Биодизель из микроводорослей: пути повышения эффектиности накопления липидов методами генетической инженерии

Биодизель из микроводорослей: пути повышения эффектиности накопления липидов методами генетической инженерии

Микроскопические водоросли рассматриваются как один из наиболее перспективных продуцентов липидов для производства биодизеля. В обзоре представлены результаты исследований по увеличению экспрессии генов, непосредственно включенных в биосинтез жирных кислот. Повышение эффективности механизмов поглоще...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Veröffentlicht in:Цитология и генетика
Datum:2013
Hauptverfasser: Корховой, В.И., Блюм, Я.Б.
Format: Artikel
Sprache:Russian
Veröffentlicht: Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2013
Schlagworte:
Оригинальные работы
Online Zugang:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/126601
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Биодизель из микроводорослей: пути повышения эффектиности накопления липидов методами генетической инженерии / В.И. Корховой, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2013. — Т. 47, № 6. — С. 30-42. — Бібліогр.: 102 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-126601
record_format dspace
spelling Корховой, В.И.
Блюм, Я.Б.
2017-11-28T16:24:15Z
2017-11-28T16:24:15Z
2013
Биодизель из микроводорослей: пути повышения эффектиности накопления липидов методами генетической инженерии / В.И. Корховой, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2013. — Т. 47, № 6. — С. 30-42. — Бібліогр.: 102 назв. — рос.
0564-3783
DOI: 10.3103/S0095452713060030
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/126601
Микроскопические водоросли рассматриваются как один из наиболее перспективных продуцентов липидов для производства биодизеля. В обзоре представлены результаты исследований по увеличению экспрессии генов, непосредственно включенных в биосинтез жирных кислот. Повышение эффективности механизмов поглощения солнечной энергии и фиксации диоксида углерода влияет на продуктивность микроводорослей. Блокирование экспрессии генов, ответственных за синтез крахмала, изменяет баланс в сторону уве-личения количества липидов в клетке. Изменение длины углеродной цепи жирных кислот в сторону ее укорочения важно в технологии производства биодизеля. Управление путями катаболизма липидов – еще одно из направлений повышения их количества. И, наконец, использование методов анализа транскриптома позволяет глубже изучить процессы интенсивного накопления липидов в стрессовых условиях с целью управления этими процессами.
Мікроскопічні водорості розглядаються як один з найбільш перспективних продуцентів ліпідів для виробництва біодизеля. В огляді представлено результати досліджень по збільшенню експресії генів, які безпосередньо беруть участь у синтезі жирних кислот. Підвищення ефективності механізмів поглинання сонячної енергії та фіксації диоксиду вуглецю впливає на продуктивність мікроводоростей. Бл-кування експресії генів, відповідальних за синтез крохмалю, змінює баланс в бік збільшення ліпідів у клітині. Зменшення довжини вуглецевого ланцюга важливе в технології виробництва біодизеля. Керування шляхами катаболізму ліпідів – ще один з напрямів збільшення їх кількості. І, насамкінець, використання методів аналізу транскриптома дозволяє глибше вивчити процеси інтенсивного накопичення ліпідів в умовах стресу з метою керування цими процесами.
Microalgae are viewed as one of the most perspective producers of lipids for biodiesel production. The review shows the results of researches into increasing the expression of genes directly participating in the biosynthesis of fatty acids. The increase in the effectiveness of solar energy absorption and carbon dioxide fixation influences the microalgae productivity. Blocking the expression of genes that are responsible for starch synthesis changes the balance towards growth in the quantity of lipids in a cell. A change in the length of the carbon backbone chain in fatty acids towards its shortening is important in the technology of biodiesel production. Manipulation processes of lipid catabolism is another way of increasing their quantity. At last, using the methods of transcription analysis allows us to understand deeper the process of intensive accumulation of lipids under stressful conditions for the purpose of directing these processes.
ru
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
Цитология и генетика
Оригинальные работы
Биодизель из микроводорослей: пути повышения эффектиности накопления липидов методами генетической инженерии
Біодизель з мікроводоростей: шляхи підвищення ефективності накопичення ліпідів методами генетичної інженерії
Biodiesel from microalgae: Ways for increasing the effectiveness of lipid accumulation by genetic engineering methods
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Биодизель из микроводорослей: пути повышения эффектиности накопления липидов методами генетической инженерии
spellingShingle Биодизель из микроводорослей: пути повышения эффектиности накопления липидов методами генетической инженерии
Корховой, В.И.
Блюм, Я.Б.
Оригинальные работы
title_short Биодизель из микроводорослей: пути повышения эффектиности накопления липидов методами генетической инженерии
title_full Биодизель из микроводорослей: пути повышения эффектиности накопления липидов методами генетической инженерии
title_fullStr Биодизель из микроводорослей: пути повышения эффектиности накопления липидов методами генетической инженерии
title_full_unstemmed Биодизель из микроводорослей: пути повышения эффектиности накопления липидов методами генетической инженерии
title_sort биодизель из микроводорослей: пути повышения эффектиности накопления липидов методами генетической инженерии
author Корховой, В.И.
Блюм, Я.Б.
author_facet Корховой, В.И.
Блюм, Я.Б.
topic Оригинальные работы
topic_facet Оригинальные работы
publishDate 2013
language Russian
container_title Цитология и генетика
publisher Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
format Article
title_alt Біодизель з мікроводоростей: шляхи підвищення ефективності накопичення ліпідів методами генетичної інженерії
Biodiesel from microalgae: Ways for increasing the effectiveness of lipid accumulation by genetic engineering methods
description Микроскопические водоросли рассматриваются как один из наиболее перспективных продуцентов липидов для производства биодизеля. В обзоре представлены результаты исследований по увеличению экспрессии генов, непосредственно включенных в биосинтез жирных кислот. Повышение эффективности механизмов поглощения солнечной энергии и фиксации диоксида углерода влияет на продуктивность микроводорослей. Блокирование экспрессии генов, ответственных за синтез крахмала, изменяет баланс в сторону уве-личения количества липидов в клетке. Изменение длины углеродной цепи жирных кислот в сторону ее укорочения важно в технологии производства биодизеля. Управление путями катаболизма липидов – еще одно из направлений повышения их количества. И, наконец, использование методов анализа транскриптома позволяет глубже изучить процессы интенсивного накопления липидов в стрессовых условиях с целью управления этими процессами. Мікроскопічні водорості розглядаються як один з найбільш перспективних продуцентів ліпідів для виробництва біодизеля. В огляді представлено результати досліджень по збільшенню експресії генів, які безпосередньо беруть участь у синтезі жирних кислот. Підвищення ефективності механізмів поглинання сонячної енергії та фіксації диоксиду вуглецю впливає на продуктивність мікроводоростей. Бл-кування експресії генів, відповідальних за синтез крохмалю, змінює баланс в бік збільшення ліпідів у клітині. Зменшення довжини вуглецевого ланцюга важливе в технології виробництва біодизеля. Керування шляхами катаболізму ліпідів – ще один з напрямів збільшення їх кількості. І, насамкінець, використання методів аналізу транскриптома дозволяє глибше вивчити процеси інтенсивного накопичення ліпідів в умовах стресу з метою керування цими процесами. Microalgae are viewed as one of the most perspective producers of lipids for biodiesel production. The review shows the results of researches into increasing the expression of genes directly participating in the biosynthesis of fatty acids. The increase in the effectiveness of solar energy absorption and carbon dioxide fixation influences the microalgae productivity. Blocking the expression of genes that are responsible for starch synthesis changes the balance towards growth in the quantity of lipids in a cell. A change in the length of the carbon backbone chain in fatty acids towards its shortening is important in the technology of biodiesel production. Manipulation processes of lipid catabolism is another way of increasing their quantity. At last, using the methods of transcription analysis allows us to understand deeper the process of intensive accumulation of lipids under stressful conditions for the purpose of directing these processes.
issn 0564-3783
