Перспективы использования экстремофильных антарктических микроорганизмов для создания новых промышленных биотехнологий
Цель работы – изучение антарктических экстремофильных микроорганизмы, а также оценка перспектив их использования для создания новых природоохранных биотехнологий и медицинских препаратов, селекции продуцентов биологически активных веществ. The aim of this study is researching Antarctic extremophilic...
Saved in:
| Published in: | Український антарктичний журнал |
|---|---|
| Date: | 2010 |
| Main Authors: | , , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Національний антарктичний науковий центр МОН України
2010
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/128413 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Перспективы использования экстремофильных антарктических микроорганизмов для создания новых промышленных биотехнологий / А.Б. Таширев, В.А. Романовская, Т.В. Береговая, Н.А. Матвеева, П.В. Рокитко, А.А. Таширева, Т.В. Фалалеева // Український антарктичний журнал. — 2010. — № 9. — С. 158-186. — Бібліогр.: 26 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859808409783631872 |
|---|---|
| author | Таширев, А.Б. Романовская, В.А. Береговая, Т.В. Матвеева, Н.А. Рокитко, П.В. Таширева, А.А. Фалалеева, Т.В. |
| author_facet | Таширев, А.Б. Романовская, В.А. Береговая, Т.В. Матвеева, Н.А. Рокитко, П.В. Таширева, А.А. Фалалеева, Т.В. |
| citation_txt | Перспективы использования экстремофильных антарктических микроорганизмов для создания новых промышленных биотехнологий / А.Б. Таширев, В.А. Романовская, Т.В. Береговая, Н.А. Матвеева, П.В. Рокитко, А.А. Таширева, Т.В. Фалалеева // Український антарктичний журнал. — 2010. — № 9. — С. 158-186. — Бібліогр.: 26 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Український антарктичний журнал |
| description | Цель работы – изучение антарктических экстремофильных микроорганизмы, а также оценка перспектив их использования для создания новых природоохранных биотехнологий и медицинских препаратов, селекции продуцентов биологически активных веществ.
The aim of this study is researching Antarctic extremophilic microorganisms, estimation of trends and prospects for developing new environment protection biotechnologies, using them as producers of biologically active substances and medications.
|
| first_indexed | 2025-12-07T15:17:59Z |
| format | Article |
| fulltext |
TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL
BIOTECHNOLOGIES ON THE BASE OF ANTARCTIC EXTREMOPHILIC
MICROORGANISMS
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЭКСТРЕМОФИЛЬНЫХ
АНТАРКТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ НОВЫХ
ПРОМЫШЛЕННЫХ БИОТЕХНОЛОГИЙ
1 1 2 1Oleksandr Tashyrev , Victoria Romanovskaya , Тetyana Beregova , Nadiia Matvieieva ,
1 3 2Pavlo Rokitko , Ganna Tashyreva , Tetyana Falalyeyeva
1 1 2 1 1А.Б. Таширев , В.А.Романовская , Т.В. Береговая , Н.А. Матвеева , П.В. Рокитко ,
3 2А.А. Таширева , Т.В. Фалалеева
1Department of Biology of Extremophilic Microorganisms, Institute of Microbiology and Virology of
the Nat. Acad. Sci. of Ukraine. Mail: 154 Zabolotny str., Kyiv, D 03680, Ukraine
2Faculty of Biology, Taras Shevchenko Kyiv National University. Mail: 2 (building 12) Glushkov
avenue, Kyiv, Ukraine
3Department of Biology, National Antarctic Scientific Center of Ukraine of the Ministry of Education
and Science of Ukraine. Mail: 16 Tarasa Shevchenka Blvd, Kyiv, 01601, Ukraine
1Отдел биологии экстремофильных микроорганизмов, Институт микробиологии и
вирусологии НАН Украины. Д 03680, Киев, ул. Заболотного, 154.
2Биологический факультет, Киевский национальный университет имени Тараса Шевченка,
проспект академика Глушкова, 2, корпус 12, Киев, Украина
3Национальный антарктический научный центр Украины Министерства образования и
науки Украины
Corresponding Author: Oleksandr Tashyrev, e-mail: tach2007@ukr.net
Автор для корреспонденции: tach2007@ukr.net
УКРАЇНСЬКИЙ АНТАРКТИЧНИЙ
ЖУРНАЛ
УАЖ № 9, 158-186 (2010)
УДК 579.26
158
БІОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
BIOLOGICAL RESEARCH
Резюме. Цель работы – изучение
антарктических экстремофильных
микроорганизмы, а также оценка
перспектив их использования для создания
новых природоохранных биотехнологий и
медицинских препаратов, селекции
продуцентов биологически активных
веществ. Системное изучение структуры и
функций микробных ценозов в Антарктике
показало, что их адаптация проявляется в
виде гомеостаза, т.е. сохранении
жизнеспособности и способности к росту в
широком диапазоне концентраций
экстремальных факторов. Создана
коллекция микроорганизмов, устойчивых к
этим факторам. Коллекция включает
микроорганизмы, синтезирующие
Abstract. The aim of this study is
researching Antarctic extremophilic
microorganisms, estimation of trends and
prospects for developing new environment
protection biotechnologies, using them as
producers of biologically active substances and
medications. Complex structure and function
researches have shown that microbial
communities of Antarctic Region possess a
high adaptation degree which is possible to
consider as a homeostasis, i.e. preservation of
viability and ability to grow in a wide range of
concentration of extreme factors, down to
bactericidal. The collection of the Antarctic
microorganisms, resistant to extreme factors is
developed. The collection includes
криопротекторы, микроорганизмы,
устойчивые к высоким дозам УФ радиации
2(500–1500 Дж/м ), широкому спектру
2+антибиотиков и токсичным металлам (Hg ,
2+ 2+ 2+ 2+Cu , Cr(VI), Co , Cd , Ni ) в диапазоне
2 45х10 –6х10 мг-ионов/л); изоляты, которые
продуцируют биологически активные
вещества (меланины, каротины,
антибиотики и др.).
Выделенные нами экстремофильные
микроорганизмы перспективны для
создания новых биотехнологий.
Технологии, основанные на микробной
мобилизации нерастворимых форм
металлов, эффективны для повышения их
извлечения в горнодобывающей
промышленности, биоремедиационных
технологиях. Иммобилизация – для
биоремедиации водоемов и очистки
сточных вод от широкого спектра металлов.
Антарктические микроорганизмы могут
использоваться для получения новых
антибиотиков, а устойчивые к ним штаммы
– для тестирования эффективности действия
антимикробных препаратов. Метилотрофы
являются перспективными продуцентами
криопротекторов, а пигментированные
микроорганизмы – биологически-активных
веществ (меланины, каротины). Уникальная
культура дрожжей Exophiala nigra
(продуцент меланина) может одновременно
использоваться для очистки сточных вод от
2+ 2+металлов (например, Ni и Co ), получения
УФ-защитных препаратов, создания
лекарственных средств с
профилактическими и лечебными
свойствами по отношению к язвенно-
эрозивным поражениям желудка и
предраковым его состояниям.
Ключевые слова. Экстремофильные
микроорганизмы, Антарктика,
биотехнология, меланин, медицинские
препараты
Введение
Жизнь неистребима и вездесуща. Об
этом свидетельствуют сотни публикаций об
экстремофильных микроорганизмах.
Поэтому мы не будем ссылаться на эти
cryoprotector-producing bacteria,
microorganisms resistant to high UV radiation
2level (up to 500-1500 J/m ), isolates resistant to
2+a wide spectrum of the most toxic metals (Hg ,
2+ 2+ 2+ 2+Cu , Cr(VI), Co , Cd , Ni ) in concentrations
2 4of 5х10 -6х10 mg/l, isolates that are producers
of biologically active substances (melanins,
carotins, antibiotics ets).
Isolated extremophilic microorganisms are
perspective for a wide spectrum of new
biotechnologies designing. Biotechnologies
based on microbial mobilisation of insoluble
metal compounds are effective for increase of
their extraction in the mining industry, and in
bioremediation. Immobilization abilities can be
applied in metal-containing sewage treatment.
Antarctic microorganisms can be used for new
antibiotics production, antibiotic-resistant
strains as test-cultures for studying efficiency
of new antimicrobial preparations.
Methylotrophic bacteria are perspective
cryoprotector producers, pigmented
microorganisms - as biologically-active
substances producers (melanins, carotins). The
unique yeast isolate Exophiala nigra (a
melanin producer) can simultaneously be used
2+for sewage treatment (for example, Ni and
2+Co ), UV-protective preparations, creation of
medicines with preventive and curative
properties in relation to ulcer-erosive lesions of
the stomach and precancerous states of its.
Key words: extremophilic microorganisms,
Antarctic Region, biotechnology, melanin,
medications
Introduction
Life is ineradicable and ubiquitous.
Hundreds of articles devoted to extremophilic
microorganisms testify to this. Therefore we
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
159
работы, хорошо известные специалистам.
Приведем лишь два примера,
подтверждающие способность
микроорганизмов существовать в условиях,
«несовместимых с жизнью». Эти работы
доказывают использование микромицетами
радиоактивного графита в качестве
источника углерода и энергии, а также
эффект «положительного радиотаксиса» [5,
26]. В данной статье мы рассмотрели
теоретические предпосылки и
закономерности формирования
экстремофильных антарктических
микробных ценозов. В качестве источников
для выделения промышленно
перспективных микроорганизмов нами
использованы образцы внутреннего
шельфового островного архипелага, а также
прилегающего побережья Антарктического
полуострова. Основным объектом
исследований служил антарктический
термостатированный оазис, расположенный
вблизи Украинской антарктической станции
Академик Вернадский (Аргентинский
архипелаг, о. Галиндез, бывшая британская
станция Майкл Фарадей) [21, 24]. Используя
GPS-методы проведена топографическая
съемка оазиса на о. Галиндез, и с
использованием GIS-технологий создана
стереометрическая 3D-модель полигона с
сетью стационарных пунктов постоянного
мониторинга (более 200 точек) [24]). Оазис
представляет собой скалистый мыс с
крутыми склонами, на вершине мыса
находится реликтовый ледник.
Особенностью оазиса является
максимальное биоразнообразие наземных
биотопов (экосистем): ледовые и
наскальные водорослево-бактериальные
маты, почва, озера, лишайники, мхи,
высшие растения (Deschampsia antarctica,
Colobanthus quitensis), беспозвоночные
животные, а также орнитофауна. Цель
работы – выделить и изучить
антарктические экстремофильные
микроорганизмы, оценить перспективы их
использования для создания новых
природоохранных биотехнологий и
селекции продуцентов биологически
активных веществ (меланинов, каротинов,
антибиотиков), а также лечебных
препаратов.
shall not refer to papers, well-known to experts.
We shall only result two examples confirming
microbial ability to exist in conditions,
«incompatible with a life». The evidence of
mentioned above is the existence of fungi
which use radioactive graphite as a source of
carbon and energy, and also the «positive
radiotaxis» effect [5, 26]. This study is
referring to theoretical preconditions and laws
of Antarctic extremophilic microbial
communities' formation. Environments of
Antarctic oases, situated in the area of
Argentine archipelago internal shelf and
adjoining coast of Antarctic Peninsula, are the
sources for industrial promising
microorganisms' isolation. The basic research
object is the biogeographical polygon of
Antarctic oasis located near Ukrainian
Antarctic station Academic Vernadsky (the
Argentina archipelago, Galindez island, former
Michael Faradey station, UK) [21, 24]. By
means of GPS-methods topographical survey
of an oasis and polygon is carried out. Using
GIS-technologies the stereometric 3D-model of
polygon with a system of fixed permanent
monitoring points (more than 200) [24]) is
designed. The oasis is a rocky cape with abrupt
slopes, at top of cape there is a relic glacier.
