Жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования

Жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования

Исследовали влияние стандартной процедуры криоконсервирования на жизнеспособность различных субпопуляций кроветворных клеток эмбриональной печени. Определяли жизнеспособность клеток специфического фенотипа по окрашиванию пропидиум иодидом (PI) и мечению моноклональными антителами CD34, CD45, AC133 и...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Datum:2002
Hauptverfasser: Тарасов, А.И., Петренко, А.Ю., Грищенко, В.И., Джонс, Д.Р.Е.
Format: Artikel
Sprache:Russian
Veröffentlicht: Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2002
Schriftenreihe:Проблемы криобиологии и криомедицины
Schlagworte:
Криоконсервация биообъектов
Online Zugang:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/134655
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования / А.И. Тарасов, А.Ю. Петренко, В.И. Грищенко, Д.Р.Е. Джонс // Проблемы криобиологии. — 2002. — № 3. — С. 36–41. — Бібліогр.: 12 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-134655
record_format dspace
spelling nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1346552025-02-23T20:16:40Z Жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования Post-thaw Viability of Human Fetal Liver Cells of Different Phenotype Тарасов, А.И. Петренко, А.Ю. Грищенко, В.И. Джонс, Д.Р.Е. Криоконсервация биообъектов Исследовали влияние стандартной процедуры криоконсервирования на жизнеспособность различных субпопуляций кроветворных клеток эмбриональной печени. Определяли жизнеспособность клеток специфического фенотипа по окрашиванию пропидиум иодидом (PI) и мечению моноклональными антителами CD34, CD45, AC133 и Gly-A. Колониеобразующую активность суспензии эмбриональной печени человека (ЭПЧ) – методом культивирования в метилцеллюлозной среде. Криоконсервирование снижает жизнеспособность стволовых кроветворных клеток (СКК) на 20-30%, эритроидно коммитированных предшественников менее чем на 10%. Колониеобразующая активность криоконсервированных стволовых клеток подтверждает адекватность измеренных значений их жизнеспособности. Полученные результаты свидетельствуют о лабильности СКК к действию низких температур и необходимости оптимизации используемых параметров их криоконсервирования. Вивчали вплив стандартної процедури кріоконсервування на життєздатність різних субпопуляцій кровотворних клітин ембріональної печінки. Життєздатність клітин специфічного фенотипу визначали по фарбуванню пропідіум іодидом та міченню моноклональними антитілами CD34, CD45, AC133 та Gly-A. Колонієутворюючу активність суспензії ембріональної печінки людини визначали методом культивування в метилцелюлозному середовищі. Кріоконсервування знижує життєздатність стовбурових кровотворних клітин на 20-30%, комітованих еритроїдних попередників менше, ніж на 10%. Колонієутворююча активність кріоконсервованих стовбурових клітин підтверджує адекватність виміряних значень життєздатності. Отримані результати свідчать про лабільність стовбурових кровотворних клітин до дії низьких температур і необхідність оптимізації параметрів їх кріоконсервування. The influence of standard cryopreservation procedure on the viability of different subpopulations of embryonic liver hemopoietic cells was investigated. The viability of cells of the specific phenotype was determined by propidium iodide (PI) staining and labelling with monoclonal antibodies: CD34, CD45, AC133, and Gly-A. The colony-forming activity of human embryonic liver (HEL) suspension was determined by culturing in semisolid medium. The cryopreservation decreases the viability of hemopoietic stem cells (HSC) by 20-30% while the viability of committed erythroid progenitors is decreased by less than 10%. The colony-forming activity of the cryopreserved stem cells demonstrates the validity of the viability values measured. The results obtained testify to the lability of HSC to the effect of low temperatures and appeal for the necessity of an optimisation for their cryopreservation technique. Работа выполнена при поддержке INTAS (Тарасов А.И., YSF00-188) и Wellcome Trust (Петренко А.Ю.) 2002 Article Жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования / А.И. Тарасов, А.Ю. Петренко, В.И. Грищенко, Д.Р.Е. Джонс // Проблемы криобиологии. — 2002. — № 3. — С. 36–41. — Бібліогр.: 12 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/134655 615.361.013.36.014.413:57.043 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
language Russian
topic Криоконсервация биообъектов
Криоконсервация биообъектов
spellingShingle Криоконсервация биообъектов
Криоконсервация биообъектов
Тарасов, А.И.
Петренко, А.Ю.
Грищенко, В.И.
Джонс, Д.Р.Е.
Жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования
Проблемы криобиологии и криомедицины
description Исследовали влияние стандартной процедуры криоконсервирования на жизнеспособность различных субпопуляций кроветворных клеток эмбриональной печени. Определяли жизнеспособность клеток специфического фенотипа по окрашиванию пропидиум иодидом (PI) и мечению моноклональными антителами CD34, CD45, AC133 и Gly-A. Колониеобразующую активность суспензии эмбриональной печени человека (ЭПЧ) – методом культивирования в метилцеллюлозной среде. Криоконсервирование снижает жизнеспособность стволовых кроветворных клеток (СКК) на 20-30%, эритроидно коммитированных предшественников менее чем на 10%. Колониеобразующая активность криоконсервированных стволовых клеток подтверждает адекватность измеренных значений их жизнеспособности. Полученные результаты свидетельствуют о лабильности СКК к действию низких температур и необходимости оптимизации используемых параметров их криоконсервирования.
format Article
author Тарасов, А.И.
Петренко, А.Ю.
Грищенко, В.И.
Джонс, Д.Р.Е.
author_facet Тарасов, А.И.
Петренко, А.Ю.
Грищенко, В.И.
Джонс, Д.Р.Е.
author_sort Тарасов, А.И.
title Жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования
title_short Жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования
title_full Жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования
title_fullStr Жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования
title_full_unstemmed Жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования
title_sort жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования
publisher Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate 2002
topic_facet Криоконсервация биообъектов
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/134655
citation_txt Жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования / А.И. Тарасов, А.Ю. Петренко, В.И. Грищенко, Д.Р.Е. Джонс // Проблемы криобиологии. — 2002. — № 3. — С. 36–41. — Бібліогр.: 12 назв. — рос.
series Проблемы криобиологии и криомедицины
work_keys_str_mv AT tarasovai žiznesposobnostʹkletokémbrionalʹnojpečeničelovekarazličnogofenotipaposlekriokonservirovaniâ
AT petrenkoaû žiznesposobnostʹkletokémbrionalʹnojpečeničelovekarazličnogofenotipaposlekriokonservirovaniâ
AT griŝenkovi žiznesposobnostʹkletokémbrionalʹnojpečeničelovekarazličnogofenotipaposlekriokonservirovaniâ
AT džonsdre žiznesposobnostʹkletokémbrionalʹnojpečeničelovekarazličnogofenotipaposlekriokonservirovaniâ
AT tarasovai postthawviabilityofhumanfetallivercellsofdifferentphenotype
AT petrenkoaû postthawviabilityofhumanfetallivercellsofdifferentphenotype
AT griŝenkovi postthawviabilityofhumanfetallivercellsofdifferentphenotype
AT džonsdre postthawviabilityofhumanfetallivercellsofdifferentphenotype
first_indexed 2025-11-25T01:33:16Z
last_indexed 2025-11-25T01:33:16Z
_version_ 1849724130957459456
fulltext ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ 2002, № 3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY 2002, № 3 36 КРИОКОНСЕРВАЦИЯ БИООБЪЕКТОВ CRYOPRESERVATION OF BIOSYSTEMS УДК 615.361.013.36.014.413:57.043 UDC 615.361.013.36.014.413:57.043 Жизнеспособность клеток эмбриональной печени человека различного фенотипа после криоконсервирования А.И. ТАРАСОВ1, А.Ю. ПЕТРЕНКО1, В.И. ГРИЩЕНКО1, Д.Р.Е. ДЖОНС2 1Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков 2Департамент иммунологии, Королевский медицинский центр, Ноттингемский Университет, Ноттингем, Великобритания Post-thaw Viability of Human Fetal Liver Cells of Different Phenotype TARASOV A.I.1, PETRENKO A.YU.1, GRISCHENKO V.I.1, JONES D.R.E.2 1Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov, Ukraine 2Division of Immunology, Queens Medical Centre, University of Nottingham, Nottingham, UK Исследовали влияние стандартной процедуры криоконсервирования на жизнеспособность различных субпопуляций кроветворных клеток эмбриональной печени. Определяли жизнеспособность клеток специфического фенотипа по окрашиванию пропидиум иодидом (PI) и мечению моноклональными антителами CD34, CD45, AC133 и Gly-A. Колониеобразующую активность суспензии эмбриональной печени человека (ЭПЧ) – методом культивирования в метилцеллюлозной среде. Криоконсервирование снижает жизнеспособность стволовых кроветворных клеток (СКК) на 20-30%, эритроидно коммитированных предшественников менее чем на 10%. Колониеобразующая активность криоконсервированных стволовых клеток подтверждает адекватность измеренных значений их жизнеспособности. Полученные результаты свидетельствуют о лабильности СКК к действию низких температур и необходимости оптимизации используемых параметров их криоконсервирования. Вивчали вплив стандартної процедури кріоконсервування на життєздатність різних субпопуляцій кровотворних клітин ембріональної