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/126601
citation_txt Биодизель из микроводорослей: пути повышения эффектиности накопления липидов методами генетической инженерии / В.И. Корховой, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2013. — Т. 47, № 6. — С. 30-42. — Бібліогр.: 102 назв. — рос.
work_keys_str_mv AT korhovoivi biodizelʹizmikrovodorosleiputipovyšeniâéffektinostinakopleniâlipidovmetodamigenetičeskoiinženerii
AT blûmâb biodizelʹizmikrovodorosleiputipovyšeniâéffektinostinakopleniâlipidovmetodamigenetičeskoiinženerii
AT korhovoivi bíodizelʹzmíkrovodorosteišlâhipídviŝennâefektivnostínakopičennâlípídívmetodamigenetičnoíínženeríí
AT blûmâb bíodizelʹzmíkrovodorosteišlâhipídviŝennâefektivnostínakopičennâlípídívmetodamigenetičnoíínženeríí
AT korhovoivi biodieselfrommicroalgaewaysforincreasingtheeffectivenessoflipidaccumulationbygeneticengineeringmethods
AT blûmâb biodieselfrommicroalgaewaysforincreasingtheeffectivenessoflipidaccumulationbygeneticengineeringmethods
first_indexed 2025-11-25T20:31:17Z
last_indexed 2025-11-25T20:31:17Z
_version_ 1850521465196118016
fulltext 30 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 Ìèêðîñêîïè÷åñêèå âîäîðîñëè ðàññìàòðèâàþòñÿ êàê îäèí èç íàèáîëåå ïåðñïåêòèâíûõ ïðîäóöåíòîâ ëèïèäîâ äëÿ ïðîèçâîäñòâà áèîäèçåëÿ.  îáçîðå ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû èññëåäîâàíèé ïî óâåëè÷åíèþ ýêñïðåññèè ãåíîâ, íåïîñðåäñòâåííî âêëþ÷åííûõ â áèîñèíòåç æèð- íûõ êèñëîò. Ïîâûøåíèå ýôôåêòèâíîñòè ìåõàíèçìîâ ïîãëîùåíèÿ ñîëíå÷íîé ýíåðãèè è ôèêñàöèè äèîêñèäà óãëåðîäà âëèÿåò íà ïðîäóêòèâíîñòü ìèêðîâîäîðîñëåé. Áëîêèðîâàíèå ýêñïðåññèè ãåíîâ, îòâåòñòâåííûõ çà ñèíòåç êðàõìàëà, èçìåíÿåò áàëàíñ â ñòîðîíó óâå- ëè÷åíèÿ êîëè÷åñòâà ëèïèäîâ â êëåòêå. Èçìåíåíèå äëèíû óãëåðîäíîé öåïè æèðíûõ êèñëîò â ñòîðîíó åå óêîðî÷åíèÿ âàæíî â òåõíîëîãèè ïðîèçâîäñòâà áèî- äèçåëÿ. Óïðàâëåíèå ïóòÿìè êàòàáîëèçìà ëèïèäîâ – åùå îäíî èç íàïðàâëåíèé ïîâûøåíèÿ èõ êîëè÷åñòâà. È, íàêîíåö, èñïîëüçîâàíèå ìåòîäîâ àíàëèçà òðàíñ- êðèïòîìà ïîçâîëÿåò ãëóáæå èçó÷èòü ïðîöåññû èíòåí- ñèâíîãî íàêîïëåíèÿ ëèïèäîâ â ñòðåññîâûõ óñëîâèÿõ ñ öåëüþ óïðàâëåíèÿ ýòèìè ïðîöåññàìè. Введение Íàèáîëåå âàæíûìè ïðè÷èíàìè âñïëåñêà èí- òåðåñà ê ïðîèçâîäñòâó áèîäèçåëÿ èç ìèêðî- ñêîïè÷åñêèõ âîäîðîñëåé (ìèêðîâîäîðîñëåé) ÿâ- ëÿþòñÿ óâåëè÷èâàþùèåñÿ îáúåìû èñïîëüçîâà- íèÿ æèäêèõ òîïëèâ, ÷òî âëå÷åò çà ñîáîé áûñò- ðîå ñîêðàùåíèå çàïàñîâ èñêîïàåìûõ óãëåâîäî- ðîäîâ è áåñïðåöåíäåíòíîå óâåëè÷åíèå êîëè- ÷åñòâà ïàðíèêîâûõ ãàçîâ – îñíîâíîé ïðè- ÷èíû ãëîáàëüíîãî ïîòåïëåíèÿ [1]. Ïî ñðàâíå- íèþ ñ äðóãèìè èñòî÷íèêàìè ëèïèäîâ, òàêè- ìè êàê æèâîòíûå æèðû, òðàäèöèîííî âîçäå- ëûâàåìûå ìàñëè÷íûå ñåëüñêîõîçÿéñòâåííûå êóëüòóðû è ìàñëè÷íàÿ ïàëüìà, ìèêðîâîäîðîñ- ëè âûäåëÿþòñÿ ðÿäîì ñóùåñòâåííûõ ïðåè- ìóùåñòâ: 1) êîëè÷åñòâî ïîëó÷àåìîãî ìàñëà íà åäèíèöó ïëîùàäè íàìíîãî âûøå ïî ñðàâíåíèþ ñ òðàäèöèîííûìè ìàñëîñîäåðæàùèìè êóëü- òóðàìè çà ñ÷åò áîëåå ýôôåêòèâíîé êîíâåðñèè ñîëíå÷íîãî ñâåòà [2, 3]; 2) ìèêðîâîäîðîñëè ìîæíî âûðàùèâàòü â ðàçíîîáðàçíûõ óñëîâèÿõ – ïðåñíàÿ, ñîëîíîâàòàÿ, ìîðñêàÿ âîäà ÿâëÿþòñÿ èäåàëüíûìè äëÿ êóëüòèâèðîâàíèÿ ìíîãèõ âè- äîâ, äàæå ñòî÷íûå âîäû ïðåäïðèÿòèé è ãî- ðîäñêèõ êàíàëèçàöèé, îáîãàùåííûå íåîðãàíè- ÷åñêèìè èîíàìè (NH4 +, NO3 –, PO4 3–) ïðèãîä- íû äëÿ êóëüòèâèðîâàíèÿ ìíîæåñòâà âèäîâ [4]; 3) â ïðîöåññå ôîòîñèíòåçà ìèêðîâîäîðîñëè àä- ñîðáèðóþò çíà÷èòåëüíîå êîëè÷åñòâî ÑÎ2, ïðåâ- ðàùàÿ â ýíåðãèþ õèìè÷åñêèõ ñâÿçåé è áèî- ìàññó; ýôôåêòèâíîå ïîãëîùåíèå äèîêñèäà óãëå- ðîäà èç àòìîñôåðû ìîæåò ïðèîñòàíîâèòü óãðî- æàþùèå èçìåíåíèÿ êëèìàòà ïëàíåòû, ñâÿçàí- íûå ñ ïàðíèêîâûì ýôôåêòîì [4, 5], ïîñêîëüêó äëÿ ïîëó÷åíèÿ 100 ò áèîìàññû ìèêðîâîäîðîñ- ëåé ðàñõîäóþòñÿ 183 ò àòìîñôåðíîãî äèîêñèäà óãëåðîäà [6]; 4) ìèêðîâîäîðîñëè ìîãóò ñëóæèòü ñûðüåì äëÿ ìíîãèõ âèäîâ òîïëèâà – áèîäèçåëÿ, ýòàíîëà, âîäîðîäà, ìåòàíà, êîòîðûå ëåãêî ðàç- ðóøàþòñÿ â îêðóæàþùåé ñðåäå è ïîýòîìó ìî- ãóò áîëåå ýôôåêòèâíî èñïîëüçîâàòüñÿ, ÷åì òðà- äèöèîííûå âèäû òîïëèâ [7]; 5) áèîìàññà ìèêðî- âîäîðîñëåé ìîæåò áûòü ïåðåðàáîòàíà ñ ïîëó- ÷åíèåì òàêèõ öåííûõ ïðîäóêòîâ, êàê êàðî- òèíîèäû, îìåãà-3-æèðíûå êèñëîòû, ñòåðîëû, à òàêæå äðóãèå ïèãìåíòû è àíòèîêñèäàíòû [8]. Ìèêðîâîäîðîñëè, íàñ÷èòûâàþùèå áîëåå 50 òûñ. âèäîâ, âñòðå÷àþòñÿ â ñàìûõ ðàçëè÷íûõ ýêîñèñòåìàõ. Íà ñåãîäíÿ èçó÷åíî îêîëî 30 òûñ. âèäîâ [9], íî äëÿ èíòåíñèâíîãî êîììåð÷åñêî- ãî êóëüòèâèðîâàíèÿ, âñïëåñê êîòîðîãî íàáëþ- äàåòñÿ â ïîñëåäíèå 40–50 ëåò, èñïîëüçóþòñÿ âñåãî íåñêîëüêî âèäîâ ìèêðîâîäîðîñëåé [10]. Êðóïíîìàñøòàáíîå âûðàùèâàíèå âîäîðîñëåé íà÷àòî â 60-õ ãîäàõ XX ñòîëåòèÿ â ßïîíèè [11], è ïåðâûì îáúåêòîì áûëà Chlorella. Âïîñëåäñò- âèè óâåëè÷èâàëèñü ïðîèçâîäñòâåííûå ìîùíîñ- òè ïî âûðàùèâàíèþ ìèêðîâîäîðîñëåé, à òàêæå ðàñøèðÿëîñü êîëè÷åñòâî èñïîëüçóåìûõ âèäîâ. Òàê, íàïðèìåð, â 1980 ã. âî âñåì Àçèàòñêîì ðåãèîíå ïðîèçâîäñòâî Chlorella ñîñòàâëÿëî 1 ò â ìåñÿö, à â 1996 ã. – 2000 ò â ìåñÿö òîëüêî ëèøü â ßïîíèè [12]. Âòîðîé ïî çíà÷èìîñòè ñðåäè êóëüòèâèðóåìûõ ìèêðîâîäîðîñëåé ÿâ- УДК В.И. КОРХОВОЙ, Я.Б. БЛЮМ Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины, Киев Е-mail: korkhovy_v@ukr.net БИОДИЗЕЛЬ ИЗ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ: ПУТИ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ НАКОПЛЕНИЯ ЛИПИДОВ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ © Â.È. ÊÎÐÕÎÂÎÉ, ß.Á. ÁËÞÌ, 2013 31 Áèîäèçåëü èç ìèêðîâîäîðîñëåé: ïóòè ïîâûøåíèÿ ýôôåêòèâíîñòè íàêîïëåíèÿ ëèïèäîâ ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 ëÿåòñÿ Spirulina, çà êîòîðîé ñëåäóåò Dunaliella salina, ñëóæàùàÿ èñòî÷íèêîì -êàðîòèíà. Îñî- áåííî äèíàìè÷íî ïðîèçâîäñòâî ýòèõ ìèêðî- âîäîðîñëåé ñòàëî âîçðàñòàòü â êîíöå ïðîøëîãî ñòîëåòèÿ [10]. Ýíåðãåòè÷åñêèé êðèçèñ ñåðåäèíû 70-õ ãî- äîâ ïîäòîëêíóë ðàçâèòûå ñòðàíû ê ïîèñêó àëü- òåðíàòèâíûõ èñòî÷íèêîâ æèäêèõ òîïëèâ, ÷òî ïîâëåêëî çíà÷èòåëüíûå èíâåñòèöèè â íàó÷íûå èññëåäîâàíèÿ, ñâÿçàííûå ñ èçó÷åíèåì íîâûõ òåõíîëîãèé ïîëó÷åíèÿ âîçîáíîâëÿåìûõ óãëå- âîäîðîäîâ. Âíèìàíèå ìíîãèõ èññëåäîâàòåëåé áûëî îáðàùåíî íà ìàñëè÷íûå êóëüòóðû, òðà- äèöèîííî âûðàùèâàåìûå äëÿ ïîëó÷åíèÿ ðàñ- òèòåëüíûõ ìàñåë, èñïîëüçîâàâøèõñÿ èçäðåâëå â ïèùåâûõ öåëÿõ. Ðàñòèòåëüíûå æèðû ñòàëè îñ- íîâîé ñûðüåâîé áàçû áèîäèçåëÿ ïåðâîãî ïî- êîëåíèÿ. Îñîáåííî ÿðêî ïðîñëåæèâàåòñÿ ñòðå- ìèòåëüíûé ðîñò ïðîèçâîäñòâà áèîäèçåëÿ â ïîñ- ëåäíåå äåñÿòèëåòèå. Ïðîèçâîäñòâî áèîäèçåëÿ â ñòðàíàõ Åâðîïåéñêîãî Ñîþçà óâåëè÷èëîñü ñ 1,9 ìëí ò â 2004 ã. äî 3,2 ìëí ò â 2005 ã. è äî 4,9 ìëí ò â 2006 ã. [13].  2011 ã. â ñòðà- íàõ ÅÑ ïðîèçâåäåíî 22,117 ìëí ò áèîäèçåëÿ [14]. Åùå áîëåå àêòèâíûìè òåìïàìè íàðàñòà- ëî ïðîèçâîäñòâî áèîäèçåëÿ â ÑØÀ: åñëè â 2008 ã. áûëî ïðîèçâåäåíî 21,73 ìëí ò, òî â 2011 ã. – óæå áîëåå 31,5 ìëí [15]. Îäíàêî êðè- òè÷åñêèå çàìå÷àíèÿ è ïðîòåñòû îòíîñèòåëüíî èñïîëüçîâàíèÿ ïèùåâûõ ìàñåë â êà÷åñòâå ñû- ðüÿ äëÿ ïðîèçâîäñòâà áèîäèçåëÿ çàñòàâèëè ïðà- âèòåëüñòâà ìíîãèõ ñòðàí ïåðåîðèåíòèðîâàòüñÿ íà äðóãèå èñòî÷íèêè ðàñòèòåëüíûõ æèðîâ, ñðå- äè êîòîðûõ íàèáîëåå ïåðñïåêòèâíûìè ÿâëÿ- þòñÿ ëèïèäû èç ìèêðîâîäîðîñëåé. Ïðîáëåìà ïîëó÷åíèÿ áèîäèçåëÿ èç ìèêðîâî- äîðîñëåé îáñóæäàëàñü áîëåå 50 ëåò íàçàä [18], íî òîëüêî êðèçèñ 70-õ ïîäòîëêíóë ïðàâèòåëüñò- âà ÑØÀ è ßïîíèè ê ôèíàíñèðîâàíèþ ïðî- ãðàìì ïîëó÷åíèÿ ýíåðãèè èç ìèêðîâîäîðîñ- ëåé [5, 19]. Õîòÿ ñîäåðæàíèå îáùèõ ëèïèäîâ â ðàñ÷åòå íà ñóõóþ ìàññó â ðàçíûõ âèäàõ ìèêðîâîäîðîñëåé øèðîêî âàðüèðóåò – îò 2 % ó ñèíå-çåëåíûõ (ðîäû Anabaena è Oscillatoria) äî 75 % ó äèàòîìîâûõ (ðîä Phaeodactylum) [16, 17] – ñðåäè ôîòîñèíòåçèðóþùèõ îðãàíèçìîâ ýòà ãðóïïà ðàñòåíèé ïðåäñòàâëåíà íàèáîëåå ýôôåêòèâíûìè ïðîäóöåíòàìè ëèïèäîâ, èç êî- òîðûõ âïîñëåäñòâèè ñ ïîìîùüþ ïðîñòûõ õè- ìè÷åñêèõ ïðåâðàùåíèé ïîëó÷àþò áèîäèçåëü [6]. Äëÿ ïðîèçâîäñòâà áèîäèçåëÿ íåîáõîäèìî èìåòü òåõíîëîãèþ ïîëó÷åíèÿ ëèïèäîâ, â êî- òîðîé öåíòðàëüíîå ìåñòî çàíèìàåò øòàìì – ïðîäóöåíò ëèïèäîâ. Èäåàëüíûì îáúåêòîì â ýòîì ñìûñëå ìîæåò áûòü øòàìì ñ âûñîêèì ïîòåíöèàëîì ê íàêîïëåíèþ ëèïèäîâ áåç ñòðåññîâûõ óñëîâèé, ñïîñîáíûé ïåðåíîñèòü çíà÷èòåëüíóþ èíñîëÿöèþ è íàãðåâ, à êëåòêè òàêîãî øòàììà äîëæíû áûòü êðóïíûìè è ñ òîíêîé ìåìáðàíîé. Øòàìì äîëæåí áûòü óñòîé÷èâûì ê âûñîêèì êîíöåíòðàöèÿì êèñ- ëîðîäà, à êëåòêè îáëàäàëè áû ñïîñîáíîñòüþ ê ðîñòó ïðè îäíîâðåìåííîì íàêîïëåíèè ëè- ïèäîâ, ôîðìèðóÿ ïðè ýòîì õëîïüåîáðàçíûå êîëîíèè. Âìåñòå ñ òåì òàêîé øòàìì äîëæåí áûòü ñòàáèëüíûì è óñòîé÷èâûì ê ðàçëè÷íûì èíôåêöèÿì. Åìó òàêæå äîëæíî áûòü ïðèñóùå òàêîå öåííîå ñâîéñòâî, êàê âûäåëåíèå ñèí- òåçèðîâàííûõ ëèïèäîâ â îêðóæàþùóþ ñðåäó, è ýòî äàëåêî íå âñå òðåáîâàíèÿ ê âûñîêî- òåõíîëîãè÷íîìó øòàììó. Î÷åâèäíî, ÷òî áåç äàëüíåéøåãî èçó÷åíèÿ ôè- çèîëîãèè, áèîõèìèè è ãåíåòèêè òàêèõ ìèêðî- âîäîðîñëåé ñ ïðèìåíåíèåì ñîâðåìåííûõ ìåòî- äîâ ìåòàáîëîìèêè è ãåíîìèêè íåâîçìîæíî ðàç- ðàáîòàòü ýôôåêòèâíûå ïîäõîäû ê íàïðàâëåí- íîìó èçìåíåíèþ âàæíûõ èõ õàðàêòåðèñòèê ñ öåëüþ ïîëó÷åíèÿ âûñîêî-ýôôåêòèâíûõ øòàì- ìîâ-ïðîäóöåíòîâ ëèïèäîâ. Ïîñëåäíåå ìîæåò áûòü äîñòèãíóòî ñ ïîìîùüþ ãåíåòè÷åñêîé èíæåíåðèè. Ïîýòîìó íàñòîÿùèé îáçîð ïîñâÿ- ùåí îñíîâíûì íàïðàâëåíèÿì óëó÷øåíèÿ øòàì- ìîâ ìèêðîâîäîðîñëåé ñ èñïîëüçîâàíèåì ìåòî- äîâ ãåíåòè÷åñêîé èíæåíåðèè. Жирнокислотный состав и биосинтез липидов микроводорослей Ìèêðîâîäîðîñëè ñèíòåçèðóþò øèðîêèé ñïåêòð ëèïèäîâ: òðè- è äèãëèöåðèäû, ôîñôî- è ãëèêîëèïèäû, óãëåâîäîðîäû è äð. [6, 16, 17, 20, 21]. Ñíà÷àëà èçó÷åíèå ëèïèäîâ ìèêðî- âîäîðîñëåé ïðîâîäèëîñü ñ òî÷êè çðåíèÿ èõ ïèùåâîé è ôàðìàöåâòè÷åñêîé öåííîñòè [22– 26], îäíàêî â ïîñëåäíèå 15–20 ëåò íàáëþäàåò- ñÿ âñå áîëüøèé èíòåðåñ ê èõ èñïîëüçîâàíèþ â êà÷åñòâå ñûðüÿ äëÿ ïðîèçâîäñòâà áèîäèçåëÿ [5, 17, 27, 28–33]. Ëèïèäû, âñòðå÷àþùèåñÿ â ìèêðîâîäîðîñëÿõ, ïîäðàçäåëÿþò ïî èõ õèìè÷åñêèì ñâîéñòâàì, êàê è îáû÷íî, íà äâà áîëüøèõ êëàññà – ïî- 32 Â.