Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах
Методами флуоресцентної спектроскопії і мікроскопії досліджували можливості застосування флуоресцентних барвників ДСМ, Є-176, 3-ДАБ, ФМЄ для вивчення впливу кріозахисних речовин на сперматозоїди собаки. Установлено, що барвники ФМЄ і 3-ДАБ придатні для розв’язання поставленої задачі, а барвники ДСМ...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Дата: | 2006 |
| Автори: | , , , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Українська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2006
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/136639 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах / М.І. Єгоров, Т.С. Дюбко, Т.П. Ліннік, О.П. Білоножко, І.Г. Єрмоленко, О.Н. Семенова, Л.Д. Паценкер, В.Г. Пивоваренко, Є.А. Поврозін // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 1. — С. 13-23. — Бібліогр.: 23 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860042392028053504 |
|---|---|
| author | Єгоров, М.І. Дюбко, Т.С. Ліннік, Т.П. Білоножко, О.П. Єрмоленко, І.Г. Семенова, О.Н. Паценкер, Л.Д. Пивоваренко, В.Г. Поврозін, Є.А. |
| author_facet | Єгоров, М.І. Дюбко, Т.С. Ліннік, Т.П. Білоножко, О.П. Єрмоленко, І.Г. Семенова, О.Н. Паценкер, Л.Д. Пивоваренко, В.Г. Поврозін, Є.А. |
| citation_txt | Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах / М.І. Єгоров, Т.С. Дюбко, Т.П. Ліннік, О.П. Білоножко, І.Г. Єрмоленко, О.Н. Семенова, Л.Д. Паценкер, В.Г. Пивоваренко, Є.А. Поврозін // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 1. — С. 13-23. — Бібліогр.: 23 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Методами флуоресцентної спектроскопії і мікроскопії досліджували можливості застосування флуоресцентних барвників ДСМ, Є-176, 3-ДАБ, ФМЄ для вивчення впливу кріозахисних речовин на сперматозоїди собаки. Установлено, що барвники ФМЄ і 3-ДАБ придатні для розв’язання поставленої задачі, а барвники ДСМ і Є-176 мають обмеження внаслідок достатньо сильної флуоресценції розчинів кріопротекторів. Показано, що досліджувані флуоресцентні барвники по-різному впливають на рухомість клітин.
Методами флуоресцентной спектроскопии и микроскопии исследовали возможности флуоресцентных красителей ДСМ, Е-176, 3-ДАБ, ФМЕ для изучения влияния криозащитных веществ на сперматозоиды собаки. Установлено, что красители ФМЕ и 3-ДАБ применимы для решения поставленной задачи, а ДСМ и Е-176 имеют ограничения в результате достаточно сильной флуоресценции растворов криопротекторов. Показано, что исследуемые флуоресцентные красители по-разному влияют на подвижность клеток.
Possibilities of using DSM, E-176, 3-DAB, FME fluorescent dyes for examining the effect of cryoprotective agents on canine spermatozoa were studied with the methods of fluorescent spectroscopy and microscopy. FME and 3-DAB dyes were found to be capable of solving the tasks set and DSM, E-176 ones had a limitation due to quite a strong fluorescence of cryoprotectants’ solutions. Studied fluorescent dyes were demonstrated as differently affecting cell motility.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:56:23Z |
| format | Article |
| fulltext |
13 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №1
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №1
УДК 611. 013. 11: 636. 082. 11. 57.043
М.І. ЄГОРОВ1*, Т.С. ДЮБКО1, Т.П. ЛІННІК1, О.П. БІЛОНОЖКО1,
І.Г. ЄРМОЛЕНКО2, О.Н. СЕМЕНОВА2, Л.Д. ПАЦЕНКЕР2, В.Г. ПИВОВАРЕНКО3, Є. А. ПОВРОЗІН2
Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження
сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах
UDC 611. 013. 11: 636. 082. 11. 57.043
М.I. ЕGOROV1*, Т.S. DYUBKO1, Т.P. LINNIK1, А.P. BELONOZHKO1,
I.G. ЕRMOLENKO2, О.N. SEMENOVA2, L.D. PATSENKER2, V.G. PIVOVARENKO3, Е.А. POVROZIN2
New Fluorescent Dyes as Fluorescent Probes for Examination of
Canine Spermatozoa in Cryoprotective Media
Методами флуоресцентної спектроскопії і мікроскопії досліджували можливості застосування флуоресцентних барвників
ДСМ, Є-176, 3-ДАБ, ФМЄ для вивчення впливу кріозахисних речовин на сперматозоїди собаки. Установлено, що барвники
ФМЄ і 3-ДАБ придатні для розв’язання поставленої задачі, а барвники ДСМ і Є-176 мають обмеження внаслідок достатньо
сильної флуоресценції розчинів кріопротекторів. Показано, що досліджувані флуоресцентні барвники по-різному впливають
на рухомість клітин.
Ключові слова: сперматозоїди собак, диметилформамід, етиленгліколь, флуоресцентні зонди, ДСМ, Є-176, 3-ДАБ, ФМЄ
Методами флуоресцентной спектроскопии и микроскопии исследовали возможности флуоресцентных красителей ДСМ,
Е-176, 3-ДАБ, ФМЕ для изучения влияния криозащитных веществ на сперматозоиды собаки. Установлено, что красители
ФМЕ и 3-ДАБ применимы для решения поставленной задачи, а ДСМ и Е-176 имеют ограничения в результате достаточно
сильной флуоресценции растворов криопротекторов. Показано, что исследуемые флуоресцентные красители по-разному
влияют на подвижность клеток.
Ключевые слова: сперматозоиды собак, диметилформамид, этиленгликоль, флуоресцентные зонды, ДСМ, Е-176, 3-ДАБ, ФМЕ.
Possibilities of using DSM, E-176, 3-DAB, FME fluorescent dyes for examining the effect of cryoprotective agents on canine
spermatozoa were studied with the methods of fluorescent spectroscopy and microscopy. FME and 3-DAB dyes were found to be
capable of solving the tasks set and DSM, E-176 ones had a limitation due to quite a strong fluorescence of cryoprotectants’ solutions.
Studied fluorescent dyes were demonstrated as differently affecting cell motility.
Key-words: canine spermatozoa, dimethyl formamide, ethylene glycol, fluorescent probes, DSM, E-176, 3-DAB, FME.
* Автор, якому необхідно надсилати кореспонденцію:
вул. Переяславська, 23, м. Харків, Україна 61015; тел.:+38
(057) 373-31-41, факс: +38 (057) 373-30-84, електронна пошта:
cryo@online.kharkov.ua
* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya
str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+38 (057) 373 3141, fax: +380 57
373 3084, e-mail:cryo@online.kharkov.ua
1Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the
National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
2Institute for Single Crystals of the National Academy of Sciences
of Ukraine, Kharkov, Ukraine
3 Taras Shevchenko Kiev National University, Kiev, Ukraine
1Інститут проблем кріобіології і кріомедицини
НАН України, м. Харків
2Інститут сцинтиляційних матеріалів НТК “Інститут
монокристалів” НАН України, м. Харків
3Київський національний університет
ім. Тараса Шевченка
Підбір оптимальних кріопротекторів (КП),
придатних для довготривалого низькотемператур-
ного зберігання сперматозоїдів, проводиться
емпірично, бо механізми захисної дії цих речовин
на молекулярному рівні недостатньо вивчені.
Метод флуоресцентних зондів (ФЗ), завдяки своїй
високій чутливості, має перспективи в дослідженні
молекулярних механізмів впливу на клітини різного
походження фізико-хімічних факторів [5, 10, 16], у
тому числі захисної дії КП.
Можливість використання методу ФЗ раніше
вивчалась на сперматозоїдах ссавців. Так, було
показано, що флуоресцентні зонди ДСМ і АНС
зв’язуються зі сперматозоїдами хряка і реагують
на зміни їх стану [10]. Однак на сперматозоїдах
собаки такі дослідження не проводили.
