Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності
Мета: дослідити вплив ліпосомальної форми доксорубіцину (LDox) на пухлини
 з фенотипом медикаментозної резистентності та визначити його
 окремі механізми. Об’єкти і методи: резистентна до вільної форми доксорубіцину
 (Dox) карцинома Герена щурів; клітини раку молочної залози...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Онкологія |
|---|---|
| Дата: | 2013 |
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Українська |
| Опубліковано: |
Iнститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького
2013
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/135384 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності / І.М. Тодор, Н.Ю. Лук’янова, Ю.О. Тимовська, В.М. Півнюк, В.Ф. Чехун // Онкологія. — 2013. — Т. 15, № 4. — С. 279-285. — Бібліогр.: 27 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860185549503987712 |
|---|---|
| author | Тодор, І.М. Лук’янова, Н.Ю. Тимовська, Ю.О. Півнюк, В.М. Чехун, В.Ф. |
| author_facet | Тодор, І.М. Лук’янова, Н.Ю. Тимовська, Ю.О. Півнюк, В.М. Чехун, В.Ф. |
| citation_txt | Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності / І.М. Тодор, Н.Ю. Лук’янова, Ю.О. Тимовська, В.М. Півнюк, В.Ф. Чехун // Онкологія. — 2013. — Т. 15, № 4. — С. 279-285. — Бібліогр.: 27 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Онкологія |
| description | Мета: дослідити вплив ліпосомальної форми доксорубіцину (LDox) на пухлини
з фенотипом медикаментозної резистентності та визначити його
окремі механізми. Об’єкти і методи: резистентна до вільної форми доксорубіцину
(Dox) карцинома Герена щурів; клітини раку молочної залози людини
MCF-7 та її резистентної до Dox сублінії MCF-7/Dox. Методи експериментальної
онкології; культивування клітин; гістологічний, імуноцитохімічний;
світлова та лазерна конфокальна мікроскопія. Результати: LDox
достовірно гальмує ріст резистентного до вільного Dox штаму карциноми
Герена та призводить до патоморфозу паренхіми пухлин. Вільний Dox потрапляє
в цитоплазму пухлинних клітин шляхом дифузії, ліпосомальний —
шляхом ендоцитозу. LDox не індукує експресію P-gp в пухлинних клітинах і
таким чином оминає активне виведення з цитоплазми за допомогою цього
білка. Висновки: LDox має переваги порівняно з вільною формою цитостатика
стосовно накопичення і впливу на злоякісні клітини. Він може тривало
акумулюватися як у цитоплазмі, так і у ядрі пухлинних клітин з фенотипом
медикаментозної резистентності.
Objective: to investigate the influence of liposomal
form of doxorubicin (LDox) on tumor phenotype
of drug resistance and to determine its individual mechanisms.
Objects and methods: Dox-resistant Guerin carcinoma
rats; human breast cancer MCF-7 cells and
Dox-resistant subline MCF-7/Dox. Methods of experimental
oncology, cell culture, histological, immunocytochemical;
the light and laser confocal microscopy. Results:
LDox significantly inhibits the growth of free Dox
resistant strain Guerin carcinoma and leads to pathomorphosis
of tumors parenchyma. Free Dox enters the
cytoplasm of tumor cells by diffusion, liposomal — by endocytosis.
Liposomal form of the drug, does not induce
the expression of P-gp in tumor cells and thus bypas ses
the ejection from the cytoplasm by this protein. Conclusions:
LDox form has advantages in terms of free-form
cytostatic regarding the accumulation and impact on
malignant cells. This leads to long-term accumulation
of cytostatic as in the cytoplasm and nucleus of tumor
cells with the phenotype of drug resistance.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:04:06Z |
| format | Article |
| fulltext |
ÎÐÈÃÈÍÀËÜÍÛÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß
279ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013 279
ВСТУП
Застосування цитостатичної терапії призводить
до поліпшення безпосередніх і віддалених результа-
тів лікування хворих зі злоякісними новоутворен-
нями. Але більшості злоякісних пухлин тією чи ін-
шою мірою притаманна первинна медикаментозна
резистентність [1]. Рак молочної залози (РМЗ), хоч
і вважається пухлиною, чутливою до цитостатичної
терапії, не є винятком з цього правила [2]. Кількість
померлих від РМЗ у всьому світі за рік (а це більше
450 тис. жінок) демонструє, що проблема лікування
цього захворювання далека від вирішення. Тому пи-
тання подолання резистентності пухлинних клітин
(ПК) до цитостатичних препаратів є одним із пріо-
ритетних в експериментальній і клінічній онкології.
Використання здобутків біо- та нанотехнологій до-
зволяє долати природні перешкоди, зокрема феномен
первинної медикаментозної резистентності, у форму-
ванні якого задіяні численні механізми, пов’язані як
зі зменшеним, сповільненим проходженням цитос-
татиків через мембрану ПК, так і з прискореним, по-
силеним їх виведенням із цитоплазми. Накопичений
масив знань про активацію систем детоксикації та ме-
ханізми відновлення пошкодженої ДНК, шляхи уник-
нення ПК апоптозу, генетичні та епігенетичні зміни
в ПК стає підґрунтям для розроблення нових мето-
дів подолання медикаментозної резистентності [3, 4].