È. Êîðõîâîé, ß.Á. Áëþì ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 ëÿðíûå è íåéòðàëüíûå, êîòîðûå ÷àñòî íàçû- âàþò ïðîñòûìè, èëè íåïîëÿðíûìè [34]. Îñ- íîâíûå èõ ñòðóêòóðíûå ôîðìóëû ïðåäñòàâ- ëåíû íà ðèñ. 1 [3]. Ê íåéòðàëüíûì îòíîñÿòñÿ òðè-, äè- è ìîíîãëèöåðèäû, âîñêè, èçîïðå- íîèäíûå ëèïèäû (íàïðèìåð êàðîòèíîèäû). Ê ïîëÿðíûì îòíîñÿòñÿ ôîñôîëèïèäû (íàïðèìåð, ôîñôàòèäèëèíîçèòîë, ôîñôàòèäèëýòàíîëàìèí è äð.) è ãëèêîëèïèäû (â êîìáèíàöèè îëèãî- ñàõàðèäîâ è ëèïèäîâ), à òàêæå îòäåëüíîé âàæ- íîé ïîäãðóïïîé ÿâëÿþòñÿ ãëèêîëèïèäû – ýôè- ðû æèðíûõ êèñëîò è ãëèöåðîëà (íàïðèìåð ìîíîãàëàêòîçèëäèãëèöåðîë), â êîòîðûõ îäíà èç ãèäðîêñèãðóïï ãëèöåðîëà îáúåäèíåíà ñ ìî- ëåêóëîé ñàõàðà, ôîðìèðóÿ òàêèì îáðàçîì ñëîæ- íûå ýôèðû æèðíûõ êèñëîò. Ñèñòåìíûå ñâåäåíèÿ î êà÷åñòâåííîì ñîñòà- âå ëèïèäîâ ìèêðîâîäîðîñëåé âàæíû â ñâåòå òîãî, ÷òî ýòîò ïîêàçàòåëü èìååò âàæíîå çíà- ÷åíèå äëÿ äàëüíåéøèõ ïðîöåññîâ õèìè÷åñêî- ãî ïðåâðàùåíèÿ ñ öåëüþ ïîëó÷åíèÿ áèîäè- çåëÿ. Ñóùåñòâóþùèå òåõíîëîãèè ïåðåðàáîòêè ìàñåë, ïîëó÷åííûõ èç ñåìÿí ðàñòåíèé, îïòè- ìèçèðîâàíû ïîä ñûðüå, ñîäåðæàùåå íå ìåíåå 95 % òðèãëèöåðèäîâ. Êà÷åñòâåííûå è êîëè÷åñò- âåííûå õàðàêòåðèñòèêè ëèïèäîâ, ïîëó÷àåìûõ èç ìèêðîâîäîðîñëåé, â çíà÷èòåëüíîé ñòåïåíè çàâèñÿò îò èñïîëüçóåìûõ âèäîâ, ñîñòàâà êóëü- òóðàëüíîé ñðåäû, óñëîâèé êóëüòèâèðîâàíèÿ è ñáîðà óðîæàÿ ìèêðîâîäîðîñëåé. Òàê, íà- ïðèìåð, âî ìíîãèõ èññëåäîâàíèÿõ ïîêàçàíî, ÷òî êîìïîçèöèÿ ëèïèäîâ â çíà÷èòåëüíîé ìå- ðå âàðüèðóåò â çàâèñèìîñòè îò ñòàäèè öèêëà ðàçâèòèÿ, ïèòàòåëüíîé ñðåäû è ÷åðåäîâàíèÿ Ðèñ. 1. Õèìè÷åñêàÿ ñòðóêòóðà íàèáîëåå òèïè÷íûõ äëÿ ìèêðîâîäîðîñëåé ëèïèäîâ: à – òðèàöèëãëèöåðèäû; á – äèàöèëãëèöåðèäû; â – ìîíîãëèöåðèäû; ã, ä – ôîñôî- ëèïèäû, å – ñòåðîëû; æ – ñóëüôîëèïèäû; ç – ãëèêî- ëèïèäû; è – êàðîòèíîèäû (ñòðóêòóðíûå ôîðìóëû âçÿòû íà ñàéòå http://www.lipidmaps.org) 33 Áèîäèçåëü èç ìèêðîâîäîðîñëåé: ïóòè ïîâûøåíèÿ ýôôåêòèâíîñòè íàêîïëåíèÿ ëèïèäîâ ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 ñâåòîâîé/òåìíîâîé ôàç â òå÷åíèå ñóòîê [16, 17, 35–38]. Äëÿ ïîíèìàíèÿ, êàêèì îáðàçîì ìîæíî ïî- âëèÿòü íà ïðîöåññû îáðàçîâàíèÿ æèðíûõ êèñ- ëîò è èõ ìåòàáîëèçìà â êëåòêàõ ìèêðîâîäî- ðîñëåé, íåîáõîäèìî êðàòêî ðàññìîòðåòü îñíîâ- íûå ïðîöåññû, â êîòîðûå îíè âîâëå÷åíû. Âñëåäñòâèå ðàçíîîáðàçèÿ ëèïèäîâ ñóùåñòâóåò áîëüøîå êîëè÷åñòâî ïóòåé èõ áèîñèíòåçà.  öåëîì, ìîæíî âûäåëèòü òðè îñíîâíûõ ýòàïà èõ ñèíòåçà, ê êîòîðûì îòíîñÿòñÿ: áèîñèíòåç æèðíûõ êèñëîò, ñèíòåç òðèãëèöåðèäîâ è, íà- êîíåö, èõ ìîáèëèçàöèÿ â îëåîñîìû, êàê ýòî èçîáðàæåíî íà ðèñ. 2 [39].  ðàáîòàõ [20, 21, 40, 41] ïîäðîáíî ðàññìîò- ðåí ïóòü ñèíòåçà æèðíûõ êèñëîò ñ ïîñëåäóþ- ùèì ïðåâðàùåíèåì èõ â òðèãëèöåðèäû. Òàê, íà ïåðâîì ýòàïå ïðè ó÷àñòèè àöåòèë-ÊîÀ-êàðáîê- ñèëàçû êàê êàòàëèçàòîðà èç ÑÎ2, ÀÒÔ è àöå- òèë-ÊîÀ ôîðìèðóåòñÿ ìàëîíèë-ÊîÀ (ðèñ. 3) [42–45]. Çàòåì ïîëó÷åííûé ìàëîíèë èñïîëü- çóåòñÿ â ïðèðàùåíèè àöèëüíîé ãðóïïû êàê îñíîâíîé èñòî÷íèê óãëåðîäà [46]. Íà ñëåäó- þùåé ñòàäèè ïðîèñõîäèò ïåðåíîñ àöèëüíîé ãðóïïû, êîòîðûé õàðàêòåðèçóåòñÿ âêëþ÷åíèåì ïðîòåèíîâîãî êîôàêòîðà èëè àöèëïåðåíîñÿ- ùåãî áåëêà (ACP) è äâóõ ìîëåêóë àöåòèë-ÊîÀ.  òî âðåìÿ êàê êîìïëåêñ ìàëîíèë-ÊîÀ/ÀÑÐ âûñîêîñïåöèôè÷åí, àöåòèë-ÊîÀ/ÀÑÐ èìååò ìå- íüøåå ñðîäñòâî è ìîæåò ðåàãèðîâàòü ñ äðóãè- ìè íèçêîìîëåêóëÿðíûìè êîìïîíåíòàìè àöèë- ÊîÀ, òàêèìè êàê ïðîïèîíèë-ÊîÀ, è äàâàòü, òà- êèì îáðàçîì, íà÷àëî ïðèðàùåíèþ ê ðàçíîìó êîëè÷åñòâó àòîìîâ óãëåðîäà, ïðèâîäÿùåìó ê âåòâëåíèþ æèðíûõ êèñëîò. Íåñìîòðÿ íà äî- âîëüíî ðàñïðîñòðàíåííîå âåòâëåíèå æèðíûõ êèñëîò ó áàêòåðèàëüíûõ ëèïèäîâ, ýòî ÿâëåíèå âñòðå÷àåòñÿ ó ìèêðîâîäîðîñëåé äîâîëüíî ðåä- êî. Ñèíòåçèðîâàííûå æèðíûå êèñëîòû âêëþ- ÷àþòñÿ â ëèïèäíûå êîìïîíåíòû ëèáî õëîðî- ïëàñòîâ, ëèáî ýíäîïëàçìàòè÷åñêîãî ðåòèêóëó- ìà [47]. Ýòè ïóòè èñïîëüçóåò ãëèöåðîë-3-ôîñ- ôàò êàê «ëåñà» äëÿ ïîñëåäîâàòåëüíîãî ïðè- ñîåäèíåíèÿ æèðíûõ êèñëîò, âîñïîëíÿåìûõ àöèë-ÊîÀ. Ïðîèñõîæäåíèå è ìåòàáîëè÷åñêèé ïóòü àöå- òèë-ÊîÀ äëÿ òàêîé ðåàêöèè – âàæíàÿ òî÷êà ðåãóëÿöèè ýòîé ÷àñòè ïóòè ñèíòåçà ëèïèäîâ. Àöåòèë-ÊîÀ ìîæåò áûòü ïîëó÷åí â ïðîöåññå ãëèêîëèçà, ëîêàëèçîâàííîãî â ïëàñòèäàõ èëè öèòîçîëå, èëè æå íåïîñðåäñòâåííî èç öèêëà Êàëüâèíà (ñâåòîâàÿ ôàçà). Öèòîçîëüíûé ãëèêî- ëèç â ðàñòèòåëüíûõ êëåòêàõ òåñíî ñâÿçàí ñ äåãðàäàöèåé ñàõàðîçû, â ðåçóëüòàòå ÷åãî îáðà- çóþòñÿ ôðóêòîçî-6-ôîñôàò, ãëþêîçî-6-ôîñôàò è, íàêîíåö, ôîñôîåíîëïèðóâàò. Ïîñëåäíèé ìî- PlastidFA synthesis Fatty acyl CoAs ?TAG TAGG3P LPA PA DAG GPAT LPAT PAP DGAT PDAT Endoplasmic reticulum PC ( ?)DGTS Lyso-PC ( ?)Lyso-DGTS Ðèñ. 2. Òðè îñíîâíûõ ïóòè ôîðìèðîâàíèÿ òðèãëèöåðèäîâ â êëåòêàõ Chlamydomonas reinhardtii. Ïîä÷åðêíóòû íåäîñòàòî÷íî èçó÷åííûå ýòàïû, òðåáóþùèå äîïîëíèòåëüíîé ïðîâåðêè è ïîäòâåðæäåíèÿ: DAG – äèàöèë- ãëèöåðîë, GPAT – ãëèöåðîë-3-ôîñôàò, LPAT – àöèëòðàíñôåðàçà ëèçîôîñôàòèäíîé êèñëîòû, LPA – ëè- çîôîñôàòèäíàÿ êèñëîòà, PA – ôîñôàòèäíàÿ êèñëîòà, PAP – ôîñôàòàçà ôîñôàòèäíîé êèñëîòû, TAG – òðèàöèëãëèöåðîë, DGTS – äèàöèëãëèöåðîëòðèìåòèëãîìîñåðèí (ñõåìà èç ñàéòà: http://lipidlibrary.aocs.org/ plantbio/tag_algae/index.htm) 34 Â.È. Êîðõîâîé, ß.Á. Áëþì ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 æåò áûòü ëåãêî ïåðåíåñåí â õëîðîïëàñòû, âî- âëåêàÿñü òàì â ðàçëè÷íûå ïóòè ìåòàáîëèçìà, îäíèì èç êîòîðûõ ÿâëÿåòñÿ ñèíòåç æèðíèõ êèñëîò. Äåòàëüíîå îáñóæäåíèå ðåãóëÿöèè ñèí- òåçà ëèïèäîâ ìîæíî íàéòè â ðàáîòå [48], ãäå òàêæå îáñóæäàåòñÿ âîçìîæíîñòü èñïîëüçîâàíèÿ àöåòèë-ÊîÀ è ìàëîíèë-ÊîÀ â õëîðîïëàñòàõ. Óêàçàííûé öèêë – íå åäèíñòâåííûé. Ñó- ùåñòâóåò åùå òàê íàçûâàåìûé êðóãîîáîðîò æèðíûõ êèñëîò – ïóòü, ïðè êîòîðîì èñ- ïîëüçóþòñÿ ïðèñóòñòâóþùèå â êëåòêå æèðíûå êèñëîòû, íàïðèìåð, ëèïèäû ìåìáðàí. Ïîêàçà- íî, ÷òî â áûñòðîðàñòóùèõ êëåòêàõ ëèïèäíûé ìåòàáîëèçì ñîñðåäîòî÷åí íà ñèíòåçå ëèïèä- íûõ ìåìáðàí [41, 49]. Áîëüøèíñòâî ëèïèäîâ â òàêîì ñëó÷àå ñèíòåçèðóþòñÿ âíîâü. Íàïðèìåð, â ñëó÷àå ñèíòåçà â ñòðåññîâûõ óñëîâèÿõ òîëü- êî ïîëîâèíà èç óâåëè÷èâàþùåãîñÿ êîëè÷åñòâà ëèïèäîâ ñèíòåçèðóåòñÿ çàíîâî, â òî âðåìÿ êàê îñòàëüíûå èç íàêîïëåííûõ ëèïèäîâ ÿâëÿþòñÿ ðåçóëüòàòîì ïåðåðàáîòêè ñóùåñòâóþùèõ æèð- íûõ êèñëîò, íàïðèìåð, ñîäåðæàùèõñÿ â ìåì- áðàíàõ êëåòêè èëè îðãàíåëë. Ðåãóëÿöèÿ ìåòàáîëèçìà òðèãëèöåðèäîâ ïðî- èñõîäèò íà íåñêîëüêèõ óðîâíÿõ â çàâèñèìîñòè îò âíóòðåííåãî ñîñòîÿíèÿ êëåòêè è âíåøíèõ âîçäåéñòâèé íà íåå. Òàê, ïîêàçàíî ïîâûøå- íèå àêòèâíîñòè ñïåöèôè÷åñêîé ê ìåìáðàí- íûì ëèïèäàì àöèëãèäðîëàçû â êëåòêàõ D. sa- lina ïðè äåôèöèòå àçîòà [36]. Ïîäîáíûå ïðî- öåññû ïðîõîäÿò è â äðîææåâûõ êëåòêàõ: íà- áëþäàåòñÿ ñíèæåíèå àêòèâíîñòè ðàçðóøàþùåé òðèãëèöåðèäû ëèïàçû íà îáåäíåííûõ ñðåäàõ. Àâòîðû ïðåäïîëàãàþò, ÷òî æèðíûå êèñëîòû ïðåèìóùåñòâåííî ñîõðàíÿþòñÿ è àêêóìóëèðó- þòñÿ â âèäå òðèãëèöåðèäîâ òîëüêî äëÿ òîãî, ÷òîáû ñòàòü áûñòðî ìîáèëèçèðîâàííûìè äëÿ âûõîäà èç äåôèöèòà ïèòàíèÿ [49]. Применение методов генетической инженерии микроводорослей с целью повышения эффективности накопления липидов  ìíîãî÷èñëåííûõ îáçîðàõ îáñóæäàþòñÿ êàê òðàäèöèîííûå ìåòîäû ñåëåêöèè ìèêðîâîäî- ðîñëåé ïî òåì èëè èíûì èíòåðåñóþùèì èñ- ñëåäîâàòåëåé ïðèçíàêàì, òàê è ãåííî-èíæåíåð- íûå ïîäõîäû ñ öåëüþ ïîëó÷åíèÿ âûñîêîýô- ôåêòèâíûõ øòàììîâ [6, 50–52].  ïîñëåä- íåå âðåìÿ íàìè ïðîâåäåíû èññëåäîâàíèÿ ïî îöåíêå áèîýíåðãåòè÷åñêîãî ïîòåíöèàëà îäíîé èç ñàìûõ áîëüøèõ îòå÷åñòâåííûõ êîëëåêöèé øòàììîâ ìèêðîâîäîðîñëåé – IBASU-A [53– 55]. Ïî ñëîæèâøèìñÿ êëàññè÷åñêèì ïîäõîäàì äëÿ ïîâûøåíèÿ ñèíòåçà ëèïèäîâ íåîáõîäè- ìû èçìåíåíèÿ â ïóòÿõ èõ áèîñèíòåçà. Âíà÷à- ëå êðàòêî îñòàíîâèìñÿ íà ðàáîòàõ, â êîòîðûõ ïðåäïðèíèìàëèñü ïîïûòêè èçìåíåíèÿ æèðíî- êèñëîòíîãî ñèíòåçà ó âûñøèõ «òðàäèöèîííûõ» ìàñëè÷íûõ ðàñòåíèé. Èññëåäîâàíèÿ ïðîâîäè- ëèñü íà áîëåå ðàííèõ ñòàäèÿõ, ñ îäíîé ñòîðî- íû, â íàïðàâëåíèè ïîâûøåíèÿ ýêñïðåññèè ãå- íîâ, âêëþ÷åííûõ íåïîñðåäñòâåííî â áèîñèíòåç æèðíûõ êèñëîò, è ñ äðóãîé – â íàïðàâëåíèè «âûêëþ÷åíèÿ» ãåíîâ, îòâåòñòâåííûõ çà êàòàáî- Ðèñ. 3. Ñèíòåç æèðíûõ êèñëîò è òðèàöèëãëèöåðîëîâ [40] 35 Áèîäèçåëü èç ìèêðîâîäîðîñëåé: ïóòè ïîâûøåíèÿ ýôôåêòèâíîñòè íàêîïëåíèÿ ëèïèäîâ ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 ëèçì æèðíûõ êèñëîò. Îäèí èç ãëàâíûõ ýòàïîâ ñèíòåçà – ïðåâðàùåíèå àöåòèë-ÊîÀ â ìàëîíèë- ÊîÀ, êàòàëèçèðóåìûé àöåòèë-ÊîÀ-êàðáîêñè- ëàçîé (AÊîÀÊ) (ðèñ. 3). Îäíàêî íåñêîëüêî ïî- ïûòîê èñïîëüçîâàíèÿ ñòðàòåãèè ïîâûøåíèÿ ýêñïðåññèè ãåíà, îòâåòñòâåííîãî çà ñèíòåç àöå- òèë-ÊîÀ-êàðáîêñèëàçû, ïðèâåëè ê íåñêîëüêî íåîæèäàííûì ðåçóëüòàòàì. Íåñìîòðÿ íà óâåëè- ÷èâøóþñÿ â 2–3 ðàçà àêòèâíîñòü àöåòèë-ÊîÀ- êàðáîêñèëàçû â òðàíñôîðìèðîâàííûõ äèàòîìî- âûõ âîäîðîñëÿõ Cyclotella cryptica è N. saprophila óâåëè÷åíèå ñèíòåçà ëèïèäîâ íå ïðîèñõîäèëî [5, 56]. Êîíñòàòèðîâàëè òàêæå ïîâûøåííóþ ýêñïðåññèþ AÊîÀÊ, êëîíèðîâàííîé èç A. tha- liana, â ðàïñå (B. napus) è êàðòîôåëå (Solanum tuberosum) [57, 58]. Îäíàêî â ðåçóëüòàòå ïî- ëó÷èëè ëèøü íà 6 % áîëüøå æèðîâ â òðàíñ- ãåííîì ðàïñå ïî ñðàâíåíèþ ñ êîíòðîëüíûì íå- òðàíñôîðìèðîâàííûì ñîðòîì.  