Флуоресцентні зонди, які використовуються для
дослідження клітин, повинні мати високі сольвато-
Selection of optimal cryoprotectants enabling the
sperm preservation for a long term is empirically
performed because of poor studying a protective effect
mechanism for these agents at molecular level. The
method of fluorescent probes (FP) due to its high
sensitivity is prospect one in examining molecular
mechanisms of the effect on cells of various origins of
physical and chemical factors [5, 10, 16], in particular,
a cryoprotectant protective effect.
Possibility to use the FP method was previously
investigated in mammalian sperm. Therefore it has
been demonstrated that DMS and ANS probes bind
the hog spermatozoa and respond the alterations of
their state [10]. However in canine spermatozoa there
were no studies performed.
Fluorescent probes used for studying cells should
have high solvate-chromic properties and significant
rise in quantum yield when being bound with biological
14 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №1
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №1
хромні властивості і значне зростання квантового
виходу при зв’язуванні з біологічним об’єктом і
реагувати на зміну мікрооточення. Оскільки
найбільш розповсюджені ФЗ не в повному обсязі
задовольняють цим вимогам, необхідно шукати і
випробувати нові ФЗ.
У роботі досліджується можливість застосуван-
ня флуоресцентних барвників, що є похідними
різних типів органічних речовин (ДСМ, Є-176,
ФМЄ, 3 ДАБ) для вивчення змін стану спермато-
зоїдів собаки під дією КП диметилформаміду
(ДМФА).
Матеріали і методи
Сперму для досліджень було отримано від 3-х
клінічно здорових кобелів породи ротвелер при
кімнатній температурі (20°С) за допомогою
масажу передміхурової залози в присутності
естральної самиці. Еякулят сперми собак скла-
дається з трьох фракцій, які виділяються окремо з
невеликим інтервалом у часі. Це дозволяє в
експерименті отримати всі фракції еякуляту окремо
і уникнути передчасної активації сперматозоїдів
собак під впливом третьої фракції, яка є секретом
передміхурової залози [17].
Отриманий матеріал (перша і друга фракції
сперми) розділяли на 4 аліквоти, центрифугували в
пластикових ампулах об’ємом 1 мл при 400 g
впродовж 3 хв. Центрифугування проводили для
відокремлення плазми еякуляту собак, білки якої
можуть зв’язувати зонди. Осадок сперматозоїдів
ресуспендували середовищем, яке містило 0,2 М
тріс-буфера (Trizma pH 7,2, Sigma, США), 0,05 М
фруктози (осмотичність середовища становила
320 мОсмоль, рН 7,2), до концентрації 106 клітин в
1 мл.
Було використано 7 еякулятів. Концентрацію
сперматозоїдів в еякулятах і процент рухливих
клітин визначали візуально під мікроскопами
“Біолар” (×250) (Польща) і “Люмам МП-4” (×1000)
(ЛОМО, Росія) за допомогою відеозапису. Відео-
запис проводився з використанням відеокамери
Panasonic WV-CP 470, з’єднаної з мікроскопом. На
цій же установці досліджували локалізацію
флуоресцентних барвників в сперматозоїдах із
застосуванням світофільтрів марок ВС-8-2,
СЗС-24-4, СС-15-2.
Для вивчення впливу ФЗ на рухливість сперма-
тозоїдів у часі суспензії клітин витримували в
термостаті при температурі 38°С, яка відповідає
фізіологічній нормі собаки. Оцінку рухливості
сперматозоїдів давали через кожні 10 хв.
Для дослідження впливу КП на спектри
флуоресценції ФЗ зразки сперматозоїдів після
центрифугування і ресуспендування, а також
розчини КП попередньо охолоджували на протязі
object and response to the change in microenvironment.
Since the most spread FPs do not meet completely the
requirements one should search and examine new
ones.
The paper covers the possibility to use fluorescent
dyes being the derivatives of various types of organic
substances (DSM, E-176, FME, 3-DAB) to investigate
the state changes of canine spermatozoa under the
effect of dimethyl formamide (DMFA).
Materials and methods
Sperm for research was obtained from 3 clinically
healthy male dogs of Rottweiler breed at room
temperature (20°C) by massaging the prostate in
presence of female in estrus. Canine sperm ejaculate
comprises three fractions which are separately
secreted with slight time interval. This enables in
experiment to obtain all ejaculate fractions separately
and avoid untimely activation of dogs’ spermatozoa
under the influence of the third fraction which is
secreted by prostate [17].
Obtained material (first and second sperm fractions)
were divided into 4 aliquots, centrifuged in 1ml plastic
ampoules at 400g for 3 min. Centrifugation was
performed to separate canine ejaculate plasma the
protein of which may bind the probes. Spermatozoa
sediment was re-suspended with the medium
comprised 0.2 M tris-buffer (Trizma pH 7.2, Sigma,
USA), 0.05 M fructose (medium osmolality made 320
mOsm, pH 7.2), to the concentration of 106 cells per 1
ml.
There were used 7 ejaculates. Spermatozoa
concentration in ejaculates and percentage of motile
cells were visually found with “Biolar” (x250)
microscope (Poland) and “Lumam MP-4” (x1000)
(LOMO, Russia) by video recording. It was performed
with Panasonic WV-CP 470 video camera combined
with microscope. At the same assembly there was
examined the localization of florescent dyes in sperma-
tozoa using light filters BC-8-2, SZS-24-4, SS-15-2.
To study the effect of FP on the motility of
spermatozoa in time cell suspensions were maintained
in thermostat at 38°C that is physiological norm for
dogs. Evaluation of spermatozoa motility was
conducted every 10 min.
To examine the effect of cryoprotectants on FP
fluorescence spectra the samples of spermatozoa after
centrifugation and re-suspending as well as solutions
of cryoprotectants were pre-cooled for 10 min down
to 4°C. Solutions of cryoprotectants (DMFA or EG)
under final concentration of 5% were added to cell
suspension directly before measuring.
Fluorescent probes DSM (4-(N-dimethylamino-
stiryl)-1-methyl pyridine-N-toluolsulfonat), E-176 and
3-DAB (commercial names) were synthesized at the
Department of organic luminophores and dyes of the
15 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №1
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №1
10 хв до температури 4°С. Розчини кріопротекторів
(ДМФА або ЕГ) у кінцевій концентрації 5%
додавали до суспензії клітин безпосередньо перед
вимірюваннями.
Флуоресцентні зонди ДСМ (4-N-диметил-
аміностирил 1-метилпірідіній-N-толуолсульфонат),
Є-176 и 3-ДАБ (комерційні назви) були синтезовані
у відділі органічних люмінофорів і барвників
Інституту сцинтиляційних матеріалів НТК “Інсти-
туту монокристалів” НАН України. Зонд ФМЄ
(3-гідрокси-4`-(N,N-диметиламінофлавон) синтезо-
вано по методу [23]. В експериментах вико-
ристовували розчини барвників, приготованих на
двічі дистильованій воді. Концентрація барвників
у суспензії клітин при мікроскопічних дослідженнях
становила 40-70, а при спектральних вимірюваннях –
4-7 мкмоль/л. Спектральні параметри флуоресцентних
барвників наведено в табл. 1.
Кріопротектори марки “х.ч.” або “ч.д.а.”
(“Реахім”, Росія) додатково очищали: ДМФА –
двократною вакуумною перегонкою [1], ЕГ – тим
же способом, але з попередньою витримкою над
окисом алюмінію чи активованим вугіллям марки
“А” [12].