печінки. Життєздатність клітин специфічного фенотипу визначали по фарбуванню пропідіум іодидом та міченню моноклональними антитілами CD34, CD45, AC133 та Gly-A. Колонієутворюючу активність суспензії ембріональної печінки людини визначали методом культивування в метилцелюлозному середовищі. Кріоконсервування знижує життєздатність стовбурових кровотворних клітин на 20-30%, комітованих еритроїдних попередників менше, ніж на 10%. Колонієутворююча активність кріоконсервованих стовбурових клітин підтверджує адекватність виміряних значень життєздатності. Отримані результати свідчать про лабільність стовбурових кровотворних клітин до дії низьких температур і необхідність оптимізації параметрів їх кріоконсервування. The influence of standard cryopreservation procedure on the viability of different subpopulations of embryonic liver hemopoietic cells was investigated. The viability of cells of the specific phenotype was determined by propidium iodide (PI) staining and labelling with monoclonal antibodies: CD34, CD45, AC133, and Gly-A. The colony-forming activity of human embryonic liver (HEL) suspension was determined by culturing in semisolid medium. The cryopreservation decreases the viability of hemopoietic stem cells (HSC) by 20-30% while the viability of committed erythroid progenitors is decreased by less than 10%. The colony-forming activity of the cryopreserved stem cells demonstrates the validity of the viability values measured. The results obtained testify to the lability of HSC to the effect of low temperatures and appeal for the necessity of an optimisation for their cryopreservation technique. Криоконсервирование эмбриональных стволо- вых клеток является одним из наиболее перспек- тивных направлений развития современной крио- биологии [2]. Это связано с широким применением эмбриональных стволовых клеток в медицинской практике. СКК ЭПЧ используются как для лечения врождённых и приобретённых заболеваний раз- личной этиологии [12], так и для экспансии гемопоэтической ткани в условиях ex vivo [9]. Криоконсервирование СКК ЭПЧ производится по стандартным протоколам замораживания под защитой ДМСО. Используется либо медленное (1°С/мин) охлаждение до -80°С с последующим погружением в жидкий азот [6], или двухэтапный режим [4], включающий медленное охлаждение до -40°С (с инициацией при -3°С и эквилибрацией при -25°С) и быстрое охлаждение от -40 до -80°С с Cryopreservation of embryonic stem cells is one of the most perspective directions in development of modern cryobiology [2]. This is due to a wide number of applications of embryonic stem cells in clinical practice. HSC from HEL are used both for the treatment of congenital and acquired diseases of various etiology [12] and for ex vivo expansion of hematopoietic tissue [9]. Cryopreservation of HSC from HEL is performed using the standard protocols under Me2SO protection. The following techniques are used: slow cooling (1°C/ min) down to -80°C with subsequent plunging into liquid nitrogen [6], and two-stage regimen [4], including slow cooling down to -40°C (with initiation at -3°C and equilibration at -25°C) and rapid cooling from -40°C down to -80°C with following plunging into liquid nitrogen. These methods are considered to be the ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ 2002, № 3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY 2002, № 3 37 последующим погружением в жидкий азот. Считается, что данные протоколы оптимальны для консервирования гемопоэтических мононуклеаров как с точки зрения сохранности клеток, так и их простоты. Сохранность клетки при криоконсервировании зависит от её способности избежать воздействия двух основных факторов низкотемпературного повреждения – экспозиции в гиперконцентри- рованных растворах солей (так называемого “эффекта раствора”) и внутриклеточной кристал- лизации и роста кристаллов льда [8]. Эта способ- ность обусловлена как устойчивостью к “эффекту раствора”, так и высоким значением прони- цаемости плазматической мембраны для воды, что позволяет клетке быстро дегидратироваться, препятствуя внутриклеточному кристаллооб- разованию. Цель данной работы – определить устойчивость гемопоэтических клеток ЭПЧ разной степени коммитированности к стандартной про- цедуре криоконсервирования. Суспензию клеток получали из печени плодов человека 6 – 12 недель гестации, замораживали под защитой 5%-го ДМСО по двухэтапному режиму [4], отогревали на водяной бане при 37°С, после чего клетки отмывали от криопротектора. Жизнеспособность до и после криоконсерви- рования определяли по окрашиванию трипа- новым синим. Подсчёт клеток производили в камере Горяева под оптическим микроскопом. Клетки ЭПЧ малой плотности выделяли на 1,071 градиенте Percoll (Pharmacia). Выделенные клетки, так же как и первичную (тотальную) суспензию клеток ЭПЧ, окрашивали моноклональными анти- телами, мечеными флуоресцентными красите- лями: CD34-PE/FITC, CD45-FITC, АС133-PE и Glycophorin-A-FITC. Содержание клеток специ- фического иммунофенотипа определяли методом проточной цитометрии на клеточном сортере EPICS Altra (Beckman Coulter). Жизнеспособность клеток специфического иммунофенотипа опреде- ляли одновременно с их содержанием с помощью дополнительного окрашивания PI. Культивирование клеток выполняли в чашках Петри диаметром 35 мм в полутвёрдой среде в атмосфере с 5% CO2 в воздухе и 100%-й влаж- ностью при 37°C. В состав среды входили: 1.3% метилцеллюлозы, 4.0 мM глутамина, 10 ед/мл пенициллин-стрептомицина, 100 ед/мл GM-CSF, 100 ед/мл IL-3, 50 нг/мл SCF и 10 ед/мл эритропоэтина. Готовую среду пропускали через 0.22 мкм фильтр и к 770 мкл среды добавляли 105 клеток (тотальная суспензия) в 230мкл RPMI-1640. Подсчёт коли- чества и типа колоний (БОЕ-Э, КОЕ-ГМ и КОЕ- ГЭММ) проводили на 14-е сутки культивирования. Статистический анализ данных выполняли при помощи пакета SPSS-9.0. Для оценки досто- верности результатов использовали критерий Вилкоксона, парные коэффициенты корреляции определяли по ρ - методу Спирмена. Достоверными считались различия с уровнем значимости p<0,05. optimal ones for the hematopoietic mononuclear cell preservation both from the aspect of cells integrity and the simplicity of the procedure. Cell integrity during cryopreservation depends on its ability to avoid the influence of two major low temperature damage factors which are the exposure to highly concentrated solutes (so-called “solution effect”) and intracellular crystallisation with growth of ice crystals [8]. This capability is stipulated both by resistance to “solution effect” and high value of plasmatic membrane permeability for water, that allows the rapid cell dehydration, avoiding the intracellular crystal formation. The aim of this work is to determine the resistance of differently committed HEL hematopoietic cells to a standard cryopreservation procedure. Cell suspension was obtained from liver of human embryos of 6-12 gestation’ weeks frozen under 5% Me2SO protection according to two-stage regimen [4], thawed on water bath at 37°C and then washed-out of cryoprotectant. The viability before and after cryopreservation was assessed by trypan blue staining. Cell counting was performed in laboratory hemocytometer using optical microscope. Low density HEL cells were separated using 1.071 Percoll gradient (Pharmacia). Separated cells, as the total HEL cell suspension, were stained with monoclonal antibodies, labelled with fluorescent dyes: CD34-PE-FITC, CD45-FITC, AC133-PE and Glycophorin-A-FITC. The content of cells of specific immunophenotype was determined using flow cytometry on EPICS Altra cell sorter (Beckman Coulter). Viability of cells of specific immunophenotype was determined simultaneously using propidium iodide staining. Cell culturing was performed in 35 mm Petri dishes in semisolid medium in atmosphere with 5% CO2 and 100% humidity at 37°C. The medium comprised of 1.3% methylcellulose, 4.0 mM glutamine, 10 U/ml of penicillin-streptomycin, 100 U/ml of GM-CSF, 100 U/ml of IL-3, 50 ng/ml of SCF and 10 U/ml of erythropoietin in IMDM. Final medium was filtered through 0.22 mcm filter and then 105 cells (total suspension) in 230 mcm of RPMI-1640 were added to 770 mcl of medium. Colony count (BFU-E, CFU-GM and CFU-GEMM) was performed on 14th day of culturing. Statistical analysis of data was performed using SPSS-9.0 software package. Statistical significance was estimated by Wilcoxon criterion, coupled coefficients of correlation were determined by Spearmen ρ-method. The differences were considered as statistically significant if significance value p was less than 0.05. Data are presented as “mean ± standard error of mean”. Total viability according to Trypan blue staining after cryopreservation and washing-out was determined as 71±4%. Content of cells of specific immunophenotype was determined by method of HEL cells flow cytometry. The results are shown in Fig.1 as dot plots. Each dot in the plot corresponds to a cell, dot’s coordinates ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ 2002, № 3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY 2002, № 3 38 Данные представлены в виде “среднее±стандартная ошибка среднего”. После криоконсервирования и отмывки крио- протектора общая жизнеспособность по окра- шиванию трипановым синим составляла до 71±4%. Содержание клеток специфического иммуно- фенотипа было определено методом проточной цитометрии клеток ЭПЧ. Ее результаты пред- ставлены на рис.1 в виде точечных графиков. Каждая точка на графике соответствует клетке, координаты точки - различным параметрам этой клетки. В