êëóáíÿõ òðàíñ- ãåííîãî êàðòîôåëÿ íàáëþäàëè ïÿòèêðàòíîå óâåëè÷åíèå ñîäåðæàíèÿ òðèãëèöåðèäîâ (ñ 0,0116 äî 0,0580 ìã/ã ñûðîé ìàññû). Ýòî ìî- æåò ñâèäåòåëüñòâîâàòü î òîì, ÷òî óðîâíè AÊîÀÊ ÿâëÿþòñÿ ëèìèòèðóþùèì ôàêòîðîì êàê ðàç â êëåòêàõ, êîòîðûå îáû÷íî íå ñïåöèàëèçèðîâà- íû äëÿ õðàíåíèÿ áîëüøèõ êîëè÷åñòâ ëèïèäîâ. Ïðåäïðèíèìàëèñü ïîïûòêè óâåëè÷åíèÿ êîëè- ÷åñòâà è äðóãèõ ôåðìåíòîâ, ïðèíèìàþùèõ ó÷àñòèå â ñèíòåçå æèðíûõ êèñëîò. Íàïðèìåð, óâåëè÷åíèå ýêñïðåññèè ãåíà, êîäèðóþùåãî 3- êåòîàöèë-ÀÑÐ-ñèíòàçó, êîòîðûé êëîíèðîâàí èç øïèíàòà, íå ïðèâåëî ê óâåëè÷åíèþ óðîâíÿ æèðíûõ êèñëîò â òðàíñãåííûõ òàáàêå, ðàïñå è àðàáèäîïñèñå [59].  öåëîì ìîæíî ñêàçàòü, ÷òî ïîâûøåíèå ýêñïðåññèè ãåíîâ, çàäåéñòâîâàííûõ â ëèïèä- íîì ñèíòåçå, íå èìåëî ñêîëüêî-íèáóäü ñåðüåç- íîãî âëèÿíèÿ íà ïîâûøåíèå óðîâíÿ ëèïèäîâ â òðàíñãåííûõ ðàñòåíèÿõ. Îäíàêî ñòîèò çàìåòèòü, ÷òî ïîâûøåííàÿ ýêñïðåññèÿ ãëèöåðîë-3-ôîñ- ôàò äåãèäðîãåíàçû â ñåìåíàõ ðàïñà ïðèâåëà ê ïîâûøåíèþ ìàñëà â ñåìåíàõ íà 40 % [60]. Ýòîò ôåðìåíò ïðèíèìàåò ó÷àñòèå â ñèíòåçå ãëèöåðîë- 3-ôîñôàòà, íåîáõîäèìîãî äëÿ ôîðìèðîâàíèÿ òðèàöèëãëèöåðîëîâ. Òàêîé ðåçóëüòàò äàåò îñ- íîâàíèå ïðåäïîëàãàòü, ÷òî êàê ðàç ãåíû, âî- âëå÷åííûå â ôîðìèðîâàíèå òðèãëèöåðîëîâ, ÿâ- ëÿþòñÿ êëþ÷åâûì çâåíîì, âëèÿþùèì íà èõ êîëè÷åñòâî â êëåòêå. Íåêîòîðûå èññëåäîâàíèÿ ïîäòâåðæäàþò ýòè ïðåäïîëîæåíèÿ. Òàê, îâåð- ýêñïðåññèÿ ãåíîâ, îòâåòñòâåííûõ çà ñèíòåç ãëè- öåðîë-3-ôîñôàò àöèëòðàíñôåðàçû, êèñëîé ëè- çîôîñôàòèä àöèëòðàíñôåðàçû èëè äèàöèëãëè- öåðîë àöèëòðàíñôåðàçû, ïðèâîäèëà ê çíà÷è- òåëüíîìó ïîâûøåíèþ ñèíòåçà ëèïèäîâ â ðàñ- òåíèÿõ [61–64]. Ó÷èòûâàÿ ïîëó÷åííûå ðåçóëü- òàòû, ñëåäóåò â ïåðâóþ î÷åðåäü ïðèëàãàòü óñè- ëèÿ â ñòîðîíó ïîâûøåíèÿ ýêñïðåññèè ýòèõ ãåíîâ äëÿ áîëüøåãî âûõîäà òðèãëèöåðèäîâ â ìèêðîâîäîðîñëÿõ. Ïî ñïðàâåäëèâîìó çàìå÷àíèþ Schuhmann et al. [65], ïðåêóðñîðû è ýíåðãèÿ, íåîáõîäèìûå äëÿ ñèíòåçà ëèïèäîâ, ïîñòàâëÿþòñÿ çà ñ÷åò ôî- òîñèíòåçà è ôèêñàöèè äèîêñèäà óãëåðîäà. Èç ýòîãî ñëåäóåò, ÷òî ëîãè÷íî íàïðàâëÿòü óñèëèÿ íà óëó÷øåíèå êëåòî÷íûõ ìåõàíèçìîâ ïîãëî- ùåíèÿ ñîëíå÷íîé ýíåðãèè è óãëåðîäà. Ñâåòî- ïîãëîùàþùèé êîìïëåêñ èãðàåò öåíòðàëüíóþ ðîëü â ïðîöåññå ôîòîñèíòåçà. Ôîòîñèíòåçèðó- þùèå îðãàíèçìû ëåãêî àäàïòèðóþòñÿ ê óñëî- âèÿì îñâåùåííîñòè, óâåëè÷èâàÿ ñâåòîâîñïðè- èì÷èâóþ àíòåííó ïðè íèçêîé èíòåíñèâíîñòè ñâåòà è, íàîáîðîò, óìåíüøàÿ åå ïðè âîçðàñòà- íèè ñâåòîâîãî ïîòîêà. Îäíàêî ÷àñòî ïîëó÷àå- ìàÿ êëåòêîé ñâåòîâàÿ ýíåðãèÿ ïðåâîñõîäèò ôîòîñèíòåòè÷åñêèå ñïîñîáíîñòè êëåòêè, è åå íåáåçîïàñíûé èçáûòîê ðàññåèâàåòñÿ ñ ïîìî- ùüþ ôëþîðåñöåíöèè õëîðîôèëëà. Êëåòêè, íà- õîäÿùèåñÿ áëèçêî ê ïîâåðõíîñòè, ïîëó÷àþò áîëüøîå êîëè÷åñòâî ñâåòîâîé ýíåðãèè, â òî æå âðåìÿ êëåòêè, íàõîäÿùèåñÿ â ãëóáèíå, ïîëó- ÷àþò îïòèìàëüíîå äëÿ ôîòîñèíòåçà èçëó- ÷åíèå.  ðàáîòå Polle et al. [66] ïîêàçàíî, ÷òî ñ ïîìîùüþ ÐÍÊ-òåõíîëîãèè áûë óìåíüøåí óðîâåíü ñâåòîïîãëîùàþùåãî áåëêà ²² (LCH – light-harvesting complex), ÷òî ïðèâåëî ê èçìå- íåíèþ öâåòà êóëüòóðû è óëó÷øèëî åå ñâåòîïî- ãëîùàþùèå ñïîñîáíîñòè. Ýòî â ñâîþ î÷åðåäü ñïîñîáñòâîâàëî óâåëè÷åíèþ ðîñòîâûõ õàðàê- òåðèñòèê ïðè âûñîêîé èíòåíñèâíîñòè îñâå- ùåíèÿ.  äðóãîé ðàáîòå èñïîëüçîâàëè èíóþ ñòðàòåãèþ – ïîëó÷åí ìóòàíòíûé êëîí ïóòåì èíñåðöèè â ÄÍÊ, ÷òî ïðèâåëî ê ðåäóêöèè ðàçìåðîâ àíòåííû [66]. Èíòåðåñíûé ïîäõîä ê óëó÷øåíèþ ôîòîñèíòåòè÷åñêèõ ñïîñîáíîñòåé, êîòîðûé, âîçìîæíî, ñûãðàåò çíà÷èòåëüíóþ ðîëü â ïîâûøåíèè ïðîäóêòèâíîñòè ìèêðîâî- äîðîñëåé, ïðåäïðèíÿò O’Neill et al. [68]. Ïîìèìî ïîâûøåíèÿ ýôôåêòèâíîñòè ñâåòî- ïîãëîùåíèÿ ïðîâîäèëèñü è ðàáîòû ïî óëó÷- 36 Â.È. Êîðõîâîé, ß.Á. Áëþì ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 øåíèþ ìåõàíèçìîâ àññèìèëÿöèè óãëåðîäà. Âîçìîæíîñòü èçìåíåíèÿ ïîãëîùåíèÿ óãëåðî- äà ïðåäñòàâèòåëåì äèàòîìîâûõ – P. tricor- nutum – ñ ïîìîùüþ ïåðåíîñà ãåíîâ, êîòîðûå êëîíèðîâàíû èç ðàçíûõ îðãàíèçìîâ, îòâåòñò- âåííûõ çà òðàíñïîðò ãëþêîçû, ïîêàçàíà Za- slavskaia et al. [68]. Îäíàêî ýêîíîìè÷åñêè îïðàâäàííàÿ áèîòåõíîëîãèÿ óñâîåíèÿ óãëåðîäà íàõîäèòñÿ ñêîðåå âñåãî â ìåõàíèçìàõ êîíöåí- òðàöèè ÑÎ2 [69] èëè ôèêñàöèè, êàòàëèçèðóå- ìîé ýíçèìàìè [70]. Äðóãîé âîçìîæíûé ïîäõîä ê ïîâûøåíèþ óðîâíÿ ëèïèäîâ â êëåòêàõ – áëîêèðîâàíèå ìåòàáîëè÷åñêèõ ïóòåé ñèíòåçà âûñîêîýíåðãå- òè÷åñêèõ ñîåäèíåíèé, òàêèõ êàê êðàõìàë. Êàê èçâåñòíî, äëÿ ñèíòåçà êðàõìàëà íåîáõîäèìû òå æå èñõîäíûå âåùåñòâà, ÷òî è äëÿ ñèíòåçà ëèïèäîâ. Äðóãèìè ñëîâàìè, ýòî äâà ïðîöåññà, êîíêóðèðóþùèõ çà èñõîäíûå ñóáñòðàòû – óãëå- âîäû [71, 72].  ðÿäå ïóáëèêàöèé [73–76] îá- ñóæäàþòñÿ ðåçóëüòàòû èññëåäîâàíèé äâóõ êðàõ- ìàë-äåôèöèòíûõ øòàììîâ C. reinhardtii – sta6 è sta7, ñîäåðæàùèõ ìóòàöèè â ãåíàõ ÀÄÔ- ãëþêîçî ïèðîôîñôîðèëàçå è èçîàìèëàçå ñî- îòâåòñòâåííî.  ðàáîòå [4] ñîîáùàåòñÿ î ïî- âûøåííûõ óðîâíÿõ òðèãëèöåðèäîâ â ýòèõ øòàì- ìàõ ïðè ñòðåññå íà ôîíå íåäîñòàòêà àçîòà. Work et al. [77] ñîîáùàþò îá àíàëîãè÷íûõ ðåçóëüòàòàõ íà ìóòàíòíûõ ïî èçîàìèëàçå øòàììàõ sta7–10 C. reinhardtii.  äðóãîì äåôèöèòíîì ïî êðàõ- ìàëó ìóòàíòíîì øòàììå Chlorella pyrenoi- dosa òàêæå óñòàíîâëåíî ïîâûøåíèå óðîâíÿ ïîëèíåíàñûùåííûõ æèðíûõ êèñëîò [78].  ñâîèõ ñòàòüÿõ Li et al. [79, 80] ïîêàçàëè, ÷òî ìóòàíòíûé ïî ëîêóñó STA6 øòàìì C. reinhar- dtii íàêàïëèâàåò â 10 ðàç áîëüøå ëèïèäîâ ïî ñðàâíåíèþ ñ äèêèì øòàììîì. Ñòîèò îòìåòèòü, ÷òî óäà÷íûå èçìåíåíèÿ ìå- òàáîëèçìà â ñòîðîíó ïîâûøåíèÿ óðîâíÿ ëè- ïèäîâ äîñòèãíóòû íå òîëüêî â âûñøèõ ðàñ- òåíèÿõ, íî è â äðîææàõ è áàêòåðèÿõ. Ãåííî- èíæåíåðíûå ìàíèïóëÿöèè ñ Escherichia coli è Saccharomyces cerevisiae ïî ãèïåðýêñïðåññèè èëè «âûêëþ÷åíèþ» ãåíîâ ïðèâåëè ê äîâîëüíî øè- ðîêîé ìîäóëÿöèè âñåõ ìåòàáîëè÷åñêèõ ïóòåé. Òàêèå ìîäèôèêàöèè òðóäíîäîñòèæèìû â îòíî- øåíèè ìèêðîâîäîðîñëåé, íî îíè ìîãóò áûòü âûïîëíèìû ñ âèäàìè, äëÿ êîòîðûõ ðàçðàáîòà- íû ìåòîäèêè ãåíåòè÷åñêîé òðàíñôîðìàöèè, è ñîîòâåòñòâóþùèìè ñåëåêòèâíûìè ìàðêåðàìè. Ïðèìåðîì îäíîé èç óäà÷íûõ âñåîáúåìëþùèõ ìîäèôèêàöèé E. coli ìîæíî íàçâàòü 20-êðàòíîå óâåëè÷åíèå ñèíòåçà ëèïèäîâ êàê ðåçóëüòàò óâå- ëè÷åíèÿ ýêñïðåññèè ãåíîâ (âêëþ÷àÿ àöåòèë- ÊîÀ êàðáîêñèëàçó), îòâåòñòâåííûõ çà ñèíòåç è âûêëþ÷åíèå ãåíîâ, ïðîäóêòû êîòîðûõ ó÷àñò- âóþò â ïðîöåññå îêèñëåíèÿ [81].  äðóãèõ èñ- ñëåäîâàíèÿõ ïîêàçàíî, ÷òî äëèííîöåïî÷å÷íûå æèðíûå êèñëîòû ìîãóò èíãèáèðîâàòü ñèíòåç æèðíûõ êèñëîò è ÷òî ýòî èíãèáèðîâàíèå ìî- æåò áûòü îáåñïå÷åíî ýêñïðåññèåé ñïåöèôè÷å- ñêèõ òèîñòåðàç [82, 83]. Óìåíüøåíèå ðàñõîäà ëèïèäîâ â ïðîöåññå êëåòî÷íîãî êàòàáîëèçìà – åùå îäèí ïóòü ïî- âûøåíèÿ èõ ñîäåðæàíèÿ â êëåòêå. Àêòèâèðî- âàíèå ãåíîâ, âêëþ÷åííûõ â áèîñèíòåç, è äå- àêòèâèðîâàíèå ãåíîâ, ó÷àñòâóþùèõ â -îêèñëå- íèè æèðíûõ êèñëîò, â íåêîòîðûõ ñëó÷àÿõ ïðè- âîäèò ê ïîâûøåíèþ óðîâíÿ ëèïèäîâ. Äëÿ ýòî- ãî ÷àùå âñåãî èñïîëüçóþò ëèáî ìåòîäû ìóòà- ãåíåçà, ëèáî ìåòîäèêó àíòèñìûñëîâûõ ÐÍÊ, ïðèâîäÿùèå ê ýôôåêòó «ìîë÷àíèÿ» ãåíîâ [84– 86]. Moellering et al. [87], èñïîëüçóÿ ìåòîäèêó àíòèñìûñëîâûõ ÐÍÊ ñ öåëüþ ïîíèæåíèÿ ýêñ- ïðåññèè ãåíà, îòâåòñòâåííîãî çà ðàçìåð ëèïèä- íûõ êàïåëü, ïîëó÷èëè òðàíñãåííûå êëîíû C. reinhardtii ñ óâåëè÷åííûìè ðàçìåðàìè æèðîâûõ ãëîáóë.  òî æå âðåìÿ ýòî íå ïîâëèÿëî íà îá- ùåå êîëè÷åñòâî òðèãëèöåðèäîâ â òðàíñãåíàõ. Îäíàêî ïðè èñïîëüçîâàíèè òàêèõ ïîäõîäîâ íå âñå òàê îäíîçíà÷íî: âûêëþ÷åíèå ãåíîâ, ïðèíèìàþùèõ ó÷àñòèå â ïðîöåññàõ êàòàáî- ëèçìà æèðíûõ êèñëîò, ïðèâîäèëî ê ïîñëåä- ñòâèÿì, ïàãóáíî âëèÿþùèì íà ðîñò è ïðî- ëèôåðàöèþ êëåòîê. Òàê, íàïðèìåð, äåàêòèâàöèÿ ïåðîêñèñîìàëüíîé äëèííîöåïî÷å÷íîé àöèë- ÊîÀ-ñèíòåòàçû â àðàáèäîïñèñå èíãèáèðîâàëà ðàñïàä æèðîâ â ñåìåíàõ, òåì ñàìûì ïîâûøàÿ èõ óðîâåíü. Îäíàêî ïðîöåññû íîðìàëüíîãî ðàç- âèòèÿ ñåìÿí òàêæå òîðìîçèëèñü áåç äîïîë- íèòåëüíûõ èñòî÷íèêîâ àçîòà [88]. Ïîäîáíóþ êàðòèíó íàáëþäàëè ïðè áëîêèðîâàíèè 3-êå- òîàöèë-ÊîÀ òèîëàçû â Arabidopsis thaliana [89]. Äðóãèå ïðîáëåìû, ñâÿçàííûå ñ óìåíüøåíèåì/ îòêëþ÷åíèåì êàòàáîëèçìà æèðíûõ êèñëîò, çà- êëþ÷àþòñÿ âî ìíîæåñòâåííîñòè ôåðìåíòîâ ñ äóáëèðóþùèìè ôóíêöèÿìè íà âñåõ ñòóïåíÿõ èõ îêèñëåíèÿ, ÷òî ïðåïÿòñòâóåò ïîëíîìó áëî- êèðîâàíèþ ïðîöåññà ðàçðóøåíèÿ ëèïèäîâ. Ïðèìåðîì ìîãóò ñëóæèòü êîðîòêîöåïî÷å÷íûå 37 Áèîäèçåëü èç ìèêðîâîäîðîñëåé: ïóòè ïîâûøåíèÿ ýôôåêòèâíîñòè íàêîïëåíèÿ ëèïèäîâ ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 àöèë-ÊîÀ îêñèäàçíûå ýíçèìû ÀÑÕ3 è ÀÑÕ4 â àðàáèäîïñèñå. Ðàñòåíèÿ ñ åäèíè÷íûìè ìó- òàöèÿìè ÀÑÕ3 èëè ÀÑÕ4 èìåëè íîðìàëüíûé ðàñïàä æèðîâ è ðàçâèòèå ñåìÿí, â òî âðåìÿ êàê ìóòàíòíûå ïî îáåèì ÀÑÕ3 è ÀÑÕ4 íå- æèçíåñïîñîáíû, âåðîÿòíåå âñåãî, èç-çà ïîë- íîé ýëèìèíàöèè àöèë-ÊîÀ îêñèäàçíîé àêòèâ- íîñòè [90].  íåêîòîðûõ èññëåäîâàíèÿõ èíãè- áèðîâàíèå æèðíîêèñëîòíîãî îêèñëåíèÿ ïðè- âîäèëî ê íåîæèäàííûì ðåçóëüòàòàì. Òàê, â íåñêîëüêèõ ïóáëèêàöèÿõ [91–93] àâòîðû ñîîá- ùàþò íå òîëüêî î ïîâûøåíèè êîëè÷åñòâà âíóòðèêëåòî÷íûõ ñâîáîäíûõ æèðîâ, íî è î ñëó÷àÿõ èõ ñåêðåöèè çà ïðåäåëû êëåòêè. Åñëè ðàññìàòðèâàòü ïðîáëåìó âñåöåëî, òî äåëî íå òîëüêî â óâåëè÷åíèè êîëè÷åñòâà ëè- ïèäîâ, íî è â èõ êà÷åñòâåííîì ñîñòàâå. Äëÿ ïðîèçâîäñòâà áèîäèçåëÿ íàèáîëåå ïîäõîäÿò æèðíûå êèñëîòû ñ äëèíîé óãëåðîäíîãî îñòî- âà 12–14 àòîìîâ. Îñíîâíàÿ ìàññà ìèêðî- âîäîðîñëåé ñèíòåçèðóþò ëèïèäû ñ äëèíîé öå- ïè â 14–20 àòîìîâ óãëåðîäà. Ôåðìåíò àöèë- ÀÑÐ òèîñòåðàçà îòâå÷àåò çà äëèíó öåïè è äëÿ íåå õàðàêòåðíà âèäîñïåöèôè÷íîñòü: â ðàçëè÷- íûõ îðãàíèçìàõ ïîä âîçäåéñòâèåì ýòîãî ôåð- ìåíòà ôîðìèðóþòñÿ ëèïèäû ðàçíîé äëèíû.  ðàáîòàõ [83, 94] ïðåäñòàâëåíû ðåçóëüòàòû, ïî- êàçûâàþùèå âîçìîæíîñòü èçìåíåíèÿ äëèíû æèðíûõ êèñëîò çà ñ÷åò òðàíñôîðìàöèè êîí- ñòðóêöèåé, â ñîñòàâ êîòîðîé âêëþ÷åí ãåí òèî- ñòåðàçû (12:0-ñìåùåííîé), êëîíèðîâàííûé èç Umbellularia californica.  