Outstanding feature of an oasis is the high
number of terrestrial environments (rocks, ice,
snow, lakes, primitive soils, etc.) where
maximal biodiversity is represented: ice and
rock biofilms, lichens, mosses, vascular plants
(Deschampsia antarctica, Colobanthus
quitensis), invertebrates, and avifauna. The aim
of this study is isolating and researching
Antarctic extremophilic microorganisms, future
trends and prospects for developing on their
base new environment protection
biotechnologies, using them as sources of
biologically active substances (melanins,
carotins antibiotics), and material for
medications.
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
160
Материалы и методы
Выделение антарктических микроорга-
низмов. Образцы для микробиологических
исследований отбирали в Западной
Антарктике на островах Galindez (где
расположен биогео-графический полигон),
Barchans, Irizar, Uruguay, Jalour, Petermann,
Berthelot, Cruls, King-Georg и др., а также на
побережье Антарктического полуострова
(мыс Rasmussen и мыс Tuxen). Исследовали
следующие биотопы: почва, трава, мхи,
лишайники и озерные илы. Образцы
хранили при +5°С и/или при –20°С.
Подготовку образцов для посева проводили
стандартными методами. При этом
использовали два подхода: (1) выделение
экстремофильных микроорганизмов
(например, посев на среды, содержащие
токсичные металлы); (2) выделение
доминирующих форм при отсутствии
экстремальных факторов.
Количество микроорганизмов в образцах
определяли посевом последовательных
десяти-кратных разведений образцов на
питательные среды [13]: гетеротрофные
микроорганизмы – на «Nutrient Agar»
(фирма HiMedia Laboratories Pvt. Ltd) и
агаризованное сусло. Различные эколого-
физиологические группы микроорганизмов
выделяли на селективных средах [6],
метилотрофные бактерии – на минеральной
среде с метанолом (0.5%) [18].
Идентификацию бактерий проводили на
основании изучения их морфолого-
физиологических свойств [6], а также
используя сиквенс-анализ генов 16S рРНК.
Методами, описанными в [18], из биомассы
антарктических бактерий выделяли ДНК. С
использованием полимеразной цепной
реакции (ПЦР) получали
амплифицированные гены 16S рРНК и их
секвенировали. Сравнительный анализ
нуклеотидных последовательностей генов
16S рРНК антарктических микроорганизмов
с таковыми различных видов проводили,
используя базу данных GenBank.
Устойчивость к металлам. Антарктиче-
ские микроорганизмы высевали на среды,
содержащие наиболее токсичные металлы
Materials and methods
Isolation of Antarctic microorganisms.
Samples for microbiological researches were
selected in the Western Antarctic Region on
islands Galindez (on the biogeographical poly-
gon), Barchans, Irizar, Uruguay, Jalour,
Petermann, Berthelot, Cruls, King-George, etc.,
and at coast of Antarctic peninsula (cape
Rasmussen and cape Tuxen). The following
environments (biotopes) are studied: soil,
grass, mosses, lichens and lake sludge.
Samples were stored at +5°С and/or at –20°С.
Preparation of samples for microbiological
investigations was carried out by standard
methods. During researches we used two
approaches: (1) extremophilic microorga-
nisms' isolation (for example, inoculation on
toxic metal-containing media); (2) isolation of
dominating morphological species of
microorganisms without extreme influence.
Microbiological counts in samples were
carried out by inoculation of consecutive
tenfold sample dilutions nutrient media [13]:
heterotrophic isolates – on «Nutrient Agar»
(HiMedia Laboratories Pvt. Ltd) and wort agar
medium. Ecological and physiological groups
of microorganisms isolated on selective media
[6], methylotrophic bacteria – on methanol-
containing (0.5 %) mineral agar medium [18].
Bacteria identification was carried out by
studying morphological and physiological
properties using standard methods [6], and also
16S rRNA gene sequence. With the methods
described in [18], we extracted DNA from a
biomass of Antarctic bacteria. Using
polymerase chain reaction (PCR) amplified
16S rRNA genes were sequenced. The
comparative analysis of nucleotide sequence of
16S rRNA genes of Antarctic microorganisms
with those of various species was studied using
GenBank database.
Resistance to metals. Antarctic
microorganisms were inoculated on toxic
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
161
2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2–(Hg Cu , Cd , Со , Ni и СrО ) в 4
диапазоне: от 0 (контроль) до 3000 мг-
ионов/л. В отдельных экспериментах
использовали более высокие концентрации
металлов (более 1.0 моль/л, например 60000
мг/л Cr(VI). Микроорганизмы
окультивировали 5–20 суток при 15–20 С
[20]. Концентрацию металлов в образцах
определяли стандартными
фотоколориметрическими методами, а
также методом атомно-адсорбционной
спектроскопии.
Выделение микробных пигментов из
клеточной биомассы угольно-чёрных
дрожжей проводили методом щелочной
экстракции [1], их свойства определяли, как
приведено в [19]. Каротиноиды в
микробной биомассе определяли
хроматографическим и
спектрофотометрическим методом. УФ
облучение антарктических микроорганизмов
проводили по методике, описанной в [16].
Цитопротекторное действие меланина
изучали в условиях острого и хронического
стресса. Острые нейро-дистрофические
поражения в слизистой оболочке желудка
крыс вызывали методом нервно-мышечного
напряжения по Селье. Хронические нейро-
дистрофические поражения в слизистой
оболочке желудка крыс вызывали методом
24-часового иммобилизационного стресса.
Содержание основных продуктов
перекисного окисления липидов (ПОЛ) -
диеновых конъюгатов определяли в
гомогенате слизистой оболочки желудка
крыс спектрофотометрических методом,
ТБК-активных продуктов по реакции с
тиабарбитуровой кислотой и Шифовых
оснований – флюорометрическим методом.
Желудочную секрецию исследовали
методом перфузии изолированного желудка
по [7]. Парафиновые срезы толщиной 5–7
мкм изготавливали на роторном микротоме,
красили гематоксилином и эозином.
Гистологические препараты анализировали
при увеличении микроскопа х100 и х400.
Содержание оксида азота в крови оценивали
путем определения концентрации конечных
-метаболитов NO (нитрит аниона (NO )) с 2
помощью реактива Гриссa [8]. Экспрессию
белка эндотелиальной синтазы оксида азота
metal containing media
2+ 2–Ni и СrО ) in a concentration range 0 4
(control) – 3000 ppm and incubated during 5-
о20 days at 15-20 С. In separate experiments the
higher metal concentration were used (more
than 1.0 M/l, for example 60000 ppm Cr (VI))
[20]. Metal concentration in samples was
determined by standard colorimetric and
atomic-adsorption spectroscopy methods.
Microbial pigment was extracted from coal-
black yeast cellular biomass by alkaline
method [1], pigment properties investigation
described in [19]. For carotenoids
characterization we used chromatographic and
spectrophotometric methods. UV-radiation
influence on Antarctic microorganisms was
studied by a technique described in [16].
In the study of cytoprotective action of
melanin in conditions of acute and chronic
stress we used the following methods. Acute
neuro-degenerative lesions in the gastric
mucosa of rats caused by neuro-muscular
tension by Selye. Chronic neuro-degenerative
lesions in the gastric mucosa of rats caused by
24-hour immobilization stress. Contents of the
main products of lipid peroxidation (LPO) –
diene conjugates were measured in homogenate
of gastric mucosa of rats by spectrophotometric
method, TBA-active products by the reaction
with tiobarbital acid and Shif`s bases – by
fluorometric method. The activity of
antioxidant enzymes superoxide dismutase
(SOD) and catalase in the homogenate of
gastric mucosa were determined. Gastric
secretion was studied by perfusion of isolated
stomach by [7]. Paraffin sections of thickness
5.7 mm were made on a rotary microtome,
dyed with hematoxylin and eosin. Histological
preparations were analyzed at magnification
х100 and х400. Contents of nitric oxide in the
blood was evaluated by determining the
concentration of the final metabolites of NO
-(nitrite anion (NO )) with the Griss reagent [8]. 2
2+ 2+ 2+ 2+(Hg Cu , Cd , Со ,
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
162
(еNOS) в слизистой оболочке желудка крыс
определяли методом иммуноблоттинга. Для
блокирования PPARγ мы использовали
необратимый селективный антагонист
PPARγ GW9662 (2-хлоро-5-нитро-N-фенил-
бензамиды) («Sigma», США, номер по
каталогу M6191). Концентрацию кортизола
в крови определяли методом твердофазного
иммуноферментного анализа в сыворотке
крови животных, применяя наборы
реактивов «стероид ИФА-кортизол-01».
Результаты и обсуждение
Характеристика антарктических
микроорганизмов. В результате
микробиологического анализа 200 образцов
наземных биотопов Антарктики выделено
90 штаммов аэробных хемоорганотрофных
микроорганизмов. Для определения
таксономического положения исследованы
их свойства. На основании изучения
морфолого-культуральных свойств 20
штаммов показано, что их можно отнести к
родам Bacillus, Actinomyces, Streptomyces. В
результате сиквенс-анализа генов 16S рРНК
25 штаммов идентифицированы как
Brevibacterium, Methylobacterium,
Enterobacter, Staphylococcus, Pseudomonas,
до видов (Brevibacterium antarcticum,
Staphylococcus saprophyticus, Enterobacter
hormachei, Pseudomonas putida, Ps.
fluorescens, Methylobacterium extorquens).
Т.о., в антарктических образцах
обнаружены представители нескольких
филогенетических линий прокариот:
Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria.
Изолированы также дрожжи, в частности 5
штаммов Exophiala nigra (филогенетическая
линия эукариот). Подобные результаты
были получены другими исследователями
[14, 15 и др.]
Выявленное биоразнообразие микро-
организмов в суровых условиях Антарктики
может быть обусловлено наличием у них
множественных механизмов устойчивости к
комплексу экстремальных факторов. Такими
абиогенными факторами являются суточные
оперепады температуры (от +10 С до –20 С) о
Protein expression of endothelial nitric oxide
synthase (eNOS) in the gastric mucosa of rats
was determined by immunoblotting. To block
PPARγ, we used the selective irreversible
antagonist of PPARγ GW9662 (2-chloro-5-
nitro-N-phenyl-benzamide) ("Sigma", USA,
catalog number M6191). The concentration of
cortisol in the blood was determined by solid-
phase enzyme immunoassay in the serum of
animals, using a set of reagents, "ELISA
steroid-cortisol-01".
Results and discussion
Characteristic of Antarctic
microorganisms. Microbiological analysis of
the 200 terrestrial samples of Antarctic Region
resulted in 90 strains of aerobic
chemoorganotrophic microorganisms isolation,
which specific features were studied for taxa
identification. On the basis of morphological
and physiological properties it is shown, that
20 of Antarctic strains related to Bacillus,
Actinomyces, Streptomyces genera. By the
means of 16S rRNA gene sequence analysis 25
strains were identified as Brevibacterium,
Methylobacterium, Enterobacter,
Staphylococcus, Pseudomonas, up to species
(Brevibacterium antarcticum, Staphylococcus
saprophyticus, Enterobacter hormachei,
Pseudomonas putida, Ps. fluorescens,
Methylobacterium extorquens). Thus, in the
Antarctic samples representatives of
Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria
(prokaryotic phylum) are found out. Various
yeast species, in particular 5 strains Exophiala
nigra (eukaryotic phylum) are also isolated.
Similar results were reported in recent
researches on Antarctic terrestrial
microorganisms [14, 15 etc.].
The revealed microbial biodiversity in
severe conditions of Antarctic Region can be
explained by presence mechanisms of
polyresistance to a complex extreme factors.
