Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации

Рассмотрен метод исследования замороженных растворов криопротекторов, клеточных суспензий и тканей, основанный на измерении их пластической деформации в режиме непрерывно повышающейся температуры в интервале -196…20⁰C при постоянной внешней нагрузке. Данным методом определены температуры расстеклова...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2005
Автори:	Осецкий, А.И., Кирилюк, А.Л., Гурина, Т.М.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2005
Назва видання:	Проблемы криобиологии и криомедицины
Теми:	Теоретическая и экспериментальная криобиология
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137046
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации / А. И. Осецкий, А. Л. Кирилюк, Т. М. Гурина // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 2. — С. 137-146. — Бібліогр.: 5 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-137046
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1370462025-02-09T20:06:58Z Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации Study of devitrification kinetics of cryoprotectant aqueous solutions using thermoplastic deformation method Осецкий, А.И. Кирилюк, А.Л. Гурина, Т.М. Теоретическая и экспериментальная криобиология Рассмотрен метод исследования замороженных растворов криопротекторов, клеточных суспензий и тканей, основанный на измерении их пластической деформации в режиме непрерывно повышающейся температуры в интервале -196…20⁰C при постоянной внешней нагрузке. Данным методом определены температуры расстеклования Тg водных растворов таких криопротекторов, как глицерин, ДМСО, ПЭО-1500 в широком диапазоне концентраций. Впервые определены значения Тg в интервале концентраций 5…15% (вес/вес). Розглянуто метод дослідження заморожених розчинів кріопротекторів, клітинних суспензій та тканин, заснований на вимірюванні їх пластичної деформації у режимі, коли температура безперервно підвищується в інтервалі -196…20⁰C при постійному зовнішньому навантаженні. Даним методом визначено температури розсклування Тg водних розчинів таких кріопротекторів, як гліцерин, ДМСО, ПЕО-1500 у широкому діапазоні концентрацій. Уперше визначено значення Тg в інтервалі концентрацій 5...15% (вага/вага). There was considered the method for investigating frozen solutions of cryoprotectants, cell suspensions and tissues, based on measuring their plastic deformation in the regimen of continuously increasing temperature within the range of -196…20⁰C at a constant external load. Using this method the devitrification temperatures Tg of aqueous solutions of such cryoprotectants as glycerol, DMSO, PEO-1500 within a wide range of concentrations were determined. For the first time Tg values within 5…15% (weight/weight) concentrations range were found-out. 2005 Article Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации / А. И. Осецкий, А. Л. Кирилюк, Т. М. Гурина // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 2. — С. 137-146. — Бібліогр.: 5 назв. — рос. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137046 57.043:612.111:536.54 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология
spellingShingle	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Осецкий, А.И. Кирилюк, А.Л. Гурина, Т.М. Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации Проблемы криобиологии и криомедицины
description	Рассмотрен метод исследования замороженных растворов криопротекторов, клеточных суспензий и тканей, основанный на измерении их пластической деформации в режиме непрерывно повышающейся температуры в интервале -196…20⁰C при постоянной внешней нагрузке. Данным методом определены температуры расстеклования Тg водных растворов таких криопротекторов, как глицерин, ДМСО, ПЭО-1500 в широком диапазоне концентраций. Впервые определены значения Тg в интервале концентраций 5…15% (вес/вес).
format	Article
author	Осецкий, А.И. Кирилюк, А.Л. Гурина, Т.М.
author_facet	Осецкий, А.И. Кирилюк, А.Л. Гурина, Т.М.
author_sort	Осецкий, А.И.
title	Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации
title_short	Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации
title_full	Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации
title_fullStr	Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации
title_full_unstemmed	Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации
title_sort	изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2005
topic_facet	Теоретическая и экспериментальная криобиология
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137046
citation_txt	Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации / А. И. Осецкий, А. Л. Кирилюк, Т. М. Гурина // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 2. — С. 137-146. — Бібліогр.: 5 назв. — рос.