Спектри флуоресценції вимірювали на спектро-
флуориметрі Cary Eclipse (Varian) з їх автоматич-
ною корекцією. Ширина вхідної і вихідної щілин
монохроматорів становила 5 нм. Спектри флуорес-
ценції ФМЄ збуджували світлом з довжиною хвилі
405, ДСМ і 3-ДАБ – 460; Є-176 – 425 нм. Для
усунення концентраційного гасіння при флуоримет-
ричних вимірюваннях зразки розводили так, щоб
їх оптична щільність на довжині хвилі збудження
флуоресценції не перевищувала 0,1. Усі спектральні
вимірювання виконували при 20°С в стандартних
кварцевих кюветах 1×1×3 см. Квантовий вихід
Таблиця 1. Спектральні параметри барвників в етанолі
Table 1. Dye spectra characteristics in ethanol
Примітки: λмакс. погл – положення максимуму спектру поглинання; λмакс. фл. –
положення максимуму спектру флуоресценції; ε – коефіцієнт молярної
екстинкції; QY – квантовий вихід флуоресценції.
Notes: λ adsorb max – maximum of the adsorbtion spectrum; λ fluor max – maximum of
the fluorescence spectrum; ε – molar extintion coefficient; QY – fluorescence
quantum yield.
йинтнецсероулФ
кинвраб
eydtnecseroulF
λ
.скам .лгоп
мн,
λ
xambrosda
мн,
ε ьлом, 1- мс 1-
ε lom, 1- mc 1-
λ
.лф.скам
мн,
λ
xamroulf
мн,
YQ
МФ Є ]32[
]32[EMF 704 00094 025 72,0
Є- 671
E- 671 514 23331 345 20,0
МСД
MSD 874 00744 206 20,0
3- БАД
3- BAD 074 05201 666 11,0
флуоресценції ДСМ, 3-ДАБ і Є-176
визначали, використовуючи як еталон
2-(4-метоксисульфофеніл)-5-(4-диме-
тиламінофеніл)-оксазол-1,3 [13],
квантовий вихід якого в спирті до-
рівнює 0,27.
Статистичну обробку результатів
виконували з використанням методу
Стьюдента [6].
Результати та обговорення
Проведені дослідження показали,
що всі вивчені флуоресцентні барв-
ники зв’язуються зі сперматозоїдами
собаки, але відрізняються за місцями
своєї локалізації (рис. 1, б, в, г). ФМЄ
локалізується переважно в ділянці
голівок (рис. 1, б), при цьому спосте-
рігаються два різних за кольором
світіння (зелене і руде) з перевагою
Institute of Scintillation Materials of State Technology
Concern “Institute of Single Crystals” of the National
Academy of Sciences of Ukraine. FME probe
(3-hydroxy-4’-(N,N-dimethylaminoflavone)) was syn-
thesized as in the method reported [23]. In experiments
there were used the solutions of dyes prepared with
double distilled water. Dye concentration in cell sus-
pension during microscopic studies made 40-70 and
during spectral measurements it was 4-7 µmol/l.
Spectral parameters of fluorescent dyes are described
in Table 1.
Cryoprotectants of the grades “chemically pure”
and “pure for analysis” (“Reakhim”, Russia) were
additionally purified: DMFA with double vacuum [1],
the same way for EG but with pre-exposure over
aluminum oxide or activated carbon of “A” grade [12].
Fluorescent spectra were measured with Cary
Eclipse spectrofluorimeter (Varian) with their
automated correction. Input and output width of
monochromators’ slits made 5 nm. Fluorescence
spectra FME were light excited with wave length 405,
460 for and 3-DAB; 425 nm for E-176. To eliminate
concentration quenching during fluorimetric measuring
the samples were diluted in such a way that their optical
density on wavelength of fluorescence excitation does
not exceed 0.1. All spectral measurement were done
at 20C in standard 1×1×3 cm quartz cuvettes. Quantum
yield of fluorescence of DSM, 3-DAB and E-76 was
examined using as etalon 2-(4-metoxysulfophenil)-5-
(4-dimethyl aminophenyl)-oxasol-1.3 [13], which
quantum yield in alcohol is 0.27.
The results were statistically processed using
Student’s method [6].
Results and discussion
The results of this research have shown that all
studied fluorescent dyes are bound with canine
16 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №1
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №1
яскраво-зеленої флуоресценції. ДСМ зв’язується
з усією поверхнею клітин, але більш висока
інтенсивність світіння спостерігається в ділянці
голівок (рис.1, в), менша – шийок; в його спектрі
переважає червоно-руда флуоресценція. Є-176
зв’язується з усією поверхнею клітин і світиться в
жовто-зеленій ділянці з майже однаковою інтен-
сивністю з різних ділянок клітин. 3-ДАБ має
червоно-руду флуоресценцію і локалізується
переважно в ділянці голівок (на рис. 1 не показано).
На рис. 2 наведено результати впливу ФЗ на
рухливість сперматозоїдів собаки впродовж 40 хв,
в контролі вона при цьому становила 65±3%. Зонд
ДСМ через 10 хв після додання до суспензії клітин
не впливає на їх рухливість, і тільки через 30 хв
кількість рухливих клітин знижується на 5%. Одним
з основних показників цитотоксичної дії речовин на
сперматозоїди є падіння їх рухливості у часі. Тому
можна дійти висновку, що ДСМ не впливає на
морфофункціональний стан клітин на відміну від 3-
ДАБ, у присутності якого вже через 10 хв
практично всі сперматозоїди стають нерухомими.
Рис. 1. Локалізація флуоресцентних барвників, які було досліджено, в сперматозоїдах собаки: а – контроль (клітини
в проминаючому світлі без барвників); б – ДСМ; в – ФМЄ; г – Є-176. ×1000.
Fig. 1. Fig. 1. Localization of fluorescent dyes studied in canine spermatozoa: a – control (cells in light microscopy with
no dyes); b - DSM, c – FME, d – E-176. ×1000.
а а б b
в c г d
spermatozoa, but differ on the sites of their localization
(Fig. 1, b, c, d). FME is mainly localized in head sites
(Fig 1, b) herewith there are observed two different
by color luminescences (green and orange) with
predominance of bright green fluorescence. DSM is
bound with the whole surface of cells however higher
intensity of luminescence is noted in head sites
(Fig. 1, c), lower one was found in those of neck; in
its spectrum red-orange fluorescence prevails. E-176
is bound with the whole cell surface and luminescent
in yellow-green area with almost the same intensity
from different cell sites. 3-DAB has red-orange fluo-
rescence and is localized mainly in head sites (not
presented in Fig. 1).
Fig. 2 shows the FP effect results on motility of
canine spermatozoa for 40 min, it made 65±3% in the
control. DSM probe 10 min after being added to cell
suspension does not affect their motility. And only 30
min later the number of motile cells reduces by 5%.
One of cytotoxic effect main indices of substances
on spermatozoa is a decrease in their motility with time.
Therefore one can conclude that DSM does not affect
17 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №1
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №1
Незначно знижує рухливість сперматозоїдів Є-176,
тобто він, як і ДСМ, не виявляє виразної цито-
токсичної дії на сперматозоїди собаки. У присут-
ності ФМЄ через 10 хв кількість рухливих клітин
не перевищує 30±5%, тобто цей барвник має
помірний пошкоджуючий вплив на клітини.
Катіонний зонд ДСМ (табл. 1) є похідним
піридину [4]. Завдяки наявності гнучкого ланцюга,
який з’єднує метилпіридинове кільце з аніліновим,
цій молекулі притаманні властивості полієнів і вона
легко піддається конформаційній ізомеризації в
полярних середовищах, яка веде до безвип-
ромінювальної конверсії S1→Sо, що супровод-
жується зниженням квантового виходу флуо-
ресценції. У гливких середовищах, а також при
зв’язуванні з біомембранами або білками, навпаки,
флуоресценція ДСМ може зростати в 10 і більше
разів. ДСМ відомий як потенціалозалежний зонд,
який застосовується для визначення поверхневого
потенціалу клітин. У той же час у різних клітинах
він може проявляти як “червону” (610 нм), так і
“зелену” (560 нм) флуоресценцію [4]. При
зв’язуванні з ДНК можна бачити лише червону
смугу, в бактеріях, покритих оболонкою, на поверхні
якої розташований шар негативно зарядженого
ліпополісахариду – в основному зелену, а в інших
мембранах чи білках можуть бути присутні обидві
[2, 3, 11] форми флуоресценції барвника.
