäå, ñîäåðæàùåé êàíàìè-
öèí â êîíöåíòðàöèè 75 ìã/ë, áîëüøàÿ ÷àñòü
ïîáåãîâ íà÷èíàëà íåêðîòèçèðîâàòüñÿ, ÷òî â
äàëüíåéøåì ïðèâîäèëî ê èõ ïîëíîé ãèáåëè.
Êàíàìèöèí â êîíöåíòðàöèè 100 ìã/ë èíãè-
áèðîâàë èíäóêöèþ ðåãåíåðàöèè ïîáåãîâ, è
õîòÿ â íåêîòîðûõ ñëó÷àÿõ ïðîèñõîäèëî ôîð-
ìèðîâàíèå êàëëóñà íà ýêñïëàíòàõ ãèïîêîòè-
ëåé, ïðè äàëüíåéøåì êóëüòèâèðîâàíèè îíè
íåêðîòèçèðîâàëè è ïîãèáàëè. Ïðè äîáàâëå-
íèè â ñðåäó 200 ìã/ë êàíàìèöèíà â òå÷åíèå
ïðåäåëüíî êîðîòêîãî ñðîêà ïðîèñõîäèëà ïîë-
íàÿ ãèáåëü èññëåäóåìûõ ýêñïëàíòîâ.
Ïîñêîëüêó êàíàìèöèí óãíåòàë ôîðìèðî-
âàíèå ïîáåãîâ óæå â êîíöåíòðàöèè 100 ìã/ë,
òî ýòà êîíöåíòðàöèÿ è áûëà âûáðàíà äëÿ ñå-
ëåêöèè òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé ëüíà-äîëãóíöà.
Ðàíåå àíàëîãè÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ êàíàìèöè-
íà áûëà èñïîëüçîâàíà è äëÿ ñåëåêöèè òðàíñ-
ãåííûõ ëèíèé ìàñëè÷íîãî ëüíà [17], à òàêæå
íàìè äëÿ ïîëó÷åíèÿ òðèôëþðàëèí-óñòîé÷è-
âûõ ëèíèé ëüíà-äîëãóíöà [20, 30].
Íåîáõîäèìûìè ôàêòîðàìè, îïðåäåëÿþùè-
ìè ýôôåêòèâíîñòü òðàíñôîðìàöèè, ÿâëÿþòñÿ
îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü áàêòåðèàëüíîé ñóñïåí-
çèè è âðåìÿ êîêóëüòèâèðîâàíèÿ ýêñïëàíòîâ
Ðèñ. 2. Âëèÿíèå ðàçëè÷íûõ êîíöåíòðàöèé êàíàìè-
öèíà (ïî ãîðèçîíòàëè, ìã/ë) íà ÷àñòîòó ðåãåíåðàöèè
ïîáåãîâ ñ ýêñïëàíòîâ ãèïîêîòèëåé ëüíà-äîëãóíöà
(ïî âåðòèêàëè, %)
7
Ãåíåòè÷åñêàÿ òðàíñôîðìàöèÿ ðàñòåíèé ëüíà-äîëãóíöà (Linum usitatissimum L.)
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. ¹ 2
ñ àãðîáàêòåðèåé. Â õîäå ýêñïåðèìåíòîâ óñòà-
íîâëåíî, ÷òî ìàêñèìàëüíàÿ ýôôåêòèâíîñòü
òðàíñôîðìàöèè ñåãìåíòîâ ãèïîêîòèëåé ëüíà
êîíñòðóêöèåé pBI121, íåñóùåé ãåí GFP-TUA6,
äîñòèãàåòñÿ ïðè çíà÷åíèè îïòè÷åñêîé ïëîò-
íîñòè (OD600) àãðîáàêòåðèàëüíîé ñóñïåíçèè,
ðàâíîé 0,4. Ïðè ýòîì ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî
êàê ïðè çíà÷åíèè OD600 = 0,3, òàê è ïðè çíà-
÷åíèè OD600 = 0,5 íàì íå óäàëîñü ïîëó÷èòü
íè îäíîé òðàíñãåííîé ëèíèè. Ýêñïëàíòû ãè-
ïîêîòèëåé, èíîêóëÿöèþ êîòîðûõ ïðîâîäèëè
ñóñïåíçèåé êëåòîê àãðîáàêòåðèè ñ îïòè÷åñ-
êîé ïëîòíîñòüþ OD600 = 0,3, ÷åðåç 3–4 íåä
ïîñëå ïåðåíåñåíèÿ íà ñðåäó äëÿ ñåëåêöèè
íåêðîòèçèðîâàëè è â äàëüíåéøåì ïîãèáàëè.
Ïðè çíà÷åíèè OD600 = 0,5 íàáëþäàëàñü î÷åíü
ñèëüíàÿ êîíòàìèíàöèÿ èñõîäíîãî ìàòåðèàëà
àãðîáàêòåðèåé, îò êîòîðîé íåâîçìîæíî áûëî
èçáàâèòüñÿ äàæå ïðè äîáàâëåíèè â ñðåäó äëÿ
ñåëåêöèè àíòèáàêòåðèàëüíûõ àãåíòîâ êàðáå-
íèöèëëèíà èëè öåôîòàêñèìà â êîíöåíòðàöèÿõ
400–500 ìã/ë.