ïîëó÷åííûõ òðàíñ- ãåííûõ ëèíèÿõ A. thaliana è E. ñoli íàáëþäàëè ñóùåñòâåííûå èçìåíåíèÿ êà÷åñòâåííîãî ñîñ- òàâà ëèïèäîâ â ñòîðîíó óâåëè÷åíèÿ êîëè÷åñòâà ëàóðèíîâîé êèñëîòû (Ñ12). Ïîäîáíûì æå îá- ðàçîì ãåí òèîñòåðàçû (14:0-ñìåùåííîé), êëî- íèðîâàííûé èç Cinnamomum camphorum è òðàíñ- ôîðìèðîâàííûé â A. thaliana è E. ñoli, ñó- ùåñòâåííî ïîâëèÿë íà óðîâåíü ìèðèñòèíî- âîé êèñëîòû (Ñ14) â ñòîðîíó åãî ïîâûøå- íèÿ [95].  íåäàâíî îïóáëèêîâàííîé ðàáîòå c èñïîëüçîâàíèåì ýòèõ æå êîíñòðóêöèé àâòîðû ñîîáùàþò î ïîäîáíûõ èçìåíåíèÿõ â òðàíñ- ãåííîé ìèêðîâîäîðîñëè Phaeodactylum tricornu- tum [96]. Âûõîä ëàóðèíîâîé êèñëîòû âûðîñ íà 6,2 % è ìèðèñòèíîâîé íà 12 % ïî îòíîøåíèþ ê èñõîäíîìó íåòðàíñãåííîìó êëîíó. Äëÿ ïðî- èçâîäñòâà áåíçèíà è àâèàöèîííîãî òîïëèâà èñïîëüçóþò æèðíûå êèñëîòû ñ åùå áîëåå êî- ðîòêèìè óãëåðîäíûìè öåïÿìè. Äëÿ óêîðî÷å- íèÿ òðàäèöèîííî èñïîëüçóþò ãèäðîêðåêèíã. Íî ñ öåëüþ óìåíüøåíèÿ çàòðàò ìîæíî âîñ- ïîëüçîâàòüñÿ ìåòîäàìè ãåííîé èíæåíåðèè. Íàïðèìåð, ãèïåðýêñïðåññèÿ 8:0- è 10:0-ñìå- ùåííîé òèîñòåðàçû â ðàïñå, êëîíèðîâàííîé èç Cuphea hookeriana, ïðèâåëà ê óâåëè÷åíèþ ñèí- òåçà êîðîòêîöåïî÷å÷íûõ æèðíûõ êèñëîò [97]. Ðàññìîòðåííûå ïóòè ïîâûøåíèÿ êîëè÷åñòâà è èçìåíåíèÿ êà÷åñòâà æèðíûõ êèñëîò â òðà- äèöèîííî âûðàùèâàåìûõ äëÿ ýòèõ öåëåé ðàñòåíèÿõ âïîëíå ìîãóò áûòü ïðèìåíèìû è ê ìèêðîâîäîðîñëÿì. Ïî ìíåíèþ Radakovits et al. [98], åùå îäíà âàæíàÿ îñîáåííîñòü âïîëíå ìîæåò áûòü ðàññìîòðåíà â êà÷åñòâå àëüòåðíàòèâíîãî ïóòè ïîâûøåíèÿ íàêîïëåíèÿ ëèïèäîâ ìèêðîâîäîðîñëÿìè. Ýòî ñëîæíûå èç- ìåíåíèÿ ýêñïðåññèè ãåíîâ â ñòðåññîâûõ óñ- ëîâèÿõ – ïðè íåäîñòàòêå àçîòíîãî ïèòàíèÿ, êîãäà ïðåêðàùàþòñÿ ïðîöåññû ïðîëèôåðàöèè è íà÷èíàåòñÿ àêòèâíûé ñèíòåç ëèïèäîâ è êðàõ- ìàëà [21].  òàêîì ñëó÷àå ïîâûøåííàÿ ýêñ- ïðåññèÿ ãåíîâ, îòâåòñòâåííûõ çà ñèíòåç ëèïè- äîâ, ìîæåò áûòü ïîëåçíîé, åñëè áóäåò êîíòðî- ëèðîâàòüñÿ èíäóöèáåëüíûì ïðîìîòîðîì, êî- òîðûé ìîæíî àêòèâèðîâàòü íà îïðåäåëåííîé ñòàäèè ðàçâèòèÿ êëåòêè è ïðè îïðåäåëåííîé ïëîòíîñòè ñóñïåíçèè. Ïðèìåðàìè òàêèõ ïðî- ìîòîðîâ â ìèêðîâîäîðîñëÿõ ìîãóò ñëóæèòü ÷óâñòâèòåëüíûé ê ìåäè ïðîìîòîð ó C. rein- hardtii [99] è íèòðàò, ÷óâñòâèòåëüíûé ó ïðåä- ñòàâèòåëåé äèàòîìîâûõ [100]. È íàêîíåö, â íåäàâíèõ ïóáëèêàöèÿõ îò- êðûâàþòñÿ íîâûå ïîäõîäû, çàêëþ÷àþùèåñÿ â ïîïûòêàõ àíàëèçà òðàíñêðèïòîìà ìèêðîâîäî- ðîñëåé ñ öåëüþ îñìûñëåíèÿ ïðîèñõîäÿùèõ â ñòðåññîâûõ óñëîâèÿõ ïðîöåññîâ èíòåíñèâíîãî íàêîïëåíèÿ ëèïèäîâ. Îäíîé èç ïåðâûõ â ýòîì íàïðàâëåíèè ñòàëà ðàáîòà [101], â êîòîðîé àâ- òîðû ñîîáùàþò î ñåêâåíèðîâàíèè ãåíîìà è ðàçâèòèè ìåòîäà òðàíñôîðìàöèè äëÿ Nanno- chloropis gaditana. Óïîìÿíóòûå èññëåäîâàíèÿ ïî- çâîëèëè îïðåäåëèòü óçêèå ìåñòà ñèíòåçà òðè- ãëèöåðèäîâ, ÷òî ïîçâîëèëî âûðàáîòàòü äàëü- íåéøóþ ñòðàòåãèþ óëó÷øåíèÿ äàííîãî øòàì- ìà ïî óâåëè÷åíèþ ñèíòåçà ëèïèäîâ. Ñðåäè ïîòåíöèàëüíûõ ìèøåíåé – ãåíû, çàäåéñòâî- âàííûå â ñèíòåçå òðèãëèöåðèäîâ (Nga21116, Nga02737), à òàêæå ãåíû òðèàöèëãëèöåðîë ëè- ïàçû (Nga30958, Nga30749) è àöèë-ÊîÀ îêñè- 38 Â.È. Êîðõîâîé, ß.Á. Áëþì ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 äàçû (Nga03053, Nga04370.1, Nga30819). Êðîìå òîãî, èíòåðåñíû äëÿ èññëåäîâàíèÿ â îòíîøå- íèè ïîâûøåííîé ýêñïðåññèè ãåíû óãëåðîäíîé àíãèäðàçû è òðàíñïîðòàçû áèêàðáîíàòîâ.  ðà- áîòå Wan et al. [102] òàêæå èñïîëüçîâàí ïîäõîä òðàíñêðèïòîìíîãî àíàëèçà îäíîêëåòî÷íîé ïî- ÷âåííîé æåëòî-çåëåíîé ìèêðîâîäîðîñëè Eus- tigmatos cf. ðolyphem.  ðåçóëüòàòå ïðîâåäåííûõ èññëåäîâàíèé âûÿâëåíû îñíîâíûå ïóòè áèî- ñèíòåçà è êàòàáîëèçìà áîëüøèíñòâà óãëåâîäîâ, æèðíûõ êèñëîò, êàðîòèíîèäîâ è òðèãëèöåðîëîâ â Eustigmatos cf. ðolyphem. Ïîëó÷åííûå äàííûå áóäóò ïîëîæåíû â îñíîâó ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè- ÷åñêèõ èññëåäîâàíèé â îáëàñòè ôóíêöèîíàëü- íîé ãåíîìèêè äëÿ êîððåêöèè óñèëèé â îáëàñòè ìåòàáîëè÷åñêîé èíæåíåðèè, íàïðàâëåííûõ íà ïîâûøåíèå êà÷åñòâåííûõ õàðàêòåðèñòèê ìèêðî- âîäîðîñëåé êàê ñûðüÿ äëÿ ïðîèçâîäñòâà áèî- òîïëèâà. Â.È. Êîðõîâîé, ß.Á. Áëþì Institute of Food Biotechnology and Genomics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv Å-mail: korkhovy_v@ukr.net BIODIESEL FROM MICROALGAE: WAYS OF INCREASING EFFECTIVENESS OF LIPIDS ACCUMULATION BY GENETIC ENGINEERING METHODS Microalgae are viewed as one of the most perspective producer of lipids for biodiesel production. The review shows the results of researches of genes’ expression in- crease actually included in fatty acids biosynthesis. The increase of effectiveness of solar energy absorption and carbon dioxide fixation influences the microalgae produc- tivity. Blocking expression of genes that are responsible for starch synthesis, changes the balance towards the quantity growth of lipids in the cell. The change of the length in fatty acids carbon backbone chain towards its shortening is important in the technology of biodiesel production. Operating processes of lipids’ catabolism is another way of increasing their quantity. And at last using the meth- ods of transcription analysis allows us to get deeper into the process of intensive accumulation of lipids in stressful conditions for the purpose of directing these processes. Â.². Êîðõîâèé, ß.Á. Áëþì Á²ÎÄÈÇÅËÜ Ç Ì²ÊÐÎÂÎÄÎÐÎÑÒÅÉ: ØËßÕÈ Ï²ÄÂÈÙÅÍÍß ÅÔÅÊÒÈÂÍÎÑÒ² ÍÀÊÎÏÈ×ÅÍÍß Ë²Ï²Ä²Â ÌÅÒÎÄÀÌÈ ÃÅÍÅÒÈ×Íί ²ÍÆÅÍÅв¯ ̳êðîñêîï³÷í³ âîäîðîñò³ ðîçãëÿäàþòüñÿ ÿê îäèí ç íàéá³ëüø ïåðñïåêòèâíèõ ïðîäóöåíò³â ë³ï³ä³â äëÿ âèðîáíèöòâà á³îäèçåëÿ.  îãëÿä³ ïðåäñòàâëåíî ðå- çóëüòàòè äîñë³äæåíü ïî çá³ëüøåííþ åêñïðåñ³¿ ãåí³â, ÿê³ áåçïîñåðåäíüî áåðóòü ó÷àñòü ó ñèíòåç³ æèðíèõ êèñëîò. ϳäâèùåííÿ åôåêòèâíîñò³ ìåõàí³çì³â ïîãëè- íàííÿ ñîíÿ÷íî¿ åíåð㳿 òà ô³êñàö³¿ äèîêñèäó âóãëåöþ âïëèâຠíà ïðîäóêòèâí³ñòü ì³êðîâîäîðîñòåé. Áëî- êóâàííÿ åêñïðåñ³¿ ãåí³â, â³äïîâ³äàëüíèõ çà ñèíòåç êðîõìàëþ, çì³íþº áàëàíñ â á³ê çá³ëüøåííÿ ë³ï³ä³â ó êë³òèí³. Çìåíøåííÿ äîâæèíè âóãëåöåâîãî ëàíöþ- ãà âàæëèâå â òåõíîëî㳿 âèðîáíèöòâà á³îäèçåëÿ. Êå- ðóâàííÿ øëÿõàìè êàòàáîë³çìó ë³ï³ä³â – ùå îäèí ç íàïðÿì³â çá³ëüøåííÿ ¿õ ê³ëüêîñò³. ², íàñàìê³íåöü, âèêîðèñòàííÿ ìåòîä³â àíàë³çó òðàíñêðèïòîìà äî- çâîëÿº ãëèáøå âèâ÷èòè ïðîöåñè ³íòåíñèâíîãî íàêî- ïè÷åííÿ ë³ï³ä³â â óìîâàõ ñòðåñó ç ìåòîþ êåðóâàííÿ öèìè ïðîöåñàìè. ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ 1. Parry M., Arnell N., Nicholls R. et al. Millions at risk: defining critical climate change threats and tar- gets // Global Environ. Change. – 2001. – 11. – P. 181–183. 2. Schenk P.M., Thomas-Hall S.R., Stephens E. et al. Second generation biofuels: high-efficiency micro- algae for biodiesel production // Bioenerg. Res. – 2008. – 1. – P. 20–43. 3. Greenwell H.C., Laurens L.M.L., Shields R.J. et al. Placing microalgae on the biofuels priority list: a re- view of the technological challenges // J. R. Soc. Interface. – 2010. – 7. – P. 703–726. 4. Wang Z.T., Ullrich N., Joo S. et al. Algal lipid bod- ies: stress induction, purification, and biochemical characterization in wild-type and starch-less Chlam- ydomonas reinhardtii // Eukaryot. Cell. – 2009. – 8, ¹ 12. – Ð. 1856–1868. 5. Sheehan J., Dunahay T., Benemann J., Roesler P. A look back at the US Department of Energy’s Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae. – Depart- ment of Energy, Golden, CO, 1998. 6. Chisti Y. Biodiesel from microalgae // Biotech. Adv. – 2007. – 25. – Ð. 294–306. 7. Delucchi M.A. A Lifecycle Emission Model (LEM): Lifecycle emissions from transportation fuels; motor vehicles, transportation modes, electricity use, heat- ing and cooking fuels / Institute of Transport Studies, Univ. California : Davis, 2003. 8. Wang B., Li Y., Wu N., Lan C.Q. CO2 bio-mitigation using microalgae // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2008. – 79. – P. 707–718. 9. Handbook of microalgal culture: biotechnology and phycology / Ed. A. Richmond. – Oxford : Blackwell publ., 2004. – 588 p. 10. Borowitzka M.A. Commercial production of microal- gae: ponds, tanks, tubes and fermenters // J. Biotech- nol. – 1999. – 70. – P. 313–321. 11. Tsukada O., Kawahara T., Miyachi S. Mass culture of 39 Áèîäèçåëü èç ìèêðîâîäîðîñëåé: ïóòè ïîâûøåíèÿ ýôôåêòèâíîñòè íàêîïëåíèÿ ëèïèäîâ ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 Chlorella in Asian countries // Biological Solar En- ergy Conversion / Eds A. Mitsui et al. – New York : Acad. Press, 1977. – P. 363–365. 12. Lee Y.K. Commercial production of microalgae in the Asia–Pacific rim // J. Appl. Phycol. – 1997. – 9. – Ð. 403–411. 13. Li Q., Du W., Liu D. Perspectives of microbial oils for biodiesel production // Appl. Microbiol. Biotech- nol. – 2008. – 80. – P. 749–756. 14. European Biodiesel Board. The EU biodiesel indus- try. Available online: http://www.ebb-eu.org/ stats. php (accessed on 18 January 2012). 15. TUSNBB. Production statistics. Available online: http://www.biodiesel.org/production/production- statistics (accesssed on 18 January 2012). 16. Áàñîâà Ì.Ì. Æèðíîêèñëîòíûé ñîñòàâ ëèïèäîâ íåêîòîðûõ âèäîâ ìèêðîâîäîðîñëåé // Àëüãîëî- ãèÿ. – 2005. – 15. – Ð. 415–436. 17. Sharma K.K., Schuhmann H., Schenk P.M. High lipid induction in microalgae for biodiesel production // Energies. – 2012. – 5. – P. 1532–1553. 