Модифікація епітеліальномезенхімального переходу в клітинах раку молочної залози внаслідок їх кокультивування з фібробластами та клітинами кісткового мозку
Мета: дослідити взаємодію пухлинних клітин з деякими компонентами мікрооточення
 для визначення можливої ролі останніх у модифікації фенотипу пухлинних
 клітин при розвитку дисемінованого пухлинного процесу із залученням кісткового
 мозку (КМ). Об’єкт і методи: дослідження пр...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Онкологія |
|---|---|
| Datum: | 2013 |
| Hauptverfasser: | , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainisch |
| Veröffentlicht: |
Iнститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького
2013
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/134965 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Модифікація епітеліальномезенхімального переходу в клітинах раку молочної залози внаслідок їх кокультивування з фібробластами та клітинами кісткового мозку / Н.О. Бездєнєжних, Н.І. Семесюк, О.О. Лихова, В.Є. Жильчук, Ю.Й. Кудрявець // Онкологія. — 2013. — Т. 15, № 3. — С. 191-196. — Бібліогр.: 17 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860251021011320832 |
|---|---|
| author | Бездєнєжних, Н.О. Семесюк, Н.І. Лихова, О.О. Жильчук, В.Є. Кудрявець, Ю.Й. |
| author_facet | Бездєнєжних, Н.О. Семесюк, Н.І. Лихова, О.О. Жильчук, В.Є. Кудрявець, Ю.Й. |
| citation_txt | Модифікація епітеліальномезенхімального переходу в клітинах раку молочної залози внаслідок їх кокультивування з фібробластами та клітинами кісткового мозку / Н.О. Бездєнєжних, Н.І. Семесюк, О.О. Лихова, В.Є. Жильчук, Ю.Й. Кудрявець // Онкологія. — 2013. — Т. 15, № 3. — С. 191-196. — Бібліогр.: 17 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Онкологія |
| description | Мета: дослідити взаємодію пухлинних клітин з деякими компонентами мікрооточення
для визначення можливої ролі останніх у модифікації фенотипу пухлинних
клітин при розвитку дисемінованого пухлинного процесу із залученням кісткового
мозку (КМ). Об’єкт і методи: дослідження проводили з використанням
біоптатів КМ хворих на рак молочної залози (РМЗ) з різним перебігом пухлинного
процесу та постійних культур клітин: використовували методи роботи
з культурами клітин, імуноцитохімічний та статистичний методи аналізу.
За допомогою створеної системи безконтактного кокультивування пухлинних
і нормальних клітин досліджували їх фенотипічний профіль, характеризуючи
рівень експресії маркерів епітеліально-мезенхімального переходу (ЕМП) (білки
адгезії та цито скелета і транскрипційний фактор Slug), стовбурових пухлинних
клітин (CD44), а також регулятора клітинного циклу р21. Результати:
виявлено значну відмінність у ростових і фенотипічних характеристиках досліджуваних
клітин залежно від ЕМП-статусу пухлинних клітин і від варіанта
їх кокультивування: використання клітин з КМ пацієнтів з різним характером
перебігу пухлинного процесу (прогресування чи ремісія захворювання). Висновок:
виявлено модифікуючий вплив in vitro мононуклеарів КМ хворих на РМЗ
на пухлині клітини залежно від перебігу захворювання. Зокрема, встановлено
факт стимуляції ЕМП пухлинних клітин при дії на них факторів, які, можливо,
продукуються клітинами КМ хворих в стадії прогресування захворювання.
Objective: the goal of our study was to investigate
the interaction between tumor cells and some
components of their microenvironment for identification
leading factors in tumor progression. Object and methods:
we used primary (biopsies of bone marrow breast
cancer patients with different stages of disease) and cell
culture lines (human breast cancer cell line, rat breast
cancer cell line, human normal fibroblasts) with immunocytochemical
analysis and statistical methods. The
proliferative potential and immunophenotypical features
of tumor and normal cells were revealed in our new
co-cultivation system in vitro, which include investigation
to markers of epithelial — mesenchymal transition
and tumor stem cells (adhesion protein and cytoskeleton
— E-cadherin, Vimentin, CD44), protein of cell
cycle p21 and transcription factor Slug. Results: it was
revealed the great differences in growth and phenotypic
features of these cells which depended on EMT status of
tumor cells and version of co-cultivation (using the bone
marrow cells of breast cancer patients with progression
or remission stage of disease). Conclusion: modifying
effects of bone marrow mononuclears of breast cancer
patients in tumor cells, depending on the disease were
found in vitro. In particular, the fact that epithelial-mesenchymal
transition stimulation of tumor cells exposed
to factors that may be produced by bone marrow cells of
patients in stage of disease progression was determined.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:43:34Z |
| format | Article |
| fulltext |
ÎÐÈÃÈÍÀËÜÍÛÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß
191ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 3 • 2013 191
ВСТУП
Пухлини, як відомо, включають декілька струк-
турних елементів: злоякісно трансформовані кліти-
ни, кровоносні судини, клітини імунної системи,
фібробласти, які сполучаються зазвичай позаклі-
тинним матриксом та формують так звану пухлин-
ну строму [1]. На цей час існує велика кількість ін-
формації про роль і особливості взаємодії «пухлин-
ної строми» з неопластичними клітинами, однак ще