series	Проблемы криобиологии и криомедицины
work_keys_str_mv	AT oseckiiai izučeniekinetikirassteklovaniâvodnyhrastvorovkrioprotektorovmetodomtermoplastičeskoideformacii AT kirilûkal izučeniekinetikirassteklovaniâvodnyhrastvorovkrioprotektorovmetodomtermoplastičeskoideformacii AT gurinatm izučeniekinetikirassteklovaniâvodnyhrastvorovkrioprotektorovmetodomtermoplastičeskoideformacii AT oseckiiai studyofdevitrificationkineticsofcryoprotectantaqueoussolutionsusingthermoplasticdeformationmethod AT kirilûkal studyofdevitrificationkineticsofcryoprotectantaqueoussolutionsusingthermoplasticdeformationmethod AT gurinatm studyofdevitrificationkineticsofcryoprotectantaqueoussolutionsusingthermoplasticdeformationmethod
first_indexed	2025-11-30T09:48:30Z
last_indexed	2025-11-30T09:48:30Z
_version_	1850208273681088512
fulltext	137 УДК 57.043:612.111:536.54 Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации А.И.ОСЕЦКИЙ, А.Л. КИРИЛЮК, Т.М.ГУРИНА Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Study of Devitrification Kinetics of Cryoprotectant Aqueous Solutions Using Thermoplastic Deformation Method A.I. OSETSKY, A.L. KIRILYUK, T.M. GURINA Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov Рассмотрен метод исследования замороженных растворов криопротекторов, клеточных суспензий и тканей, основанный на измерении их пластической деформации в режиме непрерывно повышающейся температуры в интервале -196…200C при постоянной внешней нагрузке. Данным методом определены температуры расстеклования Тg водных растворов таких криопротекторов, как глицерин, ДМСО, ПЭО-1500 в широком диапазоне концентраций. Впервые определены значения Тg в интервале концентраций 5…15% (вес/вес). Ключевые слова: термопластическая деформация, температура расстеклования, криопротектор, ДМСО, ПЭО-1500, глицерин. Розглянуто метод дослідження заморожених розчинів кріопротекторів, клітинних суспензій та тканин, заснований на вимірюванні їх пластичної деформації у режимі, коли температура безперервно підвищується в інтервалі -196…200C при постійному зовнішньому навантаженні. Даним методом визначено температури розсклування Тg водних розчинів таких кріопротекторів, як гліцерин, ДМСО, ПЕО-1500 у широкому діапазоні концентрацій. Уперше визначено значення Тg в інтервалі концентрацій 5...15% (вага/вага). Ключові слова: термопластична деформація, температура розсклування, кріопротектор, ДМСО, ПЕО-1500, гліцерин. There was considered the method for investigating frozen solutions of cryoprotectants, cell suspensions and tissues, based on measuring their plastic deformation in the regimen of continuously increasing temperature within the range of -196…20°C at a constant external load. Using this method the devitrification temperatures Tg of aqueous solutions of such cryoprotectants as glycerol, DMSO, PEO-1500 within a wide range of concentrations were determined. For the first time Tg values within 5…15% (weight/weight) concentrations range were found-out. Key-words: thermoplastic deformation, devitrification temperature, cryoprotectant, DMSO, PEO-1500, glycerol UDC 57.043:612.111:536.54 Адрес для корреспонденции: Осецкий А.И., Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38 (057) 373-38-71, факс: +38 (057) 373-30-84, e-mail: cryo@online.kharkov.ua Address for correspondence: Osetskiy A.I., Institute for Problems of Cryobiology&Cryomedicine of the Natl. Acad. Sci. of Ukraine, 23, Pereyaslavskaya str.,Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3871, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua Данные о температурных интервалах и осо- бенностях кинетики перехода водных растворов криопротекторных веществ из жидкого в твердое аморфное состояние очень важны для крио- биологии. Практика показывает, что без них невозможно разработать эффективные режимы охлаждения – нагрева и хранения криоконсер- вируемых биообъектов. Прежде всего это связано с тем, что к скорости изменения температуры криоконсервируемых биосистем, выше и ниже температуры стеклования Тg, предъявляются прямо противоположные требования. Выше температуры Тg как охлаждение, так и нагрев биообъектов в большинстве технологических подходов рекомендуется проводить с достаточно высокими скоростями [2]. Это позволяет предо- твратить контакт клеток с высококонцентри- рованными растворами, которые образуются в процессе роста внеклеточных кристаллов льда в замораживаемой суспензии клеток. Высокие скорости изменения температуры, ниже темпе- ратуры Тg, приводят к возникновению термоупругих Data about temperature intervals and kinetics peculiarities of transition of cryoprotective substances’ aqueous solutions from a liquid state into a solid amorphous one are very important for cryobiology. As practice shows, it is impossible to elaborate the efficient cooling-heating and storage regimens for cryopreserved bioobjects without their usage. First of all, this is related to the fact that the absolutely controversial demands are shown to the rate of temperature change of cryopreserved biosystems, being higher and lower than the Tg vitrification temperature. Both cooling and heating of bioobjects higher than the Tg temperature in most technological approaches are recommended to perform with quite high rates [2]. This enables to avoid the cell contact with highly concentrated solutions, which are formed during intracellular ice crystal