данном случае параметрами являются интенсивности свечения клеток, меченых флуо- ресцентными моноклональными антителами, что соответствует степени экспрессии на мембране того или иного антигена. Экспрессирующими антиген считали клетки, интенсивность флуо- ресценции которых превосходила интенсивность флуоресценции неспецифического контроля. Обозначения PE и FITC (рис. 1) соответствуют фикоэритрину и флуоресцеин-изотиоцианату, флуоресцентным маркерам, конъюгированным с моноклональными антителами. Нами опреде- Рис.1. Фенотипический анализ клеток ЭПЧ. Fig. 1. Phenotypic analysis of HEL cells. лялось содержание клеток, экспрессирующих CD34 (используется как общий маркер прогени- торных гемопоэтических клеток), AC133 (маркер гемопоэтических клеток-предшественников), CD45 (экспрессируется на всех зрелых лейкоцитах и лимфоидно коммитированных клетках, так же как и на гемопоэтических клетках-предшественниках) и гликофорин A (экспрессируется коммитиро- ванными эритроидными предшественниками разной степени зрелости, а также эритроцитами). Как видно, содержание CD34+ клеток в тоталь- ной суспензии ЭПЧ составляло 0,89±0,09%, а CD45+ клеток - 2,33±0,25%. Содержание CD34+CD45+ клеток составляло 0,82±0,09%, а содержание GlyA+ клеток – 90,00±2,54%, AC133+ клеток – 0,39±0,07%, при этом подавляющее большинство (0,28±0,07%) AC133+ клеток экспрессировало ещё и CD34 антиген. Центрифугирование в градиенте плотности позволяло повысить содержание CD34+, CD45+ и AC133+ клеток в несколько раз. Как видно из таблицы, достаточно простое одноступенчатое разделение клеток в градиенте плотности обо- гащает содержание прогениторных клеток в суспензии ЭПЧ в 2,5 – 4,25 раза. Жизнеспо- собность клеток специфического иммунофенотипа также определялась методом проточной цито- метрии с помощью дополнительного окрашивания PI. Общая жизнеспособность суспензии криокон- сервированных ядросодержащих клеток сос- тавляла 93,91±0,82%. Полученные данные (рис.2) свидетельствуют о максимальной жизнеспо- собности фракции GlyA+ клеток (жизнеспособ- ность 93,75±1,60%). Более ранние CD34+ (жизнеспособность 79,57±4,13%), AC133+ (жизнеспособность 77,16±4,81%), а также CD45+ (жизнеспособность 84,93±4,93%) клетки оказались менее жизнеспособными и, следо- correspond to various parameters of this cell. In this case, the parameters are the fluorescence intensity of cells, labelled with monoclonal antibodies, that corresponds to the expression rate of one or another antigen on the membrane. The cells were considered as antigen expressing if their fluorescence intensity was higher than that of the nonspecific control. PE and FITC designations (Fig. 1) correspond to phycoerythrin and fluorescein-isothyocyanate, fluorescent markers, conjugated with monoclonal antibodies. We have determined the content of cells, expressing CD34 (used as a general marker of progenitor hematopoietic cells), AC133(marker of hematopoietic progenitor cells), CD45 (is expressed on all mature leucocytes and lymphoid committed cells, as well as on hemopoietic progenitor cells) and glycophorine A (is expressed by committed erythroid progenitors of various maturation stage and by erythrocytes). As it is seen the CD34+ cell content in total HEL suspension made 0.89±0.09%, CD45+ cell content made 2.33±0.25%. CD34+CD45+cell content made 0.82±0.09%. Content of Gly-A+ cells was 90.00±2.54%, CD133+ made 0.39±0.07%, the majority of CD133+ cells (0.28±0.07%) also expressing CD34 antigen. Centrifugation in density gradient allowed to increase the content of CD34+, CD45+ and AC133+ cells in several times. As it is seen from Table 1 a simple cell separation in density gradient enriches the content of progenitor cells in HEL suspension in 2.5- 4.25 times. The viability of cells of specific immunophenotype was also determined by flow cytometry using an additional PI staining. The total viability of the cryopreserved nucleated cell suspension made 93.91±0.82%. The obtained data testify to the maximal viability of GlyA+ cells (the viability of 93.75±1.60%). The earliest CD34+ (viability of 77.16±4.81%), and ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ 2002, № 3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY 2002, № 3 39 вательно, более чувствительными к консер- вированию. Колониеобразующую активность клеток ЭПЧ определяли методом культивирования в полу- твёрдой среде. На 14-е сутки культивирования образовывалось 187,75±21,21 БОЕ-Э, 172,43±31,91 КОЕ-ГМ, 153,64±33,58 КОЕ-ГЭММ, что свиде- тельствует о сохранении функциональной актив- ности колониеобразующих клеток. Проведённый корреляционный анализ позволил выявить досто- верные корреляции между жизнеспособностью CD34+ клеток и числом КОЕ-ГЭММ и БОЕ-Э, а также жизнеспособностью и содержанием AC133+ клеток и числом КОЕ-ГМ и