Флуоресценція ДСМ, який знаходиться в
суспензії сперматозоїдів, практично повністю
обумовлена його зв’язаною формою (рис. 3), що
суттєво спрощує аналіз спектрів. Положення
максимуму спектра (λфл≈600 нм) свідчить про
поверхневу локалізацію основної маси зв’язаного
з клітинами ДСМ [4]. У спектрах присутнє також
плече при 550 нм, яке може віддзеркалювати
зв’язування зонда в неполярних ділянках мембран.
У середовищі, що містить ЕГ, зонд ДСМ має
інтенсивну флуоресценцію (рис. 3), хоча і в дещо
більш довгохвильовій ділянці, ніж в нативних
сперматозоїдах (λ макс знаходиться біля
607-608 нм). При цьому інтенсивність флуо-
ресценції зонда близька до інтенсивності його
світіння в клітинах, що ускладнює аналіз спектрів
ДСМ у сперматозоїдах у присутності ЕГ. У розчині
більш гідрофобного КП (ДМФА) інтенсивність
спектрів флуоресценції ДСМ перевищує їх інтен-
сивність в нативних сперматозоїдах. Це практично
унеможливлює застосування цього зонда в
розчинах КП, які мають більшу гідрофобність у
порівнянні з ЕГ.
Таким чином, зонд ДСМ може використовува-
тися для дослідження стану сперматозоїдів, які
зазнали дії різних факторів (наприклад, темпе-
ратури, іонного складу середовища, лазерного або
іонізуючого опромінення тощо), але можливості
його застосування для вивчення сперматозоїдів у
0
10
20
30
40
50
60
70
0 10 20 30 40 50
Ру
хл
ив
іс
ть
с
пе
рм
ат
оз
ої
ді
в,
%
Sp
er
m
at
oz
oa
m
ot
ilit
y,
%
Час, хв Time, min
Рис. 2. Вплив флуоресцентних барвників, які було
досліджено, на рухливість сперматозоїдів собаки: 1 –
ДСМ; 2 – Є-176; 3 – ФМЄ; 4 – 3-ДАБ.
Fig. 2. Effect of fluorescent dyes studied for canine
spermatozoa motility: 1 – DSM; 2 – E-176; 3 – FME; 4 – 3-
DAB.
morphofunctional status of cells in contrast to 3-DAB
in presence of which even 10 min later quite all
spermatozoa are getting immotile. E-176 decreases
slightly spermatozoa motility, i.e. as well as DSM does
not demonstrate a pronounced cytotoxicity effect on
canine spermatozoa. In FME presence in 10 min the
number of motile cells does not exceed 30±5%, that is
this dye has a moderate impairing influence on cells.
DSM cation probe (Table 1) is pyridine derivative
[4]. Due to the presence of flexible link joining
methyl pyridine ring with aniline one this molecule
is characterized with polyenes properties and easily
underwent conformational izomerization in polar
media leads to non-illuminating conversion S1→S0,
accompanied with the reduction of fluorescence
quantum yield. In viscous media and during binding
with biological membranes or proteins as contrary
DSM fluorescence may be increased 10 times and
higher. DSM is known as potential-dependent probe
used for examining cell surface potential. At the same
time in various cells it may manifest both “red”
(610 nm) and “green” (560 nm) fluorescence [4].
During binding with DNA one may observe only red
band in bacteria covered with membrane on surface
of which there is a layer of negatively charged
liposaccharide, basically green color and for other
membranes two dye fluorescence forms may be
present [2, 3, 11].
DSM fluorescence, being in spermatozoa suspen-
sion is quite completely stipulated by its bound form
(Fig. 3), that significantly simplifies spectra analysis.
Spectrum maximum position (λfl=600 nm) testifies to
surface localization of bulk DSM bound with cells [4].
There is a shoulder at 550 nm as well, which may
indicate probe binding in non-polar membrane sites.
1
2
3
4
18 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №1
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №1
присутності органічних речовин, зокрема КП,
обмежені. Зонд не можна використовувати для
дослідження впливу на сперматозоїди КП, більш
гідрофобних, ніж ЕГ.
Молекула Є-176 формально нейтральна. Однак
в слабокислих, нейтральних і лужних середовищах
карбоксигрупа зазнає дисоціації, і молекула зонда
перетворюється в негативно заряджений іон.
У нейтральному середовищі, яке звичайно
використовують для інкубації сперматозоїдів,
максимум спектра флуоресценції барвника Є-176
знаходиться при 547 нм. При зв’язуванні зі
сперміями максимум флуоресценції барвника дещо
зрушує в короткохвильовий бік (до 536 нм), а її
інтенсивність зростає майже в 2 рази (рис. 4). При
доданні КП до середовища інкубації зростає
інтенсивність світіння вільного барвника (тобто
того, який знаходиться у розчині) і барвника,
зв’язаного з клітинами, причому більше для ДМФА,
ніж для ЕГ, без суттєвих змін положення спектрів.
У присутності КП інтенсивності флуоресценції
молекул зонда, зв’язаних з клітинами і тих, що
знаходяться у розчині, відрізняються на 38±5 і
5±2% для ЕГ і ДМФА відповідно. Таким чином,
барвник Є-176 має обмеження при дослідженні
впливу КП на сперматозоїди. Як і ДСМ, його
можна використовувати лише для КП з гідро-
фобністю, яка не перевищує або дорівнює гідро-
фобності ЕГ.
Рис. 3. Спектри флуоресценції ДСМ в сперматозоїдах
собаки в присутності ЕГ і ДМФА: 1 – сперматозоїди +
ДСМ; 2 – середовище + ЕГ + ДСМ; 3 – сперматозоїди +
ЕГ+ ДСМ; 4 – середовище + ДМФА + ДСМ; 5 –
сперматозоїди + ДМФА + ДСМ. Концентрація ДСМ –
6,8×10-6 моль/л.
Fig. 3. Fig. 3. DSM fluorescence spectra in canine
spermatozoa in EG and DMFA presence: 1 – spermatozoa +
DSM; 2 – medium+EG+DSM; 3- spermatozoa+EG+DSM; 4-
medium+DMFA+DSM; 5- spermatozoa+DMFA+DSM;
DSM concentration is 6.8×10-6 mol/l.
Ін
те
нс
ив
ні
ст
ь
ф
лу
ор
ес
це
нц
ії,
у
м
. о
д
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
, u
ni
ts
0
10
20
30
40
50
60
70
80
500 600 700 800
Довжина хвилі, нм Wavelength, nm
1
2
3 4
5
In the medium with EG DSM probe has an
intensive fluorescence (Fig. 3), however in somewhat
long wave area than in native spermatozoa (λmax is
near 607-608 nm).
Herewith the intensity of fluorescence probe is
close to the one of its luminescence in cells that makes
difficult the analysis of DSM spectra in spermatozoa
in EG presence. In solution of more hydrophobic
DMFA the fluorescence intensity exceeds its intensity
in native spermatozoa. This makes practically
impossible the use of this probe in the solutions of
cryoprotectants which are more hydrophobic than EG.
Thus DSM probe may be used to examine state of
spermatozoa underwent different effects (e.g.
temperature, medium ionic composition, laser or
ionizing radiation etc.) but the possibilities of its
application to investigate spermatozoa in presence of
organic substances, in particular cryoprotectants, are
limited. The probe could not be used to investigate the
effect on spermatozoa of the cryoprotectants which
are more hydrophobic that EG.
E-176 molecule is formally neutral. However in
slightly acid, neutral and alkaline media carboxy group
is dissociated and probe molecule transforms into
negatively charged ion.
In neutral medium which is usually used for
spermatozoa incubation the maximum of E-176 dye
fluorescence spectrum is at 547 nm. During binding
with spermatozoa dye fluorescence spectrum
maximum is shifted towards short waves (up to 536
nm) and its intensity is increased almost twice (Fig. 4).