18. Oswald W.J., Golueke C.G. Biological transformation of solar energy // Adv. Appl. Microbiol. – 1960. – 2. – P. 223–262. 19. Usui N., Ikenouchi M. Energy Convers. Manage. 38 (suppl. 1), S487. – 1997. 20. Hu D.W., Liu H., Yang C.L., Hu E.Z. The design and optimization for light-algae bioreactor controller based on Artificial Neural Network-Model Predictive Con- trol // Acta Astronaut. – 2008. – 63. – P. 1067–1075. 21. Hu Q., Sommerfeld M., Jarvis E. et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances // Plant J. – 2008. – 54. – P. 621–639. 22. Brockerhoff H., Hoyle R.J., Hwang P.C., Litchfield C. Positional distribution of fatty acids in depot triglycerides of aquatic animals // Lipids. – 1968. – 3. – P. 24–29. 23. Radmer R.J., Parker B.C. Commercial applications of algae : Opportunities and constraints // J. Appl. Phycol. – 1994. – 6. – Ð. 93–98. 24. Becker E.W. Microalgae in human and animal nu- trition // Handbook of Microalgal Culture / Ed. A. Richmond. – Oxford : Blackwell Publ., 2004. – P. 312–351. 25. Spo laore P., Joannis-Cassan C., Duran E., Isambert A. Commercial applications of microalgae // J. Bio- sci. Bioeng. – 2006. – 101. – P. 87–96. 26. Milledge J.J. Commercial application of microalgae other than as biofuels: a brief review // Rev. Environ. Sci. Biotechnol. – 2011. – 10. – P. 31–41. 27. Roessler P.G., Brown L.M., Dunahay T.G. et al. Ge- netic-engineering approaches for enhanced produc- tion of biodiesel fuel from microalgae // ACS Symp. Ser. – 1994. – 566. – P. 255–270. 28. Sawayama S., Inoue S., Dote Y., Yokoyama S.-Y. CO2 fixation and oil production through microalga // Energy Convers Manag. – 1995. – 36. – P. 729– 731. 29. Banerjee A., Sharma R., Chisti Y., Banerjee U.C. Bot- ryococcus braunii: a renewable source of hydrocar- bons and other chemicals // Crit. Rev. Biotechnol. – 2002. – 22. – P. 245–279. 30. Scott S.A., Davey M.P., Dennis J.S. et al. Biodiesel from algae: challenges and prospects // Curr. Opin. Biotechnol. – 2010. – 21. – P. 277–286. 31. Quinn J.C., Catton K., Wagner N., Bradley T.H. Cur- rent large-scale US biofuel potential from microalgae cultivated in photobioreactors // Bioenerg. Res. – 2012. – 5, ¹ 1. – P. 49. 32. Singh A., Nigam P.S., Murphy J.D. Renewable fuels from algae: An answer to debatable land based fuels // Biores. Technol. – 2011. – 102. – P. 10–16. 33. Ahmad A.L., Mat Yasin N.H., Derek C.J.C., Lim J.K. Microalgae as a sustainable energy source for bio- diesel production : A review // Renewable and Sus- tainable Energy Rev. – 2011. – 15. – P. 584–593. 34. Christie W.W. Lipid analysis. – Bridgewater, NJ: Oily Press, 2003. 35. Sato N., Murata N., Ueta N. Effect of growth tem- perature on lipid and fatty acid composition in the blue-green alga (cyanobacterium) Anabaena variabilis and Anacystis nidulans // Biochim. biophys. acta. – 1979. – 572. – P. 19–28. 36. Cho S.H., Thompson G.A.Jr. Properties of a fatty acid hydrolase preferentially attacking monogalactosyldia- cylglycerols in Dunalliella salina chloroplasts // Bio- chim. biophys. acta. – 1986. – 878. – P. 353–359. 37. Reitan K.I., Rainuzzo J.R., Olsen Y. Effect of nu- trient limitation on fatty acid and lipid content of marine microalgae // J. Phycol. – 1994. – 30. – P. 972–979. 38. Fidalgo J.P., Cide A., Torres E. et al. Effects of nitro- gen source and growth phase on proximate biochemi- cal composition, lipid classes and fatty acid profile of the marine microalga Isochrysis galbana // Aquacul- ture. – 1998. – 166, ¹ 1/2. – P. 105–116. 39. Li-Beisson Y. Triacylglycerol biosynthesis in eukary- otic microalgae // http://lipidlibrary.aocs.org/plant- bio/tag_algae/index.htm 40. Courchesne N.M.D., Parisien A., Wang B., Lan C.Q. Enhancement of lipid production using biochemi- cal, genetic and transcription factor engineering ap- proaches // J. Biotechnol. – 2009. – 141. – P. 31– 41. 41. Roessler P.G. Changes in the activities of various lipid and carbohydrate biosynthetic enzymes in the diatom Cyclotella cryptica in response to silicon deficien- cy // Arch. Biochem. Biophys. – 1988. – 267. – Ð. 521–528. 40 Â.È. Êîðõîâîé, ß.Á. Áëþì ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 42. Davis M.S., Solbiati J., Cronan J.E.Jr. Overproduc- tion of acetyl-CoA carboxylase activity increases the rate of fatty acid biosynthesis in Escherichia coli // J. Biol. Chem. – 2000. – 275, ¹ 37. – P. 28593– 28598. 43. Kim K.H. Regulation of mammalian acetyl-coenzy- me A carboxylase // Ann. Rev. Nutr. – 1997. – 17. – P. 77–99. 44. Li S.J., Cronan J.E.Jr. Growth rate regulation of Escherichia coli acetyl coenzyme A carboxylase, which catalyzes the first committed step of lipid bio- synthesis // J. Bacteriol. – 1993. – 175, ¹ 2. – P. 332–340. 45. Sendl A., Schliack M., Loser R. et al. Inhibition of cholesterol synthesis in vitro by extracts and isolated compounds prepared from garlic and wild garlic // Atherosclerosis. – 1992. – 94, ¹ 1. – P. 79–85. 46. Ohlrogge J., Browse J. Lipid biosynthesis // Plant Cell. – 1995. – 7. – P. 957–970. 47. Riekhof W.R., Sears B.B., Benning C. Annotation of genes involved in glycerolipid biosynthesis in Chlamydo- monas reinhardtii: discovery of the betaine lipid synthase BTA1Cr // Eukaryot. Cell. – 2005. – 4. – Ð. 242–252. 48. Post-Beittenmiller D., Roughan G., Ohlrogge J.B. Reg- ulation of plant fatty acid biosynthesis; analysis of acyl-coenzyme A and acyl-acyl carrier protein sub- strate pools in spinach and pea chloroplasts // Plant Physiol. – 1992. – 100. – P. 923–930. 49. Kurat C.F., Natter K., Petschnigg J. et al. Obese yeast: triglyceride lipolysis is functionally conserved from mammals to yeast // J. Biol. Chem. – 2006. – 281. – Ð. 491–500. 50. Rosenberg J.N., Oyler G.A., Wilkinson L., Betenbaugh M.J. A green light for engineered algae: redirecting me- tabolism to fuel a biotechnology revolution // Curr. Opin. Biotech. – 2008. – 19. – P. 430–436. 51. Hallmann A. Algal transgenics and biotechnology // Transgen. Plant J. – 2007. – 1. – P. 81–98. 52. Georgianna D.R., Mayfield S.P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal bio- fuels // Nature. – 2012. – 488. – P. 329–335. 53. Öàðåíêî Ï., Áîðèñîâà Î., Áëþì ß.Á. Âîäîðîñòi ÿê îá’ºêò á³îåíåðãåòèêè. ̳êðîâîäîðîñòi IBASU-A – ïåðñïåêòèâí³ ïðîäóöåíòè á³îìàñè ÿê äæåðåëà ñèðîâèíè äëÿ á³îïàëèâà // ³ñí. ÍÀÍ Óêðà¿- íè. – 2011. – ¹ 5. – Ñ. 49–54. 54. Öàðåíêî Ï.Ì., Áîðèñîâà Î.Â., Áëþì ß.Á. ̳êðî- âîäîðîñòi êîëåêö³¿ IBASU-A – ðåñóðñ á³îìàñè äëÿ îòðèìàííÿ á³îäèçåëÿ // Äîï. ÍÀÍ Óêðà¿- íè. – 2012. – ¹ 11. – Ñ. 172–178. 55. Êîðõîâèé Â.²., ϳðêî ß.Â., Öàðåíêî Ï.Ì. Ãåíåòè÷- íà äèôåðåíö³àö³ÿ øòàì³â Botryococcus braunii Kütz. – ïðîäóöåíò³â ë³ï³ä³â – çà äîïîìîãîþ RAPD ô³íãåðïðèíòèíãó // Äîï. ÍÀÍ Óêðà¿íè. – 2011. – ¹ 2. – Ñ. 144–149. 56. Dunahay T.G., Jarvis E.E., Roessler P.G. Genetic transformation of the diatoms Cyclotella cryptica and Navicula saprophila // J. Phycol. – 1995. – 31. – Ð. 1004–1011. 57. Klaus D., Ohlrogge J.B., Neuhaus H.E., Dormann P. Increased fatty acid production in potato by engineer- ing of acetyl-CoA carboxylase // Planta. – 2004. – 219. – P. 389–396. 58. Roesler K., Shintani D., Savage L. et al. Targeting of the Arabidopsis homomeric acetyl-coenzyme A car- boxylase to plastids of rapeseeds // Plant Physiol. – 1997. – 113. – P. 75–81. 59. Dehesh K., Tai H., Edwards P. et al. Overexpres- sion of 3-ketoacyl-acyl-carrier protein synthase IIIs in plants reduces the rate of lipid synthesis // Plant Physiol. – 2001. – 125. – P. 1103–1114. 60. Vigeolas H., Waldeck P., Zank T., Geigenberger P. Increasing seed oil content in oil-seed rape (Bras- sica napus L.) by over-expression of a yeast glycer- ol-3-phosphate dehydrogenase under the control of a seedspecific promoter // Plant Biotechnol. J. – 2007. – 5. – P. 431–441. 61. Jain R.K., Coffey M., Lai K. et al. Enhancement of seed oil content by expression of glycerol-3-phos- phate acyltransferase genes // Biochem. Soc. Trans. – 2000. – 28. – P. 959–960. 62. Jako C., Kumar A., Wei Y. et al. Seed-specific over- expression of an Arabidopsis cDNA encoding a dia- cylglycerol acyltransferase enhances seed oil content and seed weight // Plant Physiol. – 2001. – 126. – P. 861–874. 63. Lardizabal K., Effertz R., Levering C. et al. Expression of Umbelopsis ramanniana DGAT2A in seed increases oil in soybean // Plant Physiol. – 2008. – 148. – P. 89–96. 64. Taylor D.C., Katavic V., Zou J. et al. Field testing of transgenic rapeseed cv. Hero transformed with a yeast sn-2 acyltransferase results in increased oil content, erucic acid content and seed yield // Mol. Breed. – 2002. – 8. – P. 317–322. 65. Schuhmann H., Lim D.K.Y., Schenk P.M. Perspec- tives on metabolic engineering for increased lipid contents in microalgae // Biofuels. – 2012. – 3. – P. 71–86. 66. Polle J.E., Kanakagiri S.D., Melis A. tla1, a DNA insertional transformant of the green alga Chlamydo- monas reinhardtii with a truncated light-harvesting chlorophyll antenna size // Planta. – 2003. – 217. – P. 49–59. 