Ýêñïåðèìåíòàëüíî òàêæå óñòàíîâëåíî, ÷òî
îïòèìàëüíîå âðåìÿ êîêóëüòèâèðîâàíèÿ ýêñ-
ïëàíòîâ ñ àãðîáàêòåðèåé ñîñòàâëÿåò 2 ñóò. Î÷å-
âèäíî, ÷òî êîêóëüòèâèðîâàíèå íà ïðîòÿæåíèè
24 ÷ íåäîñòàòî÷íî äëÿ èíòåãðàöèè ýêçîãåí-
íîé ÄÍÊ â ãåíîì ðàñòèòåëüíîãî ìàòåðèàëà,
òàê êàê ïðè ñîáëþäåíèè ýòèõ óñëîâèé íå óäà-
ëîñü ðåãåíåðèðîâàòü íà ñåëåêòèâíîé ñðåäå íè
îäíîãî ïîáåãà. Ïðè óâåëè÷åíèè âðåìåíè êî-
êóëüòèâèðîâàíèÿ äî òðåõ ñóòîê (ïðè OD600 =
= 0,4) íàì íå óäàâàëîñü ýëèìèíèðîâàòü áàêòå-
ðèþ, â ðåçóëüòàòå ÷åãî ïðîèñõîäèëà 100%-íàÿ
ãèáåëü ýêñïëàíòîâ. Òàêèì îáðàçîì, â õîäå ýêñ-
ïåðèìåíòîâ óñòàíîâëåíî, ÷òî äëÿ äîñòèæåíèÿ
ïîëîæèòåëüíûõ ðåçóëüòàòîâ ïðè ïðîâåäåíèè
Agrobacterium-îïîñðåäóåìîé òðàíñôîðìàöèè
ëüíà-äîëãóíöà íåîáõîäèìî èñïîëüçîâàòü ñó-
ñïåíçèþ áàêòåðèàëüíûõ êëåòîê, èìåþùóþ
çíà÷åíèå OD600 = 0,4, à âðåìÿ êîêóëüòèâèðî-
âàíèÿ ýêñïëàíòîâ ãèïîêîòèëåé ñ àãðîáàêòå-
ðèåé íå äîëæíî ïðåâûøàòü äâóõ ñóòîê.
 ðåçóëüòàòå ñåëåêöèè óñëîâíî òðàíñãåí-
íûõ ïîáåãîâ èç ñåãìåíòîâ ãèïîêîòèëåé èñ-
ñëåäóåìûõ ñîðòîâ ëüíà-äîëãóíöà â ïðèñóò-
ñòâèè 100 ìã/ë êàíàìèöèíà áûë îòîáðàí ðÿä
ëèíèé, ÷àñòü êîòîðûõ ïðè ïåðåíåñåíèè íà ñðå-
Ðèñ. 4. Ðåçóëüòàòû ÏÖÐ-àíàëèçà ðàñòåíèé ëüíà-äîëãóíöà, òðàíñôîðìèðîâàííûõ õèìåðíûì ãåíîì
GFP-TUA6 ñ èñïîëüçîâàíèåì ïðàéìåðîâ ê ïîñëåäîâàòåëüíîñòè 35S ïðîìîòîðà CaMV: 1 – íåãàòèâíûé
êîíòðîëü (ÄÍÊ íåòðàíñôîðìèðîâàííîãî ðàñòåíèÿ); 2 – ïîçèòèâíûé êîíòðîëü (ïëàçìèäà pBI121); 3 –
ñîðò Òîìñêèé 16, ëèíèÿ 1; 4 – ñîðò Òîìñêèé 16, ëèíèÿ 2; 5 – ñîðò Ñâèòàíîê, ëèíèÿ 3; 6 – ñîðò Ñâèòàíîê,
ëèíèÿ 4; 7 – ñîðò Ñâèòàíîê, ëèíèÿ 5; 8 – ñîðò Ñâèòàíîê, ëèíèÿ 6; 9 – ñîðò Ñâèòàíîê, ëèíèÿ 7; 10 – ñîðò
Ñâèòàíîê, ëèíèÿ 8; 11 – ñîðò Ñâèòàíîê, ëèíèÿ 9; 12 – ñîðò Ñâèòàíîê, ëèíèÿ 10; 13 – ñîðò Ñâèòàíîê,
ëèíèÿ 11; 14 – ñîðò Ñâèòàíîê, ëèíèÿ 12; 15 – ñîðò Ðóøíû÷îê, ëèíèÿ 1; 16 – ñîðò Óêðàèíñêèé-3, ëèíèÿ
4; 17 – ñîðò Óêðàèíñêèé-3, ëèíèÿ 5; 18 – ñîðò Âèòà, ëèíèÿ 1; 19 – ñîðò Âåñíà, ëèíèÿ 1; Ì – ìàðêåð
ìîëåêóëÿðíûõ ìàññ
Ðèñ. 5. Ðåçóëüòàòû ÏÖÐ-àíàëèçà òðàíñãåííûõ ëèíèé ëüíà-äîëãóíöà, òðàíñôîðìèðîâàííûõ ãåíîì GFP-
TUA6 ñ èñïîëüçîâàíèåì ïðàéìåðîâ ê ãåíó nptII: 1 – íåãàòèâíûé êîíòðîëü 1 (äèñòèëëèðîâàííàÿ âîäà);
2 – íåãàòèâíûé êîíòðîëü 2 (ÄÍÊ íåòðàíñôîðìèðîâàííîãî ðàñòåíèÿ); 3 – ïîçèòèâíûé êîíòðîëü (ïëàçìèäà
pBI121); 4 – ñîðò Óêðàèíñêèé-3, ëèíèÿ 5; 5 – ñîðò Ñâèòàíîê, ëèíèÿ 7; 6 – ñîðò Ñâèòàíîê, ëèíèÿ 12;
7 – ïîçèòèâíûé êîíòðîëü (ïëàçìèäà pBI121); 8 – ñîðò Âðó÷èé, ëèíèÿ 1; 9 – ñîðò Ñâèòàíîê, ëèíèÿ 8;
10 – ñîðò Ñâèòàíîê, ëèíèÿ 10; 11 – ñîðò Óêðàèíñêèé-3, ëèíèÿ 3
8
Å.Í. Øèøà, Â.È. Êîðõîâîé, Ã.ß. Áàåð è äð.
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. ¹ 2
äó äëÿ êîðíåîáðàçîâàíèÿ ôîðìèðîâàëè êîð-
íåâóþ ñèñòåìó â ïðèñóòñòâèè 10 ìã/ë óïîìÿíó-
òîãî àíòèáèîòèêà (ðèñ. 3, ñì. âêëåéêó â êîí-
öå íîìåðà). Íåîáõîäèìî òàêæå ïîä÷åðêíóòü,
÷òî äëÿ óêîðåíåíèÿ îòáèðàëè ïîáåãè, èíè-
öèèðîâàííûå â ìåñòàõ ïðîíèêíîâåíèÿ àãðî-
áàêòåðèè â ãèïîêîòèëè, ÷òî ïîçâîëÿåò èçáå-
æàòü îòáîðà õèìåðíûõ ïîáåãîâ [18, 19, 31]. Â
öåëîì íàìè óêîðåíåíî 17 ëèíèé íåñêîëüêèõ
ñîðòîâ ëüíà-äîëãóíöà.