When adding cryoprotectants to incubation medium
the luminescence intensity of free dye (i.e. the one
being in the solution) increased and that bound with
cells more over in greater extent for DMFA than for
EG with no considerable changes in spectra. In
cryoprotectans’ presence fluorescence intensities of
probe molecules bound with cells and those being in
solution are different by 38±5 and 5±2% for EG and
DMFA, correspondingly. Thus E-176 dye has
limitations during studying the effect of cryoprotectants
on spermatozoa. The same as for DSM it could be
used only for cryoprotectants with hydrophobicity not
exceeding or equal to that for EG.
FME as a new fluorescent probe of flavonols class,
may have two bands in fluorescence spectrum as a
result of the fact that its excited state makes two
isomere forms: normal (N*) and tautomeric (T*) [23].
Each of these forms has own fluorescence that leads
to the fact that in spectrum of FME there are observed
two bands: green-blue (N*) and yellow-orange (T*).
Position and intensity of these bands depend on
polarity, proton-donor ability and viscosity of the
medium [14, 15, 20]. FME is advantageously different
among other classes of fluorescent probes because it
is capable of simultaneous identifying such environ-
0
10
20
30
40
50
475 500 525 550 575 600
19 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №1
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №1
Новий флуоресцентний зонд класу флавонолів
ФМЄ може мати дві смуги в спектрі флуоресценції
внаслідок того, що у збудженому стані він утворює
дві ізомерні форми: нормальну (N*) і таутомерну
(T*) [23]. Кожна з цих форм має власну флуо-
ресценцію, внаслідок чого в спектрі ФМЄ спосте-
рігаються дві смуги – зелено-блакитна (N*) і
жовто-руда (T*). Положення і інтенсивність цих
смуг залежать від полярності, протондонорної
здатності і гливкості середовища [14, 15, 20]. ФМЄ
вигідно вирізняється серед інших класів флуо-
ресцентних зондів тим, що дозволяє одночасно
визначати такі фізичні параметри оточення, як
Ін
те
нс
ив
ні
ст
ь
ф
лу
ор
ес
це
нц
ії,
у
м
. о
д
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
,
un
its
Довжина хвилі, нм Wavelength, nm
Ін
те
нс
ив
ні
ст
ь
ф
лу
ор
ес
це
нц
ії,
у
м
. о
д
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
,
un
its
Довжина хвилі, нм Wavelength, nm
Рис. 4. Спектри флуоресценції зонда Є-176 в сперма-
тозоїдах собаки в присутності ДМФА і ЕГ:а) 1 –
середовище + Є-176; 2 – середовище + Є-176+ДМФА;
3 – сперматозоїди + Є-176 + ДМФА; б) 1 – середовище +
Є-176; 2 – середовище + Є-176 + ЕГ; 3 – сперматозоїди +
Є-176 + ЕГ. Концентрація Є-176 – 4,5×10-6 моль/л.
Fig. 4. E-176 fluorescence probe spectra in canine sperma-
tozoa in DMFA and EG presence: a) 1 – medium + E-176; 2 –
medium + E-176 + DMFA; 3 – spermatozoa + E-176 + DMFA;
b) 1 – medium + E-176; 2 – medium + E-176 + EG; 3 – sper-
matozoa + E-176 + EG; E-176 concentration is 4.5×10-6 mol/l
локальна діелектрична проникність середовища і
коефіцієнт рефракції, а також надає можливість
відрізняти полярність оточення, яку спричинено
утворенням водневих зв’язків, від неспецифічних
міжмолекулярних взаємодій [20]. Дані про
флуоресцентні властивості зонда ФМЄ дозволяють
з високою точністю описувати зміни, що від-
буваються в його мікрооточенні [21].
На рис. 1, в спостерігається змішана флуорес-
ценція обох форм N* і T* смуг, що підтверджується
спектрами флуоресценції цих зразків. Із спектрів,
наведених на рис. 5, а, можна бачити, що при
зв’язуванні зі сперматозоїдами зонд ФМЄ має
двосмугову флуоресценцію з максимумом при 564
нм (відповідає емісії форми Т*) і плечем у ділянці
501 нм (форма N*). У цілому сполучення ФМЄ з
різними ділянками спермальної клітини призводить
до збільшення інтенсивності його світіння і
проявлення двох смуг в спектрі флуоресценції.
У присутності КП інтенсивність флуоресценції
ФМЄ, який знаходиться у розчині, зростає, однак
залишається майже на порядок менше, ніж
аналогічний показник для ФМЄ, зв’язаного зі
сперматозоїдами внаслідок меншої гливкості
мікрооточення. Спектр вільного зонда в усіх
випадках залишається односмуговим, що свідчить
про високу концентрацію молекул води в оточенні
зонда.
При доданні КП до суспензії сперматозоїдів
двосмугова форма спектра ФМЄ зберігається. Це
свідчить про те, що барвник залишається зв’яза-
ним з клітинами. При цьому змінюються співвідно-
шення інтенсивностей смуг N* і T* флуоресценції
ФМЄ, а також положення їх максимумів: довго-
хвильова смуга Т* зсувається в короткохвильовий
бік, а короткохвильова N* в присутності ЕГ –
приблизно на 2 нм в довгохвильову сторону, а при
наявності ДМФА змінюється ще менше. Подібні
зміни у положенні спектральних смуг характерні
для зростання концентрації води в мікрооточенні
зонда, зв’язаного з клітинними структурами [21], і
можуть бути використані для оцінки впливу різних
КП на гідратацію клітин.
а а
б b
0
10
20
30
40
50
450 500 550 600
1
2
3
1
2
3
mental physical parameters as local dielectric permea-
bility of medium refraction coefficient as well as it
enables to differentiate the polarity of environment
caused by the creation of hydrogen bonds from
intermolecular interactions [20]. Data on fluorescent
properties of FME probe allow with a high accuracy
to describe the changes in its environment [21].
Fig. 1 shows mixed fluorescence of both forms N*
and T* bonds that is confirmed with the fluorescence
spectra of these samples. The spectra demonstrated
in Fig. 5, a, show that during binding with spermatozoa
FME probe has two-band fluorescence with the
maximum at 564 nm (corresponds to T* form emission)
0
5
10
15
20
25
30
35
500 550 600 650 700 750
20 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №1
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №1
Ін
те
нс
ив
ні
ст
ь
ф
лу
ор
ес
це
нц
ії,
у
м
. о
д
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
,
un
its
Довжина хвилі, нм Wavelength, nm
Ін
те
нс
ив
ні
ст
ь
ф
лу
ор
ес
це
нц
ії,
у
м
. о
д
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
,
un
its
Довжина хвилі, нм Wavelength, nmа а
б b
0
10
20
30
40
50
450 500 550 600 650 700
1
2
4
5
6
Рис. 5. Вплив кріопротекторів на спектри флуоресценції
ФМЄ (а) і 3-ДАБ (б) в середовищі інкубації і сперма-
тозоїдах собак: 1 – середовище інкубації; 2 – середо-
вище + 5% ЕГ; 3 – середовище + 5% ДМФА; 4 –
сперматозоїди (контроль); 5 – сперматозоїди + 5% ЕГ;
6 – сперматозоїди + 5% ДМФА. Концентрація барвників:
ФМЄ – 4,1×10-6 моль/л, 3-ДАБ – 7,3×10-6 моль/л.
Fig. 5. Effect of cryoprotectants on fluorescents spectra of
FME (a) and 3-DAB (b) in incubation medium and canine
sperm: 1 – incubation medium; 2 – medium + 5% EG; 3 –
medium + 5% DMFA; 4 – spermatozoa (control); 5 –
spermatozoa + 5% EG; 6 – spermatozoa + 5% DMFA.
Concentration of dyes: FME – 4.1×10-6 mol/l, 3-DAB –
7.3×10-6 mol/l.