Антрациклінові антибіотики є одними з най-
активніших цитостатичних препаратів, які засто-
совують у хворих на РМЗ [5]. Але навіть викорис-
тання антрациклінвмісних режимів поліхіміотера-
пії не зав жди призводить до бажаного результату [6,
7], тому актуальним є пошук шляхів підвищення їх
ефективності. Одним із таких способів є заміна віль-
ної форми доксорубіцину (Dox) на ліпосомальну.
Ліпосоми набувають все більшого визнання у сві-
ті як носії медикаментозних речовин загалом і ци-
тостатиків зокрема [8, 9]. Мембрани ліпосом скла-
даються з природних фосфоліпідів, що дозволяє їм
з’єднуватися з мембранами клітин, що в свою чергу
призводить до внутрішньоклітинної доставки вмісту
ліпосом. Цитостатики, інкапсульовані в ліпосоми,
потрапляють в цитоплазму ПК шляхом ендоцитозу
[10]. Слід зазначити, що майже всі проведені дослі-
дження з вивчення механізмів доставки і накопи-
чення цитостатиків, інкапсульованих у ліпосоми,
були проведені на чутливих до цитостатиків моде-
лях [11, 12]. Результати, отримані в клінічних дослі-
дженнях, показали, що ліпосомальна форма доксо-
рубіцину (LDox) ефективна у хворих зі злоякісними
новоутвореннями [13–15]. Крім того, встановлено
ефективність цієї форми препарату у хворих із ре-
зистентними до LDox пухлинами [16–18].
Нас зацікавили механізми впливу LDox на пух-
лини з фенотипом медикаментозної резистентнос-
ті. Визначення окремих механізмів і становило мету
проведеного нами дослідження. Вивчено проникну
здатність ліпосомальної форми цитостатика в ци-
топлазму ПК, резистентних до Dox, та досліджено
механізм проникнення; оцінено ефективність те-
рапевтичного впливу LDox на пухлини, резистент-
ні до вільної форми препарату.
ВПЛИВ ДОКСОРУБІЦИНУ
В ЛІПОСОМАЛЬНІЙ ФОРМІ
НА ПУХЛИНИ З ФЕНОТИПОМ
МЕДИКАМЕНТОЗНОЇ
РЕЗИСТЕНТНОСТІ
Мета: дослідити вплив ліпосомальної форми доксорубіцину (LDox) на пух-
лини з фенотипом медикаментозної резистентності та визначити його
окремі механізми. Об’єкти і методи: резистентна до вільної форми доксо-
рубіцину (Dox) карцинома Герена щурів; клітини раку молочної залози лю-
дини MCF-7 та її резистентної до Dox сублінії MCF-7/Dox. Методи експе-
риментальної онкології; культивування клітин; гістологічний, імуноцито-
хімічний; світлова та лазерна конфокальна мікроскопія. Результати: LDox
достовірно гальмує ріст резистентного до вільного Dox штаму карциноми
Герена та призводить до патоморфозу паренхіми пухлин. Вільний Dox по-
трапляє в цитоплазму пухлинних клітин шляхом дифузії, ліпосомальний —
шляхом ендоцитозу. LDox не індукує експресію P-gp в пухлинних клітинах і
таким чином оминає активне виведення з цитоплазми за допомогою цього
білка. Висновки: LDox має переваги порівняно з вільною формою цитоста-
тика стосовно накопичення і впливу на злоякісні клітини. Він може три-
вало акумулюватися як у цитоплазмі, так і у ядрі пухлинних клітин з фе-
нотипом медикаментозної резистентності.
І.М. Тодор
Н.Ю. Лук’янова
Ю.О. Тимовська
В.М. Півнюк
В.Ф. Чехун
Інститут
експериментальної патології,
онкології і радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького
НАН України, Київ, Україна
Ключові слова: медикаментозна
резистентність, ліпосомальний
доксорубіцин, ендоцитоз, P-gp.
ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013
ÎÐ ÈÃÈÍÀËÜÍÛ Å ÈÑÑËÅÄÎ ÂÀ ÍÈß
280
ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
На основі даних, отриманих із літературних
джерел та напрацьованих в Інституті експеримен-
тальної патології, онкології і радіобіології (ІЕПОР)
ім. Р.Є. Кавецького НАН України, ми висунули гі-
потезу, що за допомогою LDox можна подолати
медикаментозну резистентність до Dox. Для під-
твердження цього припущення спочатку провели
експериментальне дослідження з визначення ефек-
тивності застосування LDox у тварин. 24 щурам-са-
мицям лінії Wistar з масою тіла 150–200 г розведення
експериментальної бази ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького
НАН України було перещеплено клітини резистент-
ного до Dox штаму карциноми Герена. Усі етапи до-
слідження in vivo проводили, дотримуючись правил
Комісії з етичних норм роботи з експериментальни-
ми тваринами. Як модель пухлинного росту вико-
ристовували перещеплену пухлину резистентного
до Dox штаму карциноми Герена [19]. Усім щурам
вказану пухлину перещепили шляхом підшкірного
введення 0,5 мл 22% зависі пухлинної тканини з до-
триманням правил асептики.