Äëÿ äîêàçàòåëüñòâà òðàíñãåííîé ïðèðîäû
ïîëó÷åííûõ ëèíèé ïðîâåëè èõ ÏÖÐ-àíàëèç
ñ èñïîëüçîâàíèåì ñïåöèôè÷åñêèõ ïðàéìåðîâ
ê 35S-ïðîìîòîðó è ãåíó nptII. Íà ðèñ. 4 ïðåä-
ñòàâëåíû ðåçóëüòàòû àìïëèôèêàöèè ïîñëåäî-
âàòåëüíîñòè 35S ïðîìîòîðà ñ ïîìîùüþ ÏÖÐ
ó 17 îòîáðàííûõ ëèíèé ëüíà. Èç ýëåêòðîôî-
ðåãðàììû âèäíî, ÷òî ðàçìåðû àìïëèôèöèðî-
âàííûõ ôðàãìåíòîâ ÄÍÊ ñîîòâåòñòâóþò ïîçè-
òèâíîìó êîíòðîëþ è ñîñòàâëÿþò 195 ï.í. Ïðè
ýòîì ïðè àíàëèçå ÄÍÊ íåòðàíñôîðìèðîâàí-
íûõ ðàñòåíèé ñïåöèôè÷åñêèõ ôðàãìåíòîâ íå
îáíàðóæåíî. Íåñêîëüêî îòñåëåêòèðîâàííûõ
ëèíèé ëüíà-äîëãóíöà òàêæå áûëè âûáîðî÷-
íî ïðîàíàëèçèðîâàíû íà íàëè÷èå â èõ ãåíî-
ìå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, êîäèðóþùåé ãåí nptII.
Äëÿ ýòîãî èñïîëüçîâàëè äâå ïàðû ïðàéìåðîâ,
ïîçâîëÿþùèõ àìïëèôèöèðîâàòü ôðàãìåí-
òû ÄÍÊ ðàçìåðîì 622 è 840 ï.í. Ôðàãìåíòû
òàêèõ ðàçìåðîâ îáíàðóæèëè ó ïÿòè èç ñåìè
ïðîàíàëèçèðîâàííûõ ëèíèé, ÷òî òàêæå ñâèäå-
òåëüñòâóåò îá èõ òðàíñãåííîé ïðèðîäå (ðèñ. 5,
ñì. âêëåéêó â êîíöå íîìåðà). Ñîîòâåòñòâåí-
íî, ðåçóëüòàòû ïðîâåäåííîãî ìîëåêóëÿðíî-ãå-
íåòè÷åñêîãî àíàëèçà îòñåëåêòèðîâàííûõ ëè-
íèé L. usitatissimum ïðîäåìîíñòðèðîâàëè, ÷òî
íå âñå ðåãåíåðàíòû èìåëè â ñâîåì ãåíîìå
ïîñëåäîâàòåëüíîñòè 35S-ïðîìîòîðà èëè ãå-
íà nptII.
Âïîñëåäñòâèè âñå ëèíèè (Ò0), òðàíñãåííàÿ
ïðèðîäà êîòîðûõ ïîäòâåðæäåíà ñ ïîìîùüþ
ÏÖÐ-àíàëèçà, áûëè àäàïòèðîâàíû ê óñëîâè-
ÿì çàêðûòîãî ãðóíòà. Ïîñëå ïðîâåäåíèÿ èõ
ñàìîîïûëåíèÿ ïîëó÷èëè ñåìåíà (Ò1), êîòî-
ðûå ïîâòîðíî âûñåâàëè â çàêðûòûé ãðóíò äëÿ
îöåíêè èõ âñõîæåñòè. Óñòàíîâèëè, ÷òî ïîëó-
÷åííûå ñåìåíà ëüíà ñîõðàíÿëè ôåðòèëüíîñòü
è îáëàäàëè õîðîøåé âñõîæåñòüþ, à ðàñòåíèÿ
(Ò1) â ïðîöåññå ñâîåãî îíòîãåíåçà íè÷åì
íå îòëè÷àëèñü îò êîíòðîëüíûõ (ðèñ. 6, ñì.
âêëåéêó â êîíöå íîìåðà).
Äëÿ äîêàçàòåëüñòâà íàñëåäîâàíèÿ ÷óæå-
ðîäíûõ ãåíîâ â ïåðâîì ïîêîëåíèè òðàíñ-
ãåííûõ ðàñòåíèé ëüíà-äîëãóíöà ïðîâîäèëè
èõ ÏÖÐ-àíàëèç ñ èñïîëüçîâàíèåì ïðàéìå-
ðîâ ê ïîñëåäîâàòåëüíîñòè 35S ïðîìîòîðà.
Êàê âèäíî èç ýëåêòðîôîðåãðàììû (ðèñ. 7),
ó ÷àñòè ïðîàíàëèçèðîâàííûõ ëèíèé Ò1 îá-
íàðóæåí ôðàãìåíò ðàçìåðîì 195 ï.í. Èç-
âåñòíî, ÷òî â ïåðâîì ïîêîëåíèè òðàíñãåí-
íûõ ðàñòåíèé, ïîëó÷åííûõ â ðåçóëüòàòå ñàìî-
îïûëåíèÿ, ïðèâíåñåííûå ÷óæåðîäíûå ãåíû
íàñëåäóþòñÿ êàê åäèíè÷íûå ëîêóñû â ñîîò-
íîøåíèè 3:1 [32–34]. Ñõîäíûé õàðàêòåð ðàñ-
ùåïëåíèÿ ñâîéñòâåí è ïîëó÷åííûì ëèíè-
ÿì ëüíà, îäíàêî åñòü äîñòàòî÷íûå îñíîâà-
íèÿ ïðåäïîëàãàòü, ÷òî â íàøèõ ýêñïåðè-
ìåíòàõ ðàñùåïëåíèå òàêæå ïðîèçîøëî ïî
ìîíîãèáðèäíîé ñõåìå, ò.å. 3:1.