4
5
6
and shoulder in the area of 501 nm (N* form).
Generally FME binding with various areas of sperm
cell results in an increase in its luminescence intensity
and revealing two bands in fluorescence spectrum.
In cryoprotectant presence FME fluorescence
intensity being in a solution enhances but it is kept almost
one order less than analogous index for FME of bound
with spermatozoa due to lower viscosity of micro-
environment. Spectrum of free probe in all cases
remains one-band that testifies to a high concentration
of water molecules in probe environment.
When adding cryoprotectant to suspension of
spermatozoa the FME spectrum two-band form is kept.
This testifies to the fact that dye remains cell-bound.
Herewith the ratio of intensities for FME fluorescence
N* and T* is altered, bands as well as position of their
maxima: long wave band T* is shifted towards short
waves and the short-wave one N* in EG presence
towards long wave one approximately by 2 nm and in
DMFA presence is even less changed. Similar changes
in position of spectral bands are characteristic for rising
in concentration of water in probe microenvironment
bound with cell structures [2] and may be used to
estimate the influence of various cryoprotectants on
cell hydration.
New dye 3-DAB being benzatron derivative has
two-band fluorescence both in the incubation medium
of spermatozoa and during binding with cells (Fig. 5,
b). In latter case fluorescence short-wave band prevails
with the maximum at 590-596 nm. Intensity of both
bonds is quite similar for the probe being in the solution
of more hydrophobic DMFA. During binding with
spermatozoa there is observed the rise in fluorescence
intensities almost in 3.5 times with no essential changes
in spectrum position. Taking into account that the probe
in its structure has hydrophobic benzol rings one may
suppose that it is localized at the beginning of non-
polar site of cell membrane lipids. In the presence of
examined cryoprotectants in 3-DAB fluorescence
spectra on a background of general decrease in
fluorescence intensity there are found the changes of
the contribution into spectrum of long wave band that
points to the alterations in the number of water
Новий барвник 3-ДАБ, який є похідним бен-
зантрону, має двосмугову флуоресценцію як в
середовищі інкубації сперматозоїдів, так і при
зв’язуванні з клітинами (рис. 5, б). В останньому
випадку переважає короткохвильова смуга флуо-
ресценції з максимумом при 590-596 нм. Інтен-
сивність обох смуг майже однакова для зонда, який
знаходиться в розчині більш гідрофобного КП
ДМФА. При зв’язуванні зі сперматозоїдами
спостерігається зростання інтенсивності флуо-
ресценції майже в 3,5 рази без суттєвих змін
положення спектра. Враховуючи, що зонд має в
своїй структурі гідрофобні бензольні кільця, можна
припустити, що він локалізується на початку
неполярної ділянки ліпідів мембран клітин. У
присутності досліджених КП в спектрах флуо-
ресценції 3-ДАБ на фоні загального зниження
інтенсивності флуоресценції спостерігаються зміни
внеску в спектр довгохвильової смуги, що вказує
на зміни кількості молекул води в мікрооточенні
зонда. Ці результати збігаються з даними,
отриманими за допомогою зонда ФМЄ, і дозво-
3
2
3
1
21 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №1
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №1
дноЗ
eborP
ещиводереС
muideM
лК і инит
slleC
ГЕ+ещиводереС
GE+muideM
лК і ГЕ+инит
GE+slleC
+ещиводереС
АФМД
AFMD+muideM
лК і АФМД+инит
AFMD+slleC
F
м λ
м
F
м λ
м
F
м λ
м
F
м λ
м
F
м λ
м
F
м λ
м
МСД
MSD - - 62 995 42 706 92 506 55 806 46 706
-Є 671
E- 671 13 745 31 635 43 745 74 045 54 545 74 045
3- БАД
BAD-3 11 695 83 695 9 395 13 395
5
5
085
586 71 195
МФ Є
EMF
01
-
065
-
23
84
105
465
01
-
955
-
22
23
305
365
9
-
055
-
61
22
005
165
Таблиця 2. Зміни спектрів флуоресценції барвників в середовищі інкубації спераматозоїдів
собаки під впливом КП
Table 2. Changes in fluorescent dyes spectra in incubation media of canine spermatozoa under cryoprotectant effect
Примітки: Fм – інтенсивність флуоресценції, ум. од.; λм – положення максимуму спектра, нм. Похибка у визначенні
положення максимумів спектрів не перевищувала ±2 нм.
Notes: Fm – fluorescence intensity, rel. units; λm- spectrum maximum position, nm; deviation in spectra maxima positions
did not exceed ±2 nm.
molecules in probe microenvironment. These results
are in accordance with the data obtained with FME
probe and enable to consider 3-DAB as the probe
capable of examining spermatozoa hydration in pre-
sence of cryoprotectants. Moreover with 3-DAB probe
the hydration-caused spectral effects are more
manifested.
The effect of cryoprotectants on basic spectral
parameters of the studied dyes in incubation medium
and in canine spermatozoa is presented in Table 2.
Conclusions
The researches performed have shown that 3-
hydroxyflavone derivatives (new multi-parameter
probe FME) and benzantron (new dye 3-DAB) are
perspective for studying molecular mechanisms of the
effect of cryoprotective additives on canine sper-
matozoa. At the same time pyridine derivative, DSM
probe and new dye E-176 have limitations if they are
used to examine spermatozoa in solutions of
cryoprotectants because of quite strong background
fluorescence.
Revealed influence of dyes on spermatozoa motility
from our point of view is not the factor restricting their
use to estimate molecular mechanisms of interaction
of cryoprotectants with structural elements of cells,
moreover that they frequently are capable of toxic
effect on cells [7-9]. If necessary the effect of
spermatozoa motility decrease may be significantly
reduced with both diminishing the concentration of
dyes in suspension of cells and with the shortening the
incubation time for cells with dyes.
The work was supported by National Academy of
Sciences of Ukraine (Grant 0104U003916)
ляють розглядати 3-ДАБ як зонд, придатний для
вивчення гідратації сперматозоїдів у присутності
КП. Причому з зондом 3-ДАБ спектральні ефекти,
спричинені гідратацією, виражені більше.
Вплив КП на основні спектральні параметри
досліджуваних барвників в середовищі інкубації і
в сперматозоїдах собаки показано в табл. 2.
Висновки
Проведені дослідження показали, що похідні 3-
гідроксифлавону (новий мультипараметричний
зонд ФМЄ) і бензантрону (новий барвник 3-ДАБ)
мають перспективи для вивчення молекулярних
механізмів впливу кріозахисних додатків на
сперматозоїди собаки. У той же час похідна
піридину – зонд ДСМ і новий барвник Є-176 мають
обмеження при використанні їх для дослідження
сперматозоїдів у розчинах КП внаслідок досить
сильної фонової флуоресценції.
Виявлений вплив барвників на рухливість
сперматозоїдів, на наш погляд, не є фактором, який
обмежує їх застосування для оцінки молекулярних
механізмів взаємодії КП із структурними елемен-
тами клітин, тим більше, що КП часто здатні
спричиняти токсичну дію на клітини [7-9]. При
необхідності ефект зниження рухливості сперма-
тозоїдів у присутності флуоресцентних барвників
може бути суттєво знижений як зменшенням
концентрації барвників у суспензії клітин, так і
скороченням часу інкубації клітин з барвниками.
Робота виконана при підтримці НАН України (грант
0104U003916).
22 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №1
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №1
Література
Вайсбергер А., Проскауэр Э., Роддик Д., Тупс Э.
Органические растворители. – М.: “Химия”, 1968.– 1450 с.
Горбенко Г.П., Дюбко Т.С. Взаимодействие 4-(N-диметил-
аминостирил)-1-метилпиридиний -N-толуолсульфоната
с липосомами: анализ спектров флуоресценции //
Биофизика.– 1996.– Т. 41, №2.– С. 348-354.