На 11-ту добу після перещеплення у всіх щурів
визначали об’єм пухлини. Після цього тварин роз-
поділили на 3 групи. Тваринам першої групи (осно-
вної) вводили LDox у дозі 2,5 мг/кг; другої (конт-
роль № 1) — фізіологічний розчин (0,9%) хлориду
натрію; третьої (контроль № 2) — вільний Dox у дозі
2,5 мг/кг. Усі досліджувані групи були тотожними
за об’ємом (розміром) пухлин. Препарати вводи-
ли внутрішньочеревно (1 раз на 2 доби) на 11; 13 та
15-й день після перещеплення пухлини. В ці ж тер-
міни визначали об’єм пухлини. Тривалість спосте-
реження за тваринами всіх груп — 18 діб. На 18-ту
добу визначали кінцевий об’єм та масу пухлини.
Оцінювали динаміку росту пухлин, визначаючи
ортогональні розміри штангенциркулем з точніс-
тю до 0,1 мм. Після завершення експерименту масу
кожної пухлини визначали за допомогою торсійних
техніко-хімічних ваг 2-го класу типу WT-40 з мак-
симальним навантаженням 40 г.
Для морфологічного дослідження брали пухлин-
ну тканину у всіх тварин з кожної групи. Гістологіч-
ні препарати (зрізи товщиною 3–6 мкм) готували
за загальноприйнятою методикою та забарвлюва-
ли гематоксиліном та еозином. Морфологічні до-
слідження тканини здійснювали за допомогою мі-
кроскопа Laborlux S (Leitz).
Наступним етапом було вивчення механізмів
проникнення та накопичення в цитоплазмі ПК, ре-
зистентних до вільного Dox, ліпосомальної форми
препарату. Дослідження були проведені на кліти-
нах лінії MCF-7 (РМЗ людини) та її сублінії MCF-
7/Dox, резистентної до цитотоксичного впливу
вільного Dox. Резистентна сублінія була отримана
з вихідної лінії у відділі механізмів протипухлин-
ної терапії ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН Укра-
їни. Клітини культивували в середовищі Dulbecco
ISCOV («Sigma», США) з додаванням 10% ембріо-
нальної сироватки телят («Sigma», США) у зволоже-
ній атмосфері з 5% СО
2
при температурі 37 °С; пе-
ресівали двічі на тиждень, щільність посіву стано-
вила 2–4•104 клітин/см2 поверхні. Пересів клітин
здійснювали, коли 50% поверхні ємності для куль-
тивування були зайняті клітинами.
Для дослідження процесу ендоцитозу вихід-
ні й резистентні до Dox клітинні лінії культивува-
ли при стандартних умовах протягом 1 год із цито-
халазином В («DakoCytomation», Данія), який до-
давали в культуральне середовище в концентрації
5 мкг/мл. Потім проводили заміну поживного сере-
довища і подальше культивування клітин із препа-
ратом Dox або LDox протягом 4 год при температурі
37 °С у зволоженій атмосфері з 5% СО
2
. Після цьо-
го фіксували клітини у суміші метанол/ацетон (1/1),
відмивали і поміщали у Faramount Aqeous Mounting
Medium («DakoCytomation», Данія). Оскільки Dox
належить до препаратів, які мають здатність до влас-
ної флуоресценції при довжині хвилі збуджен-
ня λ
ех
= 540 нм і хвилі емісії λ
еm
= 590 нм, то знахо-
дження і розподіл Dox і LDox в клітинах ми вивчали
за допомогою лазерного конфокального мікроскопа
LSM 510 META («CARL ZEISS», Німеччина). Екс-
пресію P-глікопротеїну визначали з використан-
ням моноклональних антитіл і системи візуалізації
EnVision («DakoCytomation», Данія).
Статистичну обробку результатів проводили з ви-
користанням t-критерію Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
При проведенні досліджень in vivo на 18-ту добу
після перещеплення резистентного до Dox штаму
карциноми Герена у тварин основної та контроль-
ної груп були різні показники об’єму та маси транс-
плантованої пухлини. Дані щодо кінетики рос-
ту пухлини в основній та контрольних 1-й та 2-й
(№ 1 та № 2) групах в різні проміжки часу представ-
лені на рис. 1.
Î
á’
ºì
ï
óõ
ëè
íè
, ñ
ì
3
35
30
25
20
15
10
5
0
Äîáà ï³ñëÿ ïåðåùåïëåííÿ
11-òà 13-òà 15-òà 18-òà
Îñíîâíà
Êîíòðîëüíàÿ ¹ 1
Êîíòðîëüíàÿ ¹ 2
Рис. 1. Динаміка росту резистентного штаму карциноми
Герена щурів лінії Wistar в основній і контрольних групах
Як свідчать дані рис. 1 і табл. 1, на початку дослі-
дження (11-та доба після перещеплення пухлини)
ÎÐÈÃÈÍÀËÜÍÛÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß
281ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013 281
групи були тотожними за об’ємом первинної пухли-
ни (р > 0,05). Уже на 13-ту добу середній об’єм пух-
лини в основній групі був меншим порівняно з обо-
ма групами контролю (р < 0,05). На 18-ту добу досто-
вірність відмінностей між основною і кон т рольними
групами була найбільшою (р < 0,01). Між контроль-
ними групами відмінностей не виявлено (р > 0,05).
Результати визначення середньої маси пухлин на-
ведено також в табл. 1.