Ïîñêîëüêó èçâåñòíî, ÷òî ïðîäóêò ýêñïðåñ-
ñèè õèìåðíîãî ãåíà GFP-TUA6 – GFP-ìå-
÷åííûé òóáóëèí – ñïîñîáåí èíêîðïîðèðîâà-
òüñÿ â íàòèâíûå ìèêðîòðóáî÷êè ðàñòèòåëüíûõ
êëåòîê [12], íàìè íàðÿäó ñ ìîëåêóëÿðíî-
ãåíåòè÷åñêèì àíàëèçîì ïîëó÷åííûõ òðàíñ-
ãåííûõ ëèíèé ëüíà-äîëãóíöà âèçóàëèçèðîâà-
íû ìèêðîòðóáî÷êè â èõ èíòåðôàçíûõ êëåò-
êàõ ñ èñïîëüçîâàíèåì êîíôîêàëüíîé ëàçåð-
íîé ñêàíèðóþùåé ìèêðîñêîïèè. Óñòàíîâëåíî,
÷òî õèìåðíûé áåëîê GFP-òóáóëèí ñïîñîáåí
âñòðàèâàòüñÿ â êîðòèêàëüíûå ìèêðîòðóáî÷-
êè, âûçûâàÿ èõ ñâå÷åíèå â êëåòêàõ (ðèñ. 8,
ñì. âêëåéêó â êîíöå íîìåðà), ÷òî ñâèäåòåëü-
ñòâóåò îá ýêñïðåññèè ïåðåíåñåííîãî ÷óæå-
ðîäíîãî ãåíà â òðàíñãåííûõ ëèíèÿõ. Ñëåäó-
åò îòìåòèòü, ÷òî ê íàñòîÿùåìó âðåìåíè ýòî
Ðèñ. 7. Ðåçóëüòàòû ÏÖÐ-àíàëèçà òðàíñãåííûõ ðàñ-
òåíèé ïîêîëåíèÿ Ò1 ñîðòà Ñâèòàíîê, ëèíèÿ 12 ñ
èñïîëüçîâàíèåì ïðàéìåðîâ ê ïîñëåäîâàòåëüíîñòè
35S ïðîìîòîðà CaMV: Ì – ìàðêåð ìîëåêóëÿðíûõ
ìàññ, Ê1 – êîíòðîëü (Í2Î), Ï – ïëàçìèäíàÿ ÄÍÊ,
1–5 – ÄÍÊ òðàíñãåííûõ ðàñòåíèé ïîêîëåíèÿ Ò1,
Ê2 – êîíòðîëü (ÄÍÊ èç íåòðàíñôîðìèðîâàííîé
ëèíèè ëüíà-äîëãóíöà)
9
Ãåíåòè÷åñêàÿ òðàíñôîðìàöèÿ ðàñòåíèé ëüíà-äîëãóíöà (Linum usitatissimum L.)
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. ¹ 2
ïåðâûå äàííûå î âèçóàëèçàöèè GFP-ìå÷åí-
íîãî òóáóëèíà â ñòàáèëüíûõ òðàíñôîðìàíòàõ
ëüíà-äîëãóíöà, õîòÿ ðàíåå ñ èñïîëüçîâàíè-
åì ýòîãî õèìåðíîãî ãåíà óäàëîñü âèçóàëè-
çèðîâàòü ìèêðîòðóáî÷êè â æèâûõ êëåòêàõ
òðàíñãåííûõ ëèíèé Arabidopsis thaliana [12].
Ðàíåå ñîîáùàëîñü òîëüêî î âèçóàëèçàöèè
ýíäîïëàçìàòè÷åñêîãî ðåòèêóëóìà â êëåòêàõ
ëüíà-äîëãóíöà ñ ïîìîùüþ òðàíñôîðìàöèè
êîíñòðóêöèåé, ñîäåðæàùåé GFP5ER [35]. Â
äðóãîé ðàáîòå ýòè æå èññëåäîâàòåëè ïðèâî-
äÿò ïîëîæèòåëüíûå ðåçóëüòàòû ïî òðàíçè-
åíòíîé ýêñïðåññèè öèòîñêåëåòíûõ ðåïîðòåð-
íûõ ãåíîâ 35S::GFP:ABD2 (ñ âèçóàëèçàöèåé
àêòèíîâûõ ôèëàìåíòîâ) è 35S::GFP:MBD (ñ
âèçóàëèçàöèåé ìèêðîòðóáî÷åê), ïîëó÷åííîé
âñëåäñòâèå áèîëèñòè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè
êëåòîê ñåìÿäîëüíûõ ëèñòüåâ è ñåãìåíòîâ ãè-
ïîêîòèëåé ëüíà-äîëãóíöà [15].
Òàêèì îáðàçîì, â õîäå íàøèõ èññëåäîâà-
íèé ïðîäåìîíñòðèðîâàíà óñïåøíàÿ àãðîáàê-
òåðèàëüíàÿ òðàíñôîðìàöèÿ ëüíà-äîëãóíöà õè-
ìåðíûì ãåíîì GFP-TUA6 â êîìáèíàöèè ñ
ñåëåêòèâíûì ìàðêåðíûì ãåíîì nptII. Ðåçóëü-
òàòû ÏÖÐ-àíàëèçà ïîäòâåðäèëè òðàíñãåííóþ
ïðèðîäó îòîáðàííûõ íà êàíàìèöèíå ëèíèé è
èõ ïîòîìêîâ â ïåðâîì ïîêîëåíèè. Óñòàíîâëå-
íî òàêæå, ÷òî GFP-ìå÷åííûé òóáóëèí óñïåøíî
êîïîëèìåðèçóåòñÿ ñ ýíäîãåííûì òóáóëèíîì
è ïðèíèìàåò ó÷àñòèå â ôîðìèðîâàíèè êîðòè-
êàëüíîé ñåòè ìèêðîòðóáî÷åê â òðàíñãåííûõ
êëåòêàõ ëüíà-äîëãóíöà. Õîòÿ èìåþòñÿ ñîîáùå-
íèÿ î òîì, ÷òî èíòðóçèâíûé ðîñò êëåòîê, êî-
òîðûé õàðàêòåðåí äëÿ ðàñòåíèé, ñîäåðæàùèõ
âîëîêíà, è â ÷àñòíîñòè äëÿ ëüíà, íå óäàåòñÿ
âîñïðîèçâåñòè â êóëüòóðå in vitro [36], ðàçðà-
áîòêà íîâûõ êëåòî÷íî-áèîëîãè÷åñêèõ ïîäõî-
äîâ äëÿ ïðèæèçíåííîãî ôîðìèðîâàíèÿ âî-
ëîêîí ïðè ðàçâèòèè îðãàíîâ è ðåãåíåðàöèè
ðàñòåíèé èç íåäèôôåðåíöèðîâàííûõ êëåòîê
îòêðûâàåò íîâûå ýêñïåðèìåíòàëüíûå âîç-
ìîæíîñòè. Ïîëó÷åííûå íàìè ëèíèè â äàëü-
íåéøåì ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû äëÿ óãëóá-
ëåííîãî èçó÷åíèÿ ðîëè ìèêðîòðóáî÷åê â ôîð-
ìèðîâàíèè âîëîêîí, à òàêæå ìåõàíè÷åñêîé
óñòîé÷èâîñòè ê ïîëåãàíèþ ó ëüíà-äîëãóíöà.