БОЕ-Э. Основная задача данной работы состояла в определении устойчивости клеток специфического иммунофенотипа к процедуре криоконсервирова- ния, следовательно, нас интересовала сохранность клеток после отогрева. При этом сохранность клетки отождествлялась с её жизнеспособностью. Окрашивание трипановым синим и PI позволяет, как известно [11], отмечать лишь целостность плазматической мембраны, а не сохранность функциональной активности клетки. Кроме того, при одновременном окрашивании PI, FITC и PE могут возникнуть артефакты: PI+ клетке может быть ошибочно приписано FITC или PE свечение. Корректность метода определения сохранности была проверена при оценке колониеобразующей активности клеток ЭПЧ. Положительная корел- ляция между жизнеспособностью CD34+ клеток по окрашиванию PI и числом образуемых колоний позволила рассматривать окрашивание PI как корректный в рамках данной работы метод опреде- ления сохранности клетки. При анализе результатов проточной цитометрии (рис.1), мы не рассматривали клетки с аномально высоким FITC и PE свечением, поэтому популя- ции располагались на точечных графиках доста- точно локально. Кроме того, нежизнеспособные клетки располагались также в достаточно локаль- ном регионе точечного графика SSC/FSC. Такое ограничение могло привести к некоторому завыше- нию значений жизнеспособности и занижению числа клеток специфического фенотипа. Однако оно позволило считать использованный метод определения жизнеспособности клеток корректным. Различия в жизнеспособности тотальной суспен- зии ЭПЧ по окрашиванию трипановым синим ïèòîíåÔ epytonehP 43DC + 331CA + 43DC + 331CA + 54DC + AylG + èíåëåäçàðîÄ ÿ %, %,noitarapeserofeB 90,0±98,0 70,0±93,0 70,0±82,0 52,0±33,2 45,2±00,09 %,ÿèíåëåäçàðåëñîÏ %,noitarapesretfA 84,0±87,3 70,0±90,1 01,0±7,0 24,0±99,8 47,0±45,08 Nx,åèíåùàãîáÎ Nx,tnemhcirnE 79,0±52,4 86,0±97,2 89,0±05,2 95,0±68,3 30,0±98,0 Обогащение суспензии клеток ЭПЧ в градиенте плотности. Enrichment of HEL suspension cells in density gradient Рис. 2. Жизнеспособность клеток ЭПЧ специфического иммунофенотипа. Fig. 2. Viability of HEL cells of specific immunophenotype. CD45+ cells (viability of 84.93±4.93%) occurred to be less viable, and therefore more sensible to cryopreser- vation. Colony forming ability of HEL cells was determined by culturing in semisolid medium. To the 14th day of culturing there was 187.75±21.21 of BFU-E, 172.43±31.91 of CFU-GM, 153.64±33.58 of CFU-GEMM, that testifies to the preserving of the functional activity of colony forming cells. The correlation analysis allowed to reveal a statistically significant correlation between CD34+ cells viability and CFU-GEMM and BFU-E number, and the viability and content of CD133+ cells and the number of CFU-GM and BFU-E. The main aim of this work was to determine the resistance of cells of specific immunophenotype to the cryopreservation procedure, therefore, we were interested in cell integrity after thawing. Here, we have equalized the cell integrity as its viability. Trypan blue and PI staining allows, as it is known [11], only to detect if the plasmatic membrane is intact but not the functional activity. Furthermore, due to simultaneous staining with PI, FITC and PE there could arise the artifacts, when the PI+ cell could be misconsidered as the one with FITC or PE fluorescence. The validity of the determination of the integrity was confirmed by estimating the colony forming activity of HEL cells. Positive correlation between CD34+ cells viability by PI staining and the number of the formed colonies allowed the consideration of PI staining as the proper method for cell integrity determination within the frames of this work. When analysing the results of flow cytometry we did not take into account the cells with abnormally high ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ 2002, № 3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY 2002, № 3 40 (71±4%) и PI (93,91±0,82%), с нашей точки зрения, обусловлены как уже упомянутым некоторым завышением жизнеспособности при оценке резуль- татов проточной цитометрии, так и различной проницаемостью плазматической мембраны для двух использованных красителей. Существует мнение [1] о повышенной устой- чивости стволовых гемопоэтических клеток к внешним воздействиям. Оно основано на особен- ностях их клеточного цикла. В цикле СКК присут- ствует фаза покоя (G0-фаза), в течение которой клетки подвергаются “естественному консерви- рованию”: метаболизм замедляется, не происходит синтеза ДНК и т.п.