Таблиця 1
Об’єм і маса пухлини залежно від проведеної терапії
Г
р
у
п
а Об’єм пухлини (см3)
Маса пух-
лини (г)
11-та
доба
13-та
доба
15-та
доба
18-та
доба
18-та
доба
О
с
н
о
в
-
н
а 9,1±0,7 13,9±0,7 15,7±0,9 18,1±1,3 27,5±2,2
К
о
н
тр
о
л
ь
-
н
а
№
1
10,8±1,2 18,3±1,8* 22,6±1,9* 31,9±3,2** 42,9±2,5*
К
о
н
тр
о
л
ь
-
н
а
№
2
9,0±0,9 17,8±0,9* 21,1±1,1* 28,7±1,8** 41,5±1,5*
Примітка: *p<0,05, **p<0,01 у порівнянні з основною групою.
За значенням середньої маси пухлин також вста-
новлено достовірну різницю між основною та обо-
ма контрольними групами (р < 0,05). Між конт-
рольними групами № 1 і № 2 статистично значущої
різниці не виявлено. Після визначення об’єму та
маси пухлини в основній групі та контрольній № 2
обчислили відсотки гальмування пухлинного рос-
ту. Тварини контрольної групи № 1 цито статичної
терапії не отримували, тому відсоток гальмування
не визначали. Результати наведено в табл. 2.
Таблиця 2
Відсоток гальмування пухлинного росту
залежно від проведеної терапії
Групи
Відсоток гальмування
за об’ємом пухлини
за масою
пухлини
Час (доба) Час (доба)
13-та 15-та 18-та 18-та
Основна 24,0±1,8* 30,5±2,0* 43,3±3,2* 36,0±2,9*
Контрольна 2,7±0,2 6,6±0,7 10,0±0,8 3,3±0,4
Примітка: *р<0,05 у порівнянні з контрольною групою.
Як свідчать дані табл. 2, відсоток гальмування
об’єму пухлини вищий на 33,3% при застосуван-
ні ліпосомальної форми, порівняно з вільним Dox,
відсоток гальмування маси пухлини в основній гру-
пі перевищує аналогічний показник у контрольній
групі № 2 на 32,7% (р < 0,05).
Після того як визначили відсоток гальмування
пухлинного росту, з усіх пухлин було виготовлено
гістологічні препарати та проведено патоморфоло-
гічне дослідження. Морфологічна структура карци-
номи Герена зі сформованою медикаментозною ре-
зистентністю до Dox у групах щурів, які отримували
0,9% розчин хлориду натрію (контроль № 1), віль-
ну (контроль № 2) та ліпосомальну (основна група)
форми Dox, була відмінною. У контрольній групі
№ 1 у всіх препаратах була представлена структу-
ра інтактної пухлини. У контрольній групі № 2 в 1
(12,5%) пухлині патоморфологічних змін, характер-
них для лікувального патоморфозу (ЛП), не виявле-
но, в 5 (62,5%) — визначався ЛП І ступеня (рис. 2),
в 2 (25,0%) — ЛП ІІ ступеня. В основній групі сту-
пінь патоморфологічних змін був вищим (рис. 3),
ніж у контрольній групі № 2. Паренхіма складалася
зі світлих ПК зі щільними дрібними ядрами та діля-
нок некрозу. В одних випадках площа некрозу ста-
новила 20–30% від усієї площі препарату, в інших —
відзначали масивні зони некротичного розплавлен-
ня. В 1 (12,5%) пухлині зареєстровано ЛП І ступеня,
в 4 (50%) пухлинах – ЛП ІІ ступеня, в 3 (37,5%) —
ЛП ІІІ ступеня. У 6 (75%) пухлинах виявляли замі-
щення некротичних ділянок сполучною тканиною.
Встановлено, що на 18-ту добу після перещеплення
ракових клітин рівень морфологічних змін у пухли-
нах тварин основної групи перевищував відповідні
у тварин конт рольної групи № 2 (р < 0,05).
Ми виявили, що при застосуванні LDox можна
досягти ефекту щодо резистентних до вільного Dox
пухлин: загальмувати ріст пухлин та викликати не-
Рис. 2. Резистентний до Dox штам карциноми Герена.
Ознаки ЛП 0–І ступеня після терапії вільною формою
Dox. ×200
Рис. 3. Резистентний до Dox штам карциноми Герена.
Ознаки ЛП III ступеня після терапії LDox. ×200
ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013
ÎÐ ÈÃÈÍÀËÜÍÛ Å ÈÑÑËÅÄÎ ÂÀ ÍÈß
282
кротичні зміни в ії паренхімі. M.G. Zykova та спів-
автори [20] дослідили вплив LDox на резистентний
штам карциноми легені Lewis та досягли гальмуван-
ня росту пухлини на 40,0%, тобто також продемон-
стрували ефективність LDox для гальмування росту
пухлин, резистентних до вільної форми препарату.
Таким чином, в експериментальних дослідженнях
на різних модельних пухлинах підтверджено вису-
нуту гіпотезу, що за допомогою LDox можна дола-
ти медикаментозну резистентність до вільного Dox.
Результати цієї серії досліджень стали підґрун-
тям для вивчення механізмів проникнення та на-
копичення LDox у резистентних до вільної форми
препарату ПК (сублінії клітин РМЗ MCF-7/Dox).
Як відомо, препарати, розміщені в ліпосомах, про-
никають у цитоплазму клітин шляхом ендоцитозу
[20–22], тоді як вільні форми цитостатиків — шля-
хом простої дифузії. Для визначення інтенсивності
накопичення Dox та LDox у цитоплазмі чутливих і
резистентних клітин MCF-7 та MCF-7/Dox (шля-
хом дифузії чи ендоцитозу) ми провели досліджен-
ня з блокуванням процесу ендоцитозу за допомо-
гою блокатора останнього — цитохалазину В. Ме-
ханізм актинової регуляції ендоцитозу складається
з кількох ланок [23]. Актиновий цитоскелет функ-
ціонує на всіх стадіях ендоцитозу: при утворенні ен-
доцитозного комплексу, його відокремленні від ци-
топлазматичної мембрани, при наступному пере-
міщенні ендосом у клітині. Деякі стадії ендоцитозу
потребують значної локальної полімеризації акти-
ну. На пізніх стадіях дозрівання ендоцитозних ве-
зикул полімеризація актину сприяє відштовхуван-
ню ендосом від плазматичної мембрани. Інгібіто-
ри полімеризації актину призводять до порушення
ендомембранних компартментів і блокують процес
ендоцитозу. Цитохалазин В належить до інгібіторів
полімеризації актину, перешкоджає з’єднанню фі-
ламентів з позитивним кінцем актинового ланцю-
га і таким чином блокує приєднання нових моно-
мерів актину, у результаті чого припиняється зрос-
тання актинового ланцюга.
Ми встановили, що блокування ендоцито-
зу не впливає на накопичення Dox клітинами ви-
хідної лінії MCF-7 (рис. 4) і резистентної сублінії
MCF-7/Dox (рис. 5). Після 4 год інкубації з препа-
ратом реєстрували флуоресценцію Dox у клітинах.
Цей факт також вказує на те, що вільна форма Dox
надходить до цитоплазми шляхом пасивної дифузії.
Але розподіл Dox в чутливих і резистентних кліти-
нах був різним: у клітинах лінії MCF-7 препарат був
сконцентрований в ядрі клітини, виявляли невели-
кі скупчення препарату в цитоплазмі, тоді як в клі-
тинах сублінії MCF-7/Dox фіксували незначну ди-
фузну флуоресценцію в цитоплазмі. Це вказувало
на те, що вільний Dox проникає шляхом дифузії як
у чутливі, так і в резистентні клітини. Відомо, що
цитотоксичний ефект цього препарату реалізуєть-
ся на рівні ядра: проникаючи в ядро ПК, Dox пору-
шує опосередкований топоізомеразою-ІІ механізм
відновлення ДНК, а вільні радикали, які утворю-
ються внаслідок дії цього цитостатика, призводять
до розриву ДНК [24]. Виходячи із сукупних резуль-
татів дослідження, ми також встановили, що, хоча
Dox проникає в чутливі та резистентні клітини шля-
хом дифузії, ефективним він є лише відносно чут-
ливих клітин.
При дослідженні накопичення LDox клітинами
MCF-7 під дією цитохалазину В виявлено різке зни-
ження рівня флуоресценції: лише невеликі, слабко
визначені контури клітин візуалізуються за допомо-
гою конфокального мікроскопа (рис. 6). Те саме спо-
стерігали відносно резистентних клітин MCF-7/Dox
(рис. 7). Якщо без впливу цитохалазину В для ре-
зистентних клітин характерна досить виражена ди-
фузна флуоресценція цитоплазми та поява значних
за розміром і більш яскравих ділянок флуоресценції
у перинуклеарному просторі, то під дією блокатора
різко знижується рівень світіння LDox в клітинах.
Dox потрапляє до цитоплазми ПК, як зазначе-
но вище, шляхом дифузії через плазматичну мемб-
рану, але з резистентних клітин препарат швид-
ко виводиться за допомогою P-gp [25, 26]. Перева-
ги ліпосомальної форми препарату, у першу чергу,
полягають в особливостях його трансмембранно-
го транспорту: шляхом ендоцитозу з формуванням
ендосом, що знижує безпосередній зв’язок LDox
з P-gp. C. Riganti та співавтори [27] встановили, що
LDox не тільки менше виводиться з цитоплазми
за допомогою P-gp, а ще й ліпосоми, у свою чергу,
пригнічують насосну функцію цього трансмембран-
ного білка-транспортера.
За допомогою імуноцитохімічного методу і кон-
фокальної мікроскопії ми провели дослідження екс-
пресії P-gp під впливом Dox і LDox. Після культи-
вування клітин лінії MCF-7 протягом 12 год з Dox
у 80,0% клітин відзначали експресію P-gp (рис. 8,
а), тоді як взаємодія цих клітин з LDox не призво-
дила до появи експресії P-gp ні через 24 год, ні через
48 год інкубації (рис. 8, б). Таким чином, ми вста-
новили, що Dox у вільній формі, який потрапляє
в клітину шляхом дифузії, активує енергозалежний
трансмембранний білок-транспортер P-gp, внаслі-
док чого частково виводиться з клітини. При засто-
суванні препарату у ліпосомальній формі експресія
P-gp не проявлялася.
Результати, отримані в проведених раніше в на-
шому відділі дослідженнях [10, 23], продемонстру-
вали, що як для чутливих до Dox клітин вихідної
лінії MCF-7, так і для клітин резистентної сублінії
MCF-7/Dox характерне не тільки підвищене нако-
пичення, а й більш тривала акумуляція в цитоплаз-
мі та ядрі ПК LDox, ніж Dox, що таким чином при-
зводить до посилення цитотоксичної дії препарату.
Отже, ми встановили, що LDox ефективно галь-
мує ріст in vivo резистентних до Dox пухлин (на при-
кладі резистентного штаму карциноми Герена). За-
вдяки ендоцитозу Dox проникає в цитоплазму та
акумулюється в ядрі чутливих і резистентних клі-
ÎÐÈÃÈÍÀËÜÍÛÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß
283ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013 283
Рис. 4. Розподіл Dox у клітинах лінії MСF-7: а — без дії цитохалазину В; б — під впливом цитохалазину В. ×400
Рис. 5. Розподіл Dox у клітинах лінії MСF-7/Dox: а –без дії цитохалазину В; б — під впливом цитохалазину В. ×200
Рис. 6. Розподіл LDox у клітинах лінії MCF-7. а — без дії цитохалазину В; б — під впливом цитохалазину В. ×400
Рис. 7. Розподіл LDox у клітинах лінії MCF-7/Dox. а — без дії цитохалазину В; б — під впливом цитохалазину В. ×400
ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013
ÎÐ ÈÃÈÍÀËÜÍÛ Å ÈÑÑËÅÄÎ ÂÀ ÍÈß
284
тин лінії MCF-7 та MCF-7/Dox, успішно уникаю-
чи активного виведення з цитоплазми трансмемб-
ранним білком-транспортером P-gp.
ВИСНОВКИ
На основі даних, отриманих у результаті прове-
деного нами дослідження, зроблено такі висновки:
1. LDox на 33,3% більше гальмує ріст резистент-
ного до вільного Dox штаму карциноми Герена та
в 37,5% призводить до патоморфологічної регресії
паренхіми пухлин, що відповідає ІІІ ступеню ліку-
вального патоморфозу.
2. LDox проникає в чутливі клітини лінії MCF-7 і
резистентні клітини сублінії MCF-7/Dox шляхом ен-
доцитозу та акумулюється переважно в ядрі клітин.
3. Вільна форма Dox, яка потрапляє в клітини лі-
нії MCF-7 шляхом дифузії, активує енергозалежний
трансмембранний білок-транспортер P-gp, внаслі-
док чого Dox виводиться з клітин.
4. LDox не призводить до появи експресії білка
P-gp в досліджуваних клітинах лінії MCF-7.
СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ
1. Gottesman MM. Mechanisms of cancer drug resistance.
Annu Rev Med 2002; 53: 615–27.
2. Wind NS, Holen I. Multidrug resistance in breast cancer:
from in vitro models to clinical studies. Int J Breast Cancer 2011;
96: 12–24.
3. Чехун ВФ, Микитенко ДО, Лук’янова НЮ. Корекція
порушень метилування ДНК як можливий шлях модуля-
ції лікарської резистентності злоякісних клітин. Укр біохім
журн 2006; 78 (6): 5–14.
4. Kutanzi KR, Yurchenko OV, Chekhun VF, et al. Mi-
croRNA-mediated drug resistance in breast cancer. Clin Epige-
net 2011; 2: 171–85.
5. Семиглазов ВВ, Топузов ЭЭ. Рак молочной железы.
Моск ва: МЕДпресс-информ, 2009. 172 с.
6. Hortobagyi GN, Pivot X, Asmar L. Special lecture: Antra-
cycline-resistant breast cancer. Breast Cancer 1997; 4 (4): 221–7.
7. Pivot X, Asmar L, Buzdar AU, et al. A unified definition of
clinical anthracycline resistance breast cancer. Br J Cancer 2000;
82 (3): 529–34.
8. O’Shaughnessy J. Liposomal anthracyclines for breast can-
cer: Overview Joyce. Oncologist 2003; 8 (2): 1–2.
9. Кулик ГИ, Пономарева ОВ, Король ВИ, Чехун ВФ.
Токсичность и противоопухолевая активность липосомаль-
ной лекарственной формы доксорубицина. Онкология 2004;
6 (3): 207–10.
10. Rusetskaya NV, Khariton N, Yurchenko OV, Chekhun VF.
Distribution and accumulation of liposomal form of doxorubicin in
breast cancer cells of MCF-7 line. Exp Oncol 2011; 33 (2): 78–80.
11. Abrahan SA, Waterhouse DN, Mayer LD. The liposomal
formulation of doxorubicin. Methods Enzymol 2005; 391: 71–97.
12. Andresen TL, Jensen SS, Jorgesen K. Advanced strategies
in liposomal cancer therapy: problems and prospects of active and
tumor specific drug release. Prog Lipid Res 2005; 44 (1): 68–97.
13. Chao TC, Wang WS, Yen CC, et al. A dose-escalating pi-
lot study of sterically stabilized, pegylated liposomal doxorubicin
(Lipo-Dox) in patients with metastatic breast cancer. Cancer In-
vest 2003; 21 (6): 837–47.