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ïîääåðæêå ñîâìåñò-
íûõ ãðàíòîâ ñ Ðåñïóáëèêîé Áåëàðóñü è Ãîñóäàð-
ñòâåííîãî ôîíäà ôóíäàìåíòàëüíèõ èññëåäîâà-
íèé Óêðàèíû, ãðàíòû ¹ 14.4/023 (2007–2008)
è ¹ 29.4/016 (2009–2010).
E.N. Shysha, V.I. Korhovyu, G.Ya. Bayer,
E.V. Guzenko, V.A. Lemesh, N.A. Kartel,
A.I. Yemets,Ya.B. Blume
Institute of Food Biotechnology and Genomics,
National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: elenashysha@mail.ru
GENETIC TRANSFORMATION OF FLAX
(LINUM USITATISSIMUM L.) WITH CHIMERIC
GFP-TUA6 GENE FOR VISUALISATION
MICROTUBULE
The data of Agrobacterium-mediated transforma-
tion of some Linum usitatissimum cultivars zoned on
the territories of Belarus and Ukraine with the plas-
mid carrying chimeric GFP-TUA6 gene and nptII
gene as selectable marker conferring resistance to
kanamycin are presented in this study. Transforma-
tion was affected by a number of factors including
optical density (OD600), time of inoculation of ex-
plants with Agrobacterium and co-culture conditions.
Transgenic nature of obtained lines was confirmed
by PCR analysis. Expression of GFP-TUA6 gene was
detected with confocal laser scanning microscopy.
The obtained transgenic lines can be used for further
functional studies the role of microtubules in the
processes of building the flax fibres and resistance to
wind.
Î.Ì. Øèøà, Â.². Êîðõîâèé, Ã.ß. Áàºð,
Î.Â. Ãóçåíêî, Â.Î. Ëåìåø, Ì.Î. Êàðòåëü,
À.². ªìåöü, ß.Á. Áëþì
ÃÅÍÅÒÈ×ÍÀ ÒÐÀÍÑÔÎÐÌÀÖ²ß ÐÎÑËÈÍ
ËÜÎÍÓ-ÄÎÂÃÓÍÖß (LINUM USITATISSIMUM
L.) Õ²ÌÅÐÍÈÌ ÃÅÍÎÌ GFP-TUA6
ÄËß Â²ÇÓÀ˲ÇÀÖ²¯ ̲ÊÐÎÒÐÓÁÎ×ÎÊ
Ïðåäñòàâëåíî ðåçóëüòàòè ç àãðîáàêòåð³àëüíî¿
òðàíñôîðìàö³¿ ðÿäó ñîðò³â ëüîíó-äîâãóíöÿ, ðàéî-
íîâàíèõ íà òåðèòîð³ÿõ Á³ëîðóñ³ òà Óêðà¿íè, çà
äîïîìîãîþ ïëàçì³äè, ùî ì³ñòèëà õèìåðíèé ãåí
GFP-TUA6 òà ñåëåêòèâíèé ìàðêåðíèé ãåí nptII,
ÿêèé íåñå ñò³éê³ñòü äî êàíàì³öèíó. Ïðè ïðîâå-
äåíí³ òðàíñôîðìàö³¿ âðàõîâóâàëè ôàêòîðè, ùî
âïëèâàþòü íà åôåêòèâí³ñòü òðàíñôîðìàö³¿, à ñàìå
îïòè÷íó ù³ëüí³ñòü, îïòèìàëüíèé ïðîì³æîê ÷àñó
³íîêóëÿö³¿ åêñïëàíò³â ç àãðîáàêòåð³ºþ òà óìîâè
êîêóëüòèâóâàííÿ. Íà ñåëåêòèâíîìó ñåðåäîâèù³,
ùî ì³ñòèëî êàíàì³öèí â êîíöåíòðàö³¿ 100 ìã/ë,
â³ä³áðàíî ë³í³¿, òðàíñãåííà ïðèðîäà ÿêèõ áóëà
ï³äòâåðäæåíà çà äîïîìîãîþ ÏËÐ-àíàë³çó. Åêñïðå-
ñ³þ õèìåðíîãî ãåíà GFP-TUA6 äåòåêòîâàíî çà äî-
ïîìîãîþ ëàçåðíî¿ ñêàíóþ÷î¿ êîíôîêàëüíî¿ ì³êðî-
10
Å.Í. Øèøà, Â.È. Êîðõîâîé, Ã.ß. Áàåð è äð.
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. ¹ 2
ñêîﳿ. Îòðèìàí³ â õîä³ íàøèõ äîñë³äæåíü ë³í³¿
â ïîäàëüøîìó ìîæóòü áóòè âèêîðèñòàí³ äëÿ ïî-
ãëèáëåíîãî âèâ÷åííÿ ðîë³ ì³êðîòðóáî÷îê â ïðî-
öåñàõ ôîðìóâàííÿ âîëîêíà, à òàêîæ ìåõàí³÷íî¿
ñò³éêîñò³ äî ïîëÿãàííÿ ó ëüîíó-äîâãóíöÿ.
ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ
1. Kvavadze E., Bar-Yosef O., Belfer-Cohen A., Boa-
retto E., Jakeli N., Matskevich Z., Meshveliani T.
30,000-year-old wild flax fibers // Science. – 2009. –
325, ¹ 5946. – Ð. 1359.
2. Dissanayake N.P.J., Summerscales J., Grove S.M.,
Singh M.M. Life cycle assessment of flax fiber
for the reinforcement of composites // J. Bio-
Based Materials BioEnergy. – 2009. – 3, ¹ 3. –
Ð. 245–248.
3. Bringmann M., Landrein B., Schudoma C., Hamant O.,
Hauser M.-T., Persson S. Cracking the elusive alig-
nment hypothesis: the microtubule-cellulose synt-
hase nexus unraveled // Trends Plant Sci. – 2012. –
17, ¹ 11. – Ð. 666–674.
4. Ãðóøåöêàÿ Ç.Å., Ëåìåø Â.À., Õîòûëåâà Ë.Â. Ñîç-
äàíèå ñïåöèôè÷åñêèõ è âûðîæäåííûõ ïðàé-
ìåðîâ ê ãåíàì CesA öåëëþëîçîñèíòàçû ëüíà
(Linum usitatissimum L.) // Öèòîëîãèÿ è ãåíåòè-
êà. – 2010. – 44, ¹ 4. – Ñ. 3–8.
5. Baskin T.I. On the alignement of cellulose micro-
fibrils by cortical microtubules: a review and a mo-
del // Protoplasma. – 2001. – 215. – P. 150–171.
6. Baskin T.I. Anisotropic expansion of the plant cell
wall // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. – 2005. – 21. –
P. 203–222.
7. Baskin T.I., Beemster G.T., Judy-March J.E., Mar-
da F. Disorganization of cortical microtubules
stimulates tagential expansion and reduces the
uniformity of cellulose microfibril alignment
among cells in the root of Arabidopsis // Plant
Physiol. – 2004. – 135. – P. 2279–2290.
8. Hotte N.S.C., Deyholos M.K. A flax fibre proteome:
identification of proteins enriched in bast fibres //
BMC Plant Biol. – 2008. – 8. – P. 52.
9. Boutte Y., Vernhettes S., Satiat-Jeunemaitre B.
Involvement of the cytoskeleton in the secretory
pathway and plasma membrane organization //
Cell Biol. Int. – 2007. – 31. – P. 649–654.
10. Øèøà Å.Í., Åìåö À.È., Ãóçåíêî Å.Â., Ëåìåø Â.À.,
Êàðòåëü Í.À., Áëþì ß.Á. Èçó÷åíèå ðåãåíåðà-
öèîííîé ñïîñîáíîñòè è êîðíåîáðàçîâàíèÿ ñîð-
òîâ ëüíà-äîëãóíöà óêðàèíñêîé è áåëîðóñ-ñêîé
ñåëåêöèè // Ôèçèîëîãèÿ è áèîõèìèÿ êóëüòóð.
ðàñòåíèé. – 2011. – 43, ¹ 1. – Ñ. 57–64.
11. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Pren-
dergast F.G., Cormier M.J. Primary structure of
the Aequorea victoria green-fluorescent protein //
Gene. – 1992. – 111. – P. 229–233.
12. Ueda K., Matsuyamà T., Hashimoto T. Visualisation
of microtubules in living cells of transgenic Ara-
bidopsis thaliana // Protoplasma. – 1999. – 206. –
P. 201–206.
13. Kumagai F., Yoneda A., Tomida T., Sano T., Nagata T.,
Hasezawa S. Fate of nascent microtubules or-
ganized at the M/G1 interface, as visualized by
synchronized tobacco BY-2 cells stably expressing
GFP-tubulin: time-sequence observations of the
reorganization of cortical microtubules in living
plant cells // Plant Cell Physiol. – 2001. – 42,
¹ 7 – P. 723–732.
14. Krasylenko Yu., Yemets A., Sheremet Ya., Blume Ya.B.
Nitric oxide as a critical factor for perception of
UV-B irradiation by microtubules in Arabidop-
sis // Physiol. Plant. – 2012. – 145, ¹ 4. – Ð. 501–
515.
15. Bleho J., Šamaj J. Green fluorescent protein as
a vital marker for non-destructive detection of
transient transformation events in flax explants //
Agriculture (Po’nohospodárstvo). – 2010. – 56,
¹ 4. – Ð. 99–105
16. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular
Cloning. Book 1. – New York : Cold Spring Har-
bor Laboratory Press, 1989. – P. 630–631.
17. Dong J.Z., McHugen A. An improved procedure
for production of transgenic flax plants using Agro-
bacterium tumefaciens // Plant Sci. – 1993. –
88. – P. 61–71.
18. Dong J.Z., McHughen A. Transgenic flax plants from
Agrobacterium tumefaciens transformation – inci-
dence of chimeric regenerants and inheritance of
transgenic plants // Plant. Sci. – 1993. – 91. –
P. 139–138
19. Ïîëÿêîâà À.Â., ×èðêèçîâà Î.Ô., Êàëÿåâà Ì.À. è
äð. Òðàíñôîðìàöèÿ ðàñòåíèé ëüíà-äîëãóíöà //
Ôèçèîëîãèÿ ðàñòåíèé. –1998. – 45, ¹ 6. –
Ñ. 882–887.
20. Yemets A., Radchuk V., Bayer O., Bayer G., Baird V.,
Blume Ya. The development of transformation
vectors based upon modified plant a-tubulin gene
as a selectable marker // Cell. Biol. Int. – 2008. –
32, ¹ 5. – P. 566–570.
21. Ling H.Q., Binding H. Plant regeneration from pro-
toplasts in Linum // Plant Breed. – 1987. – 98. –
P. 312–317.
22. Ling H.Q., Binding H. Improvement of plant re-
generation from protoplasts by the induction of
somatic embryogenesis // J. Plant. Physiol. – 1992. –
139. – P. 422–426.
23. Áåëîíîãîâà Ì.À., Ðàëäóãèíà Ã.Í. Ðåãåíåðàöèÿ ïî-
áåãîâ íà ñåìÿäîëüíûõ ýêñïëàíòàõ ëüíà-äîë-
ãóíöà è èõ óêîðåíåíèå // Ôèçèîëîãèÿ ðàñòå-
íèé. – 2006. – 53, ¹ 4. – Ñ. 142–148.
24. Bretange B., Chupeau M.-C.,Chupeau Y., Fouil-
11
Ãåíåòè÷åñêàÿ òðàíñôîðìàöèÿ ðàñòåíèé ëüíà-äîëãóíöà (Linum usitatissimum L.)
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. ¹ 2
loux G. Improved flax regeneration from hypocotyls
using thidiazuron as a cytokinin source // Plant
Cell Rep. – 1994. – 14. – P. 120–124.