growth in a frozen cell suspension. High rates of temperature change lower than the Tg one result in the formation of thermoelastic tensions of first grade [4], and, consequently in considerable mechanical damages of bioobjects as a result of plastic relaxation of these tensions. It is possible to reduce cell damaging ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №2 138 напряжений первого рода [4] и, как следствие, к значительным механическим повреждениям биообъектов в результате пластической релак- сации этих напряжений. Уменьшить повреждение клеток за счёт термоупругих напряжений можно снижением скоростей охлаждения и нагрева биообъектов при температурах, меньших тем- пературы Тg. Ясно, что подобрать оптимальный режим охлаждения или нагрева можно, если известна зависимость температуры стеклования Тg от концентрации криопротекторного вещества Скр, особенно в области малых значений Скр (5%≤Скр≤10%), так как именно эти концентрации часто используются в практической криобиологии. В указанном интервале концентраций крио- протектора жидкие фракции вблизи температуры стеклования существуют в виде небольших замк- нутых включений. Образование микрокристаллов льда в них с точки зрения сохранения биообъектов нежелательно как непосредственно до стеклова- ния внеклеточного криозащитного раствора, так и после расстеклования на этапе отогрева. Данные о зависимостях Тg=Тg(Скр) в интервале сравни- тельно небольших концентраций криопротекторов в литературе отсутствуют, что связано с большой сложностью их определения при обычно исполь- зуемых экспериментальных методах (ДСК, ЯМР и ЭПР) в диапазоне этих концентраций. В этой работе описывается новый метод определения зависимости Tg=Тg(Скр), который позволяет изме- рить значения Тg в широких концентрационных интервалах и одновременно исследовать пласти- ческие свойства замороженных биосистем, что необходимо при анализе причин их механического повреждения. Материалы и методы Физическую основу предлагаемого метода измерения температур стеклования можно рассмотреть на примере деформации в режиме сдвига модельного замороженного образца 1 вод- ного раствора криопротекторного вещества с типичной для температур, лежащих ниже темпе- ратуры стеклования, структурой (рис.1). Такой образец представляет собой смесь кристаллов льда разной формы и величины (фракция С), окруженных застекловавшейся аморфной фазой (фракция G). Отношение масс фракций С и G зависит от начальной концентрации криопро- текторного раствора. В процессе эксперимента замороженный образец 1 помещается в дефор- мационное устройство, состоящее из неподвижного 2 и подвижного 3 захватов и механизма нагружения 4 (рис. 1). С помощью этого механизма к образцу при температуре Т1<Тg прикладывается постоян- ное во времени сдвиговое усилие F1, удовлетворяю- due to thermoelastic tensions via decreasing cooling and heating rates of bioobjects under temperatures lower than Tg ones. Selection of optimal cooling or heating regimens is clearly possible if the dependency of vitrification temperature Tg on the concentration of cryoprotective substance Ccr is known, especially within the range of small Ccr values (5%≤Ccr≤10%), because namely these concentrations are frequently used in practical cryobiology. In the mentioned interval of cryoprotectant concentrations the liquid fractions near vitrification temperature exist as small closed inclusions. The formation of ice microcrystals in them with relation to bioobjects’ preservation is undesirable both right before vitrification of intracellular cryo- protective solution and after devitrification during thawing. There are no literature data about Tg=Tg(Ccr) dependencies in the interval of comparatively low cryoprotectant concentrations, that is related to a high difficulty of their determination when using the routine experimental methods (DSC, NMR and EPR) within the range of these concentrations. This work describes a new method of Tg=Tg(Ccr) for finding the dependency, enabling the measurement of Tg values in wide concentration intervals and a simultaneous investigation of plastic properties of frozen biosystems, that is important when analysing the reasons of their mechanical damaging. Materials and methods Physical grounds of the method proposed for measuring these vitrification temperatures can be considered as an example of deformation in shift regimen of a model frozen sample 1 of cryoprotective substance aqueous solution of a typical structure for temperatures, being under vitrification temperature (Fig. 1). Such a sample represents the mixture of ice crystals of different shape and dimension (fraction C), surrounded with a vitrified amorphous phase (fraction G). Weight ratio of fractions C and G depends on the initial concentration of cryoprotective solution. During experiment the frozen sample 1 is placed into deformation device, consisting of immobile 2 and mobile 3 grips and loading mechanism 4 (Fig.1). With this mechanism at the temperature T1<Tg the shearing force F1 is constantly applied, meeting the following condition: F1 < σfl (Т1)×S, (1) where σfl(Т1) is the fluidity limit of a frozen sample at temperature T1; S is a sample’s cross-section area in shear plane. After applying the force F1 to a sample its tem- perature is augmented with a certain constant rate 1T& , being within the limits of 1…5°C/min. At