досить багато питань залишаються без відповіді. Іс-
нують, зокрема, дані щодо підвищення «злоякісних
властивостей» клітин раку молочної залози (РМЗ),
в тому числі їх інвазивності та рухомості при взає-
модії зі стромальними елементами [2]. У свою чер-
гу, пухлинні клітини (ПК) індукують зміни в фібро-
бластах, які з ними контактують [2], перетворюючи
їх у міофібробласти, які активують програму епітелі-
ально-мезенхімального переходу (ЕМП) в ПК, вна-
слідок чого в останніх починають домінувати ме-
зенхімальні, активація яких формує високометаста-
тичний фенотип клітин та максимально наближує
їх до стовбурових клітин з високим рівнем лікар-
ської резистентності. Усі ці процеси проходять із
залученням розчинних (гуморальних) факторів мі-
крооточення (цитокінів, факторів росту та ін.), які,
в свою чергу, активують інші ланки взаємодії, залу-
чені в «злоякісний транзит», зокрема, транскрипцій-
ні фактори, EPSTI1 (epithelial-stromal interaction 1)
та ін. У результаті цього епітеліальні клітини втра-
чають здатність формувати щільні міжклітинні кон-
такти, знижуються їх адгезивні властивості, вони на-
бувають здатності до інвазії та міграції. Однак коли
такі клітини досягають свого «місця призначення»,
відбувається зворотний процес — мезенхімально-
епітеліальний перехід (МЕП), при якому вони зно-
ву набувають епітеліального фенотипу з підвище-
ною адгезією, що дає можливість їм прикріпитися
до субстрату та дати ріст вторинному метастатич-
ному вогнищу [3]. Розвиток метастазів залишається
основною причиною загибелі хворих онкологічного
профілю, саме тому подальше вивчення ролі міжклі-
тинної взаємодії у складному та надзвичайно важли-
вому біологічному процесі трансдиференціювання
МОДИФІКАЦІЯ ЕПІТЕЛІАЛЬНО-
МЕЗЕНХІМАЛЬНОГО ПЕРЕХОДУ
В КЛІТИНАХ РАКУ МОЛОЧНОЇ
ЗАЛОЗИ ВНАСЛІДОК
ЇХ КОКУЛЬТИВУВАННЯ
З ФІБРОБЛАСТАМИ
ТА КЛІТИНАМИ КІСТКОВОГО
МОЗКУ
Мета: дослідити взаємодію пухлинних клітин з деякими компонентами мікро-
оточення для визначення можливої ролі останніх у модифікації фенотипу пухлин-
них клітин при розвитку дисемінованого пухлинного процесу із залученням кіст-
кового мозку (КМ). Об’єкт і методи: дослідження проводили з використанням
біоптатів КМ хворих на рак молочної залози (РМЗ) з різним перебігом пухлин-
ного процесу та постійних культур клітин: використовували методи роботи
з культурами клітин, імуноцитохімічний та статистичний методи аналізу.
За допомогою створеної системи безконтактного кокультивування пухлинних
і нормальних клітин досліджували їх фенотипічний профіль, характеризуючи
рівень експресії маркерів епітеліально-мезенхімального переходу (ЕМП) (білки
адгезії та цито скелета і транскрипційний фактор Slug), стовбурових пухлин-
них клітин (CD44), а також регулятора клітинного циклу р21. Результати:
виявлено значну відмінність у ростових і фенотипічних характеристиках до-
сліджуваних клітин залежно від ЕМП-статусу пухлинних клітин і від варіан-
та їх кокультивування: використання клітин з КМ пацієнтів з різним харак-
тером перебігу пухлинного процесу (прогресування чи ремісія захворювання). Ви-
сновок: виявлено модифікуючий вплив in vitro мононуклеарів КМ хворих на РМЗ
на пухлині клітини залежно від перебігу захворювання. Зокрема, встановлено
факт стимуляції ЕМП пухлинних клітин при дії на них факторів, які, можли-
во, продукуються клітинами КМ хворих в стадії прогресування захворювання.
Н.О. Бездєнєжних1
Н.І. Семесюк1
О.О. Лихова1
В.Є. Жильчук2
Ю.Й. Кудрявець1
1Інститут експериментальної
патології, онкології
і радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького
НАН України, Київ
2Львівський національний
медичний університет
імені Данила Галицького,
Львів, Україна
Ключові слова: рак молочної
залози, епітеліально-
мезенхімальний перехід,
мікрооточення, кістковий
мозок, кокультивування.
ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 3 • 2013
ÎÐ ÈÃÈÍÀËÜÍÛ Å ÈÑÑËÅÄÎ ÂÀ ÍÈß
192
дозволить значно поглибити розуміння механізмів
його контролю і реалізації, що, як наслідок, може
відкрити нові мішені в антиметастатичній терапії.
Принципово важливим для розробки підходів
до антиметастатичної терапії є чітке уявлення про ме-
ханізми так званого хомінг-ефекту і умови створення
і тривалого виживання віддалених мікрометастазів.
Добре відомо, що для багатьох локалізацій пухлин-
ного процесу характерні певні органи і тканини ор-
ганізму як мішень переважного метастазування. Для
РМЗ такою мішенню часто є кістковий мозок (КМ)
і кістки. На цей час добре відома важлива роль стро-
мальних клітин, зокрема фібробластів, як елементів
мікрооточення ПК у контролі їх фенотипу і біоло-
гічної поведінки [4], однак роль клітин КМ як ком-
понентів пухлинного мікрооточення дуже мало ви-
вчена. Водночас КМ є осередком значної кількості
клітин різного рівня диференціювання і різної ко-
мітованості. Це не тільки кровотворні клітини, але
й клітини, здатні утворювати інші тканинні струк-
тури, наприклад судини і капіляри. Усі ці клітини є
активними продуцентами цитокінів і хемокінів, які
безперечно впливають на долю дисемінованих ПК.
Більш того, саме ці розчинні компоненти часто й зу-
мовлюють локалізацію мікрометастазів. Тому логіч-
ним є визначення впливу клітин КМ, особливо у по-
рівняльному аспекті з фібробластними елементами,
на фенотипічну конверсію і проліферативну актив-
ність клітин РМЗ, зокрема, при їх кокультивуванні.
У рутинній практиці для дослідження впливу
речовин різної природи (протипухлинні препара-
ти, цитотоксичні чинники) застосовують ізольо-
вані культури клітин (первинні культури клітин
та постійні клітинні лінії) in vitro. Експерименталь-
ні системи in vitro з використанням клітинних ліній
людини являють собою важливий інструмент для
оцінки рівня і механізмів токсичності протипухлин-
них препаратів з метою більш чіткого визначення їх
можливої протипухлинної дії in vivo. Основним не-
доліком такої системи in vitro є відсутність числен-
них компонентів взаємодії, що існують у цілісному
організмі між різними типами клітин, які представ-
ляють кожен окремий орган. В ідеалі такі модельні
клітинні системи in vitro мають максимально відо-
бражати умови in vivo, зокрема, зі збереженням як
видової, так і тканинної специфічності. Принци-
пово новим підходом для визначення міжтканин-
ної взаємодії in vitro стала створена A.P. Li зі спів-
авторами система інтегрованих дискретних куль-
тур нормальних клітин різного гістогенезу (IdMOC)
і клітин РМЗ для дослідження одночасної комбіно-
ваної токсичної дії хіміопрепаратів на ПК-мішені
та на нормальні клітини організму (печінка, нир-
ки, легені, ендотелій судин тощо) [5]. Подібна схе-
ма з деякими модифікаціями була розроблена нами
для тестування токсичності хімічних сполук, зокре-
ма солей важких металів, in vitro та отримала назву
мультиорганної системи токсичності (МОСТ) [6].
У цій роботі для дослідження ролі клітинної взає-
модії в прогресуванні захворювання було розроб-
лено нову клітинну систему з використанням пер-
винних та постійних клітинних ліній різного гене-
зу (ПК молочної залози людини та щура, нормальні
фібробласти людини — НФЛ та щура — НФЩ, клі-
тини з пунктатів КМ хворих на РМЗ з різним пере-
бігом захворювання).
Мета роботи — дослідити in vitro взаємодію ПК
з деякими компонентами мікрооточення для визна-
чення можливої ролі останніх у модифікації фено-
типу ПК при розвитку дисемінованого пухлинного
процесу із залученням КМ.
ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Моделювання системи безконтактного ко-
культивування клітин. В якості матеріалу для ко-
культивування використовували мононуклеари, які
виділяли з КМ хворих на РМЗ, що перебували на лі-
куванні в Рівненському обласному онкологічному
диспансері. Пунктати КМ отримували шляхом пунк-
ції грудини через надріз шкіри для уникнення конта-
мінації епітеліальними клітинами від хворих на РМЗ
(стадії T1–4N1–2M0–1 та T1–4N0–2M0, гістологіч-
ний тип пухлини — інфільтративна протокова кар-
цинома) до хірургічного втручання. Після прове-
деного лікування (радикальне хірургічне втручан-
ня та ад’ювантна хіміотерапія) хворих розподілено
на групи «прогресування» чи «ремісії». Підставою
для поділу на групи були клінічний стан хворих,
наявність ПК у КМ та високий рівень пухлиноасо-
ційованих цитокінів у плазмі [7, 8]; при цьому було
дотримано існуючих стандартів щодо повної, част-
кової ремісії або прогресування захворювання. У до-
слідженнях використовували зразки КМ від 3 хво-
рих, у яких відзначали прогресування захворювання,
та від 3 пацієнтів без ознак останнього. При цьому
разом з виявленням цитокератинпозитивних клітин
в КМ у хворих, в яких реєстрували прогресування
процесу, відзначали високий рівень фактора некрозу
пухлин (> 150 пкг/мл) в КМ і ПК, колонієстимулю-
ючого фактора 1 (> 300 од./мл) в ПК, трансформую-
чого фактора росту β
1
(> 10 нг/мл) та інтерлейкіну 6
(> 50 пкг/мл) в ПК [7, 8]. Усі хворі були проінфор-
мовані про обстеження та надали згоду на викорис-
тання матеріалу в дослідницьких цілях.
Мононуклеари виділяли в градієнті щільності
LSM 1077 («PAA», Австрія), двічі відмивали центри-
фугуванням в середовищі DMEM («PAA», Австрія)
протягом 10 хв при 1000 об./хв, їх кількість обчис-
лювали в камері Горяєва та застосовували кріокон-
сервацію (2,5–4×106 кл/ампулу).
Серед клітинних ліній використовували НФЛ
і НФЩ лінії Wistar та клітини ліній РМЗ люди-
ни — T-47D, MCF-7 і щура — MRS [9, 10], що ха-
рактеризуються домінуванням у популяції клітин
з епітеліальним фенотипом, а також високоонко-
генної сублінії MRS-Т5, яка характеризується на-
явністю клітин тільки мезенхімального фенотипу.
Усі клітинні лінії були отримані з клітинного бан-
ÎÐÈÃÈÍÀËÜÍÛÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß
193ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 3 • 2013 193
ку ліній з тканин людини та тварин Інституту екс-
периментальної патології, онкології і радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України. При проведен-
ні експерименту клітини різного типу були фізично
ізольовані одна від одної (рис. 1 а) і слугували конт-
ролем, однак дослідні лунки у варіанті кокультиву-
вання були об’єднані між собою за допомогою спе-
ціально зроблених каналів у стінці лунок так, щоб
відбувалася взаємодія клітин через їх поживне сере-
довище (рис. 1 б). Для характеристики фенотипічно-
го профілю клітин обрано антигени, що є маркера-
ми ЕМП (білки адгезії та цитоскелета — Е-кадгерин,
віментин, транскрипційний фактор Slug — ЕМП-
профіль), антигени стовбурових пухлинних клітин
CD44 та регулятора клітинного циклу p21WAF (ендо-
генний інгібітор циклінзалежних кіназ).
à
á ÍÔË
Ïóõëèíí³
êë³òèíè
ÍÔË
Ïóõëèíí³
êë³òèíè
Êë³òèíè
ç ÊÌ
Êë³òèíè
ç ÊÌ
Рис. 1. Загальна схема безконтактного кокультивуван-
ня in vitro: а — контрольні лунки — ізольовані; б — лунки
з безконтактним кокультивуванням
Культивування клітин in vitro. Клітини культиву-
вали в пластиковому посуді («ТРР», Італія) в сере-
довищі DMEM («PAA», Австрія), яке містило 2 мМ
L-глютаміну та NaHCO
3
з 10% сироватки ембріо-
нів/новонароджених телят («PAA», Австрія) у зво-
ложеній атмосфері при 37 °С у присутності 5% CO
2
.
Кількість клітин після їх кокультивування визнача-
ли шляхом фарбування кристалічним фіолетовим
(«Sigma», США) з наступною реєстрацією оптичної
густини вмісту лунок за допомогою мультилунково-
го спектрометра (Labsystems Multiskan PLUS) [11].
Імуноцитохімічний аналіз. При проведенні імуно-
цитохімічного (ІЦХ) аналізу клітини фіксували в фік-
суючому розчині (метанол + ацетон: 1:1) протягом
2 год за t -20 °С, інкубували з 1% розчином бичачо-
го сироваткового альбуміну (BSA) 20 хв. Потім на-
носили моноклональні антитіла в розведеннях згід-
но з інструкцією виробника: anti-E-cadherin (Thermo
Scientific), anti CD325 (N-Cadherin) (BioLegend),
anti-Vimentin (Diagnostic BioSystems), anti-CD44
(Diagnostic BioSystems), SLUG (GeneTex), р21/
waf1 (NeoMarkers) на 60 хв, після чого застосовува-
ли систему візуалізації Poly Vue (Thermo Scientific),
кон’юговану з пероксидазою, та виявляли актив-
ність ферменту із застосуванням в якості субстра-
ту 3,3´-діамінобензидину (Thermo Scientific). Після
проведення ІЦХ реакції препарати промивали водою
та забарвлювали гематоксиліном Мейєра («Sigma»)
(15–30 с). Аналіз результатів проводили за обчислен-
ням позитивних (+) клітин за допомогою мікроско-
па AxioVert («Сarl Zeiss», Німеччина) при збільшен-
ні у 320 разів та оцінювали за допомогою класично-
го методу H-score:
S = 1 • A + 2 • B + 3 • C,
де S — показник H-score, значення якого знахо-
дяться у межах від 0 (відсутня експресія) до 300 (ін-
тенсивна експресія у 100% клітин); А — відсоток
слабко «забарвлених» клітин; В — відсоток помірно
«забарвлених» клітин; С — відсоток сильно «забарв-
лених» клітин.
Статистичну обробку одержаних результатів про-
водили за допомогою математичної програми ме-
дико-біологічної статистики STATISTIСA 6.0. Об-
числення і порівняння достовірності відміннос-
тей середніх значень проводили з використанням
t-критерію Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Для встановлення ЕМП-профілю ПК, що
були включені в систему безконтактного ко-
культивування, визначали експресію маркерів най-
більш характерних для ЕМП-транзиту, зокрема
експресію Е- та N-кадгеринів, віментину та транс-
крипційного фактора мезенхімальних клітин Slug
(табл. 1). Виявлено, що в ПК людини лінії T-47D
мезенхімальний антигенний профіль більш вираже-
ний, ніж в клітинах лінії MCF-7, яка характеризуєть-
ся епітеліальним фенотипом. Клітини лінії MRS-Т5,
які відрізняються мезенхімальною морфологією, та-
кож характеризувалися і домінуванням мезенхімаль-
них ознак порівняно з клітинами лінії MRS, яка є
культурою з переважанням клітин з епітеліальним
фенотипом, але й наявністю клітин з мезенхімаль-
ними ознаками (див. табл. 1).
При вивченні впливу на проліферативну актив-
ність ПК та фібробластів виявлено, що при кокуль-
тивуванні кількість фібробластів практично не змі-
нюється (відносно ізольованого контролю), тоді як
кількість ПК суттєво варіює залежно від домінуван-
ня в них ознак епітеліального чи мезенхімального
фенотипу, тобто на число ПК суттєво впливає саме
їх ЕМП-профіль (рис. 2). Визначено, що кількість
ПК з домінуванням мезенхімальних характеристик
(Т-47D, MRS-Т5) при їх безконтактному кокуль-
тивуванні з фібробластами більше зростає відносно
Таблиця 1
ЕМП маркери ПК ліній РМЗ
Антигени E-кадгерин N-кадгерин SLUG
Клітини T-47D MCF-7
MRS
T5 T-47D MCF-7
MRS
T5 T-47D MCF-7
MRS
T5
E M E M E M
Оцінювання в балах
за системою H-score 98 ± 11 126 ± 7 270 ± 21 22 ± 9 39 ± 4 81 ± 11 53 ± 3 72 ± 8 221 ± 28 174 ± 16 136 ± 21 54 ± 10 156 ± 26 224 ± 32 269 ± 11
ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 3 • 2013
ÎÐ ÈÃÈÍÀËÜÍÛ Å ÈÑÑËÅÄÎ ÂÀ ÍÈß
194
контролю (р < 0,05), ніж кількість ПК з переважан-
ням епітеліального фенотипу (MCF-7, MRS).
200
150
100
50
0
Æ
èâ
³ ê
ë³
òè
íè
, %
ÍÔË T-47D ÍÔË MCF-7
Âàð³àíò êîêóëüòèâóâàííÿ
à
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Æ
èâ
³ ê
ë³
òè
íè
, %
Âàð³àíò êîêóëüòèâóâàííÿ
ÍÔÙ MRS ÍÔÙ Ò5 MRS ÍÔÙ Ò5
á
Рис. 2. Кількість життєздатних нормальних фібробластів
та ПК людини (а) та щура (б) з різними фенотипічними
характеристиками при їх сумісному безконтактному ко-
культивуванні
Таким чином, виявлено суттєвий взаємо вплив
ПК та нормальних фібробластів, результати якого
значно залежали від фенотипічного профілю ПК.
Цікавими виявилися дані щодо сумісного кокуль-
тивування фібробластів з ПК щура з мезенхімаль-
ними або епітеліальними характеристиками (ва-
ріант кокультивування MRS + НФЩ + MRS-Т5)
(див. табл. 1). У цьому випадку відбувалася значна
інгібіція клітин мезенхімального фенотипу лінії
(MRS-Т5) у присутності епітеліальних клітин MRS.
Тобто, клітини більш диференційованого епітелі-
ального фенотипу можуть пригнічувати ростовий
потенціал клітин мезенхімального фенотипу. Це
свідчить про можливість контролю клітинної про-
ліферації на клонально-популяційному рівні із за-
лученням у даний процес певних клітинних факто-
рів, які формують фенотипічний профіль клітин.
Наступним етапом роботи було дослідження
впливу додаткового фактора в новій інтегрованій
системі in vitro, а саме — клітин, отриманих з пунк-
татів КМ хворих на РМЗ, оскільки КМ вважається
депо для ПК клітин та є безпосереднім учасником
мінімальної залишкової хвороби [12–14].
Виявлено суттєві зміни фенотипічних характе-
ристик як пухлинних, так і нормальних клітин у сис-
темі безконтактного кокультивування із додаванням
клітин КМ, одержаних у хворих з різним перебігом
процесу (табл. 2). При дослідженні білка — регуля-
тора клітинного циклу р21 суттєві зміни кількості
позитивних клітин відзначали лише в нормальних
фібробластах при їх кокультивуванні з ПК. Водно-
час в останніх рівень експресії і субклітинна лока-
лізація білка р21 не змінювалися при різних варіан-
тах впливу. Локалізацію р21 в клітинах важливо було
враховувати, оскільки в ядрі та цитоплазмі цей бі-
лок виконує протилежні функції. Зокрема, при ло-
калізації в ядрі р21 є регулятором клітинного ци-
клу шляхом інактивації транскрипційних факторів
Е2F1, c-Myc, STAT3 [15], а також інгібітором ре-
плікації за рахунок пригнічення субодиниці ДНК-
полімерази δ-білка PCNА. При локалізації в ци-
топлазмі р21 пригнічує утворення стрес-фібрину
та фокальних контактів, внаслідок чого сприяє мі-
грації клітин. Крім того, р21 виконує в цитоплазмі
антиапоптотичні функції шляхом пригнічення ак-
тивності проапоптотичних кіназ ASK-1, JNK, p38
та інгібіції прокаспази-3.
Таблиця 2
Експресія р21, CD44, віментину та Е-кадгерину в клітинах
лінії РМЗ людини T-47D без додаткового впливу (контроль)
та в системі безконтактного кокультивування in vitro з НФЛ
та клітинами КМ
Варіант
кокультивування
клітин
Білкові маркери1
p21
CD44
В
ім
е
н
ти
н
E
-к
а
д
ге
р
и
н
Ц
и
то
п
л
а
з
м
а
ти
ч
н
а
л
о
к
а
л
із
а
ц
ія
Я
д
е
р
н
а
л
о
к
а
л
із
а
ц
ія
Т-47D ізольовані
(без впливу) 263 ± 24 187 ± 19 97±11 0 98 ± 11
Т-47D
варіант кокульти-
вування + НФЛ +
КМ з групи «Про-
гресія»
274 ± 32 194 ± 12 122 ± 14 50 ± 6* 56 ± 3**
Т-47D
варіант кокультиву-
вання + НФЛ + КМ
з групи «Ремісія»
255 ± 15 176 ± 10 58 ± 5** 0 104 ± 12
*p ≤ 0,005; ** p ≤ 0,05; 1оцінка за методом Н-Score, бали.
Цікаві дані одержано при дослідженні експре-
сії CD44 — молекули адгезії, яка відіграє важливу
роль у взаємозв’язку «пухлина-оточення» і залучена
в процеси міграції та інвазії ПК. Крім того, CD44 ви-
користовують як маркер прогресування та метаста-
зування при багатьох онкологічних захворюваннях,
зокрема РМЗ; клітини з фенотипом CD44+CD24-
розглядають як стовбурові ПК. Нами виявлено
збільшення на 26% кількості CD44-позитивних
(CD44+) Т-47D клітин при їх кокультивуванні з клі-
тинами КМ хворих з групи «Прогресія» порівняно
з контролем клітин в ізольованих лунках. При вико-
ристанні клітин КМ хворих з групи «Ремісія» як до-
даткового фактора впливу реєстрували протилежний
результат — достовірне зменшення кількості CD44+-
клітин (р < 0,005) відносно ізольованого контролю
і достовірне зменшення кількості CD44+-клітин від-
ÎÐÈÃÈÍÀËÜÍÛÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß
195ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 3 • 2013 195
носно варіанта з кокультивуванням клітин КМ від
хворих з групи «Прогресія» (р < 0,005) (див. табл. 2).
При вивченні експресії в клітинах Т-47D ще од-
ного білка, який характеризує міжклітинну адгезію
та адгезію клітин до субстрату та властивий клітинам
«епітеліального фенотипу», — Е-кадгерину — вияв-
лено суттєве зменшення кількості позитивних клі-
тин Т-47D у варіанті їх кокультивування з клітинами
КМ хворих з групи «Прогресія» порівняно з контро-
лем; кокультивування з клітинами КМ хворих з гру-
пи «Ремісія» не змінило кількості Е-кадгерин+-
клітин РМЗ (див. табл. 2).
При дослідженні експресії білка цитоскелета ві-
ментину, характерного для клітин мезенхімальної
природи, встановлено, що клітини Т-47D не екс-
пресують цей білок. Однак при кокультивуванні їх
з КМ хворих з групи «Прогресія» з’являються клі-
тини з його експресією, на відміну від повної від-
сутності віментин+-клітин в ізольованому контро лі
та у варіанті кокультивування з клітинами КМ хво-
рих з групи «Ремісія».
Такі зміни фенотипічного профілю ПК Т-47D
внаслідок кокультивування їх з компонентами мі-
крооточення (у цьому дослідженні з нормальними
фібробластами та клітинами КМ хворих з різним
перебігом пухлинного процесу) свідчать про суттє-
вий вплив клітин КМ та факторів, які вони проду-
кують, на клітини РМЗ людини. При цьому залежно
від стану пухлинного процесу хворого — прогресу-
вання захворювання або ремісія — результат впливу
клітин КМ на ПК суттєво відрізняється. У варіанті
з кокультивуванням з клітинами КМ хворих з гру-
пи «Ремісія» фенотипічний профіль ПК практич-
но не відрізняється від контрольних клітин, тоді як
у варіанті з використанням клітин КМ хворих з гру-
пи «Прогресія» відзначається запуск в ПК програми
ЕМП, що асоціюється із набуттям більш агресивних
ознак клітинами та можливим підвищенням їх ме-
тастатичного потенціалу.
При характеристиці фенотипічного профілю
НФЛ після їх кокультивування з ПК Т-47D та клі-
тинами з КМ хворих з різними варіантами перебігу
пухлинного процесу досліджено експресію вімен-
тину, р21 та Slug. При цьому змін експресії вімен-
тину не виявляли при жодному з варіантів кокуль-
тивування, тоді як при дослідженні експресії транс-
крипційного фактора мезенхімальних клітин Slug
виявляли зміни як кількості Slug+-клітин, так і ло-
калізації цього білка в клітинах. Зокрема, відзнача-
ли релокалізацію Slug в ядро НФЛ при їх кокульти-
вуванні з ПК та клітинами КМ хворих, що підтвер-
джує відомі факти активації фібробластів при дії ПК
з набуттям ними ознак міофібробластів. Також вияв-
лено цікавий факт наявності білка р21 тільки в цито-
плазмі нормальних фібробластів (табл. 3), при цьому
кількість р21+-клітин при кокультивуванні з кліти-
нами КМ хворих з групи «Прогресія» значно зрос-
тала порівняно з контролем (р < 0,005).
Таблиця 3
Фенотипічні характеристики НФЛ безконтактного
кокультивування з ПК і клітинами КМ хворих на РМЗ
Клітини
Досліджувані маркери*
p21 SLUG
В
ім
е
н
ти
н
Ц
и
то
п
л
а
з
м
а
ти
ч
н
а
л
о
к
а
л
із
а
ц
ія
Я
д
е
р
н
а
л
о
к
а
л
із
а
ц
ія
Ц
и
то
п
л
а
з
м
а
ти
ч
н
а
л
о
к
а
л
із
а
ц
ія
Я
д
е
р
н
а
л
о
к
а
л
із
а
ц
ія
НФЛ ізольовані
(без впливу) 53 ± 7 0 186 ± 16 0 292 ± 8
НФЛ
варіант кокультиву-
вання + Т-47D + КМ
з групи «Прогресія»
148 ± 22** 0 82 ± 12**** 42 ± 4***** 300 ± 0
НФЛ
варіант кокультиву-
вання + Т-47D + КМ
з групи «Ремісія»
0*** 0 72±10**** 22±1***** 300 ± 0
*оцінка за методом Н-Score, бали; ** p < 0,005; *** p < 0,005;
****p < 0,02; *****p < 0,002.
Таким чином, отримані факти підтверджують та
певною мірою пояснюють відомі дані щодо активації
фібробластів та їх конверсії в міофібробласти при ко-
культивуванні з ПК [2], після чого «активовані» фібро-
бласти починають стимулювати вже самі ПК. Стро-
мальні елементи, складовими яких є і фібробласти,
можуть бути індукторами транскрипційних факторів
ПК, що в подальшому сприяє домінуванню в клітинах
мезенхімальних ознак. Такі модуляції внутрішньоклі-
тинних процесів відбуваються шляхом секреції кліти-
нами низки факторів (цитокіни, фактори росту та ін.);
одним з таких факторів, зокрема, може бути EPST1
(epithelial-stromal interaction 1). EPST1 був ідентифі-
кований як interferon response gene саме при кокуль-
тивуванні клітин РМЗ зі стромальними фіброблас-
тами [16, 17], а при імуногістохімічному аналізі пух-
линного післяопераційного матеріалу хворих на РМЗ
виявляли його підвищену експресію саме в пухлин-
ному матеріалі (на відміну від конт рольних тканин
молочної залози); «найвищу інтенсивність експресії»
EPST1 відзначали саме в ділянках пухлини, які тісно
контактували зі стромою [17].
ВИСНОВКИ
1. За допомогою створеної системи безконтак-
тного кокультивування клітин різного генезу вияв-
лено суттєву різницю в кількості ПК після їх взає-
модії з фібробластами залежно від ЕМП-статусу ПК.
2. Виявлено різний модифікуючий вплив моно-
нуклеарів КМ хворих на РМЗ на ПК залежно від пе-
ребігу захворювання (група «Ремісія» чи «Прогре-
сія»).
3. Встановлено факт стимуляції ЕМП ПК РМЗ
при дії на них розчинних факторів, які, можливо,
продукуються клітинами КМ хворих на РМЗ в ста-
дії прогресування захворювання.
Дані результати отримано за фінансової підтрим-
ки гранту Президента України для обдарованої молоді.
ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 3 • 2013
ÎÐ ÈÃÈÍÀËÜÍÛ Å ÈÑÑËÅÄÎ ÂÀ ÍÈß
196
СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ
1. de Neergaard M, Kim J, Villadsen R, et al. Epithelial-stromal
interaction 1 (EPSTI1) substitutes for peritumoral fibroblasts in the
tumor microenvironment. Am J Pathol 2010; 176 (3): 1229–40.
2. Tran-Thanh D, Done SJ. The role of stromal factors in breast
tumorigenicity. Am J Pathol 2010; 176 (3): 1072–74.
3. Kalluri R, Weinberg RA. The basics of epithelial-mesenchy-
mal transition. J Clin Invest 2009; 119 (6): 1420–28.
4. Strell C, Rundovist H, Ostman A. Fibroblasts — a key host
cell type in tumor initiation, progression and metastasis. Upsala J
Med Sci 2012; 117: 187–195.
5. Li AP, Bode C, Sakai Y. A novel in vitro system, the inte-
grated discrete multiple organ cell culture (IdMOC) system, for
the evaluation of human drug toxicity: comparative cytotoxicity
of tamoxifen towards normal human cells from five major organs
and MCF-7 adenocarcinoma breast cancer cells. Chem-Biol In-
teract 2004; 150 (1): 129–36.
6. Трахтенберг ІМ, Кудрявець ЮЙ, Марченко МЛ та ін.
Удосконалена модель мультиорганної системи токсичності
ксенобіотиків на основі кокультивування клітин людини in
vitro. Суч пробл токсикол 2011; (1–2): 60–4.
7. Семесюк НІ, Жильчук АВ, Бездєнєжних НО та ін. Фак-
тор некрозу пухлин в периферичній крові та кістковому моз-
ку хворих на рак молочної залози як маркер прогресії пухлин-
ного процесу. Онкологія 2012; 14 (4): 293–7.