Горбенко Г.П., Нардид О.А., Дюбко Т.С. Применение
анализа неоднородного уширения спектров флуоресцен-
ции ДСМ для исследования структурных изменений
модельных и природных мембран // Біофізичний вісник.–
1998.– Вип. 1.– С. 86-95.
Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании
клеток, мембран и липопротеинов.– М.: Наука, 1989.–
277 с.
Землянских Н.Г., Бабийчук Л.А., Дюбко Т.С. Криоконсер-
вирование эритроцитов с непроникающим криопротек-
тором ПЭО-1500. Изучение взаимодействий криопротек-
тора с мембраной при различных температурах //
Гематологія і переливання крові (Міжвідомчий збірник).–
Вип. 32, Ч. 1.– Харків: НТМТ, 2004.– С. 45-52.
Лакин Г.Ф. Биометрия.– М.: Высш. школа, 1990.– 352 с.
Линник Т.П., Бизикина О.В. Криоконсервирование
спермы петухов. I. Цитотоксичность диолов и амидов //
Пробл. криобиологии.– 2001.– №2.– С. 72-79.
Линник Т.П., Бизикина О.В. Криоконсервирование
спермы петухов. II. Криозащитная активность диолов и
амидов // Пробл. криобиологии.– 2001.– №4.– С. 43-51.
Линник Т.П. Физико-химические факторы криопов-
реждения и криозащиты сперматозоидов петухов в цикле
низкотемпературного консервирования: Автореф.
дис. ... докт. биол. наук.– Харьков, 2003.– 36 с.
Лисиченко Н.Л., Ромоданова Э.А., Нардид О.А. и др.
Структурные изменения в компонентах спермы хряка
при воздействии малых доз лазерного излучения //
Фотобиология и фотомедицина.– 2000.– №3-4.– С. 86-89.
Нардид О.А., Дюбко Т.С. Изменения центров сорбции
ДСМ в тенях эритроцитов после действия низкой темпе-
ратуры // Пробл. криобиологии.– 1999.– №1.– С. 26-31.
Протива М. Очистка растворителей // Лабораторная
техника органической химии.– М.: Мир, 1966.– С. 591-
615.
Федюняева И.А., Шершуков В.М. Производные 4-(5-орил-
2-оксазолил)бензолсульфокислоты , содержащие
диметиламиногруппу // Химия гетероциклических
соединений.– 1993.–№2.– С. 234-237.
Chou P.-T., Martinez M. L., Clements J.-H. Reversal of
excitation behavior of proton-transfer vs. charge-transfer
by dielectric perturbation of electronic manifolds // J. Phys.
Chem.– 1993.– Vol. 97, N4.– P. 2618-2622.
Duportail G., Klymchenko A., Mely Y., Demchenko A.. Neutral
Јuorescence probe with strong ratiometric response to
surface charge of phospholipid membranes // FEBS Letters.–
2001.– Vol. 508, N1 – P. 196-200.
Dyubko T.S., Nardid O.A., Gorbenko G.P. Study of structural
changes in hepatocyte membranes using inhomogeneous
broadening analysis of DSM fluorescence spectra // Functional
Materials.– 1996.– Vol. 3, N4.– P. 492-495.
England G. C. W. Cryopreservation of dog semen: a review //
J. Reprod. Fertil.– 1993.– Vol.47, N1.– Р. 243–255.
Ercelen S., Klymchenko A.S., Demchenko A.P. Novel two-
color fluorescence probe with extreme specifity to bovine
serum albumin // FEBS Letters.– 2003.– Vol. 538, N1.–
P. 25-28.
Ercelen S., Klymchenko A.S., Demchenko A.P. Ultrasensitive
fluorescent probe for the hydrophobic range of solvent
polarities // Anal. Chim. Acta.– 2002.– Vol. 464, N1.–
P. 273-287.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
References
Vajsberg A., Proskauer E., Roddik D., Tups E. Organic
dissolvents.– Moscow: Khimiya, 1968.– 1450p.
Gorbenko G.P., Dyubko T.S. Interaction of 4-(N-di-
methylaminostiryl)-1-methylpyridine-N-toluolsulfonat with
liposomes: analysis of fluorescence spectra // Biofizika.–
1996.– Vol. 41, N2.– P. 86-95.
Gorbenko G.P., Nardid O.A., Dyubko T.S. Application of
analysis of inhomogeneous broadening of DSM fluorescence
spectra to investigate structural changes in model and natural
membranes // Biofizychnyj visnyk.– 1988.– Issue 1.– P. 86-95.
Dobretsov G.E. Fluorescent probes in studying cells,
membranes and lipoproteins.– Moscow: Nauka, 1989.– 277p.
Zemlyanskikh N.G., Babijchuk L.A., Dyubko T.S. Cryopreser-
vation of erythrocytes with non-penetrating cryoprotectant
PEO-1500. Investigation of interactions of cryoprotectant with
membrane at various temperatures // Gematologiya i
perelivanie krovi (interdepartmental collection of papers) –
Issue 32, part 1.– Kharkiv: NTMT, 2004.– P. 45-52.
Lakin G.F. Biometry.– Moscow: Vysshaya shkola, 1990.–
352 p.
Linnik T.P., Bizikina O.V. Cryopreservation of fowl sperm.
1. Cytotoxicity of diols and amides // Problems of Cryobiology.–
2001.– N2.– P. 72-79.
Linnik T.P., Bizikina O.V. Cryopreservation of fowl sperm.
1. Cryoprotective activity of diols and amides // Problems of
Cryobiology.– 2001.– N4.– P. 43-51.
Linnik T.P. Physical and chemical factors of cryodamage
and cryoprotection of fowl spermatozoa in the cycle of low
temperature preservation: author’s thesis for doctor of biol.
sci. degree.– Kharkov, 2003.– 36 p.
Lisichenko N.L., Romodanova E.A., Nardid O.A. et al.
Structural changes in sperm components of hog at the effect
of low irradiation doses // Fotobiologiya i fotomeditsyna.–
2000.– N3-4.– P. 86-89.
Nardid O.A., Dyubko T.S. Change sin centers of DSM sorption
in erythrocyte ghosts after low temperature effect // Problems
of Cryobiology.– 1999.– N1.– P. 26-31.
Protiva M. Purification of dissolvents. Laboratory technique
of organic chemistry.– Moscow: Mir, 1966.– P. 591-615.
Fedyunyaeva I.A., Shershukov V.M. Derivatives of 4-(5-oryl-
2oxazolyl)benzene sulphonic acid, containing dimethyl amino
group // Khimiya geterociklicheskikh soyedineniy.– 1993.–
Issue 2.– P. 234-237.
Chou P. -T., Martinez M. L., Clements J.-H. Reversal of
excitation behavior of proton-transfer vs. charge-transfer
by dielectric perturbation of electronic manifolds // J. Phys.
Chem.– 1993.– Vol. 97, N4.– P. 2618-2622.
Duportail G., Klymchenko A., Mely Y., Demchenko A.. Neutral
Јuorescence probe with strong ratiometric response to
surface charge of phospholipid membranes // FEBS Letters.–
2001.– Vol. 508, N1 – P. 196-200.
Dyubko T.S., Nardid O.A., Gorbenko G.P. Study of structural
changes in hepatocyte membranes using inhomogeneous
broadening analysis of DSM fluorescence spectra // Functional
Materials.– 1996.– Vol. 3, N4.– P. 492-495.
England G. C. W. Cryopreservation of dog semen: a review //
J. Reprod Fertil.– 1993.– Vol.47, N1.– Р. 243–255.
Ercelen S., Klymchenko A.S., Demchenko A.P. Novel two-
color fluorescence probe with extreme specifity to bovine
serum albumin // FEBS Letters.– 2003.– Vol. 538, N1.– P. 25-28.
Ercelen S., Klymchenko A.S., Demchenko A.P. Ultrasensitive
fluorescent probe for the hydrophobic range of solvent
polarities // Anal. Chim. Acta.– 2002.– Vol. 464, N1.–
P. 273-287.
Klymchenko A.S., Demchenko A.P. Multiparametric probing
of intermolecular interactions with fluorescent dye exhibiting
excited state intramolecular proton transfer // Phys. Chem.