To such abiogenous environmental factors
belong daily temperature fluctuations (from
о о+10 С to -20 С) during polar summer, constant
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
163
во время полярного лета, фазовые переходы
«замораживание-оттаивание», УФ радиация,
особенно активная за счет наличия
антарктической «озоновой дыры», высокие
концентрации токсичных металлов,
мобилизованные из вулканогенных
скальных пород. Например, в некоторых
образцах концентрация меди достигает
426–558 мг/кг почвы [21]. К биогенным
экстремальным факторам следует отнести
неравномерное распределение органических
соединений, что приводит к жесткой
конкуренции за источники углерода для
микроорганизмов. Указанный комплекс
экстремальных факторов, видимо, влияет на
формирование микробных ценозов
антарктических оазисов. Поэтому
системное исследование их структуры и
функций необходимо для изучения
закономерностей формирования
экстремофильных микробных ценозов и
выделения микроорганизмов,
перспективных для промышленных
биотехнологий.
Комплексная адаптация микробных
ценозов к экстремальным условиям
проявляется как «гомеостаз». В контексте
этой статьи «гомеостаз» мы определяем как
способность микробных ценозов
адаптироваться и сохранять стабильное
функционирование при воздействии
комплекса экстремальных факторов. В
качестве главных факторов, значимых при
формировании микробных ценозов, нами
выбраны низкие температуры, УФ радиация,
наиболее токсичные металлы и
антибиотики. Системное изучение
гомеостаза микробных ценозов мы
осуществляли в четыре этапа: (1)
количественный учет микро-организмов в
наземных биотопах (экосистемах)
Антарктики, (2) выделение
микроорганизмов, устойчивых к
максимальным дозам экстремальных
факторов и создание коллекции экстремо-
фильных микроорганизмов-продуцентов
биологически активных веществ, (3)
комплексное изучение свойств
микроорганизмов, перспективных для
промышленных биотехнологий, (4) био-
ice nucleation/melting cycles, UV radiation,
especially strong due to presence of Antarctic
"ozone hole", high concentration of toxic
metals mobilized from igneous rock. For
example, copper concentration in some
samples is up to 426-558 mg/kg [21]. Non-
uniform distribution of biogenic factors on
Antarctic islands such as organic compounds
concentration can be related to extreme factors
resulting in strong competition for a substratum
(sources of carbon and energy for
microorganisms). The specified complex of
extreme factors probably influences microbial
communities' formation in Antarctic oases.
Therefore complex research of their structure
and functions is a necessary for studying laws
of formation extremophilic microbial
communities, and isolation of microorganisms,
perspective for industrial biotechnologies.
Complex adaptation of microbial
communities to extreme environmental
conditions is considered as the "homeostasis"
phenomenon. In a context of this study we
determine "homeostasis" as the ability to adapt
and keep stable functioning under the influence
of an extreme factor complex. We consider low
temperatures, UV radiation, the most toxic
metals and antibiotics to be primary factors that
are significant during microbial communities'
formation. Study of microbial communities'
homeostasis was carried in four stages: (1)
microbiological counts in terrestrial
environments of Antarctic Region, (2) isolation
of strains resistant to maximal extreme factor
dozes and development of a collection of
extremophilic microorganism that are
producers of biologically active substances, (3)
complex studying of their properties,
perspective for industrial biotechnologies, 4)
biotechnological testing of extremophilic
microorganisms.
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
164
технологическое тестирование
экстремофильных микроорганизмов.
Один из этапов такого анализа – это
качественный и количественный учет
микроорганизмов. Показано, что в состав
микробных ценозов (например, на
о. Галиндез) входят основные
физиологические и функциональные
группы микроорганизмов, осуществляющие
функционирование замкнутых циклов
углерода и азота. Количество
хемоорганотрофных микроорганизмов в
почве было высоким, и находилось в
4 9пределах 10 –10 клеток/г образца.
Обнаружены как аэробные, так и
анаэробные копиотрофные, олиготрофные и
олигокарбофильные микроорганизмы
4 7(2х10 –8х10 клеток/г образца) [9]. Несмотря
на то, что о. Галиндез является
«низкотемпературным» объектом, кроме
опсихрофильных микроорганизмов (+5 С,
3 710 –10 клеток/г почвы), обнаружены
о 3 7мезофильные (+25 С, 6х10 –5х10 клеток/г
о 4 6почвы) и термотолерантные (+45 С, 10 –10
клеток/г почвы) микроорганизмы. Наличие
мезофильных и термофильных
микроорганизмов в антарктических почвах
можно объяснить как
трансконтинентальным переносом
микробных аэрозолей атмосферными
потоками, так и интродукцией
микроорганизмов из птичьего помета
(например, поморников и чаек) в почву.
Следовательно, антарктические
наземные экосистемы характеризуются
высоким уровнем эколого-трофического,
физиологического и таксономического
биоразнообразия, а также высокой
численностью микроорганизмов.
Антарктические
металлрезистентные микроорганизмы.
Рассмотрим такой системный подход на
примере экстремофильных
металлрезистентных микроорганизмов.
Известно, что для большинства
хемоорганотрофных микроорганизмов
бактерицидные концентрации токсичных
2+ 2+металлов (Hg , Cu и др.) находятся в
пределах 5–10 мг-ионов/л [4, 11]. Так как
Антарктика – это экологически чистая зона
One of stages of such analysis is a
qualitative and quantitative count of
microorganisms. It is shown, that microbial
communities of Antarctic oases (for example,
island Galindez) include the basic
physiological and functional groups of the
microorganisms which provide complete
carbon and nitrogen cycles. The number of
chemoorganotrophic microorganisms in soils
4 9was high within the limits of 10 -10 cells/g of
soil, where aerobic and anaerobic olygotrophic
4 7microorganisms (2х10 –8х10 cells/g of soil)
are found out [9]. In spite of the fact that island
Galindez is a "low-temperature" object, besides
оexcept psychrophilic microorganisms (+5 С,
3 7 о10 -10 cells/g of soil), mesophslic (+25 С,
3 76х10 -5х10 cells/g of soil) and termotolerant
о 4 6(+45 С, 10 -10 cells/g of soil) microorganisms
were found. It is possible to explain presence of
mesophiles and thermophiles in Antarctic soils
as transcontinental transfer of microbial
aerosols by atmospheric streams, and inclusion
of microorganisms from bird's excrements (for
example, skua and gulls) into soil communities.
Hence, Antarctic terrestrial ecosystems are
characterized by a high level of functional,
physiological and taxonomic biodiversity, and
also a high number of microorganisms.
Antarctic microorganisms resistant to
metals. We shall consider such system
approach on the example of extremophilic
metal resistant microorganisms. It is known
that for the majority the chemoorganotrophic
microorganisms bactericidal concentrations of
2+ 2+toxic metals (Hg , Cu etc.) are within the
limits of 5-10 ppm [4, 11]. As the Antarctic
Region is a non-polluted zone on the Earth,
despite of the high content of toxic metals in
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
165
Земли, то, несмотря на высокое содержание
токсичных металлов в скальных и
осадочных породах, трудно было
предположить, что антарктические
микроорганизмы проявят
сверхустойчивость к металлам. Однако
ранее при помощи термодинамических
расчетов мы доказали, а впоследствии
подтвердили экспериментально, что рост
некоторых хемоорганотрофных
микроорганизмов возможен при высоких
(вплоть до 1M) концентрациях токсичных
металлов [22, 23]. Исходя из этого, мы
использовали в эксперименте широкий
концентрационный диапазон металлов.
Принципиально новым при выделении
металлрезистентных микроорганизмов
является очень высокий предел
концентраций металлов (3000–60000 мг /л).
Полученные результаты
свидетельствовали о высокой устойчивости
антарктических почвенных
микроорганизмов к токсичному катиону
2+Cu . Так, если в контроле количество
8микроорганизмов составляло nх10 клеток/г
2+ 8образца, то при 200–800 мг/л Cu – nх10 –
7 2+ 6nх10 , а при 1000 мг/л Cu – nх10 клеток/г
образца. Таким образом, количество клеток
микроорганизмов, выросших без
предварительной адаптации к
«сверхбактерицидной» концентрации меди
2+(1000 мг/л Cu ), составило миллионы на 1 г
почвы. Из них было изолировано 10
медьрезистентных штаммов, которые
депонированы в Украинской Коллекции
Микроорганизмов (УКМ, №№ штаммов
3201–3210) и использованы в качестве тест-
культур. Как будет показано ниже, эти
микроорганизмы устойчивы не только к
2+Cu , но и к сверхвысоким концентрациям
растворимых соединений ртути, кобальта,
кадмия, никеля и хрома(VI). Иными
словами, нами обнаружено явление
полирезистентности антарктических
микроорганизмов к широкому спектру
токсичных металлов.
Как правило, проверка множественной
резистентности сводится к изучению роста
на среде, содержащей только один металл.
При этом отсутствует информация об
rocks and sediments, it was difficult to assume
that the Antarctic microorganisms will show
high metalresistant level. In previous studies
using thermodynamic calculations we have
proved, that growth of some
chemoorganotrophic microorganisms is
possible at high (up to 1M) concentration of
toxic metals, what have been confirmed
experimentally [22, 23]. Proceeding this, we
used a wide concentration range of metals in
experiment. Using very high metal
concentrations (3000-60000 mg/l) during
isolation of metal-resistant microorganisms is
essentially new.
Results testified to high resistance of
2+Antarctic soil microorganisms to toxic Cu . In
the control (without copper) number of
8microorganisms was 10 cells/g, while at 200-
2+ 7 8800 ppm Cu – 10 -10 , and at 1000 ppm –
610 cells/g of a sample. Thus, the number of
microorganisms able to grow without
preliminary adaptation to super bactericidal
2+copper concentration (1000 ppm Cu ), reached
millions in 1 g of soil. Among isolated copper
resistant strains 10 are deposited in the
Ukrainian Collection of Microorganisms
(UCM) at numbers 3201-3210 and are used as
test-cultures. As it will be shown below, these
2microorganisms are resistant not only to Cu +,
but also to super high concentration of
mercury, cobalt, cadmium, nickel and
chromium(VI) soluble compounds. Other
Antarctic microorganisms are characterized by
polyresistance to a wide spectrum of toxic
metals.
As a rule during multiple metal resistance,
study isolates are tested on media containing
only one metal. Thus there is no information on
integrated action of several metals on
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
166
интегральном действии нескольких
металлов на микроорганизмы. Однако в
природных условиях и в техногенных зонах
микроорганизмы находятся в условиях,
когда одновременно присутствует широкий
спектр токсичных металлов, проявляющих
интегрированное действие на
микроорганизмы. В связи с этим изучение
множественной устойчивости к металлам
антарктических микроорганизмов мы
проводили на двух уровнях: «первого
порядка» и «второго порядка».
Множественная резистентность
«первого порядка», по нашему
определению, – это устой-чивость
микроорганизма к нескольким металлам при
условии, что влияние каждого из них
проверяется отдельно. Множественная
резистентность «второго порядка» –
устойчивость, когда в среде содержится
одновременно несколько металлов. При
этом многообразие токсичного действия
металлов проявляется в результате
следующих повреждающих механизмов,
которые негативно действуют на
микроорганизмы:
1. Металлы «комбинированного»
2+ 2+действия (например, Hg и Cu ) наиболее
токсичны, т. к. одновременно сочетают
свойства как металлов-окислителей с
высокими значениями стандарт-ных редокс-
потенциалов (E´ = + 790 мВ и о
E´ = +440 мВ соответственно), так и о
металлов-заместителей, необратимо
замещающих металлы в активных центрах
ферментов энергетического и
конструктивного обмена, клеточных
структурах и т.д.
2. Металлы-окислители (например,
2–Cr(VI) в форме аниона CrO , E´ = +570 4 о
мВ), которые не обладают свойствами
токсичного металла-заместителя.
2+3. Металлы-заместители (например, Cd ,
2+ 2+Co и Ni ), которые не обладают
свойствами металлов-окислителей.
Из всех известных токсичных металлов,
количественно характеризующих гомеостаз,
мы выбрали вышеуказанные шесть
металлов для изучения множественной
microorganisms. However in natural and
anthropogenic environments both isolated
cultures and microbial communities are under
simultaneous toxic influence of metals.