8. Семесюк НІ, Жильчук АВ, Бездєнєжних НО та ін. Про-
гностичне значення рівня колонієстимулюючого фактора
1 в периферичній крові та кістковому мозку хворих на рак
молочної залози. Зб. Гематол перелив крові 2012; (36): 232–7.
9. Кудрявец ЮЙ, Безденежных НА, Трегубова НА и др. Но-
вая модель экспериментальной онкологии: клеточная линия
МКС из спонтанного рака молочной железы крысы, склон-
ная к модуляции трансформированного фенотипа. В: ХІ з’їзд
онкологів України. Судак, 2006, 29 с.
10. Кудрявець ЮЙ, Бездєнєжних НО, Ковальова ОА та ін.
Клітинна лінія МКС з аденокарциноми молочної залози щура
як модель для дослідження механізмів епітеліально-мезен-
хімального переходу пухлинних клітин. Клин онкол 2011,
Спец вып II: С. 218.
11. Vega-Avila E, Pugsley KM. An overview of colorimetric as-
say methods used to assess survival or proliferation of mammalian
cells. Proc West Pharmacol Soc 2011; 54: 10–4.
12. Krishnamurthy S, Cristofanilli M, Singh B, et al. Detection
of minimal residual disease in blood and bone marrow in early stage
breast cancer. Cancer 2010; 116 (14): 3330–7.
13. Bischoff J, Rosenberg R, Dahm M, et al. Minimal residual
disease in bone marrow and peripheral blood of patients with meta-
static breast cancer. Recent Results Cancer Res 2003; 162: 135–40.
14. Diel IJ, Cote RJ. Bone marrow and lymph node assess-
ment for minimal residual disease in patients with breast cancer.
Cancer Treat Rev 2000; 26 (1): 53–65.
15. Романов ВС. Регулятор клеточного цикла p21Waf1:
роль в онкоген-индуцированной трансформации и клеточно
старении [Автореф дис... канд биол наук]. Санкт-Петербург:
Институт цитологии РАН, 2011. 26 с.
16. Nielsen HL, Ronnov-Jessen L, Villadsen R, et al. Identifi-
cation of EPSTI1, a novel gene induced by epithelial-stromal in-
teraction in human breast cancer. Genom 2002, 79 (5): 703–10.
17. Honeth G, Bedahl PO, Ringner M, et al. The CD44+/CD24-
phenotype is enriched in basal-like breast tumors. Breast Cancer
Res 2008; 10 (3): R53.
MODIFICATION OF EPITHELIAL-
MESENCHYMAL TRANSITION IN BREAST
CANCER CELLS BY MEANS OF THEIR
COCULTIVATION WITH FIBROBLASTS
AND BONE MARROW CELLS
N.O. Bezdenezhnykh, N.I. Semesiuk, O.O. Lykhova,
V.E. Zhylchuk, Yu.I. Kudryavets
Summary. Objective: the goal of our study was to in-
vestigate the interaction between tumor cells and some
components of their microenvironment for identification
leading factors in tumor progression. Object and meth-
ods: we used primary (biopsies of bone marrow breast
cancer patients with different stages of disease) and cell
culture lines (human breast cancer cell line, rat breast
cancer cell line, human normal fibroblasts) with immu-
nocytochemical analysis and statistical methods. The
proliferative potential and immunophenotypical fea-
tures of tumor and normal cells were revealed in our new
co-cultivation system in vitro, which include investiga-
tion to markers of epithelial — mesenchymal transition
and tumor stem cells (adhesion protein and cytoske-
leton — E-cadherin, Vimentin, CD44), protein of cell
cycle p21 and transcription factor Slug. Results: it was
revealed the great differences in growth and phenotypic
features of these cells which depended on EMT status of
tumor cells and version of co-cultivation (using the bone
marrow cells of breast cancer patients with progression
or remission stage of disease). Conclusion: modifying
effects of bone marrow mononuclears of breast cancer
patients in tumor cells, depending on the disease were
found in vitro. In particular, the fact that epithelial-me-
senchymal transition stimulation of tumor cells exposed
to factors that may be produced by bone marrow cells of
patients in stage of disease progression was determined.
Key words: breast cancer, epithelial-mesenchymal
transition, microenvironment, bone marrow,
co-cultivation.
Адреса для листування:
Бездєнєжних Н.О.
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології, онкології
і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України
E-mail: beznalia@mail.ru
Одержано: 01.07.2013
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-134965 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:43:34Z |
| publishDate | 2013 |
| publisher | Iнститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького |
| record_format | dspace |
| spelling | Бездєнєжних, Н.О. Семесюк, Н.І. Лихова, О.О. Жильчук, В.Є. Кудрявець, Ю.Й. 2018-06-14T12:27:36Z 2018-06-14T12:27:36Z 2013 Модифікація епітеліальномезенхімального переходу в клітинах раку молочної залози внаслідок їх кокультивування з фібробластами та клітинами кісткового мозку / Н.О. Бездєнєжних, Н.І. Семесюк, О.О. Лихова, В.Є. Жильчук, Ю.Й. Кудрявець // Онкологія. — 2013. — Т. 15, № 3. — С. 191-196. — Бібліогр.: 17 назв. — укр. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/134965 Мета: дослідити взаємодію пухлинних клітин з деякими компонентами мікрооточення
 для визначення можливої ролі останніх у модифікації фенотипу пухлинних
 клітин при розвитку дисемінованого пухлинного процесу із залученням кісткового
 мозку (КМ). Об’єкт і методи: дослідження проводили з використанням
 біоптатів КМ хворих на рак молочної залози (РМЗ) з різним перебігом пухлинного
 процесу та постійних культур клітин: використовували методи роботи
 з культурами клітин, імуноцитохімічний та статистичний методи аналізу.
 За допомогою створеної системи безконтактного кокультивування пухлинних
 і нормальних клітин досліджували їх фенотипічний профіль, характеризуючи
 рівень експресії маркерів епітеліально-мезенхімального переходу (ЕМП) (білки
 адгезії та цито скелета і транскрипційний фактор Slug), стовбурових пухлинних
 клітин (CD44), а також регулятора клітинного циклу р21. Результати:
 виявлено значну відмінність у ростових і фенотипічних характеристиках досліджуваних
 клітин залежно від ЕМП-статусу пухлинних клітин і від варіанта
 їх кокультивування: використання клітин з КМ пацієнтів з різним характером
 перебігу пухлинного процесу (прогресування чи ремісія захворювання). Висновок:
 виявлено модифікуючий вплив in vitro мононуклеарів КМ хворих на РМЗ
 на пухлині клітини залежно від перебігу захворювання. Зокрема, встановлено
 факт стимуляції ЕМП пухлинних клітин при дії на них факторів, які, можливо,
 продукуються клітинами КМ хворих в стадії прогресування захворювання. Objective: the goal of our study was to investigate
 the interaction between tumor cells and some
 components of their microenvironment for identification
 leading factors in tumor progression. Object and methods:
 we used primary (biopsies of bone marrow breast
 cancer patients with different stages of disease) and cell
 culture lines (human breast cancer cell line, rat breast
 cancer cell line, human normal fibroblasts) with immunocytochemical
 analysis and statistical methods. The
 proliferative potential and immunophenotypical features
 of tumor and normal cells were revealed in our new
 co-cultivation system in vitro, which include investigation
 to markers of epithelial — mesenchymal transition
 and tumor stem cells (adhesion protein and cytoskeleton
 — E-cadherin, Vimentin, CD44), protein of cell
 cycle p21 and transcription factor Slug. Results: it was
 revealed the great differences in growth and phenotypic
 features of these cells which depended on EMT status of
 tumor cells and version of co-cultivation (using the bone
 marrow cells of breast cancer patients with progression
 or remission stage of disease). Conclusion: modifying
 effects of bone marrow mononuclears of breast cancer
 patients in tumor cells, depending on the disease were
 found in vitro. In particular, the fact that epithelial-mesenchymal
 transition stimulation of tumor cells exposed
 to factors that may be produced by bone marrow cells of
 patients in stage of disease progression was determined. Дані результати отримано за фінансової підтримки гранту Президента України для обдарованої молоді. uk Iнститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького Онкологія Оригинальные исследования Модифікація епітеліальномезенхімального переходу в клітинах раку молочної залози внаслідок їх кокультивування з фібробластами та клітинами кісткового мозку Modification of epithelialmesenchymal transition in breast cancer cells by means of their cocultivation with fibroblasts and bone marrow cells Article published earlier |
| spellingShingle | Модифікація епітеліальномезенхімального переходу в клітинах раку молочної залози внаслідок їх кокультивування з фібробластами та клітинами кісткового мозку Бездєнєжних, Н.О. Семесюк, Н.І. Лихова, О.О. Жильчук, В.Є. Кудрявець, Ю.Й. Оригинальные исследования |
| title | Модифікація епітеліальномезенхімального переходу в клітинах раку молочної залози внаслідок їх кокультивування з фібробластами та клітинами кісткового мозку |
| title_alt | Modification of epithelialmesenchymal transition in breast cancer cells by means of their cocultivation with fibroblasts and bone marrow cells |
| title_full | Модифікація епітеліальномезенхімального переходу в клітинах раку молочної залози внаслідок їх кокультивування з фібробластами та клітинами кісткового мозку |
| title_fullStr | Модифікація епітеліальномезенхімального переходу в клітинах раку молочної залози внаслідок їх кокультивування з фібробластами та клітинами кісткового мозку |
| title_full_unstemmed | Модифікація епітеліальномезенхімального переходу в клітинах раку молочної залози внаслідок їх кокультивування з фібробластами та клітинами кісткового мозку |
| title_short | Модифікація епітеліальномезенхімального переходу в клітинах раку молочної залози внаслідок їх кокультивування з фібробластами та клітинами кісткового мозку |
| title_sort | модифікація епітеліальномезенхімального переходу в клітинах раку молочної залози внаслідок їх кокультивування з фібробластами та клітинами кісткового мозку |
| topic | Оригинальные исследования |
| topic_facet | Оригинальные исследования |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/134965 |
| work_keys_str_mv | AT bezdênêžnihno modifíkacíâepítelíalʹnomezenhímalʹnogoperehoduvklítinahrakumoločnoízalozivnaslídokíhkokulʹtivuvannâzfíbroblastamitaklítinamikístkovogomozku AT semesûkní modifíkacíâepítelíalʹnomezenhímalʹnogoperehoduvklítinahrakumoločnoízalozivnaslídokíhkokulʹtivuvannâzfíbroblastamitaklítinamikístkovogomozku AT lihovaoo modifíkacíâepítelíalʹnomezenhímalʹnogoperehoduvklítinahrakumoločnoízalozivnaslídokíhkokulʹtivuvannâzfíbroblastamitaklítinamikístkovogomozku AT žilʹčukvê modifíkacíâepítelíalʹnomezenhímalʹnogoperehoduvklítinahrakumoločnoízalozivnaslídokíhkokulʹtivuvannâzfíbroblastamitaklítinamikístkovogomozku AT kudrâvecʹûi modifíkacíâepítelíalʹnomezenhímalʹnogoperehoduvklítinahrakumoločnoízalozivnaslídokíhkokulʹtivuvannâzfíbroblastamitaklítinamikístkovogomozku AT bezdênêžnihno modificationofepithelialmesenchymaltransitioninbreastcancercellsbymeansoftheircocultivationwithfibroblastsandbonemarrowcells AT semesûkní modificationofepithelialmesenchymaltransitioninbreastcancercellsbymeansoftheircocultivationwithfibroblastsandbonemarrowcells AT lihovaoo modificationofepithelialmesenchymaltransitioninbreastcancercellsbymeansoftheircocultivationwithfibroblastsandbonemarrowcells AT žilʹčukvê modificationofepithelialmesenchymaltransitioninbreastcancercellsbymeansoftheircocultivationwithfibroblastsandbonemarrowcells AT kudrâvecʹûi modificationofepithelialmesenchymaltransitioninbreastcancercellsbymeansoftheircocultivationwithfibroblastsandbonemarrowcells |