the same time when using differentially switched detector of ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №2 139 щее условию F1 < σтек (Т1)×S, (1) где σ тек(Т1) – предел текучести замороженного образца при температуре Т1; S – площадь поперечного сечения образца в плоскости сдвига. После приложения к образцу силы F1 его температуру увеличивают с некоторой постоянной скоростью 1T& , лежащей в пределах 1…5°С/мин. При этом с помощью дифференциально вклю- ченного датчика малых линейных перемещений 5 измеряется деформация сдвига образца ε, которая фиксируется регистрирующей системой 6 в координатах деформация – температура, ε = l h ∆ , (2) где ∆l – вертикальное смещение подвижного захвата 3, равное смещению сердечника датчика малых перемещений относительно его корпуса; h– ширина области сдвига, равная зазору между захватами. Типичный вид получаемых кривых ε=ε(T), которые мы называем термопластическими, показан на рис. 2. Данное название отражает тот факт, что деформация образца вызывается не увеличением приложенного к нему напряжения, как в классических экспериментах по физике пластич- ности, а исключительно увеличением температуры образца. Согласно термопластической кривой (рис. 2) пластическая деформация образца в интервале температур Т1…Тg отсутствует и кривая совпа- short linear displacements 5 the deformation of sample’s shift ε, recorded with the system 6 in deformation-temperature coordinates is measured: ε = l h ∆ , (2) where ∆l is a vertical shift of mobile grip 3, equal to the shift of detector core for small linear displacements in respect of its body; h is the shear range width, equal to a gap between grips. Type of the obtained curves ε=ε(T), which we define as thermoplastic ones is shown in Fig. 2. This definition reflects the fact, that the sample’s deformation is caused not by an increase in applied to it tension as in classic experiments on plasticity physics, but only when increasing the temperature of a sample. According to thermoplastic curve (Fig. 2) a plastic deformation of sample in T1… Tg temperature intervals is absent and the curve coincides with the B-B base line, stipulated by heat widening of sample and device elements. When achieving Tg temperature in sample the process of fraction G devitrification begins, resulting in a sharp change in mechanism of its plastic deformation. Plastic flow of a sample at T>Tg is realised not because of plastic shifts in ice crystals, as typical for T<Tg temperatures, but due to ice crystal shift in respect of each other on viscous liquid interlayers G. In this case the rate of a sample’s plastic flow is: η σ η ε = × =× ∆ ∆= S F ht l 1 & , (3) where η is dynamical viscosity; σ is deforming shift tensions in the area of viscous flow with h width. Рис.1. Схема деформации замороженного криопро- текторного раствора в режиме сдвига. Fig.1. Deformation scheme of frozen cryoprotective solu- tion in shift regimen. Рис.2. Типичный вид термопластической кривой замороженного криопротекторного раствора. Fig.2. Typical picture of thermoplastic curve of frozen cryo- protective solution. 6 4 5 3 C G 2 1 h ∆1 t1 t2 t3 T1 Tg T2 T3 Температура Т Temperature T Время t Time t 01 =ε& 2ε& 3ε& ε B B ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №2 140 дает с базовой линией В-В, обусловленной теп- ловым расширением образца и элементов уста- новки. При достижении температуры Тg в образце начинается процесс расстеклования фракции G, в результате которого резко меняется механизм его пластической деформации. Пластическое течение образца при Т>Тg реализуется не из-за пластичес- ких сдвигов в кристаллах льда, как это характерно для температур Т<Тg, а за счет смещения крис- таллов льда друг относительно друга по вязким жидким прослойкам G. В этом случае скорость пластического течения образца: η σ η ε = × =× ∆ ∆= S F ht l 1 & (3), где η – динамическая вязкость; σ– дефор- мирующие сдвиговые напряжения в зоне вязкого течения шириной h. В свою очередь динамическая вязкость:      += kT QexpA0η , (4) где Q – энергия активации вязкости; k – постоянная Больцмана; А0– нормировочный коэффициент. Подставляя выражения (3) и (4) в выражение (2) для скорости вязкого пластического течения ε& , получаем уравнение типа Аррениуса:      −= kT Qexp A0 σε& . (5) Согласно выражению (5) скорость пласти- ческого течения образца 1 сильно зависит от температуры, экспоненциально увеличиваясь с ее ростом. Это наглядно отражается на виде термопластической кривой ε=ε(T), представленной на рис.2. Наблюдаемое резкое увеличение ε& в диапазоне температур Т>Тg и связанное с этим отклонение кривой ε=ε(T) от базовой линии В-В позволяет определять температуру начала расстеклования фракций G с высокой точностью, которая значительно превосходит точность извест- ных экспериментальных методов. Более того, используя получаемые термопластические кривые, можно легко рассчитать энергию акти-вации вязкости Q, перестраивая термопласти-ческие кривые в координатах ε=ε(t), где t – время нагрева образца. Тогда, определяя графически скорости пластического течения образцов 2ε& и 3ε& при температурах Т2 и Т3 соответственно (рис. 2), для энергии активации вязкости получаем: 2 3 23 32 ln TT TkTQ ε ε & & − ×= . (6) In its turn the dynamical viscosity is      += kT QexpA0η , (4) where Q is energy of viscosity activation; k is Boltzmann constant; A0 is normalisