Метаболическая инженерия дрожжей Hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола

До недавнего времени никто не рассматривал метилотрофные дрожжи как потенциальный продуцент биотоплива, в частности биоэтанола, из гидролизатов лигноцеллюлозы. Десять лет назад опублікована первая работа, раскрывающая способность термотолерантных метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha сбраживать...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Published in:	Цитология и генетика
Date:	2013
Main Authors:	Дмитрук, К.В., Сибирный, А.А.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2013
Subjects:	Оригинальные работы
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/126599
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Метаболическая инженерия дрожжей Hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола / К.В. Дмитрук, А.А. Сибирный // Цитология и генетика. — 2013. — Т. 47, № 6. — С. 3-21. — Бібліогр.: 71 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-126599
record_format	dspace
spelling	Дмитрук, К.В. Сибирный, А.А. 2017-11-28T16:19:48Z 2017-11-28T16:19:48Z 2013 Метаболическая инженерия дрожжей Hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола / К.В. Дмитрук, А.А. Сибирный // Цитология и генетика. — 2013. — Т. 47, № 6. — С. 3-21. — Бібліогр.: 71 назв. — рос. 0564-3783 DOI: 10.3103/S0095452713060029 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/126599 576.343:582.282.23 До недавнего времени никто не рассматривал метилотрофные дрожжи как потенциальный продуцент биотоплива, в частности биоэтанола, из гидролизатов лигноцеллюлозы. Десять лет назад опублікована первая работа, раскрывающая способность термотолерантных метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha сбраживать один из основных сахаров лигноцеллюлозы – ксилозу, что сделало эти дрожжи перспективным организмом для проведения высоко-температурной алкогольной ферментации [1]. Такая особенность дрожжей H. polymorpha может быть использована при реализации потенциально эффективного процесса одновременного осахаривания и ферментации (ООФ) сырья. ООФ позволяет соединить ферментативный гидролиз сырья с конверсией образующихся сахаров в этанол: ферменты гидролизируют полисахариды до мономерных сахаров, которые немедленно потребляются микроорганизмами – продуцентами этанола. Однако эффективность алкогольной ферментации дикими штаммами H. polymorpha основных сахаров – продуктов гидролиза лигноцеллюлозного сырья, и особенно ксилозы, требует значительного улучшения. В настоящем обзоре изложены основные результаты в области метаболической инженерии H. polymorpha для конструирования продуцентов этанола из ксилозы, крахмала, ксилана и глицерина, а также штаммов с повышенной толерантностью к высокой температуре и етанолу. До недавнього часу ніхто не розглядав метилотрофні дріжджі як потенційний продуцент біопалива, зокрема біоетанолу, з гідролізатів лігноцелюлози. Десять років тому було опубліковано першу роботу, яка розкриває здатність термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha зброджувати один з основних цукрів лігноцелюлози – ксилозу, що перетворило ці дріжджі на перспективний організм для проведення високотемпературної алкогольної ферментації. Така особливість дріжджів H. polymorpha може бути ви-користана у потенційно ефективному процесі одночасного оцукрювання та ферментації (ООФ) сировини. ООФ дозволяє поєднати ферментативний гідроліз сировини з конверсією утворених цукрів в етанол: ферменти гідролізують полісахариди до мономерних цукрів, які споживаються мікроорганізмами – продуцентами етанолу. Однак ефективність алкогольної ферментації дикими штамами H. polymorpha основних цукрів – продуктів гідролізу лігноцелюлозної сировини, та особливо ксилози, потребує істотного покращення. В представленому огляді викладено основні результати в галузі метаболічної інженерії H. Polymorpha для конструювання продуцентів етанолу з ксилози, крохмалю, ксилану та гліцерину, а також штамів з підвищеною толерантністю до високої температури та етанолу. Until recently, the methylotrophic yeast has not been considered as a potential producer of biofuels, particularly, ethanol from lignocellulosic hydrolysates. The first work published 10 years ago revealed the ability of the thermotolerant methylotrophic yeast Hansenula polymorpha to ferment xylose—one of the main sugars of lignocellulosic hydrolysates—which has made the yeast a promising organism for high-temperature alcoholic fermentation. Such a feature of H. polymorpha could be used in the implementation of a potentially effective process of simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of raw materials. SSF makes it possible to combine enzymatic hydrolysis of raw materials with the conversion of the sugars produced into ethanol: enzymes hydrolyze polysaccharides to monomers, which are immediately consumed by microorganisms (producers of ethanol). However, the efficiency of alcoholic fermentation of major sugars produced via hydrolysis of lignocellulosic raw materials and, especially, xylose by wild strains of H. polymorpha requires significant improvements. In this review, the main results of metabolic engineering of H. polymorpha for the construction of improved producers of ethanol from xylose, starch, xylan, and glycerol, as well as that of strains with increased tolerance to high temperatures and ethanol, are represented. Работа выполнена в рамках проекта № 9-11 целевой комплексной программы научных исследований НАН Украины «Биомасса как топливное сырье» («Биотоплива»), а также при финансовой поддержке УНТЦ-5505. ru Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України Цитология и генетика Оригинальные работы Метаболическая инженерия дрожжей Hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha для створення ефективних продуцентів етанолу Metabolic engineering of the yeast Hansenula polymorpha for the construction of efficient ethanol producers Article published earlier
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
title	Метаболическая инженерия дрожжей Hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола
spellingShingle	Метаболическая инженерия дрожжей Hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола Дмитрук, К.В. Сибирный, А.А. Оригинальные работы
title_short	Метаболическая инженерия дрожжей Hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола
title_full	Метаболическая инженерия дрожжей Hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола
title_fullStr	Метаболическая инженерия дрожжей Hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола
title_full_unstemmed	Метаболическая инженерия дрожжей Hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола
title_sort	метаболическая инженерия дрожжей hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола
author	Дмитрук, К.В. Сибирный, А.А.
author_facet	Дмитрук, К.В. Сибирный, А.А.
topic	Оригинальные работы
topic_facet	Оригинальные работы
publishDate	2013
language	Russian
container_title	Цитология и генетика
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
format	Article
title_alt	Метаболічна інженерія дріжджів Hansenula polymorpha для створення ефективних продуцентів етанолу Metabolic engineering of the yeast Hansenula polymorpha for the construction of efficient ethanol producers
description	До недавнего времени никто не рассматривал метилотрофные дрожжи как потенциальный продуцент биотоплива, в частности биоэтанола, из гидролизатов лигноцеллюлозы. Десять лет назад опублікована первая работа, раскрывающая способность термотолерантных метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha сбраживать один из основных сахаров лигноцеллюлозы – ксилозу, что сделало эти дрожжи перспективным организмом для проведения высоко-температурной алкогольной ферментации [1]. Такая особенность дрожжей H. polymorpha может быть использована при реализации потенциально эффективного процесса одновременного осахаривания и ферментации (ООФ) сырья. ООФ позволяет соединить ферментативный гидролиз сырья с конверсией образующихся сахаров в этанол: ферменты гидролизируют полисахариды до мономерных сахаров, которые немедленно потребляются микроорганизмами – продуцентами этанола. Однако эффективность алкогольной ферментации дикими штаммами H. polymorpha основных сахаров – продуктов гидролиза лигноцеллюлозного сырья, и особенно ксилозы, требует значительного улучшения. В настоящем обзоре изложены основные результаты в области метаболической инженерии H. polymorpha для конструирования продуцентов этанола из ксилозы, крахмала, ксилана и глицерина, а также штаммов с повышенной толерантностью к высокой температуре и етанолу. До недавнього часу ніхто не розглядав метилотрофні дріжджі як потенційний продуцент біопалива, зокрема біоетанолу, з гідролізатів лігноцелюлози. Десять років тому було опубліковано першу роботу, яка розкриває здатність термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha зброджувати один з основних цукрів лігноцелюлози – ксилозу, що перетворило ці дріжджі на перспективний організм для проведення високотемпературної алкогольної ферментації. Така особливість дріжджів H. polymorpha може бути ви-користана у потенційно ефективному процесі одночасного оцукрювання та ферментації (ООФ) сировини. ООФ дозволяє поєднати ферментативний гідроліз сировини з конверсією утворених цукрів в етанол: ферменти гідролізують полісахариди до мономерних цукрів, які споживаються мікроорганізмами – продуцентами етанолу. Однак ефективність алкогольної ферментації дикими штамами H. polymorpha основних цукрів – продуктів гідролізу лігноцелюлозної сировини, та особливо ксилози, потребує істотного покращення. В представленому огляді викладено основні результати в галузі метаболічної інженерії H. Polymorpha для конструювання продуцентів етанолу з ксилози, крохмалю, ксилану та гліцерину, а також штамів з підвищеною толерантністю до високої температури та етанолу. Until recently, the methylotrophic yeast has not been considered as a potential producer of biofuels, particularly, ethanol from lignocellulosic hydrolysates. The first work published 10 years ago revealed the ability of the thermotolerant methylotrophic yeast Hansenula polymorpha to ferment xylose—one of the main sugars of lignocellulosic hydrolysates—which has made the yeast a promising organism for high-temperature alcoholic fermentation. Such a feature of H. polymorpha could be used in the implementation of a potentially effective process of simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of raw materials. SSF makes it possible to combine enzymatic hydrolysis of raw materials with the conversion of the sugars produced into ethanol: enzymes hydrolyze polysaccharides to monomers, which are immediately consumed by microorganisms (producers of ethanol). However, the efficiency of alcoholic fermentation of major sugars produced via hydrolysis of lignocellulosic raw materials and, especially, xylose by wild strains of H. polymorpha requires significant improvements. In this review, the main results of metabolic engineering of H. polymorpha for the construction of improved producers of ethanol from xylose, starch, xylan, and glycerol, as well as that of strains with increased tolerance to high temperatures and ethanol, are represented.
issn	0564-3783
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/126599
citation_txt	Метаболическая инженерия дрожжей Hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола / К.В. Дмитрук, А.А. Сибирный // Цитология и генетика. — 2013. — Т. 47, № 6. — С. 3-21. — Бібліогр.: 71 назв. — рос.
work_keys_str_mv	AT dmitrukkv metaboličeskaâinženeriâdrožžeihansenulapolymorphadlâsozdaniâéffektivnyhproducentovétanola AT sibirnyiaa metaboličeskaâinženeriâdrožžeihansenulapolymorphadlâsozdaniâéffektivnyhproducentovétanola AT dmitrukkv metabolíčnaínženeríâdríždžívhansenulapolymorphadlâstvorennâefektivnihproducentívetanolu AT sibirnyiaa metabolíčnaínženeríâdríždžívhansenulapolymorphadlâstvorennâefektivnihproducentívetanolu AT dmitrukkv metabolicengineeringoftheyeasthansenulapolymorphafortheconstructionofefficientethanolproducers AT sibirnyiaa metabolicengineeringoftheyeasthansenulapolymorphafortheconstructionofefficientethanolproducers
first_indexed	2025-11-26T13:14:54Z
last_indexed	2025-11-26T13:14:54Z
_version_	1850622295456874496
fulltext	3ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 УДК 576.343:582.282.23 К.В. ДМИТРУК 1, А.А. СИБИРНЫЙ 1,2 1 Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, Украина 2 Жешовский университет, Польша E-mail: sibirny@cellbiol.lviv.ua МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ДРОЖЖЕЙ HANSENULA POLYMORPHA ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЭФФЕКТИВНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ЭТАНОЛА © Ê.Â. ÄÌÈÒÐÓÊ, À.À. ÑÈÁÈÐÍÛÉ, 2013 Äî íåäàâíåãî âðåìåíè íèêòî íå ðàññìàòðèâàë ìåòè- ëîòðîôíûå äðîææè êàê ïîòåíöèàëüíûé ïðîäóöåíò áèîòîïëèâà, â ÷àñòíîñòè áèîýòàíîëà, èç ãèäðîëèçà- òîâ ëèãíîöåëëþëîçû. Äåñÿòü ëåò íàçàä îïóáëèêîâàíà ïåðâàÿ ðàáîòà, ðàñêðûâàþùàÿ ñïîñîáíîñòü òåðìî- òîëåðàíòíûõ ìåòèëîòðîôíûõ äðîææåé Hansenula polymorpha ñáðàæèâàòü îäèí èç îñíîâíûõ ñàõàðîâ ëèãíî- öåëëþëîçû – êñèëîçó, ÷òî ñäåëàëî ýòè äðîææè ïåðñïåêòèâíûì îðãàíèçìîì äëÿ ïðîâåäåíèÿ âûñîêî- òåìïåðàòóðíîé àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè [1]. Òàêàÿ îñîáåííîñòü äðîææåé H. polymorpha ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàíà ïðè ðåàëèçàöèè ïîòåíöèàëüíî ýôôåêòèâ- íîãî ïðîöåññà îäíîâðåìåííîãî îñàõàðèâàíèÿ è ôåðìåí- òàöèè (ÎÎÔ) ñûðüÿ. ÎÎÔ ïîçâîëÿåò ñîåäèíèòü ôåð- ìåíòàòèâíûé ãèäðîëèç ñûðüÿ ñ êîíâåðñèåé îáðàçóþ- ùèõñÿ ñàõàðîâ â ýòàíîë: ôåðìåíòû ãèäðîëèçèðóþò ïîëèñàõàðèäû äî ìîíîìåðíûõ ñàõàðîâ, êîòîðûå íåìåä- ëåííî ïîòðåáëÿþòñÿ ìèêðîîðãàíèçìàìè – ïðîäóöåíòà- ìè ýòàíîëà. Îäíàêî ýôôåêòèâíîñòü àëêîãîëüíîé ôåð- ìåíòàöèè äèêèìè øòàììàìè H. polymorpha îñíîâíûõ ñàõàðîâ – ïðîäóêòîâ ãèäðîëèçà ëèãíîöåëëþëîçíîãî ñûðüÿ, è îñîáåííî êñèëîçû, òðåáóåò çíà÷èòåëüíîãî óëó÷øåíèÿ. Â íàñòîÿùåì îáçîðå èçëîæåíû îñíîâíûå ðåçóëüòàòû â îáëàñòè ìåòàáîëè÷åñêîé èíæåíåðèè H. polymorpha äëÿ êîíñòðóèðîâàíèÿ ïðîäóöåíòîâ ýòàíîëà èç êñèëîçû, êðàõìàëà, êñèëàíà è ãëèöåðèíà, à òàêæå øòàììîâ ñ ïîâûøåííîé òîëåðàíòíîñòüþ ê âûñîêîé òåìïåðàòóðå è ýòàíîëó. Êëþ÷åâûå ñëîâà: äðîææè, ýòàíîë, H. polymorpha, ìå- òàáîëè÷åñêàÿ èíæåíåðèÿ. Введение. Â íàñòîÿùåå âðåìÿ íàøà öèâèëè- çàöèÿ ñòîëêíóëàñü ñ âîçðàñòàþùèìè ïîòðåá- íîñòÿì â ýíåðãèè äëÿ òðàíñïîðòíîãî ñåêòîðà, à òàêæå äëÿ îáåñïå÷åíèÿ îòîïëåíèÿ è ïðî- ìûøëåííûõ ïðîöåññîâ. Èíòåíñèôèêàöèÿ èñ- ïîëüçîâàíèÿ èñêîïàåìîãî òîïëèâà ïðèâîäèò ê óâåëè÷åíèþ âûáðîñîâ ïàðíèêîâûõ ãàçîâ à àòìîñôåðó, îêàçûâàÿ íåãàòèâíîå âîçäåéñòâèå íà îêðóæàþùóþ ñðåäó. Íåñòàáèëüíîñòü îáå- ñïå÷åíèåì íåôòüþ è ïîñòîÿííûå êîëåáàíèÿ öåí íà ýòîò ýíåðãîíîñèòåëü ñòèìóëèðóþò èí- òåðåñ ê àëüòåðíàòèâíûì èñòî÷íèêàì ýíåðãèè. Ïåðå÷èñëåííûå ýêîíîìè÷åñêèå è ýêîëîãè÷å- ñêèå ôàêòîðû îïðåäåëÿþò çàèíòåðåñîâàííîñòü â èñïîëüçîâàíèè âîçîáíîâëÿåìûõ èñòî÷íèêîâ ýíåðãèè [2]. Ýòàíîë ÿâëÿåòñÿ ïåðñïåêòèâíûì âîçîáíîâ- ëÿåìûì æèäêèì òîïëèâîì, êîòîðûé â òå÷å- íèå áëèæàéøèõ 20 ëåò îáåùàåò ñòàòü îäíèì èç îñíîâíûõ âèäîâ áèîòîïëèâà â òðàíñïîðòíîì ñåêòîðå [3]. Ýòàíîë â ñìåñè ñ áåíçèíîì ýô- ôåêòèâíî èñïîëüçóåòñÿ â îáû÷íûõ äâèãàòåëÿõ âíóòðåííåãî ñãîðàíèÿ. Â ÷èñòîì âèäå ñïèðò òàêæå íàõîäèò ñâîå ïðèìåíåíèå â ñïåöèàëèçè- ðîâàííûõ äâèãàòåëÿõ. Ó ýòàíîëà â îòëè÷èå îò áåíçèíà âûøå îêòàíîâîå ÷èñëî, à òàêæå ïîâû- øåííàÿ òåïëîòà ïàðîîáðàçîâàíèÿ, ÷òî ïðåâðà- ùàåò ñïèðò â îòëè÷íîå òîïëèâî äëÿ ãèáðèäíûõ àâòîìîáèëåé ñëåäóþùåãî ïîêîëåíèÿ. Íà ñåãîäíÿøíèé äåíü äëÿ ïîëó÷åíèÿ áèî- òîïëèâà â ïðîìûøëåííûõ ìàñøòàáàõ â êà- ÷åñòâå ñûðüÿ èñïîëüçóþò êóêóðóçó èëè ñàõàð- íûé òðîñòíèê. Ýòàíîë, ïîëó÷åííûé èç êðàõìà- ëà èëè ñàõàðà, òàê íàçûâàåìûé ýòàíîë ïåðâî- ãî ïîêîëåíèÿ, êîíêóðèðóåò çà ñûðüå ñ ïèùåâîé ïðîìûøëåííîñòüþ è ñåëüñêèì õîçÿéñòâîì. Â ïðîòèâîïîëîæíîñòü ýòîìó ðàñòèòåëüíàÿ áèî- ìàññà (ëèãíîöåëëþëîçà), â ÷àñòíîñòè îòõîäû ñåëüñêîãî õîçÿéñòâà è äåðåâîîáðàáàòûâàþùåé ïðîìûøëåííîñòè, à òàêæå áûòîâûå îòõîäû, îáëàäàåò ñóùåñòâåííûì ïîòåíöèàëîì äëÿ ïî- ëó÷åíèÿ áèîòîïëèâà. Ýòî ñûðüå ðàñïðîñòðà- íåíî âî âñåì ìèðå è ÿâëÿåòñÿ ïîáî÷íûì ïðî- äóêòîì ÷åëîâå÷åñêîé äåÿòåëüíîñòè. Êðîìå òîãî, òàêèå îòõîäû íå èìåþò àëüòåðíàòèâíîãî èñ- ïîëüçîâàíèÿ. Ñóùåñòâóþò òàêæå è äðóãèå ïðå- èìóùåñòâà ýòàíîëà âòîðîãî ïîêîëåíèÿ, ïîëó- ÷åííîãî èç ëèãíîöåëëþëîçû. Ñðåäè íèõ óìåíü- øåíèå âûáðîñîâ ïàðíèêîâûõ ãàçîâ â àòìîñ- ôåðó, ñíèæåíèå íåãàòèâíîãî âîçäåéñòâèÿ íà îêðóæàþùóþ ñðåäó, îñîáåííî íà èçìåíåíèå êëèìàòè÷åñêèõ óñëîâèé (ãëîáàëüíîå ïîòåïëå- 4 Ê.Â. Äìèòðóê, À.À. Ñèáèðíûé ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 íèå), âîçìîæíîñòü ïîâûøåíèÿ òðóäîâîé çàíÿ- òîñòè íàñåëåíèÿ â àãðàðíûõ ðàéîíàõ, à òàêæå óëó÷øåííûé ýíåðãåòè÷åñêèé áàëàíñ â ñðàâíå- íèè ñ òðàäèöèîííûìè äëÿ ôåðìåíòàöèè ñóá- ñòðàòàìè [4]. Îäíàêî ïðîöåññ êîíâåðñèè ëèãíîöåëëþëîç- íîé áèîìàññû â ýòàíîë ÿâëÿåòñÿ çíà÷èòåëüíî áîëåå ñëîæíûì ïðîöåññîì ïî ñðàâíåíèþ ñ ïî- ëó÷åíèåì ýòàíîëà èç êðàõìàëà èëè ñàõàðà. Íà ïåðâûõ ýòàïàõ ëèãíîöåëëþëîçà òðåáóåò ïðåä- âàðèòåëüíîé òåðìè÷åñêîé è/èëè õèìè÷åñêîé îáðàáîòêè. Ïîñëå ýòîãî ïðîâîäÿò ãèäðîëèç ïðåäâàðèòåëüíî îáðàáîòàííîãî ñûðüÿ ñåðíîé êèñëîòîé èëè ñ ïîìîùüþ ãèäðîëèòè÷åñêèõ ôåð- ìåíòîâ (îïòèìóì äåéñòâèÿ ôåðìåíòîâ íàõîäèò- ñÿ â òåìïåðàòóðíîì äèàïàçîíå 50–60 ºÑ) äëÿ ïîëó÷åíèÿ ìîíîìåðíûõ ñàõàðîâ. Ýòîò ïðîöåññ ïîëó÷èë íàçâàíèå – «îñàõàðèâàíèå». Â ïîëó- ÷åííîé ñìåñè ìîíîñàõàðèäîâ âòîðûì ïî ñîäåð- æàíèþ ñàõàðîì ïîñëå ãëþêîçû ÿâëÿåòñÿ êñèëî- çà (ïÿòèóãëåðîäíûé ñàõàð). Ôåðìåíòàöèþ ìî- íîìåðíûõ ñàõàðîâ íà ïèëîòíûõ çàâîäàõ ïî ïåðåðàáîòêå ëèãíîöåëëþëîçíîãî ñûðüÿ (IoGen, Abengoa è äð.) îñóùåñòâëÿþò ñ ïîìîùüþ äðîæ- æåé Saccharomyces cerevisiae, êîòîðûå ôåðìåí- òèðóþò èñêëþ÷èòåëüíî ãåêñîçû. Îäíàêî èñ- ñëåäîâàòåëè íàïðàâëÿþò ñâîè óñèëèÿ íà êîíñò- ðóèðîâàíèå áàêòåðèàëüíûõ (Escherichia coli, Zy- momonas mobilis) è äðîææåâûõ (S. cerevisiae, Pichia stipitis) øòàììîâ, ñïîñîáíûõ ôåðìåíòè- ðîâàòü âñå âûñâîáîæäåííûå ñàõàðà, îñîáåííî êñèëîçó. Òàêèå øòàììû ìîãóò áûòü èñïîëü- çîâàíû äëÿ ôåðìåíòàöèè ñìåñè ñàõàðîâ ãèäðî- ëèçàòîâ ëèãíîöåëëþëîçû, ïîëó÷åííûõ ïîñðåä- ñòâîì êèñëîòíîãî ãèäðîëèçà, êîòîðûé ÿâëÿ- åòñÿ äîñòàòî÷íî äåøåâûì ìåòîäîì, îäíàêî îêîëî 30 % ñàõàðîâ ïðè ãèäðîëèçå ïðåâðà- ùàþòñÿ â ôóðôóðîë è 5-ãèäðîêñèìåòèëôóð- ôóðîë. Íàêîïëåíèå ýòèõ êîìïîíåíòîâ íåãà- òèâíî âëèÿåò íà ïðîöåññ ôåðìåíòàöèè: 1) ñíè- æåíèå âûõîäà ýòàíîëà íà 30 %; 2) ñóùåñòâåí- íîå èíãèáèðîâàíèå ôåðìåíòàöèè. Óêàçàííûå íåãàòèâíûå âîçäåéñòâèÿ íå íàáëþäàþòñÿ ïðè ïðîâåäåíèè ýíçèìàòè÷åñêîãî ãèäðîëèçà, ïîñ- êîëüêó íàêîïëåíèå ôóðôóðîëà è 5-ãèäðîêñè- ìåòèëôóðôóðîëà íå ïðîèñõîäèò. Îäíàêî ìîíî- ìåðíûå ñàõàðà, ÿâëÿþùèåñÿ êîíå÷íûìè ïðî- äóêòàìè ãèäðîëèçà, èíãèáèðóþò ýíçèìàòè÷åñ- êèå àêòèâíîñòè ãèäðîëèòè÷åñêèõ ôåðìåíòîâ öåëëþëàç è ãåìèöåëëþëàç. Äëÿ äîñòèæåíèÿ ïîë- íîãî ãèäðîëèçà ãåòåðîïîëèìåðîâ ëèãíîöåëëþ- ëîçû âûñâîáîæäåííûå ñàõàðà äîëæíû áûòü êîí- âåðòèðîâàíû â ýòàíîë ïðè ó÷àñòèè ìèêðî- îðãàíèçìîâ, ïðèñóòñòâóþùèõ â òîì æå ðåçåð- âóàðå [5]. Ôåðìåíòàòèâíûé ãèäðîëèç (îñàõàðèâàíèå) è ôåðìåíòàöèþ îñóùåñòâëÿþò îäíîâðåìåííî. Òà- êîé ïðîöåññ ïîëó÷èë íàçâàíèå îäíîâðåìåííî- ãî îñàõàðèâàíèÿ è ôåðìåíòàöèè (ÎÎÔ) [3], â íåì íå ïðîèñõîäèò èíãèáèðîâàíèå ãèäðîëèòè- ÷åñêèõ ôåðìåíòîâ îñâîáîæäàåìûìè ñàõàðàìè, ïîñêîëüêó ïîñëåäíèå ñðàçó ìåòàáîëèçèðóþòñÿ ìèêðîîðãàíèçìàìè. Ïîìèìî ýòîãî, âàæíûì ÿâ- ëÿåòñÿ ñóùåñòâåííîå ñíèæåíèå ñòîèìîñòè ïðî- öåññà, ÷òî îáóñëîâëåíî îòñóòñòâèåì ñòàäèè îõ- ëàæäåíèÿ ìåæäó îñàõàðèâàíèåì è ñïèðòîâûì áðîæåíèåì. Äîïîëíèòåëüíûå ñðåäñòâà ìîãóò áûòü ñýêîíîìëåíû çà ñ÷åò ñíèæåíèÿ ðàçíèöû òåìïåðàòóð ïðè ïåðåõîäå îò ñòàäèè áðîæåíèÿ ê ñòàäèè äèñòèëëÿöèè [6]. Íà ñåãîäíÿøíèé äåíü ýôôåêòèâíîñòü ïðî- öåññà ÎÎÔ ëèãíîöåëëþëîçíîé áèîìàññû åùå äåòàëüíî íå èçó÷åíà. Ñðåäè íåðåøåííûõ ïðîá- ëåì íà ïóòè ïðåîáðàçîâàíèÿ ëèãíîöåëëþëîçû ê ýòàíîëó ÿâëÿåòñÿ îòñóòñòâèå ìèêðîîðãàíèç- ìîâ, ñïîñîáíûõ ê ýôôåêòèâíîé êîíâåðñèè êñèëîçû â ýòàíîë ïðè ïîâûøåííûõ òåìïåðàòó- ðàõ. Îäíèì èç íàèáîëåå ïåðñïåêòèâíûõ îðãà- íèçìîâ, ñïîñîáíûõ îñóùåñòâëÿòü àëêîãîëüíóþ ôåðìåíòàöèþ êñèëîçû ïðè òåìïåðàòóðå îêîëî 50 ºC, ÿâëÿþòñÿ äðîææè Hansenula polymorpha [7]. Îäíàêî ýôôåêòèâíîñòü ýòîãî ïðîöåññà ñ èñïîëüçîâàíèåì øòàììîâ äèêîãî òèïà ñëèø- êîì íèçêà äëÿ âíåäðåíèÿ â ïðîìûøëåííîå ïðîèçâîäñòâî (0,5 ã/ë ñïèðòà ïðè ôåðìåíòà- öèè êñèëîçû). Микроорганизмы для получения этанола из лигноцеллюлозной биомассы Èññëåäîâàíèÿìè â îáëàñòè àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè ëèãíîöåëëþëîçíîé áèîìàññû çà- íèìàþòñÿ âî ìíîãèõ ðàçâèòûõ ñòðàíàõ ìèðà. Ýòè ìåæäèñöèïëèíàðíûå èññëåäîâàíèÿ âîâëå- êàþò ó÷åíûõ èç ðàçíûõ îáëàñòåé – ãåíåòèêîâ, áèîõèìèêîâ, õèìèêîâ, òåõíîëîãîâ, èíæåíåðîâ, ìàòåìàòèêîâ, ýêîíîìèñòîâ. Ïîäñ÷èòàíî, ÷òî ïîëó÷åíèå ýòàíîëà â ïðîìûøëåííûõ ìàñøòà- áàõ èç ðàñòèòåëüíîé áèîìàññû ïîçâîëèò óìåíü- øèòü èìïîðò íåôòåïðîäóêòîâ â ÑØÀ íà òðåòü. Ýòàíîë, ïîëó÷åííûé èç îòõîäîâ ñåëüñêîõîçÿé- 5 Ìåòàáîëè÷åñêàÿ èíæåíåðèÿ äðîææåé Hansenula polymorpha ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 ñòâåííîé äåÿòåëüíîñòè, âûçûâàåò çíà÷èòåëüíî ìåíüøèå âûáðîñû ïàðíèêîâûõ ãàçîâ â àòìîñôå- ðó, ÷åì ýòàíîë, ïîëó÷åííûé èç çåðíîâûõ êóëü- òóð. Ïî äàííûì Ìèíèñòåðñòâà ýíåðãåòèêè ÑØÀ (http://www.energy.gov/) ýòàíîë èç ëèãíîöåëëþ- ëîçû óìåíüøàåò âûáðîñû ïàðíèêîâûõ ãàçîâ íà 85 % ïî ñðàâíåíèþ ñ èñïîëüçîâàíèåì áåíçèíà. Â òî æå âðåìÿ ïðîèçâîäñòâî ýòàíîëà èç êðàõ- ìàëà (íàïðèìåð êóêóðóçû) ñîêðàùàåò âûáðîñû ïàðíèêîâûõ ãàçîâ ëèøü íà 18–29 % ìåíüøå áåíçèíà, ïîñêîëüêó â äàííîì ñëó÷àå äëÿ åãî ïðîèçâîäñòâà èñïîëüçóþò ïðèðîäíûé ãàç. Ýòî åùå îäèí àðãóìåíò â ïîëüçó ðàçðàáîòêè ýôôåê- òèâíîé òåõíîëîãèè ïðîèçâîäñòâà òîïëèâíîãî ýòàíîëà èç ðàñòèòåëüíîé áèîìàññû. È â òî æå âðåìÿ, íåñìîòðÿ íà ìíîãîëåòíèå óñèëèÿ, ðåíòàáåëüíûå òåõíîëîãèè äëÿ îñóùåñò- âëåíèÿ ýòîãî ïðîöåññà äî ñèõ ïîð íå ðàçðàáî- òàíû. Ñîçäàíèå ýôôåêòèâíîé òåõíîëîãèè êîí- âåðñèè ëèãíîöåëëþëîçû â ýòèëîâûé ñïèðò ìîæ- íî óñëîâíî ðàçäåëèòü íà äâà íàïðàâëåíèÿ. Ïåð- âîå – îïòèìèçàöèÿ ìåòîäîâ ôèçè÷åñêîé, ôè- çèêî-õèìè÷åñêîé è ýíçèìàòè÷åñêîé îáðàáîòêè ëèãíîöåëëþëîçíûõ îòõîäîâ ñ öåëüþ ïîëó÷åíèÿ ñâîáîäíûõ ìîíî- è äèñàõàðîâ èç î÷åíü ñëîæíîé ñìåñè ñîñòàâëÿþùèõ ëèãíîöåëëþëîçó áèîïî- ëèìåðîâ (öåëëþëîçà, ãåìèöåëëþëîçû, ëèãíèí). Âòîðîå – ïîèñê ïðèðîäíûõ è êîíñòðóèðîâà- íèå ðåêîìáèíàíòíûõ øòàììîâ ìèêðîîðãàíèç- ìîâ, ñïîñîáíûõ ê ýôôåêòèâíîé ôåðìåíòàöèè âñåõ ñàõàðîâ, âõîäÿùèõ â ñîñòàâ ãèäðîëèçà- òîâ ëèãíîöåëëþëîçû. Òðóäíîñòè âîçíèêàþò ñ àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèåé êñèëîçû, âòîðîãî ïî êîëè÷åñòâó ñàõàðà ãèäðîëèçàòà ëèãíîöåë- ëþëîçû (â ñðåäíåì, äîëÿ ýòîé ïåíòîçû ñîñòàâ- ëÿåò 30 % îáùåãî ñîäåðæàíèÿ ñàõàðîâ â ãèäðî- ëèçàòàõ). Õîòÿ êñèëîçà øèðîêî ðàñïðîñòðàíåíà â ïðèðîäå, îíà ïðàêòè÷åñêè íèêîãäà íå âñòðå- ÷àåòñÿ êàê ñâîáîäíûé ìîíîñàõàðèä, ïîýòîìó ëèøü äîñòàòî÷íî îãðàíè÷åííàÿ ãðóïïà ìèêðî- îðãàíèçìîâ ñïîñîáíà èñïîëüçîâàòü êñèëîçó â êà÷åñòâå èñòî÷íèêà óãëåðîäà, à åùå ìåíüøàÿ – ôåðìåíòèðîâàòü ýòîò ñàõàð â ýòàíîë. Ó÷åíûå ÑØÀ, Êàíàäû, Ãåðìàíèè, Øâåöèè, Ôèíëÿíäèè, Êèòàÿ, Þæíîé Àôðèêè è äðóãèõ ñòðàí çàíèìàþòñÿ ñîçäàíèåì è óëó÷øåíèåì øòàììîâ, ñáðàæèâàþùèõ êñèëîçó â ýòàíîë. Îä- íè èññëåäîâàòåëè êîíñòðóèðóþò ñîîòâåòñòâóþ- ùèå øòàììû íà îñíîâå áàêòåðèé (êèøå÷íàÿ ïàëî÷êà E. coli è Z. mobilis), äðóãèå â êà÷åñòâå îáúåêòà èññëåäîâàíèé èñïîëüçóþò äðîææè. Â öåëîì ôåðìåíòàöèÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì äðîæ- æåé èìååò ñóùåñòâåííûå ïðåèìóùåñòâà, ïî- ñêîëüêó äðîææåâûå êëåòêè ÿâëÿþòñÿ áîëüøè- ìè è ïîýòîìó ëåã÷å îòäåëÿþòñÿ îò ôåðìåíòà- öèîííîé ñðåäû. Äðîææè íå ÷óâñòâèòåëüíû ê ôàãîëèçè-ñó. Êðîìå òîãî, ýôôåêòèâíàÿ òåõíî- ëîãèÿ ïîëó÷åíèÿ ýòèëîâîãî ñïèðòà èç ãëþêî- çû èëè ñàõàðîçû ïðè ó÷àñòèè ïåêàðñêèõ äðîæ- æåé ñóùåñòâóåò óæå íà ïðîòÿæåíèè âåêîâ. Ê ñîæàëåíèþ ýòè äðîææè íå ñïîñîáíû ìåòàáî- ëèçèðîâàòü êñèëîçó. Âî ìíîãèõ ëàáîðàòîðèÿõ ìèðà ïðîâîäèòñÿ ìåòàáîëè÷åñêàÿ èíæåíåðèÿ ïåêàðñêèõ äðîææåé ñ öåëüþ êîíñòðóèðîâà- íèÿ øòàììîâ, ôåðìåíòèðóþùèõ íå òîëüêî ãëþ- êîçó, íî è êñèëîçó. Â êà÷åñòâå àëüòåðíàòèâû âåäåòñÿïîèñê íåêîíâåíöèîííûõ âèäîâ äðîæ- æåé, ñáðàæèâàþùèõ êñèëîçó, è ïóòåé äàëü- íåéøåãî óëó÷øåíèÿ ïàðàìåòðîâ àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êîíñòðóèðîâàíèåì áîëåå ïðîäóê- òèâíûõ øòàììîâ. Äîñòèãíóò çíà÷èòåëüíûé ïðîãðåññ â âûÿâ- ëåíèè è èçó÷åíèè íåêîòîðûõ âèäîâ íåêîí- âåíöèîííûõ äðîææåé, ôåðìåíòèðóþùèõ îñ- íîâíûå ñàõàðà ëèãíîöåëëþëîçíûõ ãèäðîëèçà- òîâ â ýòàíîë, â ÷àñòíîñòè, Pachysolen tannophilus, Candida shehatae, Pichia stipitis [8–10]. Ïîäîáðà- íû óñëîâèÿ àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êñèëî- çû øòàììàìè ýòèõ íåêîíâåíöèîííûõ äðîææåé [11]. Óñòàíîâëåíà îïðåäåëÿþùàÿ ðîëü íà÷àëü- íûõ ýòàïîâ êàòàáîëèçìà êñèëîçû äëÿ ýôôåê- òèâíîé ôåðìåíòàöèè ýòîãî ñàõàðà â ýòàíîë. Â ÷àñòíîñòè, óñòàíîâëåíî ïåðâîñòåïåííîå çíà÷å- íèå ýôôåêòèâíîé ýêñïðåññèè ãåíîâ XYL1, XYL2 è XYL3, êîäèðóþùèõ ôåðìåíòû òðåõ íà÷àëüíûõ ýòàïîâ óñâîåíèÿ êñèëîçû – êñèëîçîðåäóêòàçó, êñèëèòîëäåãèäðîãåíàçó è êñèëóëîêèíàçó ñîîò- âåòñòâåííî [11]. Óñòàíîâëåíî òàêæå, ÷òî ñóùå- ñòâåííîé ïðîáëåìîé äëÿ ýôôåêòèâíîé àëêî- ãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êñèëîçû ó äðîææåé ÿâëÿåòñÿ äèñáàëàíñ íèêîòèíàìèäíèõ êîôåð- ìåíòîâ, êîòîðûé âîçíèêàåò âñëåäñòâèå òîãî, ÷òî ôåðìåíò ïåðâîãî ýòàïà óòèëèçàöèè êñèëîçû, êñèëîçîðåäóêòàçà, ÿâëÿåòñÿ NADPH-çàâèñèìûì, à êñèëèòîëäåãèäðîãåíàçà (ôåðìåíò âòîðîãî ýòà- ïà) – NAD-çàâèñèìîé. Òàêîé äèñáàëàíñ ïðè- âîäèò ê ñíèæåíèþ ýôôåêòèâíîñòè ñèíòåçà ýòà- íîëà è íàêîïëåíèþ êñèëèòà â ñðåäå [11]. Îáðà- çîâàíèå ïîáî÷íîãî ïðîäóêòà – êñèëèòà – ìîæ- íî óìåíüøèòü çà ñ÷åò çàìåíû êîôàêòîðíîãî 6 Ê.Â. Äìèòðóê, À.À. Ñèáèðíûé ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 ñðîäñòâà êñèëîçîðåäóêòàçû [12]. Óäàëîñü äîñ- òè÷ü ñóùåñòâåííîãî ïðîãðåññà ïðè ãåòåðîëî- ãè÷åñêîé ýêñïðåññèè ãåíîâ áàêòåðèé è ãðèáîâ, êîäèðóþùèõ êñèëîçîèçîìåðàçó (ýòîò ôåðìåíò ïðåâðàùàåò êñèëîçó â êñèëóëîçó è íå òðåáóåò êîôàêòîðîâ) â êëåòêàõ S. cerevisiae [13, 14]. Äëÿ äðîææåé S. cerevisiae óñòàíîâëåíî, ÷òî óñèëåíèå ýêñïðåññèè ãåíîâ íåîêèñëèòåëüíîé ÷àñòè ïåíòîçîôîñôàòíîãî ïóòè èãðàåò ñóùåñò- âåííóþ ðîëü äëÿ îïòèìèçàöèè àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè ïåíòîç [15]. Óñòàíîâëåíà òàêæå çàâèñèìîñòü ýôôåêòèâíîñòè àëêîãîëüíîé ôåð- ìåíòàöèè êñèëîçû îò ôóíêöèîíèðîâàíèÿ êîì- ïîíåíòîâ äûõàòåëüíîé öåïè. Ìóòàíòû äðîæ- æåé P. stipitis ñ ïîâðåæäåííûìè ãåíàìè, êîäè- ðóþùèìè öèòîõðîì ñ è SHAM-÷óâñòâèòåëüíóþ òåðìèíàëüíóþ îêñèäàçó, ñèíòåçèðîâàëè ïîâû- øåííûå êîëè÷åñòâà ýòàíîëà [16, 17]. Âàæíûì íàïðàâëåíèåì èññëåäîâàíèé ÿâëÿåòñÿ èäåíòè- ôèêàöèÿ è ìîäèôèêàöèÿ ñïåöèôè÷åñêèõ òðàíñ- ïîðòåðîâ ïåíòîç äëÿ ýôôåêòèâíîãî êîìåòà- áîëèçìà ñìåñè ñàõàðîâ (ãëþêîçû è ïåíòîç) [18]. Äëÿ ïîâûøåíèÿ ñïîñîáíîñòè ðåêîìáè- íàíòíûõ øòàììîâ S. cerevisiae îäíîâðåìåííî ìåòàáîëèçèðîâàòü ñìåñü ñàõàðîâ áûë ïðåäëî- æåí íîâûé ìåòîä ýâîëþöèîííîé èíæåíåðèè, áàçèðóþùèéñÿ íà äëèòåëüíîì êóëüòèâèðîâà- íèè ðåêîìáèíàíòíûõ øòàììîâ íà ðàçëè÷íûõ ñàõàðàõ [19]. Îäíàêî íåñìîòðÿ íà çíà÷èòåëüíûå óñèëèÿ è îïðåäåëåííûå óñïåõè, ïðåäïðèíèìàåìûå â îá- ëàñòè àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè îñíîâíûõ ñà- õàðîâ ëèãíîöåëëþëîçíûõ ãèäðîëèçàòîâ (è êñè- ëîçû â ÷àñòíîñòè), äîñòèãíóòü ýôôåêòèâíîãî ýêîíîìè÷åñêè âûãîäíîãî ñáðàæèâàíèÿ ýòèõ ñóáñòðàòîâ êàê ïðèðîäíûìè, òàê è ðåêîìáè- íàíòíûìè øòàììàìè ìèêðîîðãàíèçìîâ ïîêà íå óäàåòñÿ. Äëÿ ïîëó÷åíèÿ ýòàíîëà èç ëèãíî- öåëëþëîçíûõ ãèäðîëèçàòîâ â ïðîìûøëåííûõ ìàñøòàáàõ íåîáõîäèìî äàëüíåéøåå ñîâåðøåí- ñòâîâàíèå ëó÷øèõ íà äàííûé ìîìåíò äðîææå- âûõ øòàììîâ, ñðåäè êîòîðûõ øòàììû äðîææåé H. polymorpha ðàññìàòðèâàþòñÿ êàê îäíè èç íàèáîëåå ïåðñïåêòèâíûõ. Íèæå ïðåäñòàâëåíû îñíîâíûå ðåçóëüòàòû â îáëàñòè ìåòàáîëè÷åñêîé èíæåíåðèè H. polymorpha, â îñíîâíîì ïîëó÷åí- íûå â ëàáîðàòîðèè àâòîðîâ â Èíñòèòóòå áèî- ëîãèè êëåòêè ÍÀÍ Óêðàèíû è íàïðàâëåííûå íà ñîçäàíèå óëó÷øåííûõ ïðîäóöåíòîâ ýòàíîëà èç êñèëîçû, êðàõìàëà, êñèëàíà è ãëèöåðèíà, à òàêæå øòàììîâ ñ ïîâûøåííîé òîëåðàíòíîñòüþ ê âûñîêîé òåìïåðàòóðå è ýòàíîëó. Èíñòèòóò áèîëîãèè êëåòêè ÍÀÍ Óêðàèíû ðàñïîëàãàåò ðÿäîì îáùåäîñòóïíûõ êîëëåêöèîí- íûõ øòàììîâ H. polymorpha, à òàêæå øòàì- ìîâ, âûäåëåííûõ íà òåððèòîðèè áûâøåãî Ñî- âåòñêîãî Ñîþçà â 1970-õ ãîäàõ, â ðåçóëüòàòå ïîèñêà ìåòèëîòðîôíûõ äðîææåé êàê ïîòåíöè- àëüíîãî èñòî÷íèêà êîðìîâîãî áåëêà. Â ðåçóëü- òàòå áèîõèìè÷åñêîãî àíàëèçà âîñüìè øòàììîâ H. polymorpha óñòàíîâëåíî, ÷òî âñå ïðîàíàëè- çèðîâàííûå øòàììû ñáðàæèâàþò â ýòàíîë ãëþêîçó, êñèëîçó, ìàííîçó, ìàëüòîçó è öåë- ëîáèîçó, òîãäà êàê ãàëàêòîçà è L-àðàáèíîçà ïðàêòè÷åñêè íå ïîääåðæèâàþò ðîñò ýòîãî âè- äà äðîææåé. Îïòèìàëüíîé òåìïåðàòóðîé äëÿ ôåðìåíòàöèè ãëþêîçû è êñèëîçû ÿâëÿåòñÿ 37–40 ºC, îäíàêî äàæå ïðè 45–48 ºÑ îíà îñòàâàëàñü äîñòàòî÷íî èíòåíñèâíîé, ÷òî ÿâ- ëÿåòñÿ àáñîëþòíûì ðåêîðäîì äëÿ ýóêàðèîòè- ÷åñêîé àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè. Íàèáîëåå àêòèâíî ôåðìåíòàöèÿ ïðîèñõîäèëà â óñëîâèÿõ óìåðåííîé àýðàöèè, à òàêæå ãîëîäàíèÿ êëåòîê ïî ôëàâèíàì, íåîáõîäèìûì äëÿ êëåòî÷íîãî äûõàíèÿ. H. polymorpha îêàçàëàñü áîëåå óñ- òîé÷èâîé ê òîêñè÷åñêîìó äåéñòâèþ ýòàíîëà ïî ñðàâíåíèþ ñ P. stipitis, îäíàêî áîëåå ÷óâñòâè- òåëüíîé, ÷åì S. cerevisiae [1]. Разработка ауксонографического метода селекции штаммов H. polymorpha с улучшенными параметрами алкогольной ферментации ксилозы Äëÿ ñåëåêöèè ìóòàíòîâ ñ ïîâûøåííîé (èëè ïîíèæåííîé) ïðîäóêöèåé ýòàíîëà âàæíî ðàç- ðàáîòàòü ïðîñòîé è íàäåæíûé ìåòîä êà÷åñò- âåííîé äåòåêöèè ýòàíîëà, îáðàçîâàííîãî äðîæ- æåâûìè êîëîíèÿìè ïðè èõ ðîñòå íà àãàðè- çîâàííîé ñðåäå. Àóêñîíîãðàôèÿ – ýòî ãðóïïà ìèêðîáèîëîãè÷åñêèõ ìåòîäîâ, îñíîâàííûõ íà èñïîëüçîâàíèè òåñòåðíûõ êóëüòóð – ìèêðîá- íûõ øòàììîâ ñ îïðåäåëåííûìè ðîñòîâûìè õà- ðàêòåðèñòèêàìè äëÿ îïðåäåëåíèÿ äåéñòâèÿ àíòè- áèîòèêîâ, ìóòàãåííîé àêòèâíîñòè ïðåïàðàòîâ, ñïîñîáíîñòè ìèêðîîðãàíèçìîâ ðàñùåïëÿòü ñà- õàðà èëè äðóãèå îðãàíè÷åñêèå âåùåñòâà. Äëÿ ñåëåêöèè ìóòàíòîâ H. polymorpha, ñïîñîáíûõ ê ïîâûøåííîìó ñèíòåçó ýòàíîëà â ñðåäå ñ êñèëî- çîé, ðàçðàáîòàí ïðîñòîé àóêñîíîãðàôè÷åñêèé ìåòîä [20]. Ìåòîä îñíîâûâàåòñÿ íà ñïîñîáíîñòè 7 Ìåòàáîëè÷åñêàÿ èíæåíåðèÿ äðîææåé Hansenula polymorpha ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 äðîææåé H. polymorpha ðàñòè â ñðåäå ñ êñèëîçîé è ïðåâðàùàòü ýòîò ñàõàð â ýòàíîë. Ìóòàíòíûé æå øòàìì H. polymorpha xyl1 ñ ïîâðåæäåííîé êñèëîçîðåäóêòàçîé íå ðàñòåò íà ñðåäå ñ êñèëî- çîé, îäíàêî ýôôåêòèâíî óñâàèâàåò ýòàíîë â êà÷åñòâå èñòî÷íèêà óãëåðîäà è ýíåðãèè. Òàêèì îáðàçîì, ïðè ðîñòå êîëîíèé äðîææåé, óñâà- èâàþùèõ êñèëîçó, íà àãàðèçîâàííîé ñðåäå ñ ýòîé ïåíòîçîé â êà÷åñòâå åäèíñòâåííîãî èñ- òî÷íèêà óãëåðîäà, ñìåøàííîé ñ æèçíåñïîñîá- íûìè êëåòêàìè øòàììà xyl1, ïîñëåäíèå áóäóò îáðàçîâûâàòü çîíû ðîñòà âîêðóã êîëîíèé, ïðî- äóöèðóþùèå ýòàíîë èç êñèëîçû. È ÷åì áîëü- øå ýòàíîëà ñèíòåçèðóåò êîëîíèÿ, òåì áîëüøå áóäåò çîíà ðîñòà øòàììà xyl1, êîòîðûé â äàííîì ñëó÷àå ÿâëÿåòñÿ òåñòåðíîé êóëüòóðîé. È íàîáîðîò, çîíà ðîñòà øòàììà xyl1 áóäåò íåçíà÷èòåëüíîé ëèáî âîâñå îòñóòñòâîâàòü âîê- ðóã êîëîíèé, êîòîðûå ñèíòåçèðóþò ýòàíîë íå- ýôôåêòèâíî èëè íå ïðîèçâîäÿò åãî âîîáùå. Ñ ïîìîùüþ ðàçðàáîòàííîãî ìåòîäà óäàëîñü ñåëåêöèîíèðîâàòü êîëëåêöèþ ÓÔ-èíäóöèðî- âàííûõ ìóòàíòîâ, ñïîñîáíûõ ê óëó÷øåííîé àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êñèëîçû. Áèîõèìè- ÷åñêèé àíàëèç îäíîãî èç øòàììîâ ïîêàçàë ñóùåñòâåííîå ñíèæåíèå óäåëüíîé àêòèâíîñòè êñèëîðåäóêòàçû ñ èñïîëüçîâàíèåì NADPH â êà÷åñòâå êîôàêòîðà, â òî âðåìÿ êàê ñïå- öèôè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü êñèëîðåäóêòàçû ñ èñ- ïîëüçîâàíèåì NADH îñòàâàëàñü íà óðîâíå øòàììà äèêîãî òèïà [20]. Òàêàÿ îñîáåííîñòü ìóòàíòíîé êñèëîðåäóêòàçû ñîãëàñîâûâàëàñü ñ íàøèìè ïîñëåäóþùèìè ðàáîòàìè ïî öåëå- íàïðàâëåííîìó èçìåíåíèþ ñðîäñòâà êîôàêòî- ðà [21], ÷òî â êîíå÷íîì ñ÷åòå ïðèâîäèëî ê óâåëè÷åíèþ ñèíòåçèðîâàííîãî ýòàíîëà ïðè ôåð- ìåíòàöèè êñèëîçû. Метаболическая инженерия начальных этапов катаболизма ксилозы у дрожжей H. polymorpha с целью конструирования улучшенных продуцентов этанола Ïðè ñáðàæèâàíèè êñèëîçû â äðîææåâîé êëåòêå ñ ïîìîùüþ NADPÍ-çàâèñèìîé êñèëî- çîðåäóêòàçû (ÊÐ) ïðîèñõîäèò åå âîññòàíîâ- ëåíèå äî êñèëèòà, êîòîðûé äàëåå ñ ïîìîùüþ NAD-çàâèñèìîé êñèëèòîëäåãèäðîãåíàçû (ÊÄÃ) îêèñëÿåòñÿ äî êñèëóëîçû (ðèñ. 1). Â ðåçóëüòàòå ýòèõ îêèñëèòåëüíî-âîññòàíîâèòåëüíûõ ðåàê- öèé ïðè îãðàíè÷åííîé àýðàöèè âî âðåìÿ ôåð- ìåíòàöèè ïðîèñõîäèò íàêîïëåíèå è äèñáà- ëàíñ êîôàêòîðîâ NADP è NADÍ, ñëåäñòâèåì ÷åãî ÿâëÿþòñÿ êðàéíå íèçêèå êîëè÷åñòâà ñèí- òåçèðîâàííîãî ýòàíîëà è îäíîâðåìåííîå íà- êîïëåíèå â ñðåäå ïîáî÷íîãî ïðîäóêòà – êñè- ëèòà. ÊÐ è ÊÄÃ äëÿ óñòðàíåíèÿ äèñáàëàíñà íèêîòèíàìèäíûõ êîôàêòîðîâ áûëè çàìåùåíû áàêòåðèàëüíîé êñèëîçîèçîìåðàçîé (ÊÈ), êî- òîðàÿ íåïîñðåäñòâåííî êîíâåðòèðóåò êñèëîçó â êñèëóëîçó è íå òðåáóåò êîôàêòîðîâ (ðèñ. 1). Ñ ýòîé öåëüþ áûëè ñêîíñòðóèðîâàíû øòàì- ìû H. polymorpha ñ äåëåöèÿìè ãåíîâ XYL1, XYL2-A è XYL2-B, êîäèðóþùèå ÊÐ è äâà ïàðà- ëîãà ÊÄÃ ñîîòâåòñòâåííî. Äåëåöèÿ ãåíà XYL1 ïîëíîñòüþ ïîäàâëÿëà àêòèâíîñòü ÊÐ, òîãäà êàê äåëåöèÿ ãåíà XYL2-A ëèøü óìåíüøàëà àêòèâ- íîñòü ÊÄÃ íà 30 %. Äîïîëíèòåëüíàÿ äåëåöèÿ ãåíà XYL2-B ñíèæàëà àêòèâíîñòü ÊÄÃ íà 65 % [22]. Äàëåå â ãåíîì ðåöèïèåíòíîãî øòàììà xyl1 xyl2-À xyl2-Â áûëè ââåäåíû ãåíû xylA, êîäèðóþùèå ÊÈ Escherichia coli è Streptomyces ñoelicolor, â ðåçóëüòàòå ÷åãî ó òðàíñôîðìàíòîâ ôîðìèðîâàëèñü ôóíêöèîíàëüíî àêòèâíûå ãå- òåðîëîãè÷íûå ôåðìåíòû. Ïðèñóòñòâèå ãåòåðî- ëîãè÷åñêîãî áåëêà ÊÈ E. coli â êëåòêàõ ñêîíñò- ðóèðîâàííûõ øòàììîâ ïîäòâåðæäåíî ïðè ïî- ìîùè âèçóàëèçàöèè äîïîëíèòåëüíûõ ëèíèé ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé 46 êÄà, êîòîðûå ñîîòâåò- ñòâóþò òåîðåòè÷åñêè ðàññ÷èòàííîé ìàññå ÊÈ, íà ýëåêòðîôîðåãðàììàõ áåñêëåòî÷íûõ ýêñòðàê- òîâ ðåêîìáèíàíòíûõ øòàììîâ â äåíàòóðèðó- þùèõ óñëîâèÿõ [23]. Óäåëüíàÿ àêòèâíîñòü ÊÈ ðåêîìáèíàíòíûõ øòàììîâ äîñòèãàëà 80 % óäåëü- íîé àêòèâíîñòè ôåðìåíòà â êëåòêàõ áàêòåðèé E. coli. Ñêîíñòðóèðîâàííûå äðîææåâûå øòàììû ðîñëè íà ïèòàòåëüíîé ñðåäå ñ êñèëîçîé â êà- ÷åñòâå åäèíñòâåííîãî èñòî÷íèêà óãëåðîäà, îäíà- êî ýôôåêòèâíîñòü àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êñèëîçû îñòàâàëàñü íà óðîâíå øòàììà äèêîãî òèïà. Ïîâûøåíèþ àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êñèëîçû ñïîñîáñòâîâàëî äîïîëíèòåëüíîå óñè- ëåíèå ýêñïðåññèè ãîìîëîãè÷åñêîãî ãåíà XYL3, êîäèðóþùåãî êñèëóëîêèíàçó (ÊÊ). Ðåêîìáè- íàíòíûé øòàìì, êîýêñïðåññèðóþùèé ãåíû xylA E. coli è XYL3 H. polymorpha, õàðàêòå- ðèçèðîâàëñÿ äâóêðàòíûì óâåëè÷åíèåì óäåëü- íîé àêòèâíîñòè ÊÊ, à òàêæå ïîâûøåíèåì óðîâ- íÿ àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êñèëîçû â 3,5–4 ðàçà ïî ñðàâíåíèþ ñî øòàììîì äèêîãî òèïà (òàáë. 1) [22]. 8 Ê.Â. Äìèòðóê, À.À. Ñèáèðíûé ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 Òàáëèöà 1. Ïðîäóêòèâíîñòü ñèíòåçà ýòàíîëà íà ÷åòâåðòûå ñóòêè ôåðìåíòàöèè, óäåëüíàÿ àêòèâíîñòü ÊÊ è ÊÈ ó ðåêîìáèíàíòíûõ è êîíòðîëüíûõ øòàììîâ Ïðèìå÷àíèå. Âî âñåõ òàáëèöàõ: «–» íå îïðåäåëÿëè; [ìã/(ë·÷)] – êîëè÷åñòâî ýòàíîëà (ìã), ñèíòåçèðóåìîãî â 1 ë ñðåäû çà 1 ÷; [ìã/(ë·ã·÷)] – êîëè÷åñòâî ýòàíîëà (ìã), ñèíòåçèðóåìîãî â 1 ë ñðåäû çà 1 ÷ ñ 1 ã êñèëîçû; ÌÅ – ìåæäóíàðîäíûå åäèíèöû èçìåðåíèÿ àêòèâíîñòè ôåðìåíòà. Øòàìì Ïðîäóêòèâíîñòü ñèíòåçà ýòàíîëà Óäåëüíàÿ àêòèâíîñòü, ÌÅ/ìã áåëêà 37 ºÑ 48 ºÑ ÊÊ ÊÈ ìã/(ë·÷) ìã/(ë·ã·÷) ìã/(ë·÷) ìã/(ë·ã·÷) xyl1 xyl2-À(xylÀ) xyl1 xyl2-À xyl2-Â(xylÀ) xyl1 xyl2-À xyl2-Â(EcxylÀ/ HpXYL3) CBS4732 leu2-2 (wt) E. coli 1,5 ± 0,07 1,7 ± 0,08 5,1 ± 0,25 1,5 ± 0,07 – 0,6 ± 0,03 0,7 ± 0,03 2,1 ± 0,11 0,6 ± 0,03 – 1,4 ± 0,07 1,6 ± 0,08 5,9 ± 0,29 1,4 ± 0,07 – 0,58 ± 0,03 0,67 ± 0,03 2,5 ± 0,12 0,58 ± 0,03 – 0,060 ± 0,003 0,061 ± 0,003 0,145 ± 0,007 0,07 ± 0,004 – 0,015 ± 0,001 0,050 ± 0,003 0,049 ± 0,002 0 0,062 ± 0,003 Ðèñ. 1. Ïóòè ñáðàæèâàíèÿ êñèëîçû, ãëþêîçû è ãëèöåðèíà äî ýòàíîëà ó äðîææåé. ÏÔÏ – ïåíòîçîôîñôàòíûé ïóòü, ÃË-6-ô – ãëþêîçî-6-ôîñôàò, ÔÐ-6-ô – ôðóêòîçî-6-ôîñôàò, ÔÐ-1,6-áô – ôðóêòîçî-1,6-áèñôîñôàò, ÃÀ- 3-ô – ãëèöåðàëüäåãèä-3-ôîñôàò, ÑÃ-7-ô – ñåäîãåïòóëîçî-7-ôîñôàò, ÝÒ-4-ô – ýðèòðîçî-4-ôîñôàò, 1,3-áôÃ – 1,3-áèñôîñôîãëèöåðàò, ÄÃÀ-ô – äèãèäðîêñèàöåòîíôîñôàò, ÊÐ – êñèëîçîðåäóêòàçà, ÊÄÃ – êñèëèòîëäå- ãèäðîãåíàçà, ÊÈ – êñèëîçîèçîìåðàçà, ÊÊ – êñèëóëîêèíàçà, ÒÊË – òðàíñêåòîëàçà, ÒÀË – òðàíñàëüäîëàçà, Ã3ÔÄÃ – ãëèöåðàëüäåãèä-3-ôîñôàòäåãèäðîãåíàçà, ÏÄÊ – ïèðóâàòäåêàðáîêñèëàçà, ÀÄÃ – àëêîãîëüäåãèäðîãåíàçà 9 Ìåòàáîëè÷åñêàÿ èíæåíåðèÿ äðîææåé Hansenula polymorpha ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 ÊÐ äðîææåé H. ðolymorpha ïðè ôåðìåíòà- òèâíîé ðåàêöèè ñïîñîáíà â êà÷åñòâå êîôàêòî- ðîâ èñïîëüçîâàòü êàê NADPÍ, òàê è NADÍ. Îäíàêî ñðîäñòâî ÊÐ ê NADÍ ñóùåñòâåííî íèæå, ÷åì ê NADPÍ. Â ñâÿçè ñ ýòèì èíîé ïîäõîä óñòðàíåíèÿ äèñáàëàíñà êîôàêòîðîâ, ñîçäàþùèéñÿ â ðåçóëüòàòå äåéñòâèÿ ÊÐ è ÊÄÃ, çàêëþ÷àëñÿ â ñíèæåíèè ñðîäñòâà ÊÐ ê NADPÍ. Ñ ïîìîùüþ ñàéò-ñïåöèôè÷åñêîãî ìó- òàãåíåçà ñêîíñòðóèðîâàíà ìîäèôèöèðîâàííàÿ ôîðìà ÊÐ, â êîòîðîé ëèçèí è àñïàðàãèí â ïî- ëîæåíèÿõ 341 è 343 áûëè çàìåíåíû àðãèíè- íîì è àñïàðàãèíîâîé êèñëîòîé ñîîòâåòñòâåí- íî. Ïðè èñïîëüçîâàíèè NADPÍ â êà÷åñòâå êîôàêòîðà àêòèâíîñòü ìîäèôèöèðîâàííîé ÊÐ ñíèçèëàñü â 9 ðàç ïî ñðàâíåíèþ ñ àêòèâíîñ- òüþ íàòèâíîé ôîðìû ÊÐ, â òî æå âðåìÿ ïðè èñïîëüçîâàíèè NADÍ àêòèâíîñòü ÊÐ îñòàâà- ëàñü áåç èçìåíåíèé â îáîèõ ñëó÷àÿõ. Òàêèì îáðàçîì, â ðåçóëüòàòå ìîäèôèêàöèè ïåðâè÷- íîé ñòðóêòóðû áåëêà ñðîäñòâî ÊÐ ê NADPÍ óìåíüøèëîñü â 17 ðàç ïî ñðàâíåíèþ ñ íà- òèâíîé ôîðìîé ôåðìåíòà, òîãäà êàê ñðîäñòâî ìîäèôèöèðîâàííîé ôîðìû ÊÐ ê NADÍ îñ- òàâàëîñü áåç èçìåíåíèé. Ñêîíñòðóèðîâàí ðå- êîìáèíàíòíûé øòàìì H. polymorpha ñ óñèëåí- íîé ýêñïðåññèåé ìîäèôèöèðîâàííîé ôîðìû ÊÐ, à òàêæå íàòèâíûõ ÊÄÃ è ÊÊ, êîòîðûé õàðàêòåðèçèðîâàëñÿ óâåëè÷åíèåì óðîâíÿ àëêî- ãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êñèëîçû â 7,4 ðàçà è îäíîâðåìåííûì ñíèæåíèåì óðîâíÿ ïðîäóêöèè êñèëèòà â 5 ðàç ïî ñðàâíåíèþ ñî øòàììîì äèêîãî òèïà (òàáë. 2) [21]. Ïðè ôåðìåíòàöèè êñèëîçû ðåêîìáèíàíòíûé øòàìì H. polymorpha ñ óñèëåííîé ýêñïðåññèåé ìîäèôèöèðîâàííîé ôîðìû ÊÐ è íàòèâíûõ ÊÄÃ è ÊÊ ñóùåñòâåííî ïðåâîñõîäèë ïî êîëè÷åñòâó ñèíòåçèðîâàííîãî ýòàíîëà ðåêîìáèíàíòíûé øòàìì, êîíâåðòèðóþ- ùèé êñèëîçó ñ ïîìîùüþ áàêòåðèàëüíîé ÊÈ è íàòèâíîé ÊÊ. Ñêîíñòðóèðîâàííûå ðåêîì- áèíàíòíûå øòàììû H. polymorpha ñ ïîâû- øåííîé ïðîäóêòèâíîñòüþ ñèíòåçèðîâàííîãî ýòàíîëà ïðè ôåðìåíòàöèè êñèëîçû ìîãóò èñ- ïîëüçîâàòüñÿ â êà÷åñòâå èñõîäíûõ ìèêðîîðãà- íèçìîâ äëÿ äàëüíåéøåãî óâåëè÷åíèÿ ýôôåê- òèâíîñòè àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè îñíîâíûõ ñàõàðîâ ëèãíîöåëëþëîçíûõ ãèäðîëèçàòîâ ïðè ïîâûøåííîé òåìïåðàòóðå ñ ïîìîùüþ ìåòîäîâ ìåòàáîëè÷åñêîé èíæåíåðèè. Метаболическая инженерия заключительных этапов синтеза этанола в процессе ферментации Ïèðóâàòäåêàðáîêñèëàçà (ÏÄÊ) ÿâëÿåòñÿ êëþ- ÷åâûì ôåðìåíòîì àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè. Ýòîò ôåðìåíò êàòàëèçèðóåò ïðåâðàùåíèå ïèðó- âàòà â óêñóñíûé àëüäåãèä è CO2 (ðèñ. 1). Ó S. cerevisiae (Êðýáòðè-ïîëîæèòåëüíûå äðîææè) ìå- òàáîëèçì óêñóñíîãî àëüäåãèäà çàâèñèò îò ïðè- ñóòñòâèÿ êèñëîðîäà. Ïèðóâàò ëèáî îêèñëÿåòñÿ äî àöåòèë-ÊîÀ ôåðìåíòàìè ÏÄÊ êîìïëåêñà, ëèáî æå âîññòàíàâëèâàåòñÿ äî ýòàíîëà ÏÄÊ è Òàáëèöà 2. Óäåëüíûå àêòèâíîñòè ÊÐ, ÊÄÃ è ÊÊ è ïðîäóêòèâíîñòü ñèíòåçà ýòàíîëà è êñèëèòà ó ðåêîìáèíàíòíûõ øòàììîâ H. polymorpha íà ïåðâûå ñóòêè ôåðìåíòàöèè Øòàìì Óäåëüíàÿ àêòèâíîñòü, ÌÅ/ìã áåëêà Ïðîäóêòèâíîñòü, ìã/(ë·÷)/ìã/(ë·ã·÷) ÊÐ ÊÄÃ ÊÊ Ýòàíîë ÊñèëèòNADPÍ(H+)/ KM(ìêM) NADÍ(H+)/ KM(ìêM) / / K / / K CBS4732 leu2-2 (wt) 0,091 ± 0,005/ 9 ± 0,5 0,01 ± 0,001/ 152 ± 8,4 – – 0,034 ± 0,025/ 7 ± 0,4 0,016 ± 0,001/ 100 ± 5,5 0,014 ± 0,001/ 112 ± 6,5 – – 0,012 ± 0,001/ 85 ± 4,7 0,551 ± 0,035 0,504 ± 0,028 – – 0,697 ± 0,049 – – 0,375 ± 0,021 0,366 ± 0,019 0,156 ± 0,009 6,3 ± 0,25/ 2,75 ± 0,11 9,8 ± 0,42/ 4,45 ± 0,19 13,8 ± 0,6/ 6,4 ± 0,29 54,7 ± 2,7/ 21,9 ± 1,1 7,5 ± 0,36/ 3,3 ± 0,16 3,4 ± 0,6/ 1,56 ± 0,08 3,2 ± 0,14/ 1,45 ± 0,07 2,8 ± 0,14/ 1,3 ± 0,06 0,9 ± 0,03/ 0,36 ± 0,02 4,2 ± 0,21/ 1,8 ± 0,1 10 Ê.Â. Äìèòðóê, À.À. Ñèáèðíûé ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 àëêîãîëüäåãèäðîãåíàçîé [24]. Ïîïûòêè ñâåðõ- ýêñïðåññèè ãåíà PDC1, êîäèðóþùåãî ÏÄÊ, ó S. cerevisiae íå óëó÷øàëè âûõîä ýòàíîëà ïðè ñáðàæèâàíèè ãëþêîçû [25, 26]. H. polymorpha ÿâëÿþòñÿ ñòðîãî àýðîáíûìè, Êðýáòðè-íåãàòèâíûìè äðîææàìè, íàêàïëèâàþ- ùèìè ìàêñèìàëüíûå êîëè÷åñòâà ýòàíîëà â óñ- ëîâèÿõ îãðàíè÷åííîé àýðàöèè. Â òàêèõ óñëîâè- ÿõ ïîâûøåíèå àêòèâíîñòè ÏÄÊ ìîæåò èìåòü êëþ÷åâîå çíà÷åíèå â ðàñïðåäåëåíèè ïèðóâà- òà ìåæäó ïèðóâàòäåãèäðîãåíàçîé è ÏÄÊ. Äëÿ ïîäòâåðæäåíèÿ ýòîé ãèïîòåçû ãåí PDC1 H. po- lymorpha, êîäèðóþùèé ÏÄÊ, êëîíèðîâàí, à òàê- æå èçó÷åí ýôôåêò ñâåðõýêñïðåññèè ýòîãî ãåíà íà ïðîöåññ àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè îñíîâ- íûõ ñàõàðîâ ëèãíîöåëëþëîçû. Ïðè ââåäåíèè ýêñïðåññèîííîé êàññåòû ñ ãåíîì PDC1 ïîä êîíòðîëåì ñèëüíîãî êîíñòèòóòèâíîãî ïðîìî- òîðà ãåíà ãëèöåðàëüäåãèä-3-ôîñôàòäåãèäðîãå- íàçû GAPDH â ñîñòàâå ïëàçìèäû äëÿ ìóëüòè- êîïèéíîé èíòåãðàöèè â ãåíîì ðåöèïèåíòíîãî øòàììà H. polymorpha ïðîèñõîäèëî 40-êðàò- íîå óâåëè÷åíèå óäåëüíîé àêòèâíîñòè ÏÄÊ. Âìåñòå ñ òåì ñêîíñòðóèðîâàííûé ðåêîìáè- íàíòíûé øòàìì õàðàêòåðèçèðîâàëñÿ óâåëè÷åíè- åì óðîâíÿ àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êñèëîçû â 2 ðàçà ïî ñðàâíåíèþ ñ èñõîäíûì øòàììîì. Óðîâåíü àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè ãëþêîçû áûë òàêæå óâåëè÷åí â 2 ðàçà (òàáë. 3). Ñõî- æèå ðåçóëüòàòû óâåëè÷åíèÿ óðîâíÿ ïðîäóêöèè ýòàíîëà èç ãëþêîçû è êñèëîçû â óñëîâèÿõ îïòèìàëüíîé (37 ºÑ) è ïîâûøåííîé òåìïå- ðàòóðû (48 ºÑ) ïîëó÷åíû ïðè óñèëåíèè ýêñ- ïðåññèè ãåòåðîëîãè÷åñêîãî ãåíà PDC1 Kluy- veromyces lactis â ñèñòåìå H. polymorpha [27]. Òàêèì îáðàçîì, ñâåðõýêñïðåññèÿ ãåíà PDC1 ìîæåò èñïîëüçîâàòüñÿ êàê îäèí èç ïîäõîäîâ äëÿ êîíñòðóèðîâàíèÿ óëó÷øåííûõ ïðîäóöåí- òîâ ýòàíîëà H. polymorpha èç ãèäðîëèçàòîâ ëèãíîöåëëþëîçû â óñëîâèÿõ ïîâûøåííîé òåì- ïåðàòóðû. Äðîææåâàÿ àëêîãîëüäåãèäðîãåíàçà (ÀÄÃ) – ôåðìåíò, êàòàëèçèðóþùèé çàâåðøàþùóþ ìå- òàáîëè÷åñêóþ ðåàêöèþ ïðè àëêîãîëüíîé ôåð- ìåíòàöèè. ÀÄÃ êàòàëèçèðóåò îáðàòèìóþ ðåàê- öèþ âîññòàíîâëåíèÿ óêñóñíîãî àëüäåãèäà â ýòàíîë ñ ñîïóòñòâóþùèì îêèñëåíèåì NADH (ðèñ. 1). Ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ADH ãåíîâ äî- âîëüíî êîíñåðâàòèâíû ó äðîææåé, îäíàêî ðå- ãóëÿöèÿ, ôèçèîëîãè÷åñêèå ôóíêöèè, êîëè÷åñò- âî ãåíîâ îòëè÷àþòñÿ ó ðàçíûõ âèäîâ. Ïî ñåìü ADH ãåíîâ (ADH1–ADH7) èäåíòèôèöèðîâàíî ó S. ñerevisiae, P. stipitis, à òàêæå ó H. poly- morpha, òîãäà êàê ó Kluyveromyces lactis îá- íàðóæåíî ëèøü ÷åòûðå ADH ãåíà (ADH1–ÀDH4) [28]. Ñðåäè íèõ ãåíû ADH1 è ADH2 S. cere- visiae è èõ áåëêîâûå ïðîäóêòû èçó÷åíû äå- òàëüíî, òàê êàê îíè èãðàþò êëþ÷åâóþ ðîëü â àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè, à èìåííî â ñèíòå- çå è óòèëèçàöèè ýòàíîëà ñîîòâåòñòâåííî [29, 30]. Â îòëè÷èå îò ïåêàðñêèõ äðîææåé, Adh1p P. stipitis àêòèâèðóåòñÿ êàê ïðè îãðàíè÷åíèè àýðàöèè (óñëîâèÿ ôåðìåíòàöèè), òàê è ïðè ðîñòå íà äûõàòåëüíîì ñóáñòðàòå – ýòàíîëå [31, 32]. Ïðè ñðàâíåíèè êàòàëèòè÷åñêèõ õàðàêòå- ðèñòèê ÀÄÃ ðàçíûõ âèäîâ äðîææåé óñòàíîâëå- íî, ÷òî Adh1p H. polymorpha ïðîÿâëÿåò ïîâû- øåííóþ êàòàëèòè÷åñêóþ àêòèâíîñòü ïðè îêèñ- ëåíèè ýòàíîëà è ñõîæèé óðîâåíü âîññòàíîâ- ëåíèÿ óêñóñíîãî àëüäåãèäà [28]. Äåëåöèÿ ãåíà ADH1 H. polymorpha âûçûâàëà ñíèæåíèå ñèí- òåçà ýòàíîëà ïðè ôåðìåíòàöèè êàê ãëþêîçû, òàê è ãëèöåðèíà. Óñèëåíèå ýêñïðåññèè ãåíà ADH1 íà ôîíå äåëåöèîííîãî øòàììà ïðèâîäèëî Òàáëèöà 3. Ôåðìåíòàöèÿ ðàçëè÷íûõ èñòî÷íèêîâ óãëåðîäà øòàììàìè H. polymorpha ïðè 48 ºC â óñëîâèÿõ îãðàíè÷åííîé àýðàöèè (140 îá/ìèí) â ñðåäàõ YNB ñ 12 % àðàáèíîçû, 12 % êñèëîçû è 12 % ãëþêîçû Øòàìì L-àðàáèíîçà D-êñèëîçà D-ãëþêîçà OD, 600 ýòàíîë, ã/ë ÏÄÊ àêòèâ- íîñòü, ÌÅ/ ìã áåëêà OD, 600 ýòàíîë, ã/ë ÏÄÊ àêòèâ- íîñòü, ÌÅ/ ìã áåëêà OD, 600 ýòàíîë, ã/ë ÏÄÊ àêòèâ- íîñòü, ÌÅ/ ìã áåëêà NCYC495 (wt) PDC1Hp 2EthOH– 2EthOH–/PDC1Hp 10,5 11,2 10,68 11,12 0,0 0,0 0,0 0,0 0,4 ± 0,06 9,2 ± 0,5 0,07 ± 0,01 0,88 ± 0,04 8,24 11,0 11,1 14,1 0,7 ± 0,05 1,2 ± 0,1 0,9 ± 0,2 1.6 ± 0,1 0,1 ± 0,02 4,1 ± 0,2 0,21 ± 0,06 2,2 ± 0,2 12,4 13,0 11,6 16,2 14,4 ± 0,9 27,9 ± 1,3 7,8 ± 0,4 10,8 ± 0,7 0,21 ± 0,03 3,2 ± 0,15 0,26 ± 0,04 2,9 ± 0,15 Ìåòàáîëè÷åñêàÿ èíæåíåðèÿ äðîææåé Hansenula polymorpha ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 11 ê äâóêðàòíîìó óâåëè÷åíèþ êîëè÷åñòâà ñèíòåçèðóåìîãî ýòàíîëà ïðè ôåðìåíòàöèè ãëþ- êîçû è íåçíà÷èòåëüíîìó óëó÷øåíèþ êîíâåð- ñèè ãëèöåðèíà â ýòàíîë [28]. Êîíñòðóèðîâàíèå äðîææåâûõ øòàììîâ, ýôôåêòèâíî êîíâåðòè- ðóþùèõ ãëèöåðèí äî ýòàíîëà, âûçûâàåò âñå áîëüøèé èíòåðåñ, òàê êàê ãëèöåðèí îáðàçóåòñÿ â áîëüøèõ êîëè÷åñòâàõ â êà÷åñòâå ïîáî÷íîãî ïðîäóêòà ïðè ïðîèçâîäñòâå áèîäèçåëÿ. Исследование роли гена ATH1 в термотолерантности и мобилизации трегалозы у H. polymorpha Òðåãàëîçà èãðàåò ñóùåñòâåííóþ ðîëü â îáåñïå÷åíèè òåðìîòîëåðàíòíîñòè H. polymorpha. Ó ýòèõ è äðóãèõ äðîææåé ñèíòåç òðåãàëîçû ÿâ- ëÿåòñÿ îäíèì èç ýëåìåíòîâ îòâåòà íà òåïëîâîé øîê. Reinders et al. [33] óñòàíîâèëè, ÷òî ïðè ïîòåðå àêòèâíîñòè òðåãàëîçî-6-ôîñôàòñèíòàçû (ïåðâîãî ôåðìåíòà ïóòè ñèíòåçà òðåãàëîçû) êëåò- êè H. polymorpha íå ñïîñîáíû ñèíòåçèðîâàòü òðåãàëîçó è ñòàíîâÿòñÿ ÷óâñòâèòåëüíûìè ê òåï- ëîâîìó øîêó. Îäíàêî äëÿ H. polymorpha âëèÿ- íèå óâåëè÷åíèÿ âíóòðèêëåòî÷íîãî óðîâíÿ òðå- ãàëîçû íà òåðìîòîëåðàíòíîñòü ðàíåå íå èññëå- äîâàëîñü. Ìåòàáîëèçì òðåãàëîçû äåòàëüíî èçó- ÷åí ó äðîææåé S. cerevisiae, ó êîòîðûõ âíóòðè- êëåòî÷íûé óðîâåíü òðåãàëîçû ïîääåðæèâàåòñÿ áëàãîäàðÿ ñáàëàíñèðîâàííîìó äåéñòâèþ ôåð- ìåíòîâ ñèíòåçà è ãèäðîëèçà ýòîãî ñàõàðà [34]. Â ãèäðîëèçå òðåãàëîçû ó÷àñòâóþò äâà ôåðìåí- òà – êèñëàÿ òðåãàëàçà (êîäèðóåòñÿ ãåíîì ATH1) è íåéòðàëüíàÿ òðåãàëàçà (êîäèðóåòñÿ ãåíîì NTH1) [35]. Êèñëàÿ òðåãàëàçà íåîáõîäèìà äëÿ ðîñòà S. cerevisiae â ñðåäå ñ òðåãàëîçîé â êà- ÷åñòâå åäèíñòâåííîãî èñòî÷íèêà óãëåðîäà è ýíåðãèè [36]. Äåëåöèÿ ãåíà ATH1 ó S. cerevisiae â áîëüøåé ñòåïåíè óâåëè÷èâàåò óðîâåíü âíóòðè- êëåòî÷íîé òðåãàëîçû, ÷åì äåëåöèÿ ãåíà NTH1 [34]. Óñòàíîâëåíî, ÷òî ath1 ìóòàíò S. cerevisiae ìåíåå ÷óâñòâèòåëüíûé ê òàêèì ñòðåññîâûì ôàê- òîðàì, êàê âûñóøèâàíèå, èíêóáàöèÿ ïðè íèç- êîé òåìïåðàòóðå, ýòàíîëüíûé è îñìîòè÷åñêèé ñòðåññû [34, 37]. Ñíèæåíèå àêòèâíîñòè êèñëîé òðåãàëàçû ó S. cerevisiae ïîâûøàåò òîëåðàíò- íîñòü ê ýòàíîëó è óâåëè÷èâàåò ïðîäóêòèâíîñòü àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè [38]. Äëÿ îïðåäåëåíèÿ ðîëè ãåíà ATH1 â òåðìîòîëåðàíòíîñòè è ìîáèëèçàöèè òðåãàëîçû ó H. polymorpha ñêîíñòðóèðîâàí øòàìì ath1 ñ äåëåöèåé ñîîòâåòñòâóþùåãî ãåíà. Êàê è ìó- òàíò ath1 S. cerevisiae, øòàìì ath1 H. poly- morpha íå ðàñòåò â ñðåäå ñ òðåãàëîçîé â êà- ÷åñòâå åäèíñòâåííîãî èñòî÷íèêà óãëåðîäà è ýíåðãèè. Â ðåçóëüòàòå ïîòåðè àêòèâíîñòè êèñ- ëîé òðåãàëàçû ìóòàíò ath1 H. polymorpha íà- êàïëèâàåò â êëåòêàõ â 1,5–2,3 ðàçà áîëüøå òðåãàëîçû â ñðàâíåíèè ñî øòàììîì äèêîãî òè- ïà â óñëîâèÿõ îïòèìàëüíîé è ïîâûøåííîé òåì- ïåðàòóð. Óâåëè÷åíèå âíóòðèêëåòî÷íîãî óðîâ- íÿ òðåãàëîçû ó H. polymorpha îêàçûâàëî ïîëî- æèòåëüíûé ýôôåêò íà òåðìîòîëåðàíòíîñòü êëå- òîê, ïîñêîëüêó ó ìóòàíòà ath1 H. polymorpha â 2 ðàçà ïîâûøàëàñü óñòîé÷èâîñòü ê òåïëîâîìó øîêó, à ïðîäóêöèÿ ýòàíîëà ïðè ñáðàæèâàíèè êñèëîçû óâåëè÷èâàëàñü â 6 ðàç ïðè òåìïåðàòóðå 50 ºÑ [7]. Повышение термотолерантности рекомбинантных штаммов H. polymorpha с усиленной экспрессией белков теплового шока Hsp16p и Hsp104p Íèçêîìîëåêóëÿðíûå áåëêè òåïëîâîãî øîêà ïðèíàäëåæàò ê ïîäñåìåéñòâó áåëêîâ ñ ìîëå- êóëÿðíîé ìàññîé ìîíîìåðîâ îò 12 äî 43 êÄà [39]. Áåëêè òåïëîâîãî øîêà ñóïðåññèðóþò àãðåãàöèþ äåíàòóðèðîâàííûõ áåëêîâ, à òàêæå îáëåã÷àþò âçàèìîäåéñòâèå ïîâðåæäåííûõ áåë- êîâ ñ äðóãèìè øàïåðîíàìè äëÿ âîññòàíîâëåíèÿ íàòèâíîé ñòðóêòóðû [40]. Ïîêàçàíî, ÷òî íèç- êîìîëåêóëÿðíûé áåëîê òåïëîâîãî øîêà Hsp16p S. pombe íåîáõîäèì äëÿ ýêñïîðòà ìÐÍÊ â óñëîâèÿõ òåïëîâîãî øîêà [41]. Îðòîëîã ýòîãî áåëêà äðîææåé S. cerevisiae, Hsp42p, ÿâëÿåòñÿ òèïè÷íûì öèòîçîëüíûì áåëêîì òåïëîâîãî øî- êà, âûïîëíÿþùèì ôóíêöèþ øàïåðîíà â óñëî- âèÿõ íîðìàëüíîé è ïîâûøåííîé òåìïåðàòóð [42]. Áëèæàéøèé èäåíòèôèöèðîâàííûé ãîìî- ëîã Hsp16p H. polymorpha ñîîòâåòñòâóþùåãî áåë- êà S. pombe èìååò ìîëåêóëÿðíóþ ìàññó 36,2 êÄà. Áåëîê Hsp104p ÿâëÿåòñÿ ïðåäñòàâèòåëåì AAA+ ïîäñåìåéñòâà áåëêîâ òåïëîâîãî øîêà, ó÷àñòâó- þùèõ â ñòðóêòóðíûõ ïåðåñòðîéêàõ áåëêîâ è áåëêîâûõ êîìïëåêñîâ [43]. Áåëîê òåïëîâîãî øî- êà Hsp104p S. cerevisiae âîññòàíàâëèâàåò ñòðóê- òóðó äåíàòóðèðîâàííûõ áåëêîâ, èñïîëüçóÿ ýíåð- ãèþ ÀTÔ è ñèñòåìó êî-øàïåðîíîâ Hsp70ð/ Hsp40ð [44]. Ýêñïðåññèÿ Hsp104p S. cerevisiae íåâåëèêà ïðè íîðìàëüíîé òåìïåðàòóðå è çíà- ÷èòåëüíî âîçðàñòàåò ïðè ïîâûøåíèè òåìïå- ðàòóðû [45]. Áåëîê òåïëîâîãî øîêà Hsp104p 12 Ê.Â. Äìèòðóê, À.À. Ñèáèðíûé ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 èãðàåò êðèòè÷åñêóþ ðîëü â âûæèâàíèè êëåòîê ïðè êóëüòèâèðîâàíèè äðîææåé â óñëîâèÿõ ýêñ- òðåìàëüíûõ òåìïåðàòóð [46]. Ýêñïðåññèÿ ýòîãî ãåíà îáåñïå÷èâàåò òåðìîòîëåðàíòíîñòü êëåòîê S. cerevisiae [45]. Hsp104p ÿâëÿåòñÿ âûñîêî- êîíñåðâàòèâíûì áåëêîì. Àìèíîêèñëîòíàÿ ïî- ñëåäîâàòåëüíîñòü Hsp104p H. polymorpha ñîñ- òàâëÿåò 64 % ãîìîëîãèè Hsp104p S. cerevisiae. Guerra et al. [47] óñòàíîâèëè, ÷òî ýêñïðåññèÿ Hsp104p H. polymorpha ïîäîáíî S. cerevisiae èíäóöèðóåòñÿ ïîâûøåíèåì òåìïåðàòóðû. Äëÿ ïðîâåðêè âëèÿíèÿ ñâåðõñèíòåçà áåëêîâ òåïëîâîãî øîêà íà òåðìîòîëåðàíòíîñòü è âûñî- êîòåìïåðàòóðíóþ ôåðìåíòàöèþ H. polymorpha ñêîíñòðóèðîâàíû øòàììû ñ óñèëåííîé ýêñïðåñ- ñèåé ãîìîëîãè÷åñêèõ ãåíîâ HSP16 è HSP104 ïîä êîíòðîëåì ïðîìîòîðà ãåíà GAPDH. Òðàíñ- ôîðìàíòû, ñîäåðæàùèå ýêñïðåññèîííûå êàññåòû HSP16 è HSP104, õàðàêòåðèçîâàëèñü ïîâûøå- íèåì óðîâíÿ âûæèâàíèÿ â óñëîâèÿõ òåïëîâîãî øîêà â 2 è 10 ðàç ñîîòâåòñòâåííî. Ñèíåðãè÷- íûé ýôôåêò êîìáèíèðîâàíèÿ ñâåðõýêñïðåññèè Hsp16p è Hsp104p ïðîÿâëÿëñÿ â 12-êðàòíîì ïî- âûøåíèè óðîâíÿ âûæèâàíèÿ â óñëîâèÿõ òåïëî- âîãî øîêà [7]. Èññëåäîâàíèå âûñîêîòåìïåðàòóðíîé ôåðìåí- òàöèè êñèëîçû ïîêàçàëî, ÷òî øòàììû H. ðoly- morpha, ñâåðõýêñïðåññèðóþùèå ãåíû áåëêîâ òåïëîâîãî øîêà, õàðàêòåðèçóþòñÿ óëó÷øåííû- ìè ïàðàìåòðàìè àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè, â ÷àñòíîñòè, ýòè øòàììû ïðîäóöèðóþò â 3–6 ðàç áîëüøå ýòàíîëà ïðè ìàêñèìàëüíîé äëÿ H. ðoly- morpha òåìïåðàòóðå 50 ºÑ. Ïðè áîëåå íèçêèõ òåìïåðàòóðàõ (37 è 48 ºÑ) óðîâåíü ïðîäóêöèè ýòàíîëà ó òðàíñôîðìàíòîâ HSP áûë íà óðîâ- íå êîíòðîëüíîãî øòàììà. Ïîñêîëüêó 50 ºÑ ÿâëÿåòñÿ ìàêñèìàëüíîé òåìïåðàòóðîé, êîòîðóþ âûäåðæèâàåò H. ðolymorpha, è ðîñò ïðè òàêîé òåìïåðàòóðå ñóùåñòâåííî óãíåòåí, ìû ïðåäïî- ëàãàåì, ÷òî â äàííûõ óñëîâèÿõ çíà÷èòåëüíàÿ ÷àñòü áåëêîâ êëåòêè äåíàòóðèðóåò. Ýòî ïðåä- ïîëîæåíèå ïîçâîëÿåò îáúÿñíèòü ïîçèòèâíûé ýôôåêò ñâåðõýêñïðåññèè ãåíîâ HSP ïðè ôåð- ìåíòàöèè êñèëîçû ïðè òåìïåðàòóðå 50 ºÑ [7]. Идентификация генов H. polymorpha, определяющих устойчивость к этиловому спирту Äëÿ êëîíèðîâàíèÿ ãåíîâ H. ðolymorpha, îáåñ- ïå÷èâàþùèõ óñòîé÷èâîñòü ê ýòèëîâîìó ñïèð- òó, ïðîâåäåíû ýêñïåðèìåíòû ñ èñïîëüçîâàíèåì èíñåðöèîííîãî ìóòàãåíåçà. Ïîñëå òðàíñôîð- ìàöèè ðåöèïèåíòíîãî øòàììà H. ðolymorpha èíñåðöèîííîé êàññåòîé ñîçäàíà êîëëåêöèÿ òðàíñôîðìàíòîâ, â êîòîðûõ êàññåòà âñòðàèâà- ëàñü â ñëó÷àéíûå õðîìîñîìíûå ëîêóñû. Îïðå- äåëåíà ìèíèìàëüíàÿ òîêñè÷åñêàÿ êîíöåíòðàöèÿ ýòàíîëà, óãíåòàþùàÿ ðîñò H. ðolymorpha, êîòî- ðàÿ ñîñòàâèëà 7 %. Ïîñëå ñêðèíèíãà òðàíñôîð- ìàíòîâ íà ñðåäå ñ ïîâûøåííîé êîíöåíòðàöèåé ýòàíîëà ñåëåêöèîíèðîâàí èíñåðöèîííûé ìó- òàíò H. ðolymorpha (7Å), íåñïîñîáíûé ðàñòè íà òàêîé ñðåäå. Øòàìì 7Å â 300–500 ðàç ÷óâñòâèòåëüíåå ê ýêçîãåííîìó ýòàíîëó, ÷åì ðåöèïèåíòíûé øòàìì. Ââåäåííàÿ ìóòàöèÿ íå ïîâðåæäàåò êàòàáîëèçì ýòàíîëà, à ëèøü âëèÿåò íà ìåõàíèçìû óñòîé÷èâîñòè ê ïîâûøåííûì êîíöåíòðàöèÿì ýòîãî ñïèðòà. Àíàëèç íóêëåîòèäíûõ ïîñëåäîâàòåëüíîñ- òåé, ôëàíêèðóþùèõ èíñåðöèîííóþ êàññåòó, âûÿâèë ïîâðåæäåíèå ãåíà ñ äîñòàòî÷íî âûñî- êîé ñòåïåíüþ ãîìîëîãèè (39 %) ê ãåíó MPE1 S. cerevisiae. Ãåí MPE1 S. cerevisiae êîäèðóåò æèçíåííî âàæíûé áåëîê, ÿâëÿþùèéñÿ êîìïî- íåíòîì ôàêòîðà ðàñùåïëåíèÿ è ïîëèàäåíè- ëèðîâàíèÿ ìÐÍÊ ïðè åå ñîçðåâàíèè. Â îò- ëè÷èå îò S. cerevisiae, MPE1 H. polymorpha íå ÿâëÿåòñÿ æèçíåííî íåîáõîäèìûì ãåíîì, à îòâå÷àåò çà ðåçèñòåíòíîñòü ê ýòàíîëó. Â ñâÿçè ñ ýòèì èäåíòèôèöèðîâàííîìó ãåíó H. polymorpha ïðèñâîåíî íîâîå íàçâàíèå: ETT1 (ethanol tolerance – òîëåðàíòíîñòü ê ýòàíîëó), à ìóòàíò 7Å ñîîòâåòñòâåííî îáîçíà÷åí êàê ett1. MPE1 S. cerevisiae íå êîìïëåìåíòèðóåò ìóòàöèþ ett1 H. polymorpha, îäíàêî ÷àñòè÷- íóþ êîìïëåìåíòàöèþ îáåñïå÷èâàë ãåí MPE1 äðîææåé P. stipitis, ôåðìåíòèðóþùèõ êñèëîçó äî ýòàíîëà. Ïîëó÷åííûå äàííûå óêàçûâàþò, ÷òî Mpe1p P. stipitis, ïîäîáíî Ett1p H. poly- morpha, îòâå÷àåò çà óñòîé÷èâîñòü ê ýòàíîëó, à Mpe1p S. cerevisiae, î÷åâèäíî, íå âûïîëíÿåò òàêîé ôóíêöèè. Óñòàíîâëåíî, ÷òî àìèíîêèñ- ëîòíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãåíîâ MPE1 S. cerevisiae, ETT1 H. polymorpha è MPE1 P. stipitis ñîäåðæàò îáùèå êîíñåðâàòèâíûå äîìåíû: óáèê- âèòèí-ïîäîáíûé DWNN-äîìåí è ìîòèâ «öèíêî- âîãî ïàëüöà». Îòëè÷èÿ âûÿâëåíû ïðè äåòàëüíîì àíàëèçå DWNN-äîìåíîâ áåëêîâ S. cerevisiae, P. stipitis è H. polymorpha. Ñîãëàñíî àìèíî- êèñëîòíûì ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿì DWNN-äî- ìåí èìååò ãîìîëîãèþ ê óáèêâèòèíó è ìî- 13 Ìåòàáîëè÷åñêàÿ èíæåíåðèÿ äðîææåé Hansenula polymorpha ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 æåò ïðèíèìàòü ó÷àñòèå â ïðîöåññå êîâàëåíòíîé ìîäèôèêàöèè áåëêîâ óáèêâèòèíîì [48]. Èç- âåñòíî, ÷òî óáèêâèòèí ñîäåðæèò êîíñåðâà- òèâíûå àìèíîêèñëîòíûå îñòàòêè ëèçèíà (K), ÿâëÿþùèåñÿ ñàéòàìè ïðèñîåäèíåíèÿ äîïîëíè- òåëüíûõ ìîëåêóë óáèêâèòèíà, ÷òî áëàãîïðèÿò- ñòâóåò ôîðìèðîâàíèþ ïîëèóáèêâèòèíîâûõ öå- ïåé [49]. Öåïè óáèêâèòèíà, ñâÿçàííûå ñ K48, K11 è K29, ðàñïîçíàþòñÿ 26S-ïðîòåàñîìîé, ïîñëå ÷åãî ïðîèñõîäèò äåãðàäàöèÿ ìîäèôèöè- ðîâàííîãî óáèêâèòèíîì áåëêà. Öåïè, ñâÿçàí- íûå ñ K6 è K63, ó÷àñòâóþò â ìíîãî÷èñëåííûõ íåïðîòåîëèòè÷åñêèõ ïðîöåññàõ, íàïðèìåð, â îò- âåòå íà ñòðåññ, ðåïàðàöèè ÄÍÊ è ýíäîöèòîçå [50]. Óáèêâèòèí ñîäåðæèò òàêæå äâà êîíñåð- âàòèâíûõ îñòàòêà ãëèöèíà (ìîòèâ GG) íà Ñ-êîíöå ìîëåêóëû. Ìîòèâ GG ÿâëÿåòñÿ ñàé- òîì ðàñïîçíàâàíèÿ ïðîòåàçû, êîòîðàÿ ðàñùåï- ëÿåò ñâÿçü ìåæäó àìèíîêèñëîòíûìè îñòàòêàìè ãëèöèíà è çàïóñêàåò ïðîöåññ êîíúþãàöèè óáèê- âèòèíà [48]. Ñðàâíåíèå àìèíîêèñëîòíîé ïîñ- ëåäîâàòåëüíîñòè óáèêâèòèíà ñ DWNN-äîìåíà- ìè Mpe1p S. cerevisiae, P. stipitis è Ett1p H. poly- morpha îáíàðóæèëî îòëè÷èÿ â êîíñåðâàòèâíûõ îñòàòêàõ àìèíîêèñëîò, õàðàêòåðíûõ äëÿ óáèêâè- òèíà. Äîìåí DWNN Ett1p H. polymorpha ñîäåð- æèò ìîòèâ GG è K6, ó P. stipitis ïðèñóòñò- âóåò ëèøü K6, òîãäà êàê ó S. cerevisiae ñîîò- âåòñòâóþùèå êîíñåðâàòèâíûå îñòàòêè óáèêâè- òèíà îòñóòñòâóþò âîîáùå. Ýòè äàííûå ìîãóò îáúÿñíèòü, ïî÷åìó ãåí MPE1 P. stipitis, à íå ñîîòâåòñòâóþùèé ãîìîëîã S. cerevisiae, ÷àñòè÷íî êîìïëåìåíòèðóåò ìóòàöèþ ett1 H. polymorpha. Äëÿ èçó÷åíèÿ âëèÿíèÿ ýêñïðåññèè ETT1 íà óñòîé÷èâîñòü H. polymorpha ê ýòèëîâîìó ñïèðòó ñêîíñòðóèðîâàí øòàìì ñ óñèëåííîé ýêñïðåñ- ñèåé ñîîòâåòñòâóþùåãî ãåíà. Ñâåðõýêñïðåññèÿ ãåíà ETT1 ñóùåñòâåííî óâåëè÷èâàëà ðåçèñòåíò- íîñòü H. polymorpha ê ýòàíîëó, ÷òî ïðèâîäèëî ê 10- è 3-êðàòíîìó óëó÷øåíèþ ðîñòà íà àãà- ðèçîâàííîé è æèäêîé ñðåäàõ ñ ýòàíîëîì ñîîò- âåòñòâåííî. Êðîìå óñòîé÷èâîñòè ê ýòàíîëó, ãåí ETT1 H. polymorpha òàêæå îòâå÷àåò çà óñòîé÷èâîñòü ê ðàçëè÷íûì ôîðìàì ñòðåññà. Øòàìì H. poly- morpha ñ óñèëåííîé ýêñïðåññèåé ETT1 ïðî- ÿâëÿåò ïîâûøåííóþ ðåçèñòåíòíîñòü ê äåíàòóðè- ðóþùåìó àãåíòó àçåòèäèí-2-êàðáîêñèëîâîé êèñ- ëîòå (Azetidine-2-carboxylic acid, AZC), òåïëî- âîìó øîêó, à òàêæå õàðàêòåðèçóåòñÿ óëó÷- øåííîé êèíåòèêîé ðîñòà ïðè ïîâûøåííûõ òåìïåðàòóðàõ 49 è 50 ºÑ. Ìóòàíò ett1 íå ñïî- ñîáåí ðàñòè ïðè ïîâûøåííîé òåìïåðàòóðå. Êî- ëè÷åñòâî ñèíòåçèðîâàííîãî ýòàíîëà ýòèì øòàì- ìîì ïðè ôåðìåíòàöèè êñèëîçû îêàçàëîñü íå- ñêîëüêî ñíèæåííûì. Ett1p H. polymorpha òàêæå ïðèíèìàåò ó÷àñ- òèå â ïîääåðæàíèè öåëîñòíîñòè êëåòî÷íîé ñòåíêè, ïîñêîëüêó ìóòàíò ett1 íå ðàñòåò â ñðåäå ñ äîäåöèëñóëüôàòîì íàòðèÿ (SDS), à øòàìì ñ óñèëåííîé ýêñïðåññèåé ETT1 õàðàêòåðèçóåòñÿ óëó÷øåííûì ðîñòîì. Òàê êàê ñâåðõýêñïðåññèÿ ãåíà ETT1 ó H. polymorpha ñîïðîâîæäàåòñÿ ïî- âûøåííîé ðåçèñòåíòíîñòüþ ê ðÿäó ñòðåññîâûõ ôàêòîðîâ, òàêèõ êàê ïîâûøåííàÿ òåìïåðàòóðà, ýòàíîë, AZC è SDS, âûçûâàþùèå äåíàòóðàöèþ áåëêîâ, ñëåäóåò ïðåäïîëîæèòü, ÷òî ýêñïðåññèÿ ETT1 îñîáåííî âàæíà â óñëîâèÿõ áåëêîâîé äåíàòóðàöèè. Ýòî ïðåäïîëîæåíèå ïîäòâåðæäà- þò äàííûå ðîñòîâûõ õàðàêòåðèñòèê øòàììîâ H. polymorpha â ñðåäå ñ ðàïàìèöèíîì. Øòàìì H. polymorpha ñ óñèëåííîé ýêñïðåññèåé ETT1 ïðîÿâëÿåò ïîâûøåííóþ óñòîé÷èâîñòü ê ðàïà- ìèöèíó. Èçâåñòíî, ÷òî ðàïàìèöèí èíãèáèðóåò ïðîòåèíêèíàçó TOR (target of rapamycin), êîòî- ðàÿ ó÷àñòâóåò â êëåòî÷íîì îòâåòå íà ãîëîäàíèå. Â óñëîâèÿõ èñ÷åðïàíèÿ ïèòàòåëüíûõ âåùåñòâ ñèãíàëüíûå ïóòè ïðîòåèíêèíàçû TOR è ïðîòåèí- êèíàçû À êîîïåðàòèâíî áëîêèðóþò êëåòî÷íûé öèêë è àêòèâèðóþò îòâåò êëåòêè íà ñòðåññ [51]. Гетерологическая экспрессия гена MPR1 S. cerevisiae в дрожжах H. polymorpha Êðîìå äåíàòóðàöèè áåëêîâ è èçìåíåíèÿ òå- êó÷åñòè ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû, ýòàíîë ïî- âûøàåò óðîâåíü îáðàçîâàíèÿ ñâîáîäíûõ ðàäè- êàëîâ êèñëîðîäà [52]. Ãåí MPR1 S. cerevisiae, êîäèðóþùèé àöåòèëòðàíñôåðàçó, ó÷àñòâóåò â çàùèòå äðîææåâîé êëåòêè îò ñâîáîäíûõ ðà- äèêàëîâ êèñëîðîäà â óñëîâèÿõ ýòàíîëüíîãî ñòðåññà [53]. Ïîñêîëüêó ãåíîì H. polymorpha íå ñîäåðæèò ãåíîâ, ãîìîëîãè÷íûõ àöåòèëòðàíñ- ôåðàçå ïåêàðñêèõ äðîææåé, èññëåäîâàëîñü âëè- ÿíèå ãåòåðîëîãè÷íîãî ãåíà MPR1 S. cerevisiae íà òîëåðàíòíîñòü H. polymorpha ê ïîâûøåííîé êîíöåíòðàöèè ýòàíîëà. Ñêîíñòðóèðîâàíà ýêñ- ïðåññèîííàÿ êàññåòà, ñîäåðæàùàÿ ãåí MPR1 S. cerevisiae ïîä êîíòðîëåì ñèëüíîãî êîíñòè- òóòèâíîãî ïðîìîòîðà ãåíà GAPDH, êîòîðóþ âïîñëåäñòâèè ââåëè â ãåíîì H. polymorpha. 14 Ê.Â. Äìèòðóê, À.À. Ñèáèðíûé ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 Òðàíñôîðìàíòû H. polymorpha, ýêñïðåññèðóþ- ùèå MPR1 S. cerevisiae, ïðèîáðåòàëè ïîâûøåí- íóþ ðåçèñòåíòíîñòü ê AZC è ýòàíîëó â ñðàâ- íåíèè ñ èñõîäíûì øòàììîì. Óðîâåíü ðåçèñ- òåíòíîñòè êîððåëèðîâàë ñ êîëè÷åñòâîì êîïèé ýêñïðåññèîííîé êàññåòû â ãåíîìå òðàíñôîð- ìàíòîâ. Òðàíñôîðìàíòû, ñîäåðæàùèå òðè êî- ïèè ãåíà MPR1 S. cerevisiae, áîëåå óñòîé÷èâû ê AZC è ýòàíîëó, ÷åì èíòåãðàíòû, íåñóùèå îäíó êîïèþ ýòîãî ãåíà. Òàêèì îáðàçîì, óñòîé- ÷èâîñòü H. polymorpha ê ýòèëîâîãî ñïèðòó ìî- æåò áûòü óñèëåíà çà ñ÷åò ñâåðõýêñïðåññèè ãå- òåðîëîãè÷íîãî ãåíà MPR1, êîäèðóþùåãî àöåòèë- òðàíñôåðàçó. Прямая конверсия крахмала либо ксилана в этанол с помощью рекомбинантных штаммов H. polymorpha Ïðÿìàÿ ìèêðîáíàÿ êîíâåðñèÿ óãëåâîäíûõ ïîëèìåðîâ â ýòàíîë ÿâëÿåòñÿ ïåðñïåêòèâíîé òåõíîëîãèåé, êîòîðàÿ ìîæåò îáåñïå÷èòü ðåí- òàáåëüíîå ïðîèçâîäñòâî ñïèðòà èç ëèãíîöåë- ëþëîçíîãî ñûðüÿ. Îäíîé èç êëþ÷åâûõ ïðåäïî- ñûëîê äëÿ ðàçâèòèÿ ýòîé òåõíîëîãèè ÿâëÿåòñÿ ïîèñê, ñåëåêöèÿ ëèáî êîíñòðóèðîâàíèå ìèêðî- îðãàíèçìîâ, ñáðàæèâàþùèõ êðàõìàë è êñè- ëàí äî ýòàíîëà ïðè ïîâûøåííûõ òåìïåðàòó- ðàõ [54]. Îïòèìàëüíàÿ òåìïåðàòóðà äåéñòâèÿ ãèäðîëèòè÷åñêèõ ôåðìåíòîâ, êîòîðûå ìîãóò èñïîëüçîâàòüñÿ ïðè ïðÿìîé ìèêðîáíîé êîí- âåðñèè ïîëèìåðîâ â ýòàíîë, ñîñòàâëÿåò îêîëî 50 ºÑ. Îäíàêî áîëüøèíñòâî ìèêðîîðãàíèçìîâ, èñïîëüçóþùèõñÿ äëÿ êîíñòðóèðîâàíèÿ ïðîäó- öåíòîâ ýòàíîëà èç ëèãíîöåëëþëîçíûõ è êðàõ- ìàëèñòûõ ñóáñòðàòîâ, ÿâëÿþòñÿ ìåçîôèëàìè ñ îïòèìàëüíîé òåìïåðàòóðîé ðîñòà è ôåðìåíòà- öèè â ïðåäåëàõ 28–40 ºÑ [55]. Íàêàïëèâàåìûå ïîñëå îáðàáîòêè çåðíà è êóêóðóçû îñòàòêè ñî- äåðæàò çíà÷èòåëüíîå êîëè÷åñòâî êðàõìàëà. Íà- ïðèìåð, ïøåíè÷íûå îòðóáè ñîñòîÿò èç 35 % ãåìèöåëëþëîçû, 18 % öåëëþëîçû è 20 % êðàõ- ìàëà [56]. Ïøåíè÷íûå îòðóáè íàêàïëèâàþòñÿ â áîëüøèõ êîëè÷åñòâàõ êàê ïîáî÷íûé ïðîäóêò ïðîèçâîäñòâà ìóêè. Òàêèì îáðàçîì, êîíñòðó- èðîâàíèå ìèêðîáíûõ øòàììîâ, ñïîñîáíûõ ê ïðÿìîé êîíâåðñèè êàê êðàõìàëà, òàê è ãåìè- öåëëþëîçû â ýòàíîë, èìååò áîëüøîå ýêîíî- ìè÷åñêîå çíà÷åíèå. Êðàõìàë ñîñòîèò èç äâóõ âûñîêîìîëåêóëÿð- íûõ ôðàêöèé – àìèëîçû è àìèëîïåêòèíà. Ìè- íîðíûé êîìïîíåíò êðàõìàëà (20–30 %) – àìè- ëîçà, ëèíåéíûé ïîëèñàõàðèä, êîòîðûé ñîñòîèò èç îñòàòêîâ ãëþêîçû, îáúåäèíåííûõ -1,4-ñâÿ- çÿìè. Àìèëîïåêòèí, â ñâîþ î÷åðåäü, ïðåäñòàâ- ëÿåò ñîáîé îñíîâíóþ ÷àñòü êðàõìàëà (70–80 %) è ñîäåðæèò, êðîìå -1,4-öåïåé ãëþêîçû, -1,6- ðàçâåòâëåííûå öåïè [57]. Êðàõìàë ðàñùåïëÿåò- ñÿ ñåêðåòîðíûìè -àìèëàçîé è ãëþêîàìèëàçîé [58]. -Àìèëàçà (EC 3.2.1.1) êàòàëèçèðóåò ðàñùå- ïëåíèå âíóòðåííèõ -1,4-ãëèêîçèäíûõ ñâÿçåé êðàõìàëà äî ìàëüòîçû, îëèãîñàõàðèäîâ è äåêñ- òðèíîâ. Ãëþêîàìèëàçà (EC 3.2.1.3) êàòàëèçè- ðóåò ãèäðîëèç ãëþêîîëèãîñàõàðèäîâ è ìàëüòî- çû äî D-ãëþêîçû. Ñêîíñòðóèðîâàíû ðåêîìáè- íàíòíûå øòàììû S. cerevisiae, ñáðàæèâàþùèå êðàõìàë ïóòåì ýêñïðåññèè ãåòåðîëîãè÷åñêèõ -àìèëàçû Streptococcus bovis è ãëþêîàìèëàçû Rhizopus oryzae [59]. Äðîææè Schwanniomyces occidentalis ñèíòåçèðóþò àìèëîëèòè÷åñêèå ôåð- ìåíòû è ñáðàæèâàþò êðàõìàë äî ýòàíîëà ñ âûñîêîé ýôôåêòèâíîñòüþ [60]. Ñåêðåòîðíàÿ -àìèëàçà êîäèðóåòñÿ ãåíîì SWA2. Ãåí GAM1 êîäèðóåò ñåêðåòîðíóþ ãëþêîàìèëàçó. Ýòîò ãåí áûë ýêñïðåññèðîâàí â H. polymorpha, ÷òî ïðè- âîäèëî ê ýôôåêòèâíîé ñåêðåöèè ãåòåðîëîãè÷- íîé ãëþêîàìèëàçû [61]. Ó÷èòûâàÿ ñïîñîáíîñòü äðîææåé H. polymorpha ôåðìåíòèðîâàòü ãëþ- êîçó ïðè ïîâûøåííîé òåìïåðàòóðå [7, 27], ïåðñ- ïåêòèâíûì ÿâëÿåòñÿ êîíñòðóèðîâàíèå ðåêîì- áèíàíòíûõ øòàììîâ íà îñíîâå ýòîãî îðãàíèç- ìà, íåïîñðåäñòâåííî ñáðàæèâàþùèõ êðàõìàë â ýòàíîë. Ýêñïðåññèîííûå êàññåòû ãåíîâ SWA2 (êî- äèðóåò ñåêðåòîðíóþ -àìèëàçó) è GAM1 (êî- äèðóåò ñåêðåòîðíóþ ãëþêîàìèëàçó) ïîä êîí- òðîëåì ñèëüíîãî êîíñòèòóòèâíîãî ïðîìîòîðà GAPDH áûëè ââåäåíû â ãåíîì ðåöèïèåíòíîãî øòàììà H. polymorpha. Ïðîâîäèëàñü ñåëåêöèÿ òðàíñôîðìàíòîâ, òåñòèðóåìûõ ïî âåëè÷èíå çîí ïðîñâåòëåíèÿ (ãàëî) êðàõìàëà. Íàëè÷èå ãàëî ñâèäåòåëüñòâóåò îá ýôôåêòèâíîé ýêñïðåññèè ñåêðåòîðíûõ ôîðì -àìèëàçû è ãëþêîàìèëàçû. Îäèí èç îòîáðàííûõ øòàììîâ, ôîðìèðóþùèé ñàìóþ êðóïíóþ çîíó ïðîñâåòëåíèÿ êðàõìàëà, ñèíòåçèðîâàë áîëåå 3 ã/ë ýòàíîëà ìåíåå ÷åì çà 48 ÷ ïðè ôåðìåíòàöèè 3 % êðàõìàëà ïðè pH 5.5 è òåìïåðàòóðå 48 ºC [62]. Äàëüíåéøåå ïîâûøåíèå àìèëîëèòè÷åñêîé àêòèâíîñòè ðåêîìáèíàíòíûõ øòàììîâ äîñòè- ãàëîñü ñ ïîìîùüþ ìóëüòèêîïèéíîé èíòåãðà- 15 Ìåòàáîëè÷åñêàÿ èíæåíåðèÿ äðîææåé Hansenula polymorpha ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 öèè ïëàçìèäû, ñîäåðæàùåé ýêñïðåññèîííûå êàññåòû ãåíîâ SWA2 è GAM1. Ñðåäè êîë- ëåêöèè ïîëó÷åííûõ òðàíñôîðìàíòîâ îòîáðàí øòàìì, ñîäåðæàùèé 8 êîïèé ýòîé ïëàçìèäû. Øòàìì ôîðìèðîâàë íàèáîëüøóþ çîíó ïðî- ñâåòëåíèÿ êðàõìàëà. Ýôôåêòèâíîñòü àëêîãîëü- íîé ôåðìåíòàöèè êðàõìàëà áûëà òàêæå ñóùåñò- âåííî óëó÷øåíà. Êîëè÷åñòâî ñèíòåçèðîâàííî- ãî ýòàíîëà äîñòèãàëî 6,5 ã/ë, ÷òî áîëåå ÷åì â äâà ðàçà ïðåâûøàåò ýôôåêòèâíîñòü àëêîãîëü- íîé ôåðìåíòàöèè øòàììà, ñîäåðæàùåãî ãåíû SWA2 è GAM1 â îäíîé êîïèè. Äîïîëíèòåëü- íîå óñèëåíèå ýêñïðåññèè ãåíà PDC1 (êîäèðóåò ïèðóâàòäåêàðáîêñèëàçó) ïîâûøàëî ýôôåêòèâ- íîñòü àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êðàõìàëà äî 9–10 ã/ë [62]. -1,4-Êñèëàí ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ãåòåðîãåí- íûé ïîëèñàõàðèä, ïðèñóòñòâóþùèé â êëåòî÷- íîé ñòåíêå ðàñòåíèé. Ìîíîìåðû êñèëîçû, îáúå- äèíåííûå -1,4-ñâÿçÿìè, ÿâëÿþòñÿ îñíîâîé öå- ïè, ê êîòîðîé ïðèñîåäèíÿþòñÿ äðóãèå ñàõàðà [63]. Ãèäðîëèç êñèëàíà êàòàëèçèðóþò ýíäî- - 1,4-êñèëàíàçà (EC 3.2.1.8) è -D-êñèëîçèäàçà (ÅÑ 3.2.1.37). Ýíäî- -êñèëàíàçà êàòàëèçèðóåò ãèäðîëèòè÷åñêîå ðàñùåïëåíèå 1,4- -êñèëîçèä- íûõ ñâÿçåé êñèëàíà è êñèëîîëèãîñàõàðèäîâ. -D-Êñèëîçèäàçà ãèäðîëèçèðóåò êñèëîîëèãîñà- õàðèäû äî D-êñèëîçû [64]. Ãðèáû ðîäà Tricho- derma ñåêðåòèðóþò áîëüøîå êîëè÷åñòâî êñè- ëàíîëèòè÷åñêèõ ôåðìåíòîâ. Õîðîøî èçâåñòåí ñâîåé öåëëþëîëèòè÷åñêîé è êñèëàíîëèòè÷åñ- êîé àêòèâíîñòüþ íèò÷àòûé ìåçîôèëüíûé ãðèá Trichoderma reesei [63]. Èç íåãî âûäåëåíî äâå îñíîâíûå ýíäîêñèëàíàçû – Xyn1ð è Xyn2ð. Ïðè êóëüòèâèðîâàíèè Ò. reesei íà êñèëàíå Xyn2ð ñîñòàâëÿåò áîëåå 50 % îáùåãî êîëè- ÷åñòâà êñèëàíîëèòè÷åñêèõ ôåðìåíòîâ. Ïðåä- ñòàâèòåëè ñåìåéñòâà Aspergillus òàêæå ÿâëÿ- þòñÿ ýôôåêòèâíûìè ïðîäóöåíòàìè öåëëþëî- ëèòè÷åñêèõ è êñèëàíîëèòè÷åñêèõ ôåðìåíòîâ. Óñïåøíàÿ ýêñïðåññèÿ ãåíà xlnD A. niger â ïå- êàðñêèõ äðîææàõ îáåñïå÷èâàëà ñèíòåç ñåêðå- òîðíîé ôîðìû -D-êñèëîçèäàçû [64]. Áîëåå òîãî, ñ ïîìîùüþ êîýêñïðåññèè ýíäî- -1,4-êñè- ëàíàçû Ò. reesei è -D-êñèëîçèäàçû A. niger ñêîíñòðóèðîâàí ðåêîìáèíàíòíûé øòàìì ïå- êàðñêèõ äðîææåé, ñáðàæèâàþùèé êñèëàí [64]. Äëÿ ñîçäàíèÿ øòàììîâ H. polymorpha, ñáðà- æèâàþùèõ êñèëàí, ñêîíñòðóèðîâàíà èíòåãðà- òèâíàÿ ïëàçìèäà, ñîäåðæàùàÿ ãåíû XYN2 T. reesei (êîäèðóåò ñåêðåòîðíóþ ýíäîêñèëàíàçó) è xlnD A. niger (êîäèðóåò ñåêðåòîðíóþ -êñè- ëîçèäàçó) ïîä êîíòðîëåì ñèëüíîãî êîíñòèòó- òèâíîãî ïðîìîòîðà GAPDH. Ïîñëå òðàíñôîð- ìàöèè ýòîé ïëàçìèäîé ïðîâîäèëè ñêðèíèíã òðàíñôîðìàíòîâ H. polymorpha, àíàëèçèðóÿ ðàç- ìåð ãàëî íà ñðåäå ñ äîáàâëåíèåì êñèëàíà èëè ï-íèòðîôåíèë- -D-êñèëîçèäà. Îïðåäåëÿëè òàê- æå óäåëüíóþ àêòèâíîñòü ýòèõ ôåðìåíòîâ, êî- òîðàÿ êîððåëèðîâàëà ñ ðàçìåðîì ãàëî. Ñêîíñò- ðóèðîâàííûå øòàììû ïðèîáðåòàëè ñïîñîáíîñòü ôåðìåíòèðîâàòü êñèëàí äî ýòàíîëà. Êîëè÷åñòâî ñèíòåçèðîâàííîãî ýòàíîëà ñîñòàâëÿëî 0,35 ã/ë ïðè 37 è 48 ºC [62]. Â ðåçóëüòàòå ïðîâåäåííîé ðàáîòû ñêîíñò- ðóèðîâàíû øòàììû H. polymorpha, îáëàäàþùèå ñïîñîáíîñòüþ ïðÿìîé ìèêðîáíîé êîíâåðñèè êðàõìàëà è êñèëàíà â ýòàíîë. Ñêîíñòðóèðîâàí- íûå ðåêîìáèíàíòíûå øòàììû ÿâëÿþòñÿ ÷ðåç- âû÷àéíî ïåðñïåêòèâíûìè äëÿ äàëüíåéøåãî óëó÷øåíèÿ ïàðàìåòðîâ àëêîãîëüíîé ôåðìåí- òàöèè óãëåâîäíûõ ïîëèìåðîâ è ñîçäàíèÿ ñîîò- âåòñòâóþùåé ïðîìûøëåííîé òåõíîëîãèè ïðÿ- ìîé ìèêðîáíîé êîíâåðñèè, ÿâëÿþùåéñÿ, ïî- âèäèìîìó, íàèáîëåå ýôôåêòèâíîé òåõíîëîãèåé àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè áèîïîëèìåðîâ. Влияние глутатиона на эффективность алкогольной ферментации H. polymorpha Ãëóòàòèîí ( -L-ãëóòàìèë-L-öèñòåèíèë-ãëè- öèí, GSH) – áèîëîãè÷åñêè àêòèâíîå âåùå- ñòâî ïåïòèäíîé ïðèðîäû, èãðàþùåå âàæíóþ ðîëü â øèðîêîì ñïåêòðå êëåòî÷íûõ ðåàêöèé [66]. Àíòèîêñèäàíòíûå ñâîéñòâà ýòîãî ñîåäè- íåíèÿ îïðåäåëÿþò åãî ðîëü â ïîääåðæàíèè âíóòðèêëåòî÷íîãî ðåäîêñ-ñòàòóñà. Çà ñ÷åò ïðè- ñóòñòâèÿ ñóëüôãèäðèëüíûõ (òèîëîâûõ) ãðóïï GSH â êëåòêå âûñòóïàåò êàê äîíîð ýëåêòðîíîâ è îáåñïå÷èâàåò ïðîòåêàíèå ðåàêöèé âîññòàíîâ- ëåíèÿ, ïðè ýòîì îí ïåðåõîäèò â îêèñëåííóþ ôîðìó (GSSG). Êðîìå ïîääåðæàíèÿ òèîëîâîãî ðåäîêñ-ñòàòóñà, ãëóòàòèîí ó÷àñòâóåò â äåòîê- ñèêàöèè ýíäîãåííûõ è ýêçîãåííûõ ðåàêòèâíûõ ìåòàëëîâ è êñåíîáèîòèêîâ. Òàêèì îáðàçîì, GSH èãðàåò âàæíóþ ðîëü â îòâåòå êëåòêè íà îêñèäàòèâíûé ñòðåññ ïóòåì äåòîêñèêàöèè âå- ùåñòâ ñâîáîäíîðàäèêàëüíîé ïðèðîäû. Èçâåñò- íî, ÷òî ïðè àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè ñèíòå- çèðîâàííûé ýòàíîë òàêæå âûçûâàåò îêñèäà- òèâíûé ñòðåññ äðîææåâûõ êëåòîê [67], ÷òî 16 Ê.Â. Äìèòðóê, À.À. Ñèáèðíûé ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 â ñâîþ î÷åðåäü ìîæåò îãðàíè÷èâàòü ýôôåê- òèâíîñòü àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè. Äëÿ èñ- ñëåäîâàíèÿ âëèÿíèÿ GSH â êà÷åñòâå êëþ÷å- âîãî ôàêòîðà â ìåõàíèçìàõ ñòðåññîâîãî îò- âåòà íà ýôôåêòèâíîñòü àëêîãîëüíîé ôåðìåí- òàöèè ó äðîææåé H. polymorpha ñêîíñò- ðóèðîâàíû ðåêîìáèíàíòíûå øòàììû ñ óñè- ëåííîé ýêñïðåññèåé ãåíîâ GSH2 (êîäèðóåò - ãëóòàìèëöèñòåèíèëñèíòàçó) [68] è MET4 (êî- äèðóåò òðàíñêðèïöèîííûé àêòèâàòîð ìåòàáî- ëèçìà ñåðû) [69]. Øòàììû, ñâåðõýêñïðåññèðóþ- ùèå GSH2 è MET4, íàêàïëèâàëè îêîëî 14 íÌ GSH â ïåðåñ÷åòå íà 1 ìã ñóõîãî âåñà äðîææå- âîé áèîìàññû. Ñèíòåç æå ãëóòàòèîíà ó èñõîä- íîãî øòàììà ñîñòàâëÿë 9 íÌ/ìã. Ïîâûøåíèå âíóòðèêëåòî÷íîé êîíöåíòðàöèåé GSH õîðî- øî êîððåëèðîâàëî ñ óñèëåíèåì ýôôåêòèâíî- ñòè àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè. Ñèíòåç ýòàíî- ëà øòàììàìè ñ óñèëåííîé ýêñïðåññèåé ãåíîâ GSH2 è MET4 äîñòèãàë 19 è 17 ã/ë ñîîòâåòñò- âåííî, òîãäà êàê èñõîäíûé øòàìì ñèíòåçèðîâàë ëèøü 7 ã/ë. Òàêèì îáðàçîì áûëî äîñòèãíóòî 2,7- è 2,4-êðàòíîå ïîâûøåíèå ýôôåêòèâíîñòè àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè ãëþêîçû (ðèñ. 2). Óñèëåíèå æå ýêñïðåññèè ãîìîëîãè÷íîãî ãåíà GSH1 (êîäèðóåò -ãëóòàìèëöèñòåèíèëñèíòàçó) â ñèñòåìå S. cerevisiae íå îêàçûâàëî âëèÿíèÿ íà ýôôåêòèâíîñòü àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè ãëþêîçû. Èíòåðåñíûì îêàçàëñÿ òîò ôàêò, ÷òî ïðîàíàëèçèðîâàííûå øòàììû H. polymorpha ïðè ôåðìåíòàöèè êñèëîçû ïîâûøåííûõ êîëè- ÷åñòâ ýòàíîëà íå ñèíòåçèðîâàëè. Ðåêîìáèíàíò- íûå øòàììû äðîææåé H. polymorpha è S. ce- revisiae ñ ïîâûøåííûì âíóòðèêëåòî÷íûì ïó- ëîì GSH îêàçàëèñü áîëåå ÷óâñòâèòåëüíûìè ê ýêçîãåííîìó ýòàíîëó â ñðàâíåíèè ñ ñîîòâåò- ñòâóþùèìè ðîäèòåëüñêèìè øòàììàìè. Òàêèì îáðàçîì, ãëóòàòèîí ñòèìóëèðóåò àëêîãîëüíóþ ôåðìåíòàöèþ ãëþêîçû äðîææåé H. polymor- pha, îäíàêî ìåõàíèçìû ýòîãî ôåíîìåíà òðåáó- þò äàëüíåéøèõ èññëåäîâàíèé [70]. Влияние некоторых пероксисомных ферментов на эффективность алкогольной ферментации H. polymorpha Ïåðîêñèñîìû – âíóòðèêëåòî÷íûå îðãàíåë- ëû, îêðóæåííûå îäíîñëîéíîé áåëêîâî-ëèïèä- íîé ìåìáðàíîé, ïðèñóùè ïðàêòè÷åñêè âñåì ýóêàðèîòàì. Ýòè îðãàíåëëû, êàê ïðàâèëî, ñî- äåðæàò ôåðìåíòû -îêèñëåíèÿ æèðíûõ êèñëîò, àöèë-ÊîÀ îêñèäàçû è êàòàëàçó, âûïîëíÿÿ æèç- íåííî âàæíóþ ôóíêöèþ – ðàçëîæåíèå Í2Î2 äî âîäû è êèñëîðîäà. Ó äðîææåé ôóíêöèè ïåðîêñèñîì ñóùåñòâåííû, â ÷àñòíîñòè, äëÿ ïåð- âè÷íîãî ìåòàáîëèçìà ìåòàíîëà èëè í-àëêàíîâ, ÷òî äåëàåò ýòè îðãàíåëëû ïðèâëåêàòåëüíûìè â áèîòåõíîëîãè÷åñêîì àñïåêòå. Íàðóøåíèå áèî- ãåíåçà ýòèõ îðãàíåëë ó äðîææåé H. polymorpha óõóäøàåò ðîñò è ñíèæàåò ýôôåêòèâíîñòü àëêî- ãîëüíîé ôåðìåíòàöèè íà ñðåäå ñ êñèëîçîé â êà÷åñòâå èñòî÷íèêà óãëåðîäà (íåîïóáëèêîâàí- íûå äàííûå). Ïðè íàðóøåíèè áèîãåíåçà ïåðîê- ñèñîì ïðèñóùèå èì ôåðìåíòû äåëîêàëèçè- ðóþòñÿ, òåðÿÿ ïðè ýòîì ñâîþ àêòèâíîñòü. Ïðåä- ëîæåíà ãèïîòåçà, ñîãëàñíî êîòîðîé óñèëåíèå Ðèñ. 2. Àëêîãîëüíàÿ ôåðìåíòàöèÿ øòàììà äèêîãî òèïà (WT) H. polymorpha DL-1 è ðåêîìáèíàíòíûõ øòàììîâ, ñâåðõïðîäóöèðóþùèõ ãëóòàòèîí (mcHpGSH2 è mcHpMET4) ïðè êóëüòèâèðîâàíèè íà ñðåäå ñ äî- áàâëåíèåì 4 % ãëþêîçû â óñëîâèÿõ îãðàíè÷åííîé àýðàöèè (â ôåðìåíòåðå) ïðè òåìïåðàòóðå 37 ºC: ïî âåðòèêàëè – ñèíòåç ýòàíîëà, ã/ë (à) è ãëóòàòèîíà íÌ/ìã ñóõîé ìàññû (á); ïî ãîðèçîíòàëè – âðåìÿ èíêóáàöèè, ÷. Ïðåäñòàâëåíû óñðåäíåííûå ðåçóëü- òàòû òðåõ íåçàâèñèìûõ ýêñïåðèìåíòîâ 17 Ìåòàáîëè÷åñêàÿ èíæåíåðèÿ äðîææåé Hansenula polymorpha ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 ýêñïðåññèè ãåíîâ, êîäèðóþùèõ ïåðîêñèñîìíûå ôåðìåíòû äèãèäðîêñèàöåòîíñèíòàçó (ÄÀÑ, ïå- ðîêñèñîìíàÿ òðàíñêåòîëàçà, ó÷àñòâóþùàÿ â àñ- ñèìèëÿöèè ôîðìàëüäåãèäà) è òðàíñàëüäîëàçó (ÒÀË, ôóíêöèÿ ïåðîêñèñîìíîé òðàíñàëüäîëà- çû íå óñòàíîâëåíà), ïðèâåäåò ê óëó÷øåíèþ ïà- ðàìåòðîâ àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êñèëîçû. Ñðåäè âñåõ ïåðîêñèñîìíûõ ôåðìåíòîâ ëèøü ÄÀÑ è, âîçìîæíî, ÒÀË íåïîñðåäñòâåííî âîâ- ëå÷åíû â ìåòàáîëèçì ïðîèçâîäíûõ êñèëîçû. ÄÀÑ êàòàëèçèðóåò êîíäåíñàöèþ êñèëóëîçî- 5-ôîñôàòà è ôîðìàëüäåãèäà ñ îáðàçîâàíèåì ãëèöåðàëüäåãèä-3-ôîñôàòà è äèãèäðîêñèàöå- òîíà. Íåëüçÿ èñêëþ÷èòü òàêæå âîâëå÷åíèå ÄÀÑ â êà÷åñòâå íåñïåöèôè÷åñêîé òðàíñêåòî- ëàçû (ÒÊË) â íåîêèñëèòåëüíîé ÷àñòè ïåíòî- çîôîñôàòíîãî ïóòè. ÒÀË êàòàëèçèðóåò êîíäåí- ñàöèþ ñåäîãåïòóëîçî-7-ôîñôàòà è ãëèöåðàëü- äåãèä-3-ôîñôàòà ñ îáðàçîâàíèåì ýðèòðîçî-4- ôîñôàòà è ôðóêòîçî-6-ôîñôàòà. Â íîðìå ýòà ðåàêöèÿ ïðîèñõîäèò â öèòîçîëå, êàêîâà æå ôóíêöèÿ ïåðîêñèñîìíîãî ôåðìåíòà, êàê óêà- çûâàëîñü âûøå, íå óñòàíîâëåíî. Ïðîäóêòû îáå- èõ ðåàêöèé, ãëèöåðàëüäåãèä-3-ôîñôàò è ôðóê- òîçî-6-ôîñôàò, ÿâëÿþòñÿ òàêæå ìåòàáîëèòàìè ãëèêîëèçà (ðèñ. 1). Óâåëè÷åíèå èõ êîíöåíòðà- öèè âñëåäñòâèå äåðåïðåññèè ÄÀÑ è ÒÀË ìîæåò ñòèìóëèðîâàòü àëêîãîëüíóþ ôåðìåíòàöèþ êñè- ëîçû. Ñêîíñòðóèðîâàíû ðåêîìáèíàíòíûå øòàì- ìû H. polymorpha ñ óñèëåííîé ýêñïðåññèåé ãå- íîâ DAS1 è TAL2, êîäèðóþùèõ ïåðîêñèñî- ìàëüíûå äèãèäðîêñèàöåòîíñèíòàçó è òðàíñàëü- äîëàçó ñîîòâåòñòâåííî. Ýôôåêòèâíîñòü ñáðàæè- âàíèÿ êñèëîçû ó øòàììîâ ñ îäíîâðåìåííûì óñèëåíèåì ýêñïðåññèè DAS1 è TAL2 ñóùåñò- âåííî óâåëè÷èâàëàñü ïî ñðàâíåíèþ ñî øòàì- ìàìè, ó êîòîðûõ äåðåïðåññèðîâàí ëèøü îäèí èç ýòèõ ôåðìåíòîâ. Ïðîäóêöèÿ ýòàíîëà ðåêîì- áèíàíòíûìè øòàììàìè áîëåå ÷åì â äâà ðàçà ïðåâûøàëà êîëè÷åñòâî ýòàíîëà, îáðàçóåìîãî èñõîäíûì øòàììîì. Âàæíî îòìåòèòü, ÷òî ïðè äåðåïðåññèè ãåíà TAL1, êîäèðóþùåãî öèòî- ïëàçìàòè÷åñêóþ òðàíñàëüäîëàçó, óâåëè÷åíèÿ ýô- ôåêòèâíîñòè àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êñè- ëîçû íå íàáëþäàëîñü. Ïåðîêñèñîìàëüíûå ôåð- ìåíòû ÄÀÑ è ÒÀË âîâëå÷åíû â ïðîöåññ àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êñèëîçû ó H. poly- morpha, îäíàêî ôóíêöèè ïåðîêñèñîì ïðè àëêî- ãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êñèëîçû òðåáóþò äàëü- íåéøåãî èçó÷åíèÿ. Ãåí VPS34 H. polymorpha, êîäèðóþùèé ôîñ- ôàòèäèëèíîçèòîë-3-êèíàçó, âîâëå÷åí â ýíäî- öèòîç è âàêóîëÿðíûé ñîðòèíã áåëêîâ. Ìóòàíò vps34 H. polymorpha íå ñïîñîáåí ê ñåëåêòèâ- íîé äåãðàäàöèè ïåðîêñèñîì [71]. Ýôôåêòèâ- íîñòü àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè ãëþêîçû øòàì- ìà vps34 H. polymorpha óâåëè÷èâàëàñü â 1,7 ðàçà â ñðàâíåíèè ñî øòàììîì äèêîãî òèïà [70], ÷òî òàêæå ñâèäåòåëüñòâóåò î âîâëå÷åíèè ïåðîêñèñîì â ïðîöåññå àëêîãîëüíîé ôåðìåí- òàöèè óãëåðîäíûõ ñóáñòðàòîâ. Перспективы Ìîæíî íàäåÿòüñÿ, ÷òî äàëüíåéøàÿ ðàáîòà â îáëàñòè ìåòàáîëè÷åñêîé èíæåíåðèè äðîææåé H. polymorpha ïîçâîëèò ñêîíñòðóèðîâàòü øòàì- ìû, êîòîðûå ïî ïàðàìåòðàì àëêîãîëüíîé ôåð- ìåíòàöèè êñèëîçû áóäóò ïðåâîñõîäèòü âñå èç- âåñòíûå íà ñåãîäíÿ øòàììû ìèêðîîðãàíèçìîâ. Ïåðñïåêòèâíûìè íàïðàâëåíèÿìè óëó÷øåíèÿ ïàðàìåòðîâ àëêîãîëüíîé ôåðìåíòàöèè êñèëîçû H. polymorpha ñëåäóåò ðàññìàòðèâàòü íà÷àëü- íûå ýòàïû êàòàáîëèçìà êñèëîçû, à òàêæå òðàíñ- ïîðò ýòîé ïåíòîçû â êëåòêó, àìïëèôèêàöèþ ëèìèòèðóþùèõ ãåíîâ ãëèêîëèçà è ïåíòîçî- ôîñôàòíîãî ïóòè, ãåíîâ, îïðåäåëÿþùèõ óñòîé- ÷èâîñòü ê ïîâûøåííîé òåìïåðàòóðå è ýòàíîëó. Ìàêñèìàëüíàÿ òåìïåðàòóðà ôåðìåíòàöèè H. polymorpha (48 ºÑ) äîëæíà îáåñïå÷èòü ïðîâåäå- íèå ïðîöåññà ÎÎÔ ãëþêîçû è êñèëîçû, ïîñ- êîëüêó ýòà òåìïåðàòóðà áëèçêà ê îïòèìàëüíîé äëÿ äåéñòâèÿ öåëëþëàç è ãåìèöåëëþëàç. Íå- äîñòàòêîì H. polymorpha ÿâëÿåòñÿ íåñïîñîá- íîñòü ôåðìåíòèðîâàòü ãàëàêòîçó è L-àðàáèíî- çó (ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî â êîëëåêöèè ìèêðî- îðãàíèçìîâ Èíñòèòóòà áèîëîãèè êëåòêè ÍÀÍ Óêðàèíû èäåíòèôèöèðîâàí øòàìì H. poly- morpha, ðàñòóùèé â ñðåäå ñ L-àðàáèíîçîé, îäíàêî íå ñáðàæèâàþùèé ýòîò ñàõàð). Ïîýòî- ìó çàäàíèåì áóäóùåé ðàáîòû äîëæíî ñòàòü ââåäåíèå â ýòîò îðãàíèçì ãåíîâ èç äðóãèõ ìèêðîîðãàíèçìîâ, ÷òî îáåñïå÷èò àêòèâíóþ ôåðìåíòàöèþ âñåõ îñíîâíûõ ñàõàðîâ ëèãíî- öåëëþëîçû. Ïîêà ÷òî ñîâåðøåííî íå èçó÷åííîé ÿâëÿåòñÿ óñòîé÷èâîñòü H. polymorpha ê òîê- ñè÷åñêèì ïðîäóêòàì (àëüäåãèäû, ôåíîëû, óê- ñóñíàÿ è ìóðàâüèíàÿ êèñëîòû), íàêàïëèâàþ- ùèåñÿ â ãèäðîëèçàòàõ ëèãíîöåëëþëîçû â óñ- ëîâèÿõ êèñëîòíîãî ãèäðîëèçà. Âïðî÷åì, â óñ- ëîâèÿõ ôåðìåíòàòèâíîãî ãèäðîëèçà êîëè÷åñò- 18 Ê.Â. Äìèòðóê, À.À. Ñèáèðíûé ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 âî òàêèõ òîêñè÷åñêèõ ïðîäóêòîâ ìîæåò áûòü ñâåäåíî ê ìèíèìóìó. Ðàáîòà âûïîëíåíà â ðàìêàõ ïðîåêòà ¹ 9-11 öåëåâîé êîìïëåêñíîé ïðîãðàììû íàó÷íûõ èññëå- äîâàíèé ÍÀÍ Óêðàèíû «Áèîìàññà êàê òîïëèâíîå ñûðüå» («Áèîòîïëèâà»), à òàêæå ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå ÓÍÒÖ-5505. K.V. Dmytruk, A.A. Sibirny Institute of Cell Biology, NAS of Ukraine, Lviv, Ukraine Rzeszow University, Poland E-mail: sibirny@cellbiol.lviv.ua METABOLIC ENGINEERING OF YEAST HANSENULA POLYMORPHA FOR CONSTRUCTION OF EFFICIENT ETHANOL PRODUCERS Until recently, the methylotrophic yeast was not con- sidered as a potential producer of biofuels, particularly of ethanol from lignocellulosic hydrolysates. The first work published 10 years ago reveals the ability of thermotolerant methylotrophic yeast Hansenula polymorpha to ferment xylose – one of the main sugars of lignocellulosic hydrolysates, which has made these yeast promising organism for high temperature alcoholic fermentation. Such feature of the H. polymorpha can be used in the implementation of potentially effective process of simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of raw materials. SSF allows combining enzymatic hydrolysis of raw materials with the conversion of produced sugars into ethanol: enzymes hydrolyze polysaccharides to monomers, which are immediately consumed by microorganisms-producers of ethanol. However, the efficiency of alcoholic fermentation of major sugars realized after hydrolysis of lignocellulosic raw materials, and especially xylose, by wild strains of H. polymorpha requires significant improvement. In this review the main results of metabolic engineering of H. polymorpha for the construction of improved producers of ethanol from xylose, starch, xylan, and glycerol, as well as strains with increased tolerance to high temperature and ethanol are represented. Ê.Â. Äìèòðóê, À.À. Ñèá³ðíèé ÌÅÒÀÁÎË²×ÍÀ ²ÍÆÅÍÅÐ²ß ÄÐ²ÆÄÆ²Â HANSENULA POLYMORPHA ÄËß ÑÒÂÎÐÅÍÍß ÅÔÅÊÒÈÂÍÈÕ ÏÐÎÄÓÖÅÍÒ²Â ÅÒÀÍÎËÓ Äî íåäàâíüîãî ÷àñó í³õòî íå ðîçãëÿäàâ ìåòèëî- òðîôí³ äð³æäæ³ ÿê ïîòåíö³éíèé ïðîäóöåíò á³î- ïàëèâà, çîêðåìà, á³îåòàíîëó ç ã³äðîë³çàò³â ë³ãíî- öåëþëîçè. Äåñÿòü ðîê³â òîìó áóëî îïóáë³êîâàíî ïåð- øó ðîáîòó, ÿêà ðîçêðèâàº çäàòí³ñòü òåðìîòîëåðàíò- íèõ ìåòèëîòðîôíèõ äð³æäæ³â Hansenula polymorpha çáðîäæóâàòè îäèí ç îñíîâíèõ öóêð³â ë³ãíîöåëþ- ëîçè – êñèëîçó, ùî ïåðåòâîðèëî ö³ äð³æäæ³ íà ïåðñ- ïåêòèâíèé îðãàí³çì äëÿ ïðîâåäåííÿ âèñîêî- òåìïåðàòóðíî¿ àëêîãîëüíî¿ ôåðìåíòàö³¿. Òàêà îñîá- ëèâ³ñòü äð³æäæ³â H. polymorpha ìîæå áóòè âè- êîðèñòàíà ó ïîòåíö³éíî åôåêòèâíîìó ïðîöåñ³ îäíî- ÷àñíîãî îöóêðþâàííÿ òà ôåðìåíòàö³¿ (ÎÎÔ) ñè- ðîâèíè. ÎÎÔ äîçâîëÿº ïîºäíàòè ôåðìåíòàòèâíèé ã³äðîë³ç ñèðîâèíè ç êîíâåðñ³ºþ óòâîðåíèõ öóêð³â â åòàíîë: ôåðìåíòè ã³äðîë³çóþòü ïîë³ñàõàðèäè äî ìîíîìåðíèõ öóêð³â, ÿê³ ñïîæèâàþòüñÿ ì³êðî- îðãàí³çìàìè – ïðîäóöåíòàìè åòàíîëó. Îäíàê åôåê- òèâí³ñòü àëêîãîëüíî¿ ôåðìåíòàö³¿ äèêèìè øòàìà- ìè H. polymorpha îñíîâíèõ öóêð³â – ïðîäóê- ò³â ã³äðîë³çó ë³ãíîöåëþëîçíî¿ ñèðîâèíè, òà îñîá- ëèâî êñèëîçè, ïîòðåáóº ³ñòîòíîãî ïîêðàùåííÿ. Â ïðåäñòàâëåíîìó îãëÿä³ âèêëàäåíî îñíîâí³ ðåçóëüòà- òè â ãàëóç³ ìåòàáîë³÷íî¿ ³íæåíåð³¿ H. polymorpha äëÿ êîíñòðóþâàííÿ ïðîäóöåíò³â åòàíîëó ç êñèëîçè, êðîõìàëþ, êñèëàíó òà ãë³öåðèíó, à òàêîæ øòàì³â ç ï³äâèùåíîþ òîëåðàíòí³ñòþ äî âèñîêî¿ òåìïåðàòóðè òà åòàíîëó. ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ 1. Ryabova O.B., Chmil O.M., Sibirny A.A. Xylose and cellobiose fermentation to ethanol by the thermotol- erant methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // FEMS Yeast Res. – 2003. – 3. – P. 157–164. 2. Schubert C. Can biofuels finally take center stage? // Nat. Biotechnol. – 2006. – 24, ¹ 7. – P. 777–784. 3. Hahn-Hägerdal B., Galbe M., Gorwa-Grauslund M.F. et al. Bio-ethanol – the fuel of tomorrow from the residues of today // Trends Biotechnol. – 2006. – 24, ¹ 12. – P. 549–556. 4. Hill J., Nelson E., Tilman D. et al. Environmental, economic, and energetic costs and benefits of bio- diesel and ethanol biofuels // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 2006. – 103, ¹ 30. – P. 11206–11210. 5. Olofsson K., Bertilsson M., Lidén G. A short review on SSF – an interesting process option for ethanol production from lignocellulosic feedstocks // Bio- technol. Biofuels. – 2008. – 1, ¹ 1. – P. 7. 6. Abdel-Banat B.M., Hoshida H., Ano A. et al. High- temperature fermentation: how can processes for ethanol production at high temperatures become superior to the traditional process using mesophilic yeast? // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2010. – 85, ¹ 4. – P. 861–867. 7. Ishchuk O.P., Voronovsky A.Y., Abbas C.A., Sibirny A.A. Construction of Hansenula polymorpha strains with improved thermotolerance // Biotechnol. Bioeng. – 2009. – 104, ¹ 5. – P. 911–919. 8. Du Preez J.C., van der Walt J.P. Fermentation of D- xylose to ethanol by a strain of Candida shehatae // Biotechnol. Lett. – 1983. – 5. – P. 357–362. 9. Toivola A., Yarrow D., van den Bosch E. et al. Al- 19 Ìåòàáîëè÷åñêàÿ èíæåíåðèÿ äðîææåé Hansenula polymorpha ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 coholic fermentation of D-xylose by yeasts // Appl. Environ. Microbiol. – 1984. – 47, ¹ 6. – P. 1221– 1223. 10. Du Preez J.C., Bosch M., Bernard A. Prior xylose fermentation by Candida shehatae and Pichia stipitis: effects of pH, temperature and substrate concentra- tion // Enzyme and Microbial Technology. – 1986. – 8, ¹ 6. – P. 360–364. 11. Jeffries T.W., Jin Y.-S. Metabolic engineering for im- proved fermentation of pentoses by yeasts // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2004. – 63. – P. 495–509. 12. Zeng Q.K., Du H.L., Wang J.F. et al. Reversal of coenzyme specificity and improvement of catalytic efficiency of Pichia stipitis xylose reductase by ratio- nal site-directed mutagenesis // Biotechnol. Lett. – 2009. – 31, ¹ 7. – P. 1025–1029. 13. Matsushika A., Inoue H., Kodaki T., Sawayama S. Ethanol production from xylose in engineered Sac- charomyces cerevisiae strains: current state and per- spectives // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2009. – 84, ¹ 1. – P. 37–53. 14. Brat D., Boles E., Wiedemann B. Functional expres- sion of a bacterial xylose isomerase in Saccharomyces cerevisiae // Appl. Environ. Microbiol. – 2009. – 75, ¹ 8. – P. 2304–2311. 15. Kuyper M., Hartog M.M., Toirkens M.J. et al. Meta- bolic engineering of a xylose-isomerase-expressing Saccharomyces cerevisiae strain for rapid anaerobic xylose fermentation // FEMS Yeast Res. – 2005. – 5. – P. 399–409. 16. Jeffries T.W., Shi N.Q. Disruption of the cytochrome c gene in the xylose-fermenting yeast // United States Patent. – 2000. – ¹ 6071729. 17. Shi N.Q., Cruz J., Sherman F., Jeffries T.W. SHAM- sensitive alternative respiration in the xylose-metab- olizing yeast Pichia stipites // Yeast. – 2002. – 19, ¹ 14. – P. 1203–1220. 18. Hahn-Hägerdal B., Karhumaa K., Fonseca C. et al. Towards industrial pentose-fermenting yeast strains // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2007. – 74, ¹ 5. – P. 937–953. 19. Wisselink H.W., Toirkens M.J., Wu Q. et al. Novel evolutionary engineering approach for accelerated utilization of glucose, xylose, and arabinose mixtures by engineered Saccharomyces cerevisiae strains // Appl. Environ. Microbiol. – 2009. – 75, ¹ 4. – P. 907–914. 20. Grabek-Lejko D., Ryabova O.B., Oklejewicz B. et al. Plate ethanol-screening assay for selection of the Pi- chia stipitis and Hansenula polymorpha yeast mutants with altered capability for xylose alcoholic fermenta- tion // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2006. – 33, ¹ 11. – P. 934–940. 21. Dmytruk O.V., Dmytruk K.V., Abbas C.A. et al. En- gineering of xylose reductase and overexpression of xylitol dehydrogenase and xylulokinase improves xylose alcoholic fermentation in the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha // Microb. Cell Fact. – 2008. – 23. – P. 7–21. 22. Dmytruk O.V., Voronovsky A.Y., Abbas C.A. et al. Overexpression of bacterial xylose isomerase and yeast host xylulokinase improves xylose alcoholic fermentation in the thermotolerant yeast Hansenula polymorpha // FEMS Yeast Res. – 2008. – 8. – P. 165–173. 23. Voronovsky A.Y., Ryabova O.B., Verba O.V. et al. Expression of xylA genes encoding xylose isomerases from Escherichia coli and Streptomyces coelicolor in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // FEMS Yeast Res. – 2005. – 5. – P. 1055–1062. 24. Pronk J.T., Yde Steensma H., Van Dijken J.P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae // Yeast. – 1996. – 12, ¹ 16. – P. 1607–1633. 25. Schaaff I., Heinisch J., Zimmermann F.K. Overpro- duction of glycolytic enzymes in yeast // Yeast. – 1989. – 5, ¹ 4. – P. 285–290. 26. van Hoek P., Flikweert M.T., van der Aart Q.J. et al. Effects of pyruvate decarboxylase overproduction on flux distribution at the pyruvate branch point in Sac- charomyces cerevisiae // Appl. Environ. Microbiol. – 1998. – 64, ¹ 6. – P. 2133–2140. 27. Ishchuk O.P., Voronovsky A.Y., Stasyk O.V. et al. Overexpression of pyruvate decarboxylase in the yeast Hansenula polymorpha results in increased ethanol yield in high-temperature fermentation of xylose // FEMS Yeast Res. – 2008. – 8, ¹ 7. – P. 1164– 1174. 28. Suwannarangsee S., Oh D.B., Seo J.W. et al. Char- acterization of alcohol dehydrogenase 1 of the ther- motolerant methylotrophic yeast Hansenula polymor- pha // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2010. – 88, ¹ 2. – P. 497–507. 29. Denis C.L., Ferguson J., Young E.T. mRNA levels for the fermentative alcohol dehydrogenase of Saccharo- myces cerevisiae decrease upon growth on a nonfer- mentable carbon source // J. Biol. Chem. – 1983. – 258. – P. 1165–1171. 30. Lutstorf U., Megnet R. Multiple forms of alcohol de- hydrogenase in Saccharomyces cerevisiae. 1. Physi- ological control of ADH-2 and properties of ADH-2 and ADH-4 // Arch. Biochem. Biophys. – 1968. – 126. – P. 933–944. 31. Cho J.-Y., Jeffries T.W. Pichia stipitis genes for alco- hol dehydrogenase with fermentative and respiratory functions // Appl. Environ. Microbiol. – 1998. – 64. – P. 1350–1358. 32. Passoth V., Schäfer B., Liebel B. et al. Molecular cloning of alcohol dehydrogenase genes of the yeast Pichia stipitis and identification of the fermentative ADH // Yeast. – 1998. – 14. – P. 1311–1325. 20 Ê.Â. Äìèòðóê, À.À. Ñèáèðíûé ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 33. Reinders A., Romano I., Wiemken A., De Virgilio C. The thermophilic yeast Hansenula polymorpha does not require trehalose synthesis for growth at high temperatures but does for normal acquisition of ther- motolerance // J. Bacteriol. – 1999. – 181, ¹ 15. – P. 4665–4668. 34. Kim J., Alizadeh P., Harding T. et al. Disruption of the yeast ATH1 gene confers better survival after dehydration, freezing, and ethanol shock: potential commercial applications // Appl. Environ. Micro- biol. – 1996. – 62, ¹ 5. – P. 1563–1569. 35. Londesborough J., Varimo K. Characterization of two trehalases in baker’s yeast // Biochem. J. – 1984. – 219, ¹ 2. – P. 511–518. 36. Nwaka S., Mechler B., Holzer H. Deletion of the ATH1 gene in Saccharomyces cerevisiae prevents growth on trehalose // FEBS Lett. – 1996. – 386, ¹ 2/3. – P. 235–238. 37. Parrou J.L., Jules M., Beltran G., François J. Acid trehalase in yeasts and filamentous fungi: localiza- tion, regulation and physiological function // FEMS Yeast Res. – 2005. – 5, ¹ 6/7. – P. 503–511. 38. Jung Y.J., Park H.D. Antisense-mediated inhibition of acid trehalase (ATH1) gene expression promotes ethanol fermentation and tolerance in Saccharo- myces cerevisiae // Biotechnol. Lett. – 2005. – 27, ¹ 23/24. – P. 1855–1859. 39. Haslbeck M., Franzmann T., Weinfurtner D., Buchner J. Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins // Nat. Struct. Mol. Biol. – 2005. – 12, ¹ 10. – P. 842–846. 40. Kitagawa M., Miyakawa M., Matsumura Y., Tsuchido T. Escherichia coli small heat shock proteins, IbpA and IbpB, protect enzymes from inactivation by heat and oxidants // Eur. J. Biochem. – 2002. – 269, ¹ 12. – P. 2907–2917. 41. Yoshida J., Tani T. Hsp16p is required for thermo- tolerance in nuclear mRNA export in fission yeast Schizosaccharomyces pombe // Cell Struct. Funct. – 2005. – 29, ¹ 5/6. – P. 125–138. 42. Haslbeck M., Braun N., Stromer T. et al. Hsp42 is the general small heat shock protein in the cytosol of Saccharomyces cerevisiae // EMBO J. – 2004. – 23, ¹ 3. – P. 638-649. 43. Cashikar A.G., Duennwald M., Lindquist S.L. A chap- erone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactiva- tion by Hsp104 // J. Biol. Chem. – 2005. – 280, ¹ 25. – P. 23869–23875. 44. Weibezahn J., Tessarz P., Schlieker C. et al. Ther- motolerance requires refolding of aggregated proteins by substrate translocation through the central pore of ClpB // Cell. – 2004. – 119, ¹ 5. – P. 653–665. 45. Lindquist S., Kim G. Heat-shock protein 104 ex- pression is sufficient for thermotolerance in yeast // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1996. – 93, ¹ 11. – P. 5301–5306. 46. Parsell D.A., Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reacti- vation of damaged proteins // Ann. Rev. Genet. – 1993. – 27. – P. 437–496. 47. Guerra E., Chye P.P., Berardi E., Piper P.W. Hypoxia abolishes transience of the heat-shock response in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // Mi- crobiology. – 2005. – 151, ¹ 3. – P. 805–811. 48. Pugh D.J., Ab E., Faro A. et al. DWNN, a novel ubiquitin-like domain, implicates RBBP6 in mRNA processing and ubiquitin-like pathways // BMC Struct. Biol. – 2006. – 5. – P. 6:1. 49. Weissman A.M. Themes and variations on ubiquity- lation // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2001. – 2, ¹ 3. – P. 169–178. 50. Passmore L.A., Barford D. Getting into position: the catalytic mechanisms of protein ubiquitylation // Biochem. J. – 2004. – 379, ¹ 3. – P. 513–525. 51. Cardona F., Aranda A., del Olmo M. Ubiquitin li- gase Rsp5p is involved in the gene expression changes during nutrient limitation in Saccharomyces cerevi- siae // Yeast. – 2009. – 26, ¹1. – P. 1–15. 52. Costa V., Amorim M.A., Reis E. et al. Mitochondrial superoxide dismutase is essential for ethanol toler- ance of Saccharomyces cerevisiae in the post-diaux- ic phase // Microbiology. – 1997. – 143, ¹ 5. – P. 1649–1656. 53. Nomura M., Takagi H. Role of the yeast acetyltrans- ferase Mpr1 in oxidative stress: regulation of oxygen reactive species caused by a toxic proline catabolism intermediate // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 2004. – 101, ¹ 34. – P. 12616–12621. 54. Kadam K.L., Schmidt S.L. Evaluation of Candida ac- idothermophilum in ethanol production from ligno- cellulosic biomass // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1997. – 48. – P. 709–713. 55. Fujita Y., Ito J. Synergistic saccharification, and di- rect fermentation to ethanol, of amorphous cellulose by use of an engineered yeast strain codisplaying three types of cellulolytic enzyme // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – 70. – P. 1207–1212. 56. Gaspar M., Kalman G., Reczey K. Corn fiber as a raw material for hemicellulose and ethanol production // Process. Biochem. – 2007. – 42. – P. 1135–1139. 57. Eksteen J.M., van Rensburg P., Cordero Otero R.R., Pretorius I.S. Starch fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae strains expressing the - amylase and glucoamylase genes from Lipomyces ko- nonenkoae and Saccharomycopsis fibuligera // Bio- technol Bioeng. – 2003. – 84. – P. 639–646. 58. Piontek M., Hagedorn J., Hollenberg C.P. et al. Two novel gene expression systems based on the yeasts Schwanniomyces occidentalis and Pichia stipitis // 21 Çâ’ÿçîê àëåë³â ì³êðîñàòåë³òíèõ ëîêóñ³â ï’ÿòî¿ ãðóïè õðîìîñîì ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1998. – 5. – P. 331– 338. 59. Shigechi H., Koh J., Fujita Y. et al. Direct production of ethanol from raw corn starch via fermentation by use of a novel surface-engineered yeast strain codis- playing glucoamylase and -amylase // Appl. Envi- ron. Microbiol. – 2004. – 70. – P. 5037–5040. 60. Wang T.T., Lin L.L., Hsu W.H. Cloning and expres- sion of a Schwanniomyces occidentalis -amylase gene in Saccharomyces cerevisiae // Appl. Environ.Micro- biol. – 1989. – 55. – P. 3167–3172. 61. Gellissen G., Janowicz Z.A., Merckelbach A. et al. Heterologous gene expression in Hansenula polymor- pha: Efficient secretion of glucoamylase // Bio.Tech- nology. – 1991. – 9. – P. 291–295. 62. Voronovsky A.Y., Rohulya O.V., Abbas C.A., Sibir- ny A.A. Development of strains of the thermotoler- ant yeast Hansenula polymorpha capable of alcoholic fermentation of starch and xylan // Metab. Eng. – 2009. – 11, ¹ 4/5. – P. 234–242. 63. Torronen A., Mach L.R., Massner R. et al. The two major xylanases from Trichoderma reesei: character- ization of both enzymes and genes // Biothechnol- ogy. – 1992. – 10. – P. 1461–1465. 64. La Grange D.C., Pretorius I.S., van Zyl W.H. Expres- sion of a Trichoderma reesei -xylanase gene (XYN2) in Saccharomyces cerevisiae // Appl. Environ. Micro- biol. – 1996. – 62. – P. 1036–1044. 65. Katahira S., Fujita Y., Mizuike A. et al. Construction of a xylan-fermenting yeast strain through codisplay of xylanolytic enzymes on the surface of xylose-uti- lizing Saccharomyces cerevisiae cells // Appl. Envi- ron. Microbiol. – 2004. – 70. – P. 5407–5414. 66. Meister A. Glutathione metabolism and its selec- tive modification // J. Biol. Chem. – 1988. – 263, ¹ 33. – P. 17205–17208. 67. Alexandre H., Ansanay-Galeote V., Dequin S., Blondin B. Global gene expression during short-term ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae // FEBS Lett. – 2001. – 498. – P. 98–103. 68. Ubiyvovk V.M., Nazarko T.Y., Stasyk O.G. et al. GSH2, a gene encoding gamma-glutamylcysteine synthetase in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // FEMS Yeast Res. – 2002. – 2. – P. 327–332. 69. Ubiyvovk V.M., Ananin V.M., Malyshev A.Y. et al. Optimization of glutathione production in batch and fed-batch cultures by the wild-type and recombinant strains of the methylotrophic yeast Hansenula poly- morpha DL-1 BMC // Biotechnol. – 2011. – 11, ¹ 1. – P. 8. 70. Grabek-Lejko D., Kurylenko O.O., Sibirny V.A. et al. Alcoholic fermentation by wild-type Hansenula poly- morpha and Saccharomyces cerevisiae versus recom- binant strains with an elevated level of intracellular glutathione // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2011 [Epub ahead of print]. 71. Kiel J.A., Rechinger K.B., van der Klei I.J. et al. The Hansenula polymorpha PDD1 gene product, essen- tial for the selective degradation of peroxisomes, is a homologue of Saccharomyces cerevisiae Vps34p // Yeast. – 1999. – 15, ¹ 9. – P. 741–754. Ïîñòóïèëà 27.10.11 << /ASCII85EncodePages false /AllowTransparency false /AutoPositionEPSFiles true /AutoRotatePages /None /Binding /Left /CalGrayProfile (Dot Gain 20%) /CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2) /sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CannotEmbedFontPolicy /Error /CompatibilityLevel 1.4 /CompressObjects /Tags /CompressPages true /ConvertImagesToIndexed true /PassThroughJPEGImages true /CreateJobTicket false /DefaultRenderingIntent /Default /DetectBlends true /DetectCurves 0.0000 /ColorConversionStrategy /CMYK /DoThumbnails false /EmbedAllFonts true /EmbedOpenType false /ParseICCProfilesInComments true /EmbedJobOptions true /DSCReportingLevel 0 /EmitDSCWarnings false /EndPage -1 /ImageMemory 1048576 /LockDistillerParams false /MaxSubsetPct 100 /Optimize true /OPM 1 /ParseDSCComments true /ParseDSCCommentsForDocInfo true /PreserveCopyPage true /PreserveDICMYKValues true /PreserveEPSInfo true /PreserveFlatness true /PreserveHalftoneInfo false /PreserveOPIComments false /PreserveOverprintSettings true /StartPage 1 /SubsetFonts true /TransferFunctionInfo /Apply /UCRandBGInfo /Preserve /UsePrologue false /ColorSettingsFile () /AlwaysEmbed [ true ] /NeverEmbed [ true ] /AntiAliasColorImages false /CropColorImages true /ColorImageMinResolution 300 /ColorImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleColorImages true /ColorImageDownsampleType /Bicubic /ColorImageResolution 1200 /ColorImageDepth -1 /ColorImageMinDownsampleDepth 1 /ColorImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeColorImages false /ColorImageFilter /DCTEncode /AutoFilterColorImages true /ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG /ColorACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /ColorImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000ColorACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000ColorImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasGrayImages false /CropGrayImages true /GrayImageMinResolution 300 /GrayImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleGrayImages true /GrayImageDownsampleType /Bicubic /GrayImageResolution 1200 /GrayImageDepth -1 /GrayImageMinDownsampleDepth 2 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeGrayImages false /GrayImageFilter /DCTEncode /AutoFilterGrayImages true /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG /GrayACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /GrayImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000GrayACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000GrayImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasMonoImages false /CropMonoImages true /MonoImageMinResolution 1200 /MonoImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleMonoImages true /MonoImageDownsampleType /Bicubic /MonoImageResolution 1200 /MonoImageDepth -1 /MonoImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeMonoImages false /MonoImageFilter /CCITTFaxEncode /MonoImageDict << /K -1 >> /AllowPSXObjects false /CheckCompliance [ /None ] /PDFX1aCheck false /PDFX3Check false /PDFXCompliantPDFOnly false /PDFXNoTrimBoxError true /PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXSetBleedBoxToMediaBox true /PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXOutputIntentProfile (None) /PDFXOutputConditionIdentifier () /PDFXOutputCondition () /PDFXRegistryName () /PDFXTrapped /False /CreateJDFFile false /Description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> /CHS <FEFF4f7f75288fd94e9b8bbe5b9a521b5efa7684002000410064006f006200650020005000440046002065876863900275284e8e9ad88d2891cf76845370524d53705237300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c676562535f00521b5efa768400200050004400460020658768633002> /CHT <FEFF4f7f752890194e9b8a2d7f6e5efa7acb7684002000410064006f006200650020005000440046002065874ef69069752865bc9ad854c18cea76845370524d5370523786557406300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c4f86958b555f5df25efa7acb76840020005000440046002065874ef63002> /CZE <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> /DAN <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> /DEU <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> /ESP <FEFF005500740069006c0069006300650020006500730074006100200063006f006e0066006900670075007200610063006900f3006e0020007000610072006100200063007200650061007200200064006f00630075006d0065006e0074006f00730020005000440046002000640065002000410064006f0062006500200061006400650063007500610064006f00730020007000610072006100200069006d0070007200650073006900f3006e0020007000720065002d0065006400690074006f007200690061006c00200064006500200061006c00740061002000630061006c0069006400610064002e002000530065002000700075006500640065006e00200061006200720069007200200064006f00630075006d0065006e0074006f00730020005000440046002000630072006500610064006f007300200063006f006e0020004100630072006f006200610074002c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000200079002000760065007200730069006f006e0065007300200070006f00730074006500720069006f007200650073002e> /ETI <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> /FRA <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> /GRE <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a stvaranje Adobe PDF dokumenata najpogodnijih za visokokvalitetni ispis prije tiskanja koristite ove postavke. Stvoreni PDF dokumenti mogu se otvoriti Acrobat i Adobe Reader 5.0 i kasnijim verzijama.) /HUN <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> /ITA <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> /JPN <FEFF9ad854c18cea306a30d730ea30d730ec30b951fa529b7528002000410064006f0062006500200050004400460020658766f8306e4f5c6210306b4f7f75283057307e305930023053306e8a2d5b9a30674f5c62103055308c305f0020005000440046002030d530a130a430eb306f3001004100630072006f0062006100740020304a30883073002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee5964d3067958b304f30533068304c3067304d307e305930023053306e8a2d5b9a306b306f30d530a930f330c8306e57cb30818fbc307f304c5fc59808306730593002> /KOR <FEFFc7740020c124c815c7440020c0acc6a9d558c5ec0020ace0d488c9c80020c2dcd5d80020c778c1c4c5d00020ac00c7a50020c801d569d55c002000410064006f0062006500200050004400460020bb38c11cb97c0020c791c131d569b2c8b2e4002e0020c774b807ac8c0020c791c131b41c00200050004400460020bb38c11cb2940020004100630072006f0062006100740020bc0f002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020c774c0c1c5d0c11c0020c5f40020c2180020c788c2b5b2c8b2e4002e> /LTH <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> /LVI <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> /NLD (Gebruik deze instellingen om Adobe PDF-documenten te maken die zijn geoptimaliseerd voor prepress-afdrukken van hoge kwaliteit. De gemaakte PDF-documenten kunnen worden geopend met Acrobat en Adobe Reader 5.0 en hoger.) /NOR <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> /POL <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> /PTB <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> /RUM <FEFF005500740069006c0069007a00610163006900200061006300650073007400650020007300650074010300720069002000700065006e007400720075002000610020006300720065006100200064006f00630075006d0065006e00740065002000410064006f006200650020005000440046002000610064006500630076006100740065002000700065006e0074007200750020007400690070010300720069007200650061002000700072006500700072006500730073002000640065002000630061006c006900740061007400650020007300750070006500720069006f006100720103002e002000200044006f00630075006d0065006e00740065006c00650020005000440046002000630072006500610074006500200070006f00740020006600690020006400650073006300680069007300650020006300750020004100630072006f006200610074002c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020015f00690020007600650072007300690075006e0069006c006500200075006c0074006500720069006f006100720065002e> /RUS <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> /SKY <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> /SLV <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> /SUO <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> /SVE <FEFF0041006e007600e4006e00640020006400650020006800e4007200200069006e0073007400e4006c006c006e0069006e006700610072006e00610020006f006d002000640075002000760069006c006c00200073006b006100700061002000410064006f006200650020005000440046002d0064006f006b0075006d0065006e007400200073006f006d002000e400720020006c00e4006d0070006c0069006700610020006600f60072002000700072006500700072006500730073002d007500740073006b00720069006600740020006d006500640020006800f600670020006b00760061006c0069007400650074002e002000200053006b006100700061006400650020005000440046002d0064006f006b0075006d0065006e00740020006b0061006e002000f600700070006e00610073002000690020004100630072006f0062006100740020006f00630068002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020006f00630068002000730065006e006100720065002e> /TUR <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> /UKR <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> /ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents best suited for high-quality prepress printing. Created PDF documents can be opened with Acrobat and Adobe Reader 5.0 and later.) >> /Namespace [ (Adobe) (Common) (1.0) ] /OtherNamespaces [ << /AsReaderSpreads false /CropImagesToFrames true /ErrorControl /WarnAndContinue /FlattenerIgnoreSpreadOverrides false /IncludeGuidesGrids false /IncludeNonPrinting false /IncludeSlug false /Namespace [ (Adobe) (InDesign) (4.0) ] /OmitPlacedBitmaps false /OmitPlacedEPS false /OmitPlacedPDF false /SimulateOverprint /Legacy >> << /AddBleedMarks false /AddColorBars false /AddCropMarks false /AddPageInfo false /AddRegMarks false /ConvertColors /ConvertToCMYK /DestinationProfileName () /DestinationProfileSelector /DocumentCMYK /Downsample16BitImages true /FlattenerPreset << /PresetSelector /MediumResolution >> /FormElements false /GenerateStructure false /IncludeBookmarks false /IncludeHyperlinks false /IncludeInteractive false /IncludeLayers false /IncludeProfiles false /MultimediaHandling /UseObjectSettings /Namespace [ (Adobe) (CreativeSuite) (2.0) ] /PDFXOutputIntentProfileSelector /DocumentCMYK /PreserveEditing true /UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged /UntaggedRGBHandling /UseDocumentProfile /UseDocumentBleed false >> ] >> setdistillerparams << /HWResolution [2400 2400] /PageSize [612.000 792.000] >> setpagedevice

Метаболическая инженерия дрожжей Hansenula polymorpha для создания эффективных продуцентов этанола

Institution

Similar Items