25. Dedicova B., Hricova A., Samaj J., Obert B., Bobak A.,
Pretova A. Shoots and embryo-like structures re-
generated from cultured flax (Linum usitatissimum
L.) hypocotyl segments // J. Plant. Physiol. –
2000. – 157. – P. 327–334.
26. Áàåð Î.À., Áàåð Ã.ß., Åìåö ß.Á., Áëþì ß.Á. Ââå-
äåíèå â êóëüòóðó in vitro è ðåãåíåðàöèîííàÿ
ñïîñîáíîñòü ñîðòîâ ëüíà-äîëãóíöà ñ ðàçëè÷íîé
óñòîé÷èâîñòüþ ê ïîëåãàíèþ // Ôèçèîëîãèÿ è
áèîõèìèÿ êóëüòóð. ðàñòåíèé. – 2004. – 36, ¹ 1. –
Ñ. 48–54.
27. Nichterlein K., Umbach H., Friedt W. Genotypic
and exogenous factors affecting shoot regeneration
from anther callus of linseed (Linum usitatissimum
L.) // Euphytica. – 1991. – 58. – P. 157–164.
28. Chen Y., Kenaschuk E.O., Dribnenki P. Response
of flax genotypes to doubled haploid production //
Plant Cell Tissue Org. Cult. – 1999. – 57. – P. 195–
198.
29. Chen Y., Dribnenki P. Effect of genotype and me-
dium composition on flax (Linum usitatissimum L.)
anther culture // Ibid. – P. 204–207.
30. Åìåö À.È., Áàåð Î.À., Ðàä÷óê Â.Â., Áëþì ß.Á.
Àãðîáàêòåðèàëüíàÿ òðàíñôîðìàöèÿ ëüíà-äîë-
ãóíöà ìóòàíòíûì ãåíîì òóáóëèíà, íåñóùèì óñ-
òîé÷èâîñòü ê äèíèòðîàíèëèíîâûì ãåðáèöè-
äàì // Ãåíåòèêà. – 2009. – 45, ¹ 10. – Ñ. 1377–
1385.
31. Jordan M., McHughen A. Transformed callus does
not necessarily regenerate transformed shoots //
Plant Cell Rep. – 1988. – 7. – P. 285–287.
32. Misra S., Gedamu L. Heavy metal tolerant trans-
genic Brassica napus L. and Nicotiana tabacum L.
plants // Theor. Appl. Genet. – 1989. – 78. –
P. 161–168.
33. Denis M., Delourme R., Gourret J.P., Mariani C.,
Renard M. Expression of engineered nuclear ma-
le sterility in Brassica napus // Plant Physiol. –
1993. – 101. – P. 1295–1304.
34. Budar F., Thia-Thoong L., Van Montagu M., Hernals-
teens J.P. Agrobacterium-mediated gene transfer re-
sults mainly in transgenic plants transmitting
T-DNA as a single Mendelian factor // Gene-
tics. – 1986. – 114. – P. 303–313.
35. Bleho J., Obert B., Taká T., Petrovská B., Heym C.,
Menzel D., Šamaj J. ER disruption and GFP degra-
dation during non-regenerable transformation of
flax with Agrobacterium tumefaciens // Protoplas-
ma. – 2012. – 249. – P. 53–63.
36. Ñíåãèðåâà À.Â., Àãååâà Ì.Â., Àìåíèöêèé Ñ.È.,
×åðíîâà Ò.Å., Ýáñêàìï Ì., Ãîðøêîâà Ò.À. Èíò-
ðóçèâíûé ðîñò âîëîêîí ñêëåðåíõèìû // Ôè-
çèîëîãèÿ ðàñòåíèé. – 2010. – 57, ¹ 3. –
Ñ. 361–375.
Ïîñòóïèëà 24.07.12
<<
/ASCII85EncodePages false
/AllowTransparency false
/AutoPositionEPSFiles true
/AutoRotatePages /None
/Binding /Left
/CalGrayProfile (Dot Gain 20%)
/CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1)
/CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2)
/sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1)
/CannotEmbedFontPolicy /Error
/CompatibilityLevel 1.4
/CompressObjects /Tags
/CompressPages true
/ConvertImagesToIndexed true
/PassThroughJPEGImages true
/CreateJobTicket false
/DefaultRenderingIntent /Default
/DetectBlends true
/DetectCurves 0.0000
/ColorConversionStrategy /CMYK
/DoThumbnails false
/EmbedAllFonts true
/EmbedOpenType false
/ParseICCProfilesInComments true
/EmbedJobOptions true
/DSCReportingLevel 0
/EmitDSCWarnings false
/EndPage -1
/ImageMemory 1048576
/LockDistillerParams false
/MaxSubsetPct 100
/Optimize true
/OPM 1
/ParseDSCComments true
/ParseDSCCommentsForDocInfo true
/PreserveCopyPage true
/PreserveDICMYKValues true
/PreserveEPSInfo true
/PreserveFlatness true
/PreserveHalftoneInfo false
/PreserveOPIComments false
/PreserveOverprintSettings true
/StartPage 1
/SubsetFonts true
/TransferFunctionInfo /Apply
/UCRandBGInfo /Preserve
/UsePrologue false
/ColorSettingsFile ()
/AlwaysEmbed [ true
]
/NeverEmbed [ true
]
/AntiAliasColorImages false
/CropColorImages true
/ColorImageMinResolution 300
/ColorImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleColorImages true
/ColorImageDownsampleType /Bicubic
/ColorImageResolution 1200
/ColorImageDepth -1
/ColorImageMinDownsampleDepth 1
/ColorImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeColorImages false
/ColorImageFilter /DCTEncode
/AutoFilterColorImages true
/ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG
/ColorACSImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/ColorImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/JPEG2000ColorACSImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/JPEG2000ColorImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/AntiAliasGrayImages false
/CropGrayImages true
/GrayImageMinResolution 300
/GrayImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleGrayImages true
/GrayImageDownsampleType /Bicubic
/GrayImageResolution 1200
/GrayImageDepth -1
/GrayImageMinDownsampleDepth 2
/GrayImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeGrayImages false
/GrayImageFilter /DCTEncode
/AutoFilterGrayImages true
/GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG
/GrayACSImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/GrayImageDict <<
/QFactor 0.15
/HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
>>
/JPEG2000GrayACSImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/JPEG2000GrayImageDict <<
/TileWidth 256
/TileHeight 256
/Quality 30
>>
/AntiAliasMonoImages false
/CropMonoImages true
/MonoImageMinResolution 1200
/MonoImageMinResolutionPolicy /OK
/DownsampleMonoImages true
/MonoImageDownsampleType /Bicubic
/MonoImageResolution 1200
/MonoImageDepth -1
/MonoImageDownsampleThreshold 1.50000
/EncodeMonoImages false
/MonoImageFilter /CCITTFaxEncode
/MonoImageDict <<
/K -1
>>
/AllowPSXObjects false
/CheckCompliance [
/None
]
/PDFX1aCheck false
/PDFX3Check false
/PDFXCompliantPDFOnly false
/PDFXNoTrimBoxError true
/PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
]
/PDFXSetBleedBoxToMediaBox true
/PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [
0.00000
0.00000
0.00000