[10]. Морфологические наблю- дения подтверждают увеличение поверхностно- объёмного отношения клеток и уменьшение осмотически активного объёма, что снижает время дегидратации при замораживании. Эксперимен- тально доказанная радио- и хемирезистентность [5,7] СКК объясняется изменениями, характер- ными для G0-фазы. Следовало ожидать, что среди клеток суспензии ЭПЧ именно СКК окажутся более жизнеспособными и менее прихотливыми в отношении режимов замораживания. Согласно полученным результатам, в ЭПЧ как в основном органе кроветворения [3] преобладают гемопоэтические клетки, среди которых СКК составляют лишь малую долю. Более 90% клеток суспензии ЭПЧ экспрессирует GlyA, что свидетель- ствует об эритроидной коммитации. Таким образом, общая жизнеспособность суспензии ЭПЧ подтверждает сохранность эритроидных пред- шественников различной степени зрелости и может не отражать сохранность СКК. Можно полагать, что и среди эритроидных клеток доминирует какая-то одна субпопуляция с характер- ными криобиологическими параметрами, причём они позволяют клеткам избежать действия повреж- дающих факторов низкотемпературного консерви- рования при использовании данного режима замораживания. По сравнению с эритроидными клетками СКК повреждаются больше, следовательно, криобиологические параметры СКК отличаются от параметров эритроидных клеток. Очевидно опти- мальные скорости замораживания СКК и эрит- роидных предшественников будут различными. Возможно, при используемом протоколе замора- живания СКК не успевают полностью дегидра- тироваться до достижения температуры внутри- клеточной кристаллизации, и образующиеся в результате внутриклеточные кристаллы льда перфо- рируют плазматическую мембрану СКК. Но СКК может обезвоживаться достаточно быстро (эта точка зрения согласуется с уже описанными наблюдениями особенностей клеточного цикла СКК) и подвергаться более длительной экспозиции в гиперкон- центрированном растворе, что и обусловливает меньшую жизнеспособность. Различия в кинетике транспорта ДМСО через плазматическую мембрану могут быть рассмотрены как ещё одна возможная причина разной устойчивости клеток ЭПЧ к дейст- FITC and PE fluorescence, that is why the considered populations had quite narrow localisation on the dot plots. Furthermore, non-viable cells were localised also in quite a narrow region of SSC/FSC dot plot. This limitation could lead to some overestimating of the viability values and decreasing of the number of cells of specific phenotype. However it allowed to consider the utilized method of cell viability determination as a proper one. Differences in the viability of total HEL suspension estimated by staining with Trypan blue (71±4%) and PI (93.91±0,82%) are preconditioned, from our point of view, by both already mentioned overestimation of viability during evaluation of flow cytometry results, and different plasmatic membrane permeability for each of two dyes used. There exists an opinion [1] about an increased resistance of hematopoietic stem cells to the external stresses emanating from the pecularities of their cell cycle. In HSC cycle there is a quiescence phase (G0- stage), during which the cells become “naturally preserved”: the metabolism is slowing down, no DNA synthesis occurs, etc [10]. Morphological observations confirm the increasing of the surface-volume ratio of cells and decreasing of osmotically active volume, that reduces the dehydration time during freezing. Experimentally proved radio- and chemoresistance of HSC [5, 7] is explained by the changes, being characteristic to G0 stage. It should be expected, that among the HEL cell suspension the HSC will appear to be more viable and less sensible to freezing stages. According to the obtained results, HEL, as a major blood forming organ [3], contains mainly hemopoietic cells, among which the HSC make only small part. More than 90% of HEL suspension cells express GlyA, that testifies to the erythroid commitment. Thus, total viability of HEL suspension confirms the integrity of erythroid progenitors of various maturation stage and may not show the HSC integrity. It could be supposed that among the erythroid cells dominates a distinct subpopulation with characteristic cryobiological paramethers, and they allow the cells to avoid the action of low temperature preservation damage factors when using this freezing regimen. Compared to erythroid cells, the HSC become damaged in greater extent, thus, cryobiological parameters of HSC differ from those of erythroid cells. It is evident that optimal freezing rates of HSC and erythroid progenitors will be different. It is possible, that by the freezing protocol utilized, the HSC have not fully dehydrated to the moment of intracellular crystallisation, and intracellular ice crystals perforate the HSC plasmatic membrane. However, HSC can dehydrate quite rapidly (this opinion agrees with described observation of HSC cell cycle features) and undergo longer exposure in hyperconcentated solution, that leads to the decreased viability. Differences in Me2SO transport via plasmatic membrane could be considered as another reason of various resistance of HEL cells to the effect of low temperature preservation damaging factors. However, our investigation does not ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ 2002, № 3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY 2002, № 3 41 вию повреждающих факторов низкотемпературного консервирования. Однако наше исследование не позволяет однозначно указать, как конкретно должен быть оптимизирован используемый протокол замора- живания. Для оптимизации необходимо исследовать кинетику транспорта воды и ДМСО через плазма- тическую мембрану СКК. Работа выполнена при поддержке INTAS (Тарасов А.