67. O’Neill B.M., Mikkelson K.L., Gutierrez J.L. et al. An exogenous chloroplast genome for complex sequence manipulation in algae // Nucl. Acids Res. – 2012. – 40. – P. 2782–2792. 68. Zaslavskaia L.A., Lippmeier J.C., Shih C. et al. Tro- phic conversion of an obligate photoautotrophic or- 41 Áèîäèçåëü èç ìèêðîâîäîðîñëåé: ïóòè ïîâûøåíèÿ ýôôåêòèâíîñòè íàêîïëåíèÿ ëèïèäîâ ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 ganism through metabolic engineering // Science. – 2001. – 292. – P. 2073–2075. 69. Raven J.A. Inorganic carbon acquisition by eukaryot- ic algae: four current questions // Photosynth. Res. – 2010. – 106. – P. 123–134. 70. Whitney S.M., Houtz R.L., Alonso H. Advancing our understanding and capacity to engineer nature’s CO2- sequestering enzyme, Rubisco // Plant Physiol. – 2011. – 155. – P. 27–35. 71. Rawsthorne S. Carbon flux and fatty acid synthesis in plants // Prog. Lipid Res. – 2002. – 41. – P. 182– 196. 72. Weselake R.J., Taylor D.C., Rahman M.H. et al. In- creasing the flow of carbon into seed oil // Biotech- nol. Adv. – 2009. – 27. – P. 866–878. 73. Mouille G., Maddelein M.L., Libessart N. et al. Pre- amylopectin processing: a mandatory step for starch biosynthesis in plants // Plant Cell. – 1996. – 8. – Ð. 1353–1366. 74. Posewitz M.C., King P.W., Smolinski S.L. et al. Iden- tification of genes required for hydrogenase activ- ity in Chlamydomonas reinhardtii // Biochem. Soc. Trans. – 2005. – 33. – Ð. 102–104. 75. Posewitz M.C., Smolinski S.L., Kanakagiri S. et al. Hydrogen photoproduction is attenuated by disrup- tion of an isoamylase gene in Chlamydomonas rein- hardtii // Plant Cell. – 2004. – 16. – Ð. 2151–2163. 76. Zabawinski C., Van Den Koornhuyse N., D’Hulst C. et al. Starchless mutants of Chlamydomonas reinhardtii lack the small subunit of a heterotetrameric ADP- glucose pyrophosphorylase // J. Bacteriol. – 2001. – 183. – Ð. 1069–1077. 77. Work V.H., Radakovits R., Jinkerson R.E. et al. In- creased lipid accumulation in the Chlamydomonas reinhardtii sta7–10 starchless isoamylase mutant and increased carbohydrate synthesis in complemented strains // Eukaryot. Cell. – 2010. – 9. – P. 1251– 1261. 78. Ramazanov A., Ramazanov Z. Isolation and charac- terization of a starchless mutant of Chlorella pyre- noidosa STL-PI with a high growth rate, and high protein and polyunsaturated fatty acid content // Phycol. Res. – 2006. – 54. – Ð. 255–259. 79. Li Y.T., Han D.X., Hu G.R. et al. Chlamydomonas starchless mutant defective in ADP-glucose pyro- phosphorylase hyper-accumulates triacylglycerol // Metab. Eng. – 2010. – 12. – P. 387–391. 80. Li Y., Han D., Hu G., Sommerfeld M., Hu Q. Inhibi- tion of starch synthesis results in overproduction of lipids in Chlamydomonas reinhardtii // Biotechnol. Bioeng. – 2010. – 107. – P. 258–268. 81. Lu X., Vora H., Khosla C. Overproduction of free fatty acids in E. coli: implications for biodiesel pro- duction // Metab. Eng. – 2008. – 10. – P. 333–339. 82. Jiang P., Cronan J.E. Jr. Inhibition of fatty acid syn- thesis in Escherichia coli in the absence of phospho- lipid synthesis and release of inhibition by thioesterase action // J. Bacteriol. – 1994. – 176. – P. 2814–2821. 83. Voelker T.A., Davies H.M. Alteration of the specifici- ty and regulation of fatty acid synthesis of Escherichia coli by expression of a plant medium-chain acyl-acyl carrier protein thioesterase // J. Bacteriol. – 1994. – 176. – P. 7320–7327. 84. De Riso V., Raniello R., Maumus F. et al. Gene si- lencing in the marine diatom Phaeodactylum tricornu- tum // Nucl. Acids. Res. – 2009. – ¹ 41. – å96. 85. Molnar A., Bassett A., Thuenemann E. et al. Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in the unicellular alga Chlamydomonas reinhardtii // Plant J. – 2009. – 58 – P. 165–174. 86. Zhao T., Wang W., Bai X., Qi Y. Gene silencing by artificial microRNAs in Chlamydomonas // Plant J. – 2009. – 58. – P. 157–164. 87. Moellering E.R., Benning C. RNA interference silenc- ing of a major lipid droplet protein affects lipid drop- let size in Chlamydomonas reinhardtii // Eukaryot. Cell. – 2010. – 9. – P. 97–106. 88. Fulda M., Schnurr J., Abbadi A., Heinz E. Peroxi- somal acyl-CoA synthetase activity is essential for seedling development in Arabidopsis thaliana // Plant Cell. – 2004. – 16. – P. 394–405. 89. Germain V., Rylott E.L., Larson T.R. et al. Require- ment for 3-ketoacyl-CoA thiolase-2 in peroxisome development, fatty acid betaoxidation and breakdown of triacylglycerol in lipid bodies of Arabidopsis seed- lings // Plant J. – 2001. – 28. – P. 1–12. 90. Rylott E.L., Rogers C.A., Gilday A.D. et al. Arabidop- sis mutants in short- and medium-chain acyl-CoA oxidase activities accumulate acyl-CoAs and reveal that fatty acid betaoxidation is essential for embryo development // J. Biol. Chem. – 2003. – 278. – P. 21370–21377. 91. Michinaka Y., Shimauchi T., Aki T. et al. Extracellu- lar secretion of free fatty acids by disruption of a fatty acyl-CoA synthetase gene in Saccharomyces cerevi- siae // J. Biosci. Bioeng. – 2003. – 95. – P. 435– 440. 92. Nojima Y., Kibayashi A., Matsuzaki H. et al. Isola- tion and characterization of triacylglycerol-secreting mutant strain from yeast, Saccharomyces cerevisiae // J. Gen. Appl. Microbiol. – 1999. – 45. – P. 1–6. 93. Scharnewski M., Pongdontri P., Mora G. et al. Mu- tants of Saccharomyces cerevisiae deficient in acyl- CoA synthetases secrete fatty acids due to interrupted fatty acid recycling // FEBS J. – 2008. – 275. – P. 2765–2778. 94. Voelker T.A., Worrell A.C., Anderson L. et al. Fatty acid biosynthesis redirected to medium chains in transgenic oilseed plants // Science. – 1992. – 257. – P. 72–74. 42 Â.È. Êîðõîâîé, ß.Á. Áëþì ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2013. Ò. 47. ¹ 6 95. Yuan L., Voelker T.A., Hawkins D.J. Modification of the substrate specificity of an acyl-acyl carrier protein thioesterase by protein engineering // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1995. – 92. – P. 10639– 10643. 96. Radakovits R., Eduafo P.M., Posewitz M.C. Genetic engineering of fatty acid chain length in Phaeodac- tylum tricornutum // Metab. Eng. – 2011. – 13. – P. 89–95. 97. Dehesh K., Jones A., Knutzon D.S., Voelker T.A. Pro- duction of high levels of 8:0 and 10:0 fatty acids in transgenic canola by overexpression of Ch FatB 2, a thioesterase cDNA from Cuphea hookeriana // Plant J. – 1996. – 9. – P. 167–172. 98. Radakovits R., Jinkerson R.E., Darzins Al., Posewitz M.C. Genetic engineering of algae for enhanced biofuel production // Eukaryot. Cell. – 2010. – 9, ¹ 4. – P. 486–501. 99. Quinn J.M., Merchant S. Two copper-responsive elements associated with the Chlamydomonas Cyc6 gene function as targets for transcriptional activa- tors // Plant Cell. – 1995. – 7. – P. 623–638. 100. Poulsen N., Kroger N. A new molecular tool for transgenic diatoms // FEBS J. – 2005. – 272. – P. 3413–3423. 101. Radakovits R., Jinkerson R.E., Fuerstenberg S.I. et al. Draft genome sequence and genetic transformation of the oleaginous alga Nannochloropis gaditana // Nat. Commun. – 2012. – 3. – Ð. 686. 102. Wan L.L., Han J., Sang M. et al. De novo transcrip- tomic analysis of an oleaginous microalga: pathway description and gene discovery for production of next-generation biofuels // PLoS One. – 2012. – 7, ¹ 6. – Ð. 1371. Ïîñ òóïèëà 28.05.13 << /ASCII85EncodePages false /AllowTransparency false /AutoPositionEPSFiles true /AutoRotatePages /None /Binding /Left /CalGrayProfile (Dot Gain 20%) /CalRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2) /sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1) /CannotEmbedFontPolicy /Error /CompatibilityLevel 1.4 /CompressObjects /Tags /CompressPages true /ConvertImagesToIndexed true /PassThroughJPEGImages true /CreateJobTicket false /DefaultRenderingIntent /Default /DetectBlends true /DetectCurves 0.0000 /ColorConversionStrategy /CMYK /DoThumbnails false /EmbedAllFonts true /EmbedOpenType false /ParseICCProfilesInComments true /EmbedJobOptions true /DSCReportingLevel 0 /EmitDSCWarnings false /EndPage -1 /ImageMemory 1048576 /LockDistillerParams false /MaxSubsetPct 100 /Optimize true /OPM 1 /ParseDSCComments true /ParseDSCCommentsForDocInfo true /PreserveCopyPage true /PreserveDICMYKValues true /PreserveEPSInfo true /PreserveFlatness true /PreserveHalftoneInfo false /PreserveOPIComments false /PreserveOverprintSettings true /StartPage 1 /SubsetFonts true /TransferFunctionInfo /Apply /UCRandBGInfo /Preserve /UsePrologue false /ColorSettingsFile () /AlwaysEmbed [ true ] /NeverEmbed [ true ] /AntiAliasColorImages false /CropColorImages true /ColorImageMinResolution 300 /ColorImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleColorImages true /ColorImageDownsampleType /Bicubic /ColorImageResolution 1200 /ColorImageDepth -1 /ColorImageMinDownsampleDepth 1 /ColorImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeColorImages false /ColorImageFilter /DCTEncode /AutoFilterColorImages true /ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG /ColorACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /ColorImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000ColorACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000ColorImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasGrayImages false /CropGrayImages true /GrayImageMinResolution 300 /GrayImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleGrayImages true /GrayImageDownsampleType /Bicubic /GrayImageResolution 1200 /GrayImageDepth -1 /GrayImageMinDownsampleDepth 2 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeGrayImages false /GrayImageFilter /DCTEncode /AutoFilterGrayImages true /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG /GrayACSImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /GrayImageDict << /QFactor 0.15 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1] >> /JPEG2000GrayACSImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /JPEG2000GrayImageDict << /TileWidth 256 /TileHeight 256 /Quality 30 >> /AntiAliasMonoImages false /CropMonoImages true /MonoImageMinResolution 1200 /MonoImageMinResolutionPolicy /OK /DownsampleMonoImages true /MonoImageDownsampleType /Bicubic /MonoImageResolution 1200 /MonoImageDepth -1 /MonoImageDownsampleThreshold 1.50000 /EncodeMonoImages false /MonoImageFilter /CCITTFaxEncode /MonoImageDict << /K -1 >> /AllowPSXObjects false /CheckCompliance [ /None ] /PDFX1aCheck false /PDFX3Check false /PDFXCompliantPDFOnly false /PDFXNoTrimBoxError true /PDFXTrimBoxToMediaBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXSetBleedBoxToMediaBox true /PDFXBleedBoxToTrimBoxOffset [ 0.00000 0.00000 0.00000 0.00000 ] /PDFXOutputIntentProfile (None) /PDFXOutputConditionIdentifier () /PDFXOutputCondition () /PDFXRegistryName () /PDFXTrapped /False /CreateJDFFile false /Description << /ARA <FEFF06270633062A062E062F0645002006470630064700200627064406250639062F0627062F0627062A002006440625064606340627062100200648062B062706260642002000410064006F00620065002000500044004600200645062A064806270641064206290020064406440637062806270639062900200641064A00200627064406450637062706280639002006300627062A0020062F0631062C0627062A002006270644062C0648062F0629002006270644063906270644064A0629061B0020064A06450643064600200641062A062D00200648062B0627062606420020005000440046002006270644064506460634062306290020062806270633062A062E062F062706450020004100630072006F0062006100740020064800410064006F006200650020005200650061006400650072002006250635062F0627063100200035002E0030002006480627064406250635062F062706310627062A0020062706440623062D062F062B002E0635062F0627063100200035002E0030002006480627064406250635062F062706310627062A0020062706440623062D062F062B002E> /BGR <FEFF04180437043f043e043b043704320430043904420435002004420435043704380020043d0430044104420440043e0439043a0438002c00200437043000200434043000200441044a0437043404300432043004420435002000410064006f00620065002000500044004600200434043e043a0443043c0435043d04420438002c0020043c0430043a04410438043c0430043b043d043e0020043f044004380433043e04340435043d04380020043704300020043204380441043e043a043e043a0430044704350441044204320435043d0020043f04350447043004420020043704300020043f044004350434043f0435044704300442043d04300020043f043e04340433043e0442043e0432043a0430002e002000200421044a04370434043004340435043d043804420435002000500044004600200434043e043a0443043c0435043d044204380020043c043e0433043004420020043404300020044104350020043e0442043204300440044f0442002004410020004100630072006f00620061007400200438002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020043800200441043b0435043404320430044904380020043204350440044104380438002e> /CHS <FEFF4f7f75288fd94e9b8bbe5b9a521b5efa7684002000410064006f006200650020005000440046002065876863900275284e8e9ad88d2891cf76845370524d53705237300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c676562535f00521b5efa768400200050004400460020658768633002> /CHT <FEFF4f7f752890194e9b8a2d7f6e5efa7acb7684002000410064006f006200650020005000440046002065874ef69069752865bc9ad854c18cea76845370524d5370523786557406300260a853ef4ee54f7f75280020004100630072006f0062006100740020548c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee553ca66f49ad87248672c4f86958b555f5df25efa7acb76840020005000440046002065874ef63002> /CZE <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> /DAN <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> /DEU <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> /ESP <FEFF005500740069006c0069006300650020006500730074006100200063006f006e0066006900670075007200610063006900f3006e0020007000610072006100200063007200650061007200200064006f00630075006d0065006e0074006f00730020005000440046002000640065002000410064006f0062006500200061006400650063007500610064006f00730020007000610072006100200069006d0070007200650073006900f3006e0020007000720065002d0065006400690074006f007200690061006c00200064006500200061006c00740061002000630061006c0069006400610064002e002000530065002000700075006500640065006e00200061006200720069007200200064006f00630075006d0065006e0074006f00730020005000440046002000630072006500610064006f007300200063006f006e0020004100630072006f006200610074002c002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000200079002000760065007200730069006f006e0065007300200070006f00730074006500720069006f007200650073002e> /ETI <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> /FRA <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> /GRE <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a stvaranje Adobe PDF dokumenata najpogodnijih za visokokvalitetni ispis prije tiskanja koristite ove postavke. Stvoreni PDF dokumenti mogu se otvoriti Acrobat i Adobe Reader 5.0 i kasnijim verzijama.) /HUN <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> /ITA <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> /JPN <FEFF9ad854c18cea306a30d730ea30d730ec30b951fa529b7528002000410064006f0062006500200050004400460020658766f8306e4f5c6210306b4f7f75283057307e305930023053306e8a2d5b9a30674f5c62103055308c305f0020005000440046002030d530a130a430eb306f3001004100630072006f0062006100740020304a30883073002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e003000204ee5964d3067958b304f30533068304c3067304d307e305930023053306e8a2d5b9a306b306f30d530a930f330c8306e57cb30818fbc307f304c5fc59808306730593002> /KOR <FEFFc7740020c124c815c7440020c0acc6a9d558c5ec0020ace0d488c9c80020c2dcd5d80020c778c1c4c5d00020ac00c7a50020c801d569d55c002000410064006f0062006500200050004400460020bb38c11cb97c0020c791c131d569b2c8b2e4002e0020c774b807ac8c0020c791c131b41c00200050004400460020bb38c11cb2940020004100630072006f0062006100740020bc0f002000410064006f00620065002000520065006100640065007200200035002e00300020c774c0c1c5d0c11c0020c5f40020c2180020c788c2b5b2c8b2e4002e> /LTH <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> /LVI <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> /NLD (Gebruik deze instellingen om Adobe PDF-documenten te maken die zijn geoptimaliseerd voor prepress-afdrukken van hoge kwaliteit. De gemaakte PDF-documenten kunnen worden geopend met Acrobat en Adobe Reader 5.0 en hoger.) /NOR <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> /POL <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> /PTB <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> /RUM <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> /RUS <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> /SKY <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> /SLV <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> /SUO <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> /SVE <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> /TUR <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> /UKR <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> /ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents best suited for high-quality prepress printing. Created PDF documents can be opened with Acrobat and Adobe Reader 5.0 and later.) >> /Namespace [ (Adobe) (Common) (1.0) ] /OtherNamespaces [ << /AsReaderSpreads false /CropImagesToFrames true /ErrorControl /WarnAndContinue /FlattenerIgnoreSpreadOverrides false /IncludeGuidesGrids false /IncludeNonPrinting false /IncludeSlug false /Namespace [ (Adobe) (InDesign) (4.0) ] /OmitPlacedBitmaps false /OmitPlacedEPS false /OmitPlacedPDF false /SimulateOverprint /Legacy >> << /AddBleedMarks false /AddColorBars false /AddCropMarks false /AddPageInfo false /AddRegMarks false /ConvertColors /ConvertToCMYK /DestinationProfileName () /DestinationProfileSelector /DocumentCMYK /Downsample16BitImages true /FlattenerPreset << /PresetSelector /MediumResolution >> /FormElements false /GenerateStructure false /IncludeBookmarks false /IncludeHyperlinks false /IncludeInteractive false /IncludeLayers false /IncludeProfiles false /MultimediaHandling /UseObjectSettings /Namespace [ (Adobe) (CreativeSuite) (2.0) ] /PDFXOutputIntentProfileSelector /DocumentCMYK /PreserveEditing true /UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged /UntaggedRGBHandling /UseDocumentProfile /UseDocumentBleed false >> ] >> setdistillerparams << /HWResolution [2400 2400] /PageSize [612.000 792.000] >> setpagedevice

Ähnliche Einträge