Chem. Phys.– 2003.– Vol. 5, N2.– P. 461-468.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Klymchenko A.S., Demchenko A.P. Multiparametric probing
of intermolecular interactions with fluorescent dye exhibiting
excited state intramolecular proton transfer // Phys. Chem.
Chem. Phys.– 2003.– Vol. 5, N2.– P. 461-468.
Klymchenko A. S., Duportail G., Demchenko A. P., Mely Y.
Bimodal Distribution and Fluorescence Response of
Environment-Sensitive Probes in Lipid Bilayers // Biophys.
J.– 2004.– Vol. 86, N4.– P. 2929-2941.
Olar T. T., Bower R. A., Pickett B. W. Influence of extender
cryopreservation and seminal processing procedures on
postthaw motility of canine spermatozoa frozen in straws //
Theriogenology.– 1988.– Vol. 31, N2.– P. 134-142.
Ormson S. M., Brown R. G., Vollmer F., Rettig W. Switching
between charge- and proton-transfer emission in the excited
state of a substituted 3-hydroxyflavone // J. Photochem.
Photobiol. A: Chem.– 1994.– Vol. 81, N1.– P. 65-72.
Надійшла 14.12.2004
20.
21.
22.
23.
Klymchenko A.S., Duportail G., Demchenko A.P., Mely Y.
Bimodal Distribution and Fluorescence Response of
Environment-Sensitive Probes in Lipid Bilayers // Biophys.
J.– 2004.– Vol. 86, N4.– P. 2929-2941.
Olar T. T., Bower R. A., Pickett B. W. Influence of extender
cryopreservation and seminal processing procedures on
postthaw motility of canine spermatozoa frozen in straws //
Theriogenology.– 1988.– Vol. 31, N2.– P. 134-142.
Ormson S. M., Brown R. G., Vollmer F., Rettig W. Switching
between charge- and proton-transfer emission in the excited
state of a substituted 3-hydroxyflavone // J. Photochem.
Photobiol. A: Chem.– 1994.– Vol. 81, N1.– P. 65-72.
Accepted in 14.12.2004
21.
22.
23.
23 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 16, 2006, №1
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 16, 2006, №1
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-136639 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:56:23Z |
| publishDate | 2006 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Єгоров, М.І. Дюбко, Т.С. Ліннік, Т.П. Білоножко, О.П. Єрмоленко, І.Г. Семенова, О.Н. Паценкер, Л.Д. Пивоваренко, В.Г. Поврозін, Є.А. 2018-06-16T14:48:15Z 2018-06-16T14:48:15Z 2006 Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах / М.І. Єгоров, Т.С. Дюбко, Т.П. Ліннік, О.П. Білоножко, І.Г. Єрмоленко, О.Н. Семенова, Л.Д. Паценкер, В.Г. Пивоваренко, Є.А. Поврозін // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 1. — С. 13-23. — Бібліогр.: 23 назв. — укр. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/136639 611. 013. 11: 636. 082. 11. 57.043 Методами флуоресцентної спектроскопії і мікроскопії досліджували можливості застосування флуоресцентних барвників ДСМ, Є-176, 3-ДАБ, ФМЄ для вивчення впливу кріозахисних речовин на сперматозоїди собаки. Установлено, що барвники ФМЄ і 3-ДАБ придатні для розв’язання поставленої задачі, а барвники ДСМ і Є-176 мають обмеження внаслідок достатньо сильної флуоресценції розчинів кріопротекторів. Показано, що досліджувані флуоресцентні барвники по-різному впливають на рухомість клітин. Методами флуоресцентной спектроскопии и микроскопии исследовали возможности флуоресцентных красителей ДСМ, Е-176, 3-ДАБ, ФМЕ для изучения влияния криозащитных веществ на сперматозоиды собаки. Установлено, что красители ФМЕ и 3-ДАБ применимы для решения поставленной задачи, а ДСМ и Е-176 имеют ограничения в результате достаточно сильной флуоресценции растворов криопротекторов. Показано, что исследуемые флуоресцентные красители по-разному влияют на подвижность клеток. Possibilities of using DSM, E-176, 3-DAB, FME fluorescent dyes for examining the effect of cryoprotective agents on canine spermatozoa were studied with the methods of fluorescent spectroscopy and microscopy. FME and 3-DAB dyes were found to be capable of solving the tasks set and DSM, E-176 ones had a limitation due to quite a strong fluorescence of cryoprotectants’ solutions. Studied fluorescent dyes were demonstrated as differently affecting cell motility. uk Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах New fluorescent dyes as fluorescent probes for examination of canine spermatozoa in cryoprotective media Article published earlier |
| spellingShingle | Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах Єгоров, М.І. Дюбко, Т.С. Ліннік, Т.П. Білоножко, О.П. Єрмоленко, І.Г. Семенова, О.Н. Паценкер, Л.Д. Пивоваренко, В.Г. Поврозін, Є.А. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах |
| title_alt | New fluorescent dyes as fluorescent probes for examination of canine spermatozoa in cryoprotective media |
| title_full | Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах |
| title_fullStr | Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах |
| title_full_unstemmed | Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах |
| title_short | Нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах |
| title_sort | нові флуоресцентні барвники як зонди для дослідження сперматозоїдів собак у кріозахисних середовищах |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/136639 |
| work_keys_str_mv | AT êgorovmí novífluorescentníbarvnikiâkzondidlâdoslídžennâspermatozoídívsobakukríozahisnihseredoviŝah AT dûbkots novífluorescentníbarvnikiâkzondidlâdoslídžennâspermatozoídívsobakukríozahisnihseredoviŝah AT línníktp novífluorescentníbarvnikiâkzondidlâdoslídžennâspermatozoídívsobakukríozahisnihseredoviŝah AT bílonožkoop novífluorescentníbarvnikiâkzondidlâdoslídžennâspermatozoídívsobakukríozahisnihseredoviŝah AT êrmolenkoíg novífluorescentníbarvnikiâkzondidlâdoslídžennâspermatozoídívsobakukríozahisnihseredoviŝah AT semenovaon novífluorescentníbarvnikiâkzondidlâdoslídžennâspermatozoídívsobakukríozahisnihseredoviŝah AT pacenkerld novífluorescentníbarvnikiâkzondidlâdoslídžennâspermatozoídívsobakukríozahisnihseredoviŝah AT pivovarenkovg novífluorescentníbarvnikiâkzondidlâdoslídžennâspermatozoídívsobakukríozahisnihseredoviŝah AT povrozínêa novífluorescentníbarvnikiâkzondidlâdoslídžennâspermatozoídívsobakukríozahisnihseredoviŝah AT êgorovmí newfluorescentdyesasfluorescentprobesforexaminationofcaninespermatozoaincryoprotectivemedia AT dûbkots newfluorescentdyesasfluorescentprobesforexaminationofcaninespermatozoaincryoprotectivemedia AT línníktp newfluorescentdyesasfluorescentprobesforexaminationofcaninespermatozoaincryoprotectivemedia AT bílonožkoop newfluorescentdyesasfluorescentprobesforexaminationofcaninespermatozoaincryoprotectivemedia AT êrmolenkoíg newfluorescentdyesasfluorescentprobesforexaminationofcaninespermatozoaincryoprotectivemedia AT semenovaon newfluorescentdyesasfluorescentprobesforexaminationofcaninespermatozoaincryoprotectivemedia AT pacenkerld newfluorescentdyesasfluorescentprobesforexaminationofcaninespermatozoaincryoprotectivemedia AT pivovarenkovg newfluorescentdyesasfluorescentprobesforexaminationofcaninespermatozoaincryoprotectivemedia AT povrozínêa newfluorescentdyesasfluorescentprobesforexaminationofcaninespermatozoaincryoprotectivemedia |