И., YSF00-188) и Wellcome Trust (Петренко А.Ю.). References 1. Gavrilov O.K., Kozinets G.I., Chernyak N.B. Cells of bone marrow and blood.– M.: Meditsina, 1985.– 288 p. 2. Grischenko V.I. Role of cryobiology in creating the cell and tissue transplantation biotechnologies // Probl. of Cryobiology.– 2001.– N3.– P.7–8. 3. Grischenko V.I., Lobyntseva G.S., Votyakova I.A, Shereshkov S.I. Hemopoietic cells of embryonic liver.– Kiev: Naukova dumka, 1988.– 192 p. 4. Grischenko V.I., Tarasov A.I., Rudenko S.V., Petrenko A.Yu. Sensitivity to a programmed and cycled freeze-thawing of human embryonic liver cells of 7-12 wekks of gestation // Probl. of Cryobiology.– 2000.– N4.– P. 37–44. 5. Chertkov I.L., Fridenstein A.Ya. Cellular bases of hemopoiesis. M.: Meditsina, 1977.– 272 p. 6. Leibo S.P., Mazur P. The role of cooling rates in low tempera- ture preservation // Cryobiology.– 1971, – 8.– P. 447 7. Lerner C., Harrison D.E. 5-fluorouracil spares hemopoietic stem cells responsible for long-term repopulation // Exp. Hematol. – 1990. – 18. – P. 114. 8. Mazur P. Kinetics of Water Loss from Cells at subzero Temperatures and the Likelihood of Intracellular Freezing // J. Gen. Physiol.– 1963.– V. 47, N 2.– P. 347–369. 9. Mellado-Damas N., Rodriguez J.M., Carmona M. et al. Ex- vivo expansion and maturation of CD34-positive hematopoietic progenitors optimization of culture conditions // Leukemia Research.– 1999.– 23.– P. 1035–1040. 10. Ogawa M. Differentiation and Proliferation of Hematopoietic Stem Cells // Blood. – 1993.– V. 81, N11.– P. 2844–2853. 11. Shier W.T. The final steps to toxic cell death // The Journal of Toxicology. – 1985.– 4(2).– P. 191–249. 12. Touraine J.-L., Raudrant D., Laplace S. Transplantation of Hemopoietic Cells From the Fetal Liver to Treat Patients With Congenital Diseases Postnatally or Prenatally // Transplantation Proceedings.– 1997.– 29.– P. 712–713. Accepted in 2.07.2002 Литература 1. Гаврилов О.К., Козинец Г.И., Черняк Н.Б. Клетки костного мозга и крови.– М.: Медицина, 1985.– 288 с. 2. Грищенко В.И. Роль криобиологии в создании биотехнологий клеточной и тканевой трансплантации // Пробл. криобиологии.– 2001.– №3.– С. 7–8. 3. Грищенко В.И., Лобынцева Г.С., Вотякова И.А., Шерешков С.И. Гемопоэтические клетки эмбриональной печени.– Киев: Наук. думка, 1988.– 192 с. 4. Грищенко В.И., Тарасов А.И., Руденко С.В., Петренко А.Ю. Чувствительность к программному и циклическому замораживанию-отогреву клеток эмбриональной печени человека 7-12 недель гестации // Пробл. криобиологии.– 2000.– №4.– С. 37–44. 5. Чертков И.Л., Фриденштейн А.Я. Клеточные основы кроветворения.– М.: Медицина, 1977.– 272 с. 6. Leibo S.P., Mazur P. The role of cooling rates in low tempe- rature preservation // Cryobiology.– 1971, – 8.– P. 447 7. Lerner C., Harrison D.E. 5-fluorouracil spares hemopoietic stem cells responsible for long-term repopulation // Exp. Hematol. – 1990. – 18. – P. 114. 8. Mazur P. Kinetics of Water Loss from Cells at subzero Temperatures and the Likelihood of Intracellular Freezing // J. Gen. Physiol.– 1963.– V. 47, N 2.– P. 347–369. 9. Mellado-Damas N., Rodriguez J.M., Carmona M. et al. Ex-vivo expansion and maturation of CD34-positive hematopoietic progenitors optimization of culture conditions // Leukemia Research.– 1999.– 23.– P. 1035–1040. 10. Ogawa M. Differentiation and Proliferation of Hematopoietic Stem Cells // Blood. – 1993.– V. 81, N11.– P. 2844–2853. 11. Shier W.T. The final steps to toxic cell death // The Journal of Toxicology. – 1985.– 4(2).– P. 191–249. 12. Touraine J.-L., Raudrant D., Laplace S. Transplantation of Hemopoietic Cells From the Fetal Liver to Treat Patients With Congenital Diseases Postnatally or Prenatally // Transplantation Proceedings.– 1997.– 29.– P. 712–713. Поступила 2.07.2002 allow to answer, how the freezing protocol utilized could be optimized in fact. For this reason it is necessary to investigate the kinetics of water and Me2SO transport via HSC plasmatic membrane. This work was supported by INTAS (Tarasov A.I., YSF00-188) and Wellcome Trust (Petrenko A.Yu.).

Ähnliche Einträge