Concerning to this we studied polyresistance of
the Antarctic microorganisms at two levels:
«the first order» and «the second order».
«The first order» of polyresistance we
define as microbial resistance to several metals
separately, in case of nutrient medium contains
only one metal. «The second order» of
polyresistance takes place when growth
medium contains simultaneously some metals.
The variety of metal toxic actions can be
shown by following damaging mechanisms
which negatively influence the
microorganisms:
1. Metals of the "combined" action
2+ 2+(for example, Hg and Cu ) are most toxic,
due to oxidizing properties (with high values of
standard redox-potentials E´ =+790 mV and о
E´ =+440 mV accordingly) and replacing о
properties (those, which irreversible replace
2 2bivalent cations like Ca + and Mg + in enzyme
active centers, cell structures etc.)
2. Metals with oxidizing properties (for
2–example, Cr(VI) as CrO compound, E´ = 4 о
+570 mV) which does not possess replacing
properties.
3. Metals with replacing properties (for
2+ 2+ 2+example, Cd , Co and Ni ) which do not
possess oxidizing properties.
Among all toxic metals quantitatively
describing a homeostasis, we have chosen the
mentioned six metals for studying
polyresistance of Antarctic microorganisms.
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
167
резистентности у антарктических
микроорганизмов.
Множественную резистентность
первого порядка изучали у десяти тест-
культур (№ штаммов 3201–3210) по
отношению к наиболее токсичным
2 2 2 2 2металлам: Hg , Cu Cr(VI), Co , Cd и Ni .
Полученные данные свидетельствуют о
чрезвычайно высоком уровне устойчивости
к этим металлам (Табл. 1–4). В контроле
(без металлов) все тест-культуры вырастали
через сутки. Внесение металлов иногда
приводило к задержке роста. Известно, что
катион ртути – самый токсичный среди
металлов «комбинированного» действия,
его бактерицидное действие проявляется в
2+диапазоне 0,1–1,0 мг/л Hg [3]. В наших
экспериментах некоторые тест-культуры
2+росли даже при 500 мг/л Hg (Табл. 1), что
+ + + + +
The first order of polyresistance of ten test-
cultures (isolates № 3201–3210) has been
2+studied at the most toxic metals: Hg ,
2+ 2+ 2+ 2+Cu Cr(VI), Co , Cd and Ni . Obtained data
testify to extremely high levels of resistance to
these metals (Tab. 1–4). In control (without
metals) all test-cultures grew in day. Metal
introduction sometimes resulted in a growth
inhibition. It is known, that mercuric ion is the
highest bactericidal influence, it inhibits
2+bacterial growth at 0.1-1.0 ppm Hg [3]. In our
experiments some test-cultures grew even at
2+500 ppm Hg (Tab. 1), level that 2.5 orders
exceeds the mercury bactericidal concentration
for the majority of chemoorganotrophic
microorganisms.
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
Table 1. The first order of polyresistance of test-cultures to toxic metals with «combined»
action
Таблица 1. Множественная резистентность первого порядка тест-культур к
токсичным металлам «комбинированного» действия
Notes. The absence and presence of growth: "–" and "+" respectively. Number in brackets – the
time of lag-phase (days). In the control (without metals) the lag-phase was 1 day, in the presence of
metals "+" without brackets also means the 1 day time of lag-phase. 3202 - Enterobacter hormachei,
3204 - Brevibacterium antarcticum.
Примечание. «–» и «+» – отсутствие и наличие роста. Цифры в скобках – длительность лаг-
фазы (сутки). В контроле (без металлов) лаг-фаза была 1 сутки, в присутствии металлов «+» без
скобок также означает, что лаг-фаза была 1 сутки. 3202 – Enterobacter hormachei, 3204 –
Brevibacterium antarcticum.
168
на 2,5 порядка превышает бактерицидные
концентрации ртути для большинства
хемоорганотрофов.
Очень высокую устойчивость (до
2+2000–3000 мг/л Cu ) проявили тест-
культуры и по отношению к меди (Табл. 1).
Самый высокий уровень устойчивости (до
1000–30000 мг/л) тест-культур показан при
добавлении Cr(VI) – высокопотенциального
металла-окислителя (Табл. 2). При внесении
в среду глюкозы (20 г/л) в качестве
дополнительного источника углерода и
энергии несколько культур росли даже при
концентрации Cr(VI), близкой к
одномолярной. Наконец, культуры 3202 и
3207 росли при 60000 мг/л Cr(VI), что
превышает на 8000 мг одномолярную
концентрацию (1 моль/л составляет 51996
мг/л Cr(VI)).
Металлы-заместители (Табл. 3) образуют
следующий концентрационный ряд
2+ 2+ 2+токсичности: Cd Co Ni . Максимальные
концентрации металлов, при которых росли
некоторые тест-культуры, составляли
2+ 2+500–1000 мг/л Cd , 1000–1500 мг/л Co и
2+3000 мг/л Ni (Табл. 3). Следует отметить,
что некоторые металлы-заместители влияли
на лаг-фазу роста культур. Если в контроле
Test cultures showed very high levels of
2+resistance (up to 2000-3000 ppm Cu ) to
cupric ion (Tab. 1). Among all metals the
highest resistance (up to 1000-30000 ppm)
have been revealed concerning Cr(VI) – a
metal with oxidizing properties characterized
by a high redox-potential (Tab. 2). In the case
using glucose (20 g/l) as an additional source
of carbon and energy, some strains grew even
at concentrations of Cr(VI) close to 1M. At
last, isolates 3202 and 3207 grew at 60000 ppm
Cr(VI) that 8000 ppm exceeds 1M
concentration (1 mole/l makes 51996 ppm Cr
(VI)).
Metals with replacing properties (Tab. 3)
2+ 2+ 2+form a toxicity range Cd Co Ni . Maximal
growth concentrations for the test-cultures were
2+ 2+500-1000 ppm Cd , 1000-1500 ppm Co and
2+3000 ppm Ni (Tab. 3). It is necessary to note,
that some metals with replacing properties
influenced growth in lag-phase. During growth
without metals colonies were observed in one
day and in the presence of high concentration
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
4Notes. See Table 1. In variants 3х10 , 5х10 , 6х10 - the growth in the presence of 20 g/l glucose.
4 4 4Примечание. См. таблицу 1. В вариантах 3х10 , 5х10 , 6х10 – в среду внесена глюкоза (20
г/л).
4 4
Table 2. The first order resistance of test-cultures to Cr(VI) (metal with oxidizing properties)
Таблица 2. Резистентность первого порядка тест-культур к Cr(VI) (металл-
окислитель)
169
(без металлов) рост культур наблюдался
через одни сутки, то в присутствии высоких
концентраций этих металлов лаг-фаза
составляла от 2 до 7 суток (в редких случаях
– до 11–25 суток). Следовательно, все
исследованные тест-культуры проявили
высокий уровень множественной
резистентности первого порядка по
of these metals the lag-phase lasted from 2 till
7 day (in rare cases – till 11-25 day). Hence, all
investigated test-cultures have shown a high
level of the first order polyresistance in relation
to six most toxic metals that combine both
metal with oxidizing properties and metals with
replacing properties.
Table 3. The first order of polyresistance of test-cultures to toxic metals with replacing
properties
Таблица 3. Множественная резистентность первого порядка тест-культур к
токсичным металлам-заместителям
Notes. See Table 1.
Примечание. См. таблицу 1.
+Table 4. The second order of polyresistance of test-cultures to high concentration of Cu2 ,
+Hg2 и Cr(VI)
Таблица 4. Полирезистентность второго порядка тест-культур к высоким
+ +концентрациям Cu2 , Hg2 и Cr(VI)
Notes. See Table 1.
Примечание. См. таблицу 1.
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
170
отношению к шести наиболее токсичным
металлам, сочетающим в себе
повреждающие свойства как металлов-
окислителей, так и металлов-заместителей.
Множественная резистентность
второго порядка. Наличие в среде
нескольких токсичных металлов усиливает
их интегральное ингибирующее действие на
микроорганизмы. Поэтому при изучении
данного явления мы одновременно вносили
в среду различные комбинации наиболее
2 2 2токсичных металлов: Hg , Cu и CrO
(Табл. 4). Три тест-культуры (3203, 3206 и
3208), проявившие максимальную
устойчивость первого порядка к металлам,
были устойчивы к смеси токсичных
металлов (Табл. 4). Необходимо отметить,
что даже высокие концентрации металлов в
среде не приводили к существенной
задержке роста культур. Так, при наличии
2+ 2+трёх металлов (100 мг/л Hg , 500 мг/л Cu ,
100 мг/л Cr(VI)) все культуры вырастали,
как правило, на 1-2 сутки, и только в
некоторых случаях лаг-фаза составляла 4–6
суток.
Предельно допустимой для роста тест-
2+культур была комбинация: 100 мг/л Hg , 500
2+мг/л Cu и 100 мг/л Cr(VI) (Табл. 4, № 12).
При дальнейшем повышении концентрации
металлов рост микроорганизмов
отсутствовал (Табл. 4, №№ 13, 14).
Наиболее значимые результаты по
полирезистентности второго порядка
получены на среде, содержащей смесь трех
металлов (Табл. 4, № 10-12). По-видимому,
тест-культуры имеют различные
компенсаторные механизмы для снижения
интегрального ингибиторного действия
металлов-окислителей и металлов-
заместителей, что обеспечивает их рост при
экстремально высоких концентрациях
металлов.
Перспективы создания новых промыш-
ленных биотехнологий на основе
взаимодействия антарктических
микроорганизмов с металлами.
Эффективное использование
металлрезистентных микроорганизмов в
+ + –
4
The second order plural of polyresistance.
Presence of several toxic metals in the medium
strengthens their integrated toxic influence on
microorganisms. Studying the given
polyresistance phenomenon we simultaneously
brought in medium various combinations of the
2 2 2most toxic metals Hg , Cu and CrO (Tab.
4). Isolates 3203, 3206 and 3208 characterized
with the highest resistance level of the first
order also showed resistance to toxic metal
mixes (Tab. 4). It is necessary to note, that even
high concentrations of metals did not result in
an essential growth inhibition of isolates'
growth. So, at presence of three metals (100
2+ 2+ppm Hg , 500 ppm Cu , 100 ppm Cr(VI),
the lag-phase as a rule lasted 1-2 days, and only
in some cases 4-6 days.
Maximum permissible metal combination
2+for growth of test-cultures was 100 ppm Hg ,
2+500 ppm Cu and 100 ppm Cr(VI) (Tab. 4, N
12). At the further increase of metal
concentration growth was not revealed (Tab. 4,
N 13, 14). The most significant results on the
second order plural metal resistance were
obtained on media containing a mix of three
metals (Tab. 4, N 10-12). We suggest isolates
possess various compensatory mechanisms
against metals with oxidizing properties and
metals with replacing properties toxic
influence, which provide their growth at
extremely high metal concentrations.
Prospects of development of new
environment-protection industrial
biotechnologies on the basis of interaction of
the Antarctic microorganisms with metals. The
effective use of metal resistant microorganisms
in industrial biotechnologies assumes presence
+ + –
4
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
171
промышленных биотехнологиях
предполагает наличие целого ряда
механизмов взаимодействия
микроорганизмов с металлами. Так,
например, при очистке металл-содержащих
сточных вод микроорганизмы должны
извлекать металлы из водной фазы до
установленных техническим заданием
предельно-допустимых концентраций.
Поэтому мы исследовали механизмы
взаимодействия антарктических
микроорганизмов с металлами, такие как
иммобилизация и мобилизация.
Иммобилизация металлов осуществляется
за счет их восстановления до
2+нерастворимых форм (Сu Cu(OH) ,
2-CrO → Cr(OH) ↓ etc.), осаждения 4 3
органическими и неорганическими
микробными экзометаболитами
2+ 2+ 2+(Cu → [Cu -белок]↓; Сo → CoS↓ etc.;
2+Cu → CuCO ↓, а также аккумуляции 3
металлов клетками (образование комплекса
[металл-клетка]↓ и активный транспорт
металлов в клетку). Мобилизация металлов
происходит вследствие образования
комплексных растворимых соединений
металлов с микробными метаболитами
(например, с органическими кислотами), а
также вследствие снижения рН среды с
последующим растворением осажденной
формы металла (например, Cu(OH) ↓ + 2
+ 2+nхH → Cu ).
В зависимости от условий культивирова-
ния антарктические микроорганизмы могут
осуществлять как мобилизацию, так и
иммобилизацию токсичных металлов. Такая
направленная регуляция микробного
метаболизма позволяет в перспективе
создать полифункциональные
промышленные биотехнологии,
предназначенные как для удаления металлов
из водных растворов, так и, напротив,
перевода осажденных соединений металлов
в растворимую форму. Так, иммобилизация
может быть использована в: (1)
биотехнологиях очистки металлсодержащих
промышленных сточных вод от широкого
спектра металлов (в диапазоне 200–1000 мг-
→ ↓
of mechanisms of interaction of
microorganisms with metals. So, during
purification of metal-containing wastewater
microorganisms should uptake metals up to
level of maximal permissible concentrations in
requirements specification. It is possible to
specify such interaction of Antarctic
microorganisms with metals as immobilization
and mobilization. Metal immobilization takes
place due to their reduction up to insoluble
2+ 2-compounds (Сu → Cu(OH)↓, CrO → 4
Cr(OH) ↓ etc.), sedimentation with organic 3
2+and inorganic microbial metabolites (Cu →
2+ 2+ 2+[Cu -белок]↓; Сo → CoS↓ etc.; Cu →
CuCO ↓, metal accumulation (formation of 3
[metal - cell] ↓ complex and energy-
dependent transport of metals into a cell).
Metal mobilization occurs owing to formation
of complex soluble compound with microbial
metabolites (for example, organic acids), and
also рН value reduction with the subsequent
dissolution of insoluble metal compounds
+ 2+Cu(OH) ↓ + nхH → Cu .2
Depending on cultivation conditions
Antarctic microorganisms can carry out both
mobilization and immobilization of toxic
metals. Such directed regulation of a microbial
metabolism allows designing multifunctional
industrial biotechnologies aiming at metal
uptake, and opposite, transformation of
insoluble metal compounds into soluble ones.
Immobilization processes can be used in
biotechnologies of (1) industrial metal-
containing sewage purification (at metal
concentration 200 - 1000 ppm); (2)
bioremediation of metal-polluted
environments; (3) extraction and concentration
of precious metals from the diluted solutions at
the mining enterprises, etc. Biotechnologies
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
172
ионов/л); (2) биоремедиации природных и
техногенных водоемов, загрязненных
металлами; (3) извлечении и
концентрировании ценных металлов из
разбавленных растворов на
горнодобывающих предприятиях, и т.д.
Биотехнологии, основанные на
мобилизации нерастворимых соединений
металлов, перспективны для повышения
эффективности извлечения металлов из
пород в горнодобывающей и
горноперерабатывающей промышленности.
Мобилизация металлов антарктическими
микроорганизмами может применяться в
биоремедиационных технологиях в зонах
техногенных катастроф для очистки
терриконов и почв от токсичных металлов и
т.д.
Пигментированные антарктические
микроорганизмы и их экофизиологические
свойства. Пигментированные
микроорганизмы выделяли на средах, в
отсутствие экстремальных факторов. В
результате было показано, что они широко
распространены в наземных биотопах
Антарктики. Например, в наскальных
антарктических фитоценозах частота их
встречаемости, а также общее количество и
биоразнообразие значительно выше, чем в
других антарктических биотопах. Изучение
морфологокультуральных свойств
изолированных пигментированных
микроорганизмов показало, что они
представле-ны как прокариотами (бактерии
и актиномицеты), так и эукариотами
(мицелиальные грибы и дрожжи). Мы
изучали природу пигментов у изо-
лированных микроорганизмов, так как они
явля-ются потенциальными продуцентами
биологически активных веществ (меланины,
каротины и др.), которые могут быть
использованы в промышленных
биотехнологиях.
Синтез меланина. Несколько штаммов
угольно-чёрных дрожжей (Exophiala nigra)
синтезировали тёмные пигменты. Изучение
физико-химических свойств этих пигментов
показало, что по комплексу специфических
химических тестов они подобны меланину.
based on insoluble metal compounds
mobilization are perspective to increase the
efficiency of extraction of metals from breeds
in mining industry. Mobilization of metals by
the Antarctic microorganisms can be applied in
bioremediation technologies of highly metal-
polluted areas such as heaps and soils, etc.
Pigmented Antarctic microorganisms and
their ecophysiological characteristics.
Pigmented microorganisms were isolated on
media without influence of extreme factors. It
has been shown, that they are widely occurring
in terrestrial environments of Antarctic Region.
For example, their total number, occurrence
and biodiversity in rock samples is much
higher, than in other Antarctic biotopes.
Morphological and physiological properties
characterize pigmented isolates as prokaryotes
(bacteria and actinomycetes) and eukaryotes
(fungi and yeast). We studied the nature of
extracted microbial pigments as far as they are
potential producers of biologically active
substances (melanins, carotins, etc) which can
be used in industrial biotechnologies.
Melanin synthesis. Several coal-black yeast
isolates (Exophiala nigra) have shown the
ability to synthesize dark pigment. Studying
pigment characteristics confirmed their relation
to melanin by a complex of physical and
chemical properties. This conclusion is
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
173
Этот вывод подтверждён также характером
УФ-спектров (в области 220–230 нм) и
спектров поглощения пигмента в видимой
области (400–800 нм). Выход пигмента
меланиновой природы составлял более 10%
от биомассы. Это может оказаться
перспективным для медицинской
промышленности, т.к. меланины,
выделенные из чёрных антарктических
дрожжей, обладают уникальными
лечебными свойствами.
Синтез каротинов. Детальный хромато-
графический и спектрофотометрический
анализ розово-пигментированных бактерий
(Methylobacterium extorquens) показал, что
каро-тиноиды исследуемых штаммов
представлены преимущественно
ксантофиллами. Общий для всех
исследованных штаммов и представленный
в наибольшем количестве каротиноид был
иден-тифицирован как осцилоксантин (рис
1). Количественное содержание
каротиноидов составляло 0,23–0,35 мг/г
сухого веса клеток у разных штаммов.
Исследованные метилотрофы могут
Figure 1. Oscilloxanthin
absorption spectra (a pigment
extracted from
Methylobacterium extorquens
cells). 1 – native carotenoid, 2
– carotenoid after effects
NaBH , 3 – carotenoid after 4
effects HCl.
Рис. 1. Спектры
поглощения осцилоксантина
(выделенного из клеток
Methylobacterium extorquens).
Цифрами обо-значены: 1 –
нативный каротиноид, 2 –
каротиноид после действия
NaBH , 3 – каротиноид после 4
действия HCl.
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
confirmed also with UV-spectra at 220-230
nanometers and absorption spectra in visible
light (400-800 nanometers). Melanin output
made more than 10 % from total yeast biomass.
It can appear perspectives for the physical and
chemical properties.
Carotenoid synthesis. Detailed
chromatographic and spectrophotometric
analysis of pink pigmented bacteria
(Methylobacterium extorquens) has shown, that
carotenoids are mainly represented by
xanthophyll. Common feature of isolates is that
carotenoids are identified as oscilloxanthins
(Figure 1). Carotenoid content was 0.23-0.35
ppm of dry cells weight at different strains.
Investigated methylotrophs can be considered
as potential industrial carotenoid producers. It
is known that caroptenoids possess high
antioxidative activity which appears in highly
reacting oxygen radicals' deactivation. As it is
174
рассматриваться как потенциальные
промышленные продуценты каротиноидов.
Известно, что каротиноиды имеют высокую
антиоксидантную активность, которая
проявляется в дезактивации
высокореакционных свободных радикалов
кислорода. Как сказано выше, в
антарктических фитоценозах нами
обнаружены красные дрожжи, пигменты
которых содержат β-каротин. Поэтому они
могут рассматриваться как потенциальные
продуценты β-каротина для промышленных
биотехнологий.
Синтез криопротекторов
метилотрофами. Некоторые бактерии
катализируют процесс образования льда при
температуре от –2 °С до
–5 °С. Являясь центрами кристаллизации
льда, такие бактерии способствуют
образованию льда даже при небольших
заморозках, в результате чего повреждаются
растительные ткани. Это способствует
проникновению бактериальной инфекции в
растения и их гибели при заморозках [12].
above, we have found out red-pigmented yeast
in Antarctic phytocenoses which contain β-
carotin. Therefore they can be considered to be
potential β-carotin producers for industrial
biotechnologies.
Synthesis of cryoprotectors by methylo-
trophic bacteria. Some bacteria cata-lyze ice
nucleation processes at temperature from -2°С
to -5°С. Being ice nucleation centers such
bacteria provide crystallization even at a small
touch of frost that results plant tissues damag-
ing. This causes penetration of a bacterial
infection into plants and their destructions at
low temperatures (freeze) [12]. In the majority
of Antarctic phytocenosis (moss, lichens, grass)
on islands of Antarctic Region we found out
Figure 2. Survival of the Antarctic microorganisms at various dozes UV irradiation. Numbers of
strains are resulted in a legend: I – pink pigmented strains Methylobacterium; II – red yeast (3133,
3136) and coal-black yeast Exophiala nigra (3084, 3135).
Рис. 2. Выживаемость антарктических микроорганизмов при различных дозах УФ
облучения. В легенде приведены номера штаммов: I – розово-пигментированные штаммы
Methylobacterium; II – красные дрожжи (3133, 3136) и угольно-чёрные дрожжи Exophiala nigra
(3084, 3135).
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
175
Нами в большинстве антарктических
фитоценозов (мох, лишайник, трава) на
островах Антарктики обнаружены
эпифитные метилотрофные бактерии
(метилотрофы). Поэтому представлялось
целесообразным изучить у них
льдообразующие свойства. Показано, что в
присутствии метилотрофов кристаллизация
льда начиналась при температуре от –6°С до
–13°С [17].
Таким образом, метилотрофы, которые
являются постоянными обитателями
фитоценозов, не катализировали процесс
образования льда, и более того: некоторые
из них оказывали «антифризный» эффект.
Следовательно, в отличие от других
бактерий они положительно влияют на
фитоценозы Антарктики в период
заморозков в результате криопротекторного
действия. Видимо, в перспективе из
метилотрофов могут быть получены
промышленно-значимые криопротекторы.
Устойчивость к УФ радиации. Мы
предположили, что на вертикальных скалах,
открытых для непрерывного действия
Солнца во время полярного лета, должны
существовать микроорганизмы, устойчивые
к УФ радиации. Действительно, оказалось,
что антарктические розово-
пигментированные метилотрофы высоко
устойчивы к УФ (рис. 2, I). Сублетальная
доза УФ (LD ) для них составляла 200–300 99,99
2Дж/м , в то время как для бесцветных
2метилотрофов – 20–40 Дж/м .
Красные, а также угольно-чёрные
дрожжи Exophiala nigra были ещё более
устойчивыми к УФ (рис. 2, II). Сублетальная
доза УФ для угольно-чёрных дрожжей
2составляла 500-800 Дж/м , для красных
антарктических дрожжей – 1000–1500
2Дж/м .
Итак, впервые на вертикальных скалах в
Антарктике показано наличие бактерий и
дрожжей, резистентных к высоким дозам
УФ радиации, летальных для многих
микроорганизмов. По-видимому,
значительное количество
пигментированных форм антарктических
микро-организмов на вертикальных скалах
epiphyte methylotrophic bacteria (further
methylotrophs). Therefore we have found
reasonable to study their ice nucleation
properties. It was established that in the
presence of methylotrophs ice nucleation
process starts at temperatures from -6°С to -
13°С [17].
Thus, methylotrops which are constant
phytocenosis inhabitants did not catalyze ice
nucleation, and, moreover, some of them
provided antifreeze effect. Hence, on the
contrary to other bacteria, they positively effect
phytocenosis of Antarctic Region and act as
cryoprotectors. We suppose Antarctic
methylotrophs to be significant source for
industrial cryoprotector.
Resistance to UV radiation. Since vertical
rocks are under permanent action of the Sun
during polar summer we assumed there should
be microorganisms resistant to UV radiation.
Indeed, Antarctic pink-pigmented
methylotrophs were found out to be highly
resistant to UV radiation (Figure 2, I).
Sublethal UV dozes (LD ) for pigmented 99,99
2methylotrophs made 200-300 J/m , while for
2non-pigmented - 20-40 J/m .
Red and coal-black yeast Exophiala nigra
were more resistant to UV-radiation (Figure 2,
2II). Sublethal UV dozes made 500-800 J/m for
coal-black yeast, for red-pigmented Antarctic
2yeast - 1000-1500 J/m .
So, for the first time on vertical rocks in
Antarctic Region presence of bacteria and
yeast, resistant to high UV radiation dozes
lethal for the majority of microorganisms is
revealed. The high number of pigmented
microorganisms on Antarctic vertical rocks
(cell/g of sample): (1) pink-, yellow- and
2orange-pigmented bacteria – from 10 up to
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
176
(клеток/г образца): (1) розовые, желтые и
2 6оранжевые бактерии – от 10 до 10 ; (2)
4 6красные и чёрные дрожжи – от 10 до 10 ;
(3) бурые и чёрные микроскопические
3грибы – до 10 объясняется непрерывным
действием на протяжении полярного лета
активной солнечной радиации. Мы
предполагаем, что адаптация микробных
сообществ к высокому уровню УФ радиации
происходит путём природной селекции
микроорганизмов, у которых устойчивость к
этому фактору генетически
детерминирована. Видимо, в условиях
повышенного уровня солнечной радиации в
Антарктике преимущество для выживания
на скалах получили микроорганизмы,
которые имели эффективные механизмы
репарации повреждений ДНК, и/или
пигменты, защищающие клетки от
солнечной радиации. Пигментированные
изоляты представляют перспективные
продуценты биологически активных
веществ (меланинов, каротинов,
криопротекторов).
Синтез антибиотиков и
устойчивость к ним антарктических
микроорганизмов. Как уже упоминалось, в
зоне субполярных оазисов, на поверхности
антарктических островов крайне
неравномерно распределены органические
соединения. Это приводит к жесткой
конкуренции микроорганизмов за субстрат
(т.е. за источники углерода и энергии) и как
следствие – к антибиозу. Антибиоз
проявляется как синтезом антибиотиков, так
и устойчивостью к ним.
Синтез антибиотиков. Из
антарктических биотопов выделено 50
штаммов флуоресцирующих бактерий рода
Pseudomonas [10]. Показано, что для них
оптимальная температура роста равна
+26°С. Однако культивирование этих
бактерий при низких температурах (+4 °С)
приводило к резкому возрастанию
антибиотической активности. Это
необычное проявление адаптации
микроорганизмов к условиям жесткой
конкуренции за субстрат в антарктических
условиях было показано нами на
6 410 ; (2) red and black yeast – from 10 up to
6 310 ; (3) brown and black fungi – up to 10 , can
be explained by continuous action of active
solar radiation during polar summer. We
assume that adaptation of microbial
communities to high level of UV radiation in
Antarctic Region occurs by natural selection of
microorganisms which resistance is genetically
determined. Probably, in conditions of the high
level of solar radiation in Antarctic Region,
anadvantage to a survival on rocks got
microorganisms which had effective DNA
reparation mechanisms and/or possed
protective properties of pigments. Pigmented
isolates present industrial interest as
perspective producers of biological-active
substances (melanins, carotins, cryoprotectors).
Synthesis of antibiotics and resistance to
them of Antarctic microorganisms. As it was
already mentioned, in a zone of Antarctic
oases, on a surface of the islands organic
compounds are extremely non-uniformly
distributed. This results in a severe competition
of microorganisms for a substratum (i.e. for
sources of carbon and energy) and as
consequence to antibiosis phenomenon.
Antibiosis means both synthesis of antibiotics,
and resistance to them.
Synthesis of antibiotics. 50 fluorescing
Pseudomonas strains are isolated from
Antarctic biotopes [10]. Their optimum growth
temperature is equal +26°С. However
cultivation at low temperatures (+4°С) resulted
in sharp increase of antibiotic activity. This
unusual effect of microbial adaptation to
conditions of severe competition for a
substratum in Antarctic environments has been
shown for several Pseudomonas putida isolates.
At +26°С antibiotic activity was minimal, and
at +4°С – sharply grew and resulted in growth
suppression of conditionally pathogenic Gram-
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
177
нескольких антарктических штаммах
Pseudomonas putida. Так, при температуре
+26°С антибиотическая активность была
минимальной, а при +4 °С резко возрастала
и приводила к подавлению роста условно-
патогенных грамположительных и
грамотрицательных бактерий Staphylococcus
aureus, Escherihia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Ps. aeruginosa, а также
микроскопических грибов Fusarium
oxysporum, Penicillium chrysogenum, Mucor
circinelloides.
Устойчивость к антибиотикам. Другой
аспект антибиоза (устойчивость к
антибиотикам) был изучен у
антарктических штаммов Enterobacter
hormachеi 3202 и Brevibacterium antarcticum
3204. Исследованные штаммы проявили
различную степень устойчивости к
антибиотикам широкого спектра действия
(рис. 3), которые вызывают повреждение
цитоплазматической мембраны, подавление
синтеза белка и т.д.
Высокоустойчив к антибиотикам
Enterobacter hormachеi 3202, в отличие от
него Brevibacterium antarcticum 3204 в
positive and Gram-negative bacteria:
Staphylococcus aureus, Escherihia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Ps. aeruginosa, and
fungi Fusarium oxysporum, Penicillium
chrysogenum, Mucor circinelloides.
Resistance to antibiotics. Other aspect of
antibiotic resistance has been investigated at
Antarctic strains Enterobacter hormachеi 3202
and Brevibacterium antarcticum 3204. Isolates
have shown resistance to antibiotics of wide
spectrum action (Figure 3) which cause
cytoplasmic membranes degrading,
suppression of protein synthesis, etc.
Enterobacter hormachеi 3202 was highly
resistant to the antibiotic spectrum while
Brevibacterium antarcticum 3204, basically
Figure 3. Resistance of Antarctic cultures Entherobacter hormachеi 3202 (white columns) and
Brevibacterium antarcticum 3204 (grey columns) to antibiotics of a wide spectrum of action (1 - teicoplanin, 2 -
clindamycin, 3 - cefuroxime, 4 - cefoxitin, 5 - amikacin, 6 - chloramphenicol, 7 - oleandomycin, 8 - lincomycin,
9 - oxacillin).
Рис. 3. Устойчивость антарктических культур Entherobacter hormachеi 3202 (белые столбики) и
Brevibacterium antarcticum 3204 (серые столбики) к антибиотикам широкого спектра действия (1 –
тейкопланин, 2 – клиндамицин, 3 – цефуроксим, 4 – цефокситин, 5 – амикацин, 6 – левомицетин,
7 – олеандомицин, 8 – линкомицин, 9 – оксациллин).
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
178
основном чувствителен к исследованному
спектру антибиотиков. Работы по
исследованию синтеза антибиотиков и
устой-чивости к ним антарктических
микроорганизмов начаты нами недавно,
однако приведенные результаты однозначно
свидетельствуют об активном проявлении
антибиоза в антарктических биотопах.
Таким образом, на первых этапах
изучения явления антибиоза нами показано,
что в состав микробных антарктических
ценозов входят продуценты антибиотиков,
которые в перспективе, при системном
исследовании, могут найти применение в
медицинской промышленности. Кроме того,
на примере устойчивых к антибиотикам
антарктических микроорганизмов можно
тестировать эффективность действия новых
антимикробных препаратов.
Цитопротекторное действие
меланина (продуцент – антарктические
дрожжи Exophiala nigra). Изучали влияние
меланина на развитие язв, эрозий,
кровоизлияний в слизистой оболочке
желудка крыс, а также на развитие
предраковых состояний в желудке.
Влияние меланина на
нейродистрофические поражения в
слизистой оболочке желудка крыс,
вызванные острым стрессом по Селье.
Острый стресс по Селье вызывал
образование нейродистрофических
поражений (язвы, эрозии, кровоизлияния) в
слизистой оболочке желудка крыс,
интенсифицировал процесс перекисного
окисления липидов в слизистой оболочке
желудка, что проявлялось в увеличении
концентрации диеновых конъюгатов на 63%
(p<0,05), ТБК-активных продуктов – на
98,5% (p<0,05), шиффовых оснований – на
82% (p<0,05). Одновременно возрастала
активность ферментов антиоксидантной
защиты: активность СОД и каталазы
увеличивались на 29% (p<0,05) и 37%
(p<0,05) соответственно. Введение
меланина крысам перед нанесением стресса
приводило к уменьшению площади язв в
слизистой оболочке желудка крыс,
вызванных методом нервно-мышечного
was sensitive to the same antibiotics. Works on
antibiotic synthesis and antibiotic resistance of
the Antarctic microorganisms we started
recently, however results testify to active
antibiosis in Antarctic environments.
Thus, at the first stages of the antibiosis
phenomenon studying we have shown that
Antarctic microbial communities contain
antibiotic producers which can find their
application in medical industry. Besides this
Antarctic microorganisms can be used as test-
cultures for studying efficiency of new
antimicrobial preparations.
Cytoprotective effect of melanin (producer
- Antarctic yeast Exophiala nigra). The
influence of melanin on the development of
ulcers, erosions, hemorrhages in the gastric
mucosa of rats, as well as the development of
precancerous lesions in the stomach were
studied.
Effect of melanin on neuro-degenerative
lesions in the gastric mucosa of rats caused by
acute stress according to Selye. Acute stress by
Selye formed neuro-degenerative lesions
(ulcers, erosions, hemorrhage) in the gastric
mucosa of rats, intensified the process of lipid
peroxidation in the gastric mucosa, resulting in
increased concentrations of conjugated dienes
by 63% (p<0.05) , TBA-active products - by
98.5% (p <0.05), Schiff`s bases - by 82% (p
<0.05). Simultaneously, increased antioxidant
enzyme activity: SOD and catalase activity
increased by 29% (p <0.05) and 37% (p <0.05)
respectively. Introduction of melanin to rats
before the application of stress leads to a
decrease of ulcers area in the gastric mucosa of
rats caused by neuro-muscular tension by
Selye, for 79% (p <0.001), to reduce the
content of the products of lipid peroxidation in
the gastric mucosa of rats and a further increase
of SOD activity. The activity of catalase
decreased to control values.
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
179
напряжения по Селье, на 79% (p<0,001), к
уменьшению содержания продуктов
перекисного окисления липидов в слизистой
оболочке желудка крыс и дальнейшему
увеличению активности СОД. При этом
активность каталазы падала до контрольных
величин.
Влияние меланина на
нейродистрофические поражения в
слизистой оболочке желудка крыс,
вызванные хроническим
иммобилизационным стрессом. Меланин
оказывал выраженное цитопротекторное
действие на слизистую оболочку желудка
крыс, что проявлялось в уменьшении
количества и площади нейро-
дистрофических поражений, вызванных
методом иммобилизационного стресса.
Меланин усиливал экспрессию белка eNOS
в слизистой оболочке желудка крыс,
подвергшихся воздействию хронического
стресса, что приводило к увеличению
генерации оксида азота, в результате чего
возрастала концентрация в крови его
2-метаболита NO . Таким образом, один из
механизмов антистрессового влияния
меланина состоит в увеличении продукции
оксида азота, которому принадлежит важная
роль в цитопротекции. Блокатор рецепторов
активации пролиферации пероксисом гамма
GW9662 устранял защитное действие
меланина на образование язв и массивных
кровоизлияний в слизистой оболочке
желудка крыс, подвергнутых воздействию
хронического стресса, что является
свидетельством того, что цитопротективные
свойства меланина в условиях стресса
частично обусловлены стимуляцией
рецепторов активации пролиферации
пероксисом гамма.
Таким образом, механизм
антистрессового влияния меланина
обусловлен антиоксидантными свойствами
меланина, стимуляцией рецепторов
активации пролиферации пероксисом гамма,
усилением экспрессии eNOS, а также
уменьшением концентрации в крови
гормона стресса кортизола, уровень
которого резко возрастает под влиянием
Effect of melanin on neuro-degenerative
lesions in the gastric mucosa of rats caused by
chronic immobilization stress. Melanin has a
pronounced cytoprotective effect on the gastric
mucosa of rats, which manifested in reducing
the number and area of neuro-degenerative
lesions caused by immobilization stress.
Melanin enhanced the expression of eNOS
protein in the gastric mucosa of rats exposed to
chronic stress, leading to increased generation
of nitric oxide, resulting in increased
concentration in the blood of its metabolite
2-NO . Thus, one of the mechanisms of anti-
stress effect of melanin is to increase the
production of nitric oxide, which plays an
important role in cytoprotection. Blocker of
peroxisome proliferator-activated receptor
gamma GW9662 eliminated the protective
effect of melanin on ulceration and massive
hemorrhage in the gastric mucosa of rats
susceptible to chronic stress, which is an
indication that the cytoprotective properties of
melanin in stress conditions are partly due to
the stimulation of peroxisome proliferator-
activated receptor gamma.
Therefore, the mechanism of antistress
effect of melanin is due to antioxidant
properties of melanin, the stimulation of
peroxisome proliferator-activated receptor
gamma, increased expression of eNOS, as well
as lower blood concentrations of the stress
hormone cortisol, the level of which increases
dramatically under stress.
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
180
стресса.
Влияние меланина на структурно-
функциональные изменения в слизистой
оболочке желудка крыс, вызванные
длительной гипергастринемией. Длительная
гипергастринемия, вызванная 28-дневным
введением омепразола [25], приводила к
развитию гиперплазии в слизистой оболочке
желудка у 50% крыс и метаплазии – у 50%
крыс, что проявлялось в изменениях
морфометрических показателей [2]. У крыс
с гиперплазией регистрировалась
повышенная, а у крыс с метаплазией –
пониженная базальная секреция соляной
кислоты в желудке. Введение меланина
одновременно с омепразолом
предотвращало развитие структурных
изменений в слизистой оболочке желудка
крыс, в результате чего нормализовалась
базальная секреция соляной кислоты в
желудке. Полученные данные являются
экспериментальным обоснованием
возможного создания на основе меланина,
продуцентом которого являются дрожжи
Exophiala nigra, медицинских препаратов.
Например, для профилактики рецидивов
язвенной болезни желудка и
двенадцатиперстной кишки, препаратов для
профилактики неопластических изменений
в желудке, антиоксидантов и адаптогенов.
Effect of melanin on structural and
functional changes in the gastric mucosa of
rats caused by long hypergastrinemia.
Prolonged hypergastrinemia, caused by the 28-
day administration of omeprazole [25], led to
the development of hyperplasia in the gastric
mucosa in 50% of rats and metaplasia in 50%
of rats, which manifested in morphometric
parameters changes [2]. In rats with
hyperplasia of the recorded high, and in rats
with metaplasia - reduced basal secretion of
hydrochloric acid in the stomach. Introduction
of melanin in conjunction with omeprazole
prevented the development of structural
changes in the gastric mucosa of rats, resulting
in normalized basal secretion of hydrochloric
acid in the stomach. These data are
experimental justification for the possible
establishment on the basis of melanin, the
producer of which is the yeast Exophiala nigra,
of drugs for the prevention of recurrence of
gastric ulcers and duodenal ulcers, drugs for
the prevention of neoplastic changes in the
stomach, antioxidants and adaptogens.
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
181
Figure 4. Perspectives of multifunctional industrial biotechnologies development on the basis of Antarctic
coal-black yeast Exophiala nigra as natural result of system investigation of Antarctic microbial cenoses'
structure and functions.
Рисунок 4. Перспективы создания полифункциональных промышленных биотехнологий на основе
антарктических черно-пигментированных дрожжей Exophiala nigra как закономерный результат
системного исследования структуры и функций антарктических микробных ценозов.
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
182
Заключение. Системное изучение
структуры и функций антарктических
микробных ценозов показало, что они
проявляют высокую степень адаптации к
экстремальным факторам. Создана
коллекция микроорганизмов, устойчивых к
экстремальным факторам. Коллекция
включает микроорганизмы, устойчивые к
высоким дозам УФ радиации (500–1500
2Дж/м ), широкому спектру антибиотиков и
2+ 2+наиболее токсичным металлам (Hg , Cu ,
2+ 2+ 2+Cr(VI), Co , Cd , Ni ) в диапазоне
2 45х10 …6х10 мг-ионов/л, продуценты
криопротекторов, биологически активных
веществ (меланины, каротины,
антибиотики).
Эффективность системного подхода при
изучении структуры и функций
антарктических микробных ценозов для
получения промышленно-перспективных
штаммов продемонстрирована на примере
дрожжей Exophiala nigra, синтезирующей
меланины (рис. 4). Эта культура была
изолирована в 2004 г. из накипных
лишайников на скалах полигона
(о. Галиндез) и хранится в UCM.
Установлено, что Exophiala nigra обладает
рядом уникальных свойств: устойчивостью
2+к токсичным металлам (250 мг/л Ni и 1000
2+мг/л Co ) и к высоким дозам УФ (600–800
2Дж/м ), а меланины обладают выраженными
профилактическими свойствами по
отношению к ряду заболеваний. Уникальная
культура дрожжей Exophiala nigra
(продуцент меланина) может одновременно
использоваться в промышленных
технологиях очистки сточных вод от
2+ 2+металлов (например, Ni и Co ), получения
УФ-защитных препаратов, а также создания
лекарственных средств с
профилактическими свойствами по
отношению к язвенно-эрозивным
поражениям желудка и предраковым его
состояниям.
Выделенные нами экстремофильные
микроорганизмы являются перспективными
для создания широкого спектра новых
биотехнологий. Технологии, основанные на
Conclusion. System study of structure and
functions of Antarctic microbial communities
has shown their high adaptation degree to
extreme factors. The collection of the Antarctic
microorganisms, resistant to extreme factors is
developed. The collection includes
microorganisms resistant to high UV radiation
2level (up to 500-1500 J/m ), isolates resistant to
2+a wide spectrum of the most toxic metals (Hg ,
2+ 2+ 2+ 2+Cu , Cr(VI), Co , Cd and Ni ) in
2 4concentrations 5х10 -6х10 ppm,
cryoprotector-producing bacteria, isolates that
are producers of biologically active substances
(melanins, carotins, antibiotics).
Efficiency of the system approach
concerning structure and function of Antarctic
microbial communities for obtaining industrial
perspective strains is demonstrated on the
example of melanin-producing Exophiala nigra
(Figure 4). This strain has been isolated in 2004
rock sample colonized by lichens (island
Galindez) and deposited to UCM. It is
established that Exophiala nigra possesses a
wide range of unique properties: resistance to
2+toxic metals (250 ppm Ni and 1000 ppm
Co2+) and high resistance to UV radiation
2level (600-800 J/m ), extracted melanins have a
pronounced preventive and curative properties
in relation to the ulcer-erosive lesions of the
stomach and precancerous conditions of it. The
unique yeast isolate Exophiala nigra (a melanin
producer) can simultaneously be used for
+ +sewage treatment (for example, Ni2 and Co2 ),
UV-protective preparations, creation of
medicines with preventive properties in relation
to the ulcer-erosive lesions of the stomach and
precancerous.
Isolated extremophilic microorganisms are
perspective for a wide spectrum of new
biotechnologies designing. Biotechnologies
based on microbial mobilisation of insoluble
183
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
микробной мобилизации нерастворимых
форм металлов, эффективны для
повышения их извлечения из пород в горной
промышленности, в биоремедиации.
Иммобилизация перспективна в
биотехнологиях очистки сточных вод,
биоремедиации природных и техногенных
водоемов. Антарктические микроорганизмы
могут использоваться для получения новых
антибиотиков, а устойчивые к антибиотикам
штаммы – для тестирования эффективности
действия новых антимикробных препаратов.
Из метилотрофов могут быть получены
промышленно-значимые криопротекторы, а
пигментированные микроорганизмы
являются перспективными продуцентами
биологически-активных веществ
(меланины, каротины и др.).
metal compounds are effective for increase of
their extraction in the mining industry, and in
bioremediation. Immobilization abilities can be
applied in metal-containing sewage treatment.
The Antarctic microorganisms can be used for
new antibiotics production, antibiotic-resistant
strains as test-cultures for studying efficiency
of new antimicrobial preparations.
Methylotrophic bacteria are perspective
cryoprotector producers, pigmented
microorganisms – as biologically-active
substances producers (melanins, carotins, etc).
184
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
References
1. Bainbridge B.W., Bull A.T., Pirt S.J. еt аl. Biochemical and structural changes in non-
growing maintained and autolizing cultures of Aspergillus nidulans // Trans. Brit. Soc. – 1971. – 56. –
P. 371–385.
2. Beregova T.V., L.I. Ostapchenko, Tsyryuk O.I. еt аl. Probiotic is preventive agent against
structural and functional changes in stomach evoked by long-term reduction of gastric acid secretion //
Gut. – 2009. – 58, Suppl. II. – P. 124–125.
3. Bowman J.P, L.I Sly, Hayward A.C. Patterns of tolerance to heavy metals among methane-
utilizing bacteria // Lett. Appl. Microbiol. – 1990. – 10. – P. 85–87.
4. Brhynhildsen L., B.V. Lundgren, B. Allard еt аl. Effects of glucose concentrations on
cadmium, copper, mercury, and zinc toxicity to a Klebsiella sp. // Appl. Environ. Microbiol. – 1988. –
54. – P. 1689–1693.
5. Dighton J., T. Tugay, Zhdanova N. Fungi and ionizing radiation from radionuclides // FEMS
Microbiol. Lett. – 2008. – N 281. – P. 109–120.
6. Gerhard F. (ed.). Manual of Methods for General Bacteriology, American Society for
Microbiology, Washington, DC 200006, 1981.
7. Ghosh U.H., Shild H.O. Continious recording of acid secretion in the rat // British J. Pharm.
Chemotherapy. – 1958. – 13. – P. 54–61.
8. Green L., A. David, Glosgowski J. Аnalysis of nitrate, nitrite and [15N] nitrate in biological
fluids // Annal. Biochem. – 1982. – 126. – P. 131–138.
9. Iutynska G.O., Tashyreva G.O. Microbial communities of soil-like substrate of Antarctic
island Galindez // Microbiologichny Zhyrnal. – 2008. – 70, № 5. – Р. 3–8 (in Ukrainian: Іутинська
Г.О., Таширева Г.О. Мікробні угруповання ґрунто-субстратів антарктичного острова Галіндез
// Мікробіол. журнал. – 2008. – 70, № 5. – С. 3–8).
10. Kotsoflyak O.I., Reva O.N., Tashyrev O.B. Taxonomy and antagonistic properties of
antarctic fluorescent bacteria of Pseudomonas genus // Mikrobiologichny Zhurnal – 2004. – 66, № 2.
– Р. 3–10 (in Ukrainian: Коцофляк О.І., Рева О.М., Таширев О.Б. Таксономічний склад та
антагоністичні властивості антарктичних флуоресциюючих бактерій роду Pseudomonas //
Мікробіол. журнал. – 2004. – 66, № 2. – C. 3–10).
11. Kumar N.C, Ramachandra R.T.K. Effect of cadmium on microorganisms and microbe-
mediated mineralization process in the soil // Bull. Environ. Contam. and Toxicol. – 1988. – 41. – P.
657–663.
12. Lindow E. The role of bacterial ice nucleation in frost injury to plants // Ann. Rew.
Phytopathol. – 1983. – 21. – P. 363–384.
13. Meynell G., Meynell E. Theory and Practice in Experimental Bacteriology / Cambridge: At
the University Press. 1965.
14. Negoita T. Gh., Bahrim G. Antarctic bacteria as good producers of industrial interest
enzymes // CIENCIA/SANTAR07/CD/TAPA. HTM, CVRE408, 2007, ISSN 1851-555X
15. Negoita T. Gh., Bahrim G., Cotarlet M. еt аl. Microbiological study of Grove Mountains
soils, East Antarctica // SCAR/IASC/IPY Open Science Conference. St. Petersburg, 2008, S5.2/O02.
P. 442.
16. Romanovskaya V.A., Sokolov I.G., Malashenko Y.R. еt аl. Mutability of epiphytic and soil
bacteria of genus Methylobacterium and their resistance to UV and nuclear radiation //
Mikrobiologiia. – 1998. – Т. 67, № 1. – Р. 106–115 (in Russian: Романовская В.А., Соколов И.Г.,
Малашенко Ю.Р. и др. Мутабильность эпифитных и почвенных бактерий рода
Methylobacterium и их резистентность к УФ и ионизирующему излучению // Микробиология. –
1998. – Т. 67, № 1. – С. 106–115).
185
Tashyrev O.: TRENDS AND PROSPECTS FOR DEVELOPING OF NEW INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGIES ON THE...
17. Romanovskaya V.A., Stoliar S.M., Malashenko Y.R. еt аl. Processes of plant colonization
by Methylobacterium strains and some bacterial properties // Mikrobiologiia – 2001. – 70, № 2. – Р.
263–269 (in Russian: Романовская В.А., Столяр С.М., Малашенко Ю.Р. и др. Пути колонизации
растений штаммами Methylobacterium и их некоторые свойства // Микробиология. – 2001. – 70,
№ 2. – С. 263–269).
18. Romanovskaya V.A., Rokitko P.V., Shylin S.O. еt аl. Identification of Methylobacterium
strains using sequence analysis of 16S rRNA genes // Mikrobiologiia. – 2004. – 73, № 6. – Р. 846–
848. (in Russian: Романовская В.А., Рокитко П.В., Шилин С.О. и др. Идентификация штаммов
Methylobacterium с использованием сиквенс-анализа генов 16S рРНК // Микробиология. –
2004. – 73, № 6. – С. 846–848).
19. Ruban E.L., Layh S.P., Hruleva I.M. еt аl. Melanin pigments Nadsoniella nigra //
Proceedings Acad. Sci. USSR, Ser. Biol. – 1969. – № 1-3. – P. 134–148 (in Russian: Рубан Е.Л.,
Лях С.П., Хрулева И.М. и др. Меланиновые пигменты Nadsoniella nigra // Известия АН СССР.
Сер. Биол. – 1969. – № 1-3. – C. 134–148).
20. Tashyrev O.B., N.A. Matvieieva, V.A. Romanovskaya еt аl. Polyresistance and
superresistance of Antarctic microorganisms to heavy metals, Reports of Nat. Acad. Sci. of Ukraine,
11 (2007), pp. 170–175 (in Russian: Таширев А.Б., Матвеева Н.А., Романовская В.А. и др.
Полирезистентность и сверхустойчивость к тяжёлым металлам антарктических
микроорганизмов // Доповіді НАН України. – 2007. – № 11. – С. 170–175).
21. Tashyrev O.B., V.A. Romanovskaya, I.B. Sioma еt аl. Antarctic microorganisms resistant to
2+ 2+ 2+ 2-high concentration of Hg , Cu , Cd and СrО // Reports of Nat. Acad. Sci. of Ukraine. – 2008. – № 4 –
1. – P. 169–176 (in Russian: Таширев А.Б., Романовская В.А., Сиома И.А. и др. Антарктические
2+ 2+ 2+ 2-микроорганизмы, устойчивые к высоким концентрациям Hg , Cu , Cd и СrО // Доповіді 4 –
НАН України. – 2008. – № 1. – С. 169–176.
22. Tashyrev O.B., E.V. Galinker, Andreyuk E.I. Thermodynamic forecasting of redox-
2+ 2- 2+interaction of microorganisms with metals-oxidizers (Hg , CrO and Cu ) // Reports of Nat. Acad. 4 –
Sci. of Ukraine. – 2008. – № 4. – P. 166–172 (in Russian: Таширев А.Б., Галинкер Э.В., Андреюк
Е.И. Термодинамическое прогнозирование редокс-взаимодействия микроорганизмов с
2+ 2- 2+металлами-окислителями (Hg , CrO и Cu ) // Доповіді НАН України. – 2008. – № 4. – С. 4 –
166–172).
23. Tashyrev O.B., N.A. Matvieieva, Tashyreva G.O. еt аl. Experimental substantiation of
2+ 2-thermodynamic prognosis of redox-interaction microorganisms with metals-oxidizers (Hg , CrO 4
2+and Cu ). Reports of Nat. Acad. Sci. of Ukraine. – 2008. – № 5. – P. 174–180 (in Russian: Таширев
А.Б., Матвеева Н.А., Таширева А.А. и др. // Экспериментальное обоснование
термодинамического прогнозирования редокс-взаимодействия микроорганизмов с
2+ 2- 2+металлами-окислителями (Hg , CrO и Cu ) // Доповіді НАН України. – 2008. – № 5. – С. 4 –
174–180.
24. Tashyrev O.B. Complex researches of structure and function of Antarctic terrestrial microbial
communities // Ukrainian Antarctic Journal (ISSN 1727-7485). – 2009. – N 8. – P. 228–242.
25. Тsyryuk O., Radchuk O., Beregova T. The influence of multiprobiotic "SYMBITER®
ACIDOPHILIC" on structurally functional state of gastric mucosa in omeprazole-treated rats //
Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska (Lublin-Polonia). – 2008. – 21. – P. 257–260.
26. Zhdanova N., Tugay T., Dighton J. et al. Ionizing radiation attracts soil fungi // Mycol. Res.
– 2004. – N 108. – P. 1089–1096.
186
Страница 1
Страница 2
Страница 3
Страница 4
Страница 5
Страница 6
Страница 7
Страница 8
Страница 9
Страница 10
Страница 11
Страница 12
Страница 13
Страница 14
Страница 15
Страница 16
Страница 17
Страница 18
Страница 19
Страница 20
Страница 21
Страница 22
Страница 23
Страница 24
Страница 25
Страница 26
Страница 27
Страница 28
Страница 29
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-128413 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1727-7485 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T15:17:59Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Національний антарктичний науковий центр МОН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Таширев, А.Б. Романовская, В.А. Береговая, Т.В. Матвеева, Н.А. Рокитко, П.В. Таширева, А.А. Фалалеева, Т.В. 2018-01-08T18:43:48Z 2018-01-08T18:43:48Z 2010 Перспективы использования экстремофильных антарктических микроорганизмов для создания новых промышленных биотехнологий / А.Б. Таширев, В.А. Романовская, Т.В. Береговая, Н.А. Матвеева, П.В. Рокитко, А.А. Таширева, Т.В. Фалалеева // Український антарктичний журнал. — 2010. — № 9. — С. 158-186. — Бібліогр.: 26 назв. — рос. 1727-7485 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/128413 579.26 Цель работы – изучение антарктических экстремофильных микроорганизмы, а также оценка перспектив их использования для создания новых природоохранных биотехнологий и медицинских препаратов, селекции продуцентов биологически активных веществ. The aim of this study is researching Antarctic extremophilic microorganisms, estimation of trends and prospects for developing new environment protection biotechnologies, using them as producers of biologically active substances and medications. ru Національний антарктичний науковий центр МОН України Український антарктичний журнал Біологічні дослідження Перспективы использования экстремофильных антарктических микроорганизмов для создания новых промышленных биотехнологий Trends and prospects for developing of new industrial biotechnologies on the base of Antarctic extremophilic microorganisms Article published earlier |
| spellingShingle | Перспективы использования экстремофильных антарктических микроорганизмов для создания новых промышленных биотехнологий Таширев, А.Б. Романовская, В.А. Береговая, Т.В. Матвеева, Н.А. Рокитко, П.В. Таширева, А.А. Фалалеева, Т.В. Біологічні дослідження |
| title | Перспективы использования экстремофильных антарктических микроорганизмов для создания новых промышленных биотехнологий |
| title_alt | Trends and prospects for developing of new industrial biotechnologies on the base of Antarctic extremophilic microorganisms |
| title_full | Перспективы использования экстремофильных антарктических микроорганизмов для создания новых промышленных биотехнологий |
| title_fullStr | Перспективы использования экстремофильных антарктических микроорганизмов для создания новых промышленных биотехнологий |
| title_full_unstemmed | Перспективы использования экстремофильных антарктических микроорганизмов для создания новых промышленных биотехнологий |
| title_short | Перспективы использования экстремофильных антарктических микроорганизмов для создания новых промышленных биотехнологий |
| title_sort | перспективы использования экстремофильных антарктических микроорганизмов для создания новых промышленных биотехнологий |
| topic | Біологічні дослідження |
| topic_facet | Біологічні дослідження |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/128413 |
| work_keys_str_mv | AT taširevab perspektivyispolʹzovaniâékstremofilʹnyhantarktičeskihmikroorganizmovdlâsozdaniânovyhpromyšlennyhbiotehnologii AT romanovskaâva perspektivyispolʹzovaniâékstremofilʹnyhantarktičeskihmikroorganizmovdlâsozdaniânovyhpromyšlennyhbiotehnologii AT beregovaâtv perspektivyispolʹzovaniâékstremofilʹnyhantarktičeskihmikroorganizmovdlâsozdaniânovyhpromyšlennyhbiotehnologii AT matveevana perspektivyispolʹzovaniâékstremofilʹnyhantarktičeskihmikroorganizmovdlâsozdaniânovyhpromyšlennyhbiotehnologii AT rokitkopv perspektivyispolʹzovaniâékstremofilʹnyhantarktičeskihmikroorganizmovdlâsozdaniânovyhpromyšlennyhbiotehnologii AT taširevaaa perspektivyispolʹzovaniâékstremofilʹnyhantarktičeskihmikroorganizmovdlâsozdaniânovyhpromyšlennyhbiotehnologii AT falaleevatv perspektivyispolʹzovaniâékstremofilʹnyhantarktičeskihmikroorganizmovdlâsozdaniânovyhpromyšlennyhbiotehnologii AT taširevab trendsandprospectsfordevelopingofnewindustrialbiotechnologiesonthebaseofantarcticextremophilicmicroorganisms AT romanovskaâva trendsandprospectsfordevelopingofnewindustrialbiotechnologiesonthebaseofantarcticextremophilicmicroorganisms AT beregovaâtv trendsandprospectsfordevelopingofnewindustrialbiotechnologiesonthebaseofantarcticextremophilicmicroorganisms AT matveevana trendsandprospectsfordevelopingofnewindustrialbiotechnologiesonthebaseofantarcticextremophilicmicroorganisms AT rokitkopv trendsandprospectsfordevelopingofnewindustrialbiotechnologiesonthebaseofantarcticextremophilicmicroorganisms AT taširevaaa trendsandprospectsfordevelopingofnewindustrialbiotechnologiesonthebaseofantarcticextremophilicmicroorganisms AT falaleevatv trendsandprospectsfordevelopingofnewindustrialbiotechnologiesonthebaseofantarcticextremophilicmicroorganisms |