14. Ranson MR, Carmichael J, O’Byrne K, et al. Treatment of
advanced breast cancer with sterically stabilized liposomal doxo-
rubicin: results of a multicenter phase II trial. J Clin Oncol 1997;
15 (10): 3185–91.
15. Reynolds JG, Geretti E, Hendriks BS, et al. HER2-targe-
ted liposomal doxorubicin displays enhanced anti-tumorigenic
effects without associated cardiotoxicity. Toxicol Appl Pharma-
col 2012; 262 (1): 1–10.
16. Al-Batran S-E, Güntner M, Pauligk C, et al. Anthracycline
rechallenge using pegylated liposomal doxorubicin in patients with
metastatic breast cancer: a pooled analysis using individual data
from four prospective trials. Br J Cancer 2010; 103 (10): 1518–1523.
17. Півнюк ВМ, Тимовська ЮО, Пономарьова ОВ та ін.
Використання ліпосомальних форм препаратів у хворих
на резистентний до доксорубіцину рак молочної залози. Он-
кологія 2007; 10 (2): 121–4.
18. Tимовська ЮО, Півнюк ВМ, Олійніченко ГП, Че-
хун ВФ. Первинна медикаментозна резистентність до ан-
трациклінових антибіотиків у хворих з місцево-розповсю-
дженим раком молочної залози та можливості її подолання.
Онкологія 2010; 12 (2): 154–9.
19. Чехун ВФ, Тодор ИН, Соляник ГИ, Кулик ГИ, Трин-
дяк ВП. Особенности окислительного фосфорилирова-
ния и энергетического статуса чувствительной и резистент-
ной к доксорубицину карциномы Герена. Эксп Онкол 2000;
22 (4): 195–9.
20. Zykova MG, Medvedeva NV, Torkhovskaya TI, et al. Influ-
ence of doxorubicin inclusion into phospholipid nanoformulation
on its antitumor activity in mice: increased efficiency for resistant
tumor model. Exp Oncol 2012; 34: 12–24.
21. Lee KD, Hong K. Recognition of liposome by cells: in vitro
building and endocytosis mediated by specific lipid headgroups and
surface charge density. Biochim Biophys Acta 1992; 1103: 85–97.
22. Pollock S, Antrobus R, Newton L, et al. Uptake and traf-
ficking of liposomes to the endoplasmic reticulum. FASEB J 2010;
24 (6): 1866–78.
Рис. 8. Зміна експресії P-gp у клітинах РМЗ MCF-7 при культивуванні з Dox (а) та LDox (б) протягом 24 год. ×400
ÎÐÈÃÈÍÀËÜÍÛÅ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈß
285ÎÍÊÎËÎÃÈß • Ò. 15 • ¹ 4 • 2013 285
23. Rusetskaya NV, Khariton NG, Yurchenko OV, Naleski-
na LA, Chekhun VF. Features of liposomal doxorubicin accumu-
lation and distribution in tumor cells of human breast cancer. Ma-
terials of international conference «Tumor and host: novel aspects
and old problems». Exp Oncol 2010; 32 (3): 24.
24. Smythe E, Ayscough KR. Actin regulation in endocytosis.
J Cell Sci 2006; 119: 4589–98.
25. Thorn CF, Oshiro C, Marsh S, et al. Doxorubicin path-
ways: pharmacodynamics and adverse effects. Pharmacogenet
Geno mics 2011; 21 (7): 440–6.
26. Shen F, Chu S, Bence AK, et al. Quantitation of Doxoru-
bicin Uptake, Efflux, and Modulation of Multidrug Resistance
(MDR) in MDR Human Cancer Cells. J Pharmacol Exp Ther
2008; 324 (1): 95–102.
27. Riganti C, Voena C, Kopecka J. Liposome-encapsulated
doxorubicin reverses drug resistance by inhibiting P-glycoprotein
in human cancer cells. Mol Pharm 2011; 8 (3): 683–700.
THE EFFECT OF LIPOSOMAL
DOXORUBICIN FORM ON DRUG
RESISTANT TUMOR PHENOTYPE
I.M. Todor, N.Y. Lukyanova, Y.O. Tymovska,
V.M. Pivnyuk, V.F. Chekhun
Summary. Objective: to investigate the influence of lipo-
somal form of doxorubicin (LDox) on tumor phenotype
of drug resistance and to determine its individual mech-
anisms. Objects and methods: Dox-resistant Guerin car-
cinoma rats; human breast cancer MCF-7 cells and
Dox-resistant subline MCF-7/Dox. Methods of exper-
imental oncology, cell culture, histological, immunocy-
tochemical; the light and laser confocal microscopy. Re-
sults: LDox significantly inhibits the growth of free Dox
resistant strain Guerin carcinoma and leads to patho-
morphosis of tumors parenchyma. Free Dox enters the
cytoplasm of tumor cells by diffusion, liposomal — by en-
docytosis. Liposomal form of the drug, does not induce
the expression of P-gp in tumor cells and thus bypas ses
the ejection from the cytoplasm by this protein. Conclu-
sions: LDox form has advantages in terms of free-form
cytostatic regarding the accumulation and impact on
malignant cells. This leads to long-term accumulation
of cytostatic as in the cytoplasm and nucleus of tumor
cells with the phenotype of drug resistance.
Key words: drug resistance, liposomal doxorubicin,
endocytosis, P-gp.
Адреса для листування:
Тодор І.М.
03022, Київ, вул. Васильківська, 45
Інститут експериментальної патології, онкології
і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України
E-mail: todor_igor@yahoo.com
Одержано: 2.08.2013
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-135384 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:04:06Z |
| publishDate | 2013 |
| publisher | Iнститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького |
| record_format | dspace |
| spelling | Тодор, І.М. Лук’янова, Н.Ю. Тимовська, Ю.О. Півнюк, В.М. Чехун, В.Ф. 2018-06-15T09:32:23Z 2018-06-15T09:32:23Z 2013 Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності / І.М. Тодор, Н.Ю. Лук’янова, Ю.О. Тимовська, В.М. Півнюк, В.Ф. Чехун // Онкологія. — 2013. — Т. 15, № 4. — С. 279-285. — Бібліогр.: 27 назв. — укр. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/135384 Мета: дослідити вплив ліпосомальної форми доксорубіцину (LDox) на пухлини
 з фенотипом медикаментозної резистентності та визначити його
 окремі механізми. Об’єкти і методи: резистентна до вільної форми доксорубіцину
 (Dox) карцинома Герена щурів; клітини раку молочної залози людини
 MCF-7 та її резистентної до Dox сублінії MCF-7/Dox. Методи експериментальної
 онкології; культивування клітин; гістологічний, імуноцитохімічний;
 світлова та лазерна конфокальна мікроскопія. Результати: LDox
 достовірно гальмує ріст резистентного до вільного Dox штаму карциноми
 Герена та призводить до патоморфозу паренхіми пухлин. Вільний Dox потрапляє
 в цитоплазму пухлинних клітин шляхом дифузії, ліпосомальний —
 шляхом ендоцитозу. LDox не індукує експресію P-gp в пухлинних клітинах і
 таким чином оминає активне виведення з цитоплазми за допомогою цього
 білка. Висновки: LDox має переваги порівняно з вільною формою цитостатика
 стосовно накопичення і впливу на злоякісні клітини. Він може тривало
 акумулюватися як у цитоплазмі, так і у ядрі пухлинних клітин з фенотипом
 медикаментозної резистентності. Objective: to investigate the influence of liposomal
 form of doxorubicin (LDox) on tumor phenotype
 of drug resistance and to determine its individual mechanisms.
 Objects and methods: Dox-resistant Guerin carcinoma
 rats; human breast cancer MCF-7 cells and
 Dox-resistant subline MCF-7/Dox. Methods of experimental
 oncology, cell culture, histological, immunocytochemical;
 the light and laser confocal microscopy. Results:
 LDox significantly inhibits the growth of free Dox
 resistant strain Guerin carcinoma and leads to pathomorphosis
 of tumors parenchyma. Free Dox enters the
 cytoplasm of tumor cells by diffusion, liposomal — by endocytosis.
 Liposomal form of the drug, does not induce
 the expression of P-gp in tumor cells and thus bypas ses
 the ejection from the cytoplasm by this protein. Conclusions:
 LDox form has advantages in terms of free-form
 cytostatic regarding the accumulation and impact on
 malignant cells. This leads to long-term accumulation
 of cytostatic as in the cytoplasm and nucleus of tumor
 cells with the phenotype of drug resistance. uk Iнститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького Онкологія Оригинальные исследования Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності The effect of liposomal doxorubicin form on drug resistant tumor phenotype Article published earlier |
| spellingShingle | Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності Тодор, І.М. Лук’янова, Н.Ю. Тимовська, Ю.О. Півнюк, В.М. Чехун, В.Ф. Оригинальные исследования |
| title | Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності |
| title_alt | The effect of liposomal doxorubicin form on drug resistant tumor phenotype |
| title_full | Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності |
| title_fullStr | Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності |
| title_full_unstemmed | Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності |
| title_short | Вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності |
| title_sort | вплив доксорубіцину в ліпосомальній формі на пухлини з фенотипом медикаментозної резистентності |
| topic | Оригинальные исследования |
| topic_facet | Оригинальные исследования |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/135384 |
| work_keys_str_mv | AT todorím vplivdoksorubícinuvlíposomalʹníiformínapuhlinizfenotipommedikamentoznoírezistentností AT lukânovanû vplivdoksorubícinuvlíposomalʹníiformínapuhlinizfenotipommedikamentoznoírezistentností AT timovsʹkaûo vplivdoksorubícinuvlíposomalʹníiformínapuhlinizfenotipommedikamentoznoírezistentností AT pívnûkvm vplivdoksorubícinuvlíposomalʹníiformínapuhlinizfenotipommedikamentoznoírezistentností AT čehunvf vplivdoksorubícinuvlíposomalʹníiformínapuhlinizfenotipommedikamentoznoírezistentností AT todorím theeffectofliposomaldoxorubicinformondrugresistanttumorphenotype AT lukânovanû theeffectofliposomaldoxorubicinformondrugresistanttumorphenotype AT timovsʹkaûo theeffectofliposomaldoxorubicinformondrugresistanttumorphenotype AT pívnûkvm theeffectofliposomaldoxorubicinformondrugresistanttumorphenotype AT čehunvf theeffectofliposomaldoxorubicinformondrugresistanttumorphenotype |