0.00000
]
/PDFXOutputIntentProfile (None)
/PDFXOutputConditionIdentifier ()
/PDFXOutputCondition ()
/PDFXRegistryName ()
/PDFXTrapped /False
/CreateJDFFile false
/Description <<
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
/BGR <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>
/CHS <FEFF4f7f75288fd94e9b8bbe5b9a521b5efa7684002000410064006f006200650020005000440046002065876863900275284e8e9ad88d2891cf76845370524d53705237300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c676562535f00521b5efa768400200050004400460020658768633002>
/CHT <FEFF4f7f752890194e9b8a2d7f6e5efa7acb7684002000410064006f006200650020005000440046002065874ef69069752865bc9ad854c18cea76845370524d5370523786557406300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c4f86958b555f5df25efa7acb76840020005000440046002065874ef63002>
/CZE <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>
/DAN <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>
/DEU <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>
/ESP <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>
/ETI <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>
/FRA <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>
/GRE <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>
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
/HRV (Za stvaranje Adobe PDF dokumenata najpogodnijih za visokokvalitetni ispis prije tiskanja koristite ove postavke. Stvoreni PDF dokumenti mogu se otvoriti Acrobat i Adobe Reader 5.0 i kasnijim verzijama.)
/HUN <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>
/ITA <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>
/JPN <FEFF9ad854c18cea306a30d730ea30d730ec30b951fa529b7528002000410064006f0062006500200050004400460020658766f8306e4f5c6210306b4f7f75283057307e305930023053306e8a2d5b9a30674f5c62103055308c305f0020005000440046002030d530a130a430eb306f3001004100630072006f0062006100740020304a30883073002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee5964d3067958b304f30533068304c3067304d307e305930023053306e8a2d5b9a306b306f30d530a930f330c8306e57cb30818fbc307f304c5fc59808306730593002>
/KOR <FEFFc7740020c124c815c7440020c0acc6a9d558c5ec0020ace0d488c9c80020c2dcd5d80020c778c1c4c5d00020ac00c7a50020c801d569d55c002000410064006f0062006500200050004400460020bb38c11cb97c0020c791c131d569b2c8b2e4002e0020c774b807ac8c0020c791c131b41c00200050004400460020bb38c11cb2940020004100630072006f0062006100740020bc0f002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020c774c0c1c5d0c11c0020c5f40020c2180020c788c2b5b2c8b2e4002e>
/LTH <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>
/LVI <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>
/NLD (Gebruik deze instellingen om Adobe PDF-documenten te maken die zijn geoptimaliseerd voor prepress-afdrukken van hoge kwaliteit. De gemaakte PDF-documenten kunnen worden geopend met Acrobat en Adobe Reader 5.0 en hoger.)
/NOR <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>
/POL <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>
/PTB <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>
/RUM <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>
/RUS <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>
/SKY <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>
/SLV <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>
/SUO <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>
/SVE <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>
/TUR <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>
/UKR <FEFF04120438043a043e0440043804410442043e043204430439044204350020044604560020043f043004400430043c043504420440043800200434043b044f0020044104420432043e04400435043d043d044f00200434043e043a0443043c0435043d044204560432002000410064006f006200650020005000440046002c0020044f043a04560020043d04300439043a04400430044904350020043f045604340445043e0434044f0442044c00200434043b044f0020043204380441043e043a043e044f043a04560441043d043e0433043e0020043f0435044004350434043404400443043a043e0432043e0433043e0020043404400443043a0443002e00200020042104420432043e04400435043d045600200434043e043a0443043c0435043d0442043800200050004400460020043c043e0436043d04300020043204560434043a0440043804420438002004430020004100630072006f006200610074002004420430002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e0030002004300431043e0020043f04560437043d04560448043e04570020043204350440044104560457002e>
/ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents best suited for high-quality prepress printing. Created PDF documents can be opened with Acrobat and Adobe Reader 5.0 and later.)
>>
/Namespace [
(Adobe)
(Common)
(1.0)
]
/OtherNamespaces [
<<
/AsReaderSpreads false
/CropImagesToFrames true
/ErrorControl /WarnAndContinue
/FlattenerIgnoreSpreadOverrides false
/IncludeGuidesGrids false
/IncludeNonPrinting false
/IncludeSlug false
/Namespace [
(Adobe)
(InDesign)
(4.0)
]
/OmitPlacedBitmaps false
/OmitPlacedEPS false
/OmitPlacedPDF false
/SimulateOverprint /Legacy
>>
<<
/AddBleedMarks false
/AddColorBars false
/AddCropMarks false
/AddPageInfo false
/AddRegMarks false
/ConvertColors /ConvertToCMYK
/DestinationProfileName ()
/DestinationProfileSelector /DocumentCMYK
/Downsample16BitImages true
/FlattenerPreset <<
/PresetSelector /MediumResolution
>>
/FormElements false
/GenerateStructure false
/IncludeBookmarks false
/IncludeHyperlinks false
/IncludeInteractive false
/IncludeLayers false
/IncludeProfiles false
/MultimediaHandling /UseObjectSettings
/Namespace [
(Adobe)
(CreativeSuite)
(2.0)
]
/PDFXOutputIntentProfileSelector /DocumentCMYK
/PreserveEditing true
/UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged
/UntaggedRGBHandling /UseDocumentProfile
/UseDocumentBleed false
>>
]
>> setdistillerparams
<<
/HWResolution [2400 2400]
/PageSize [612.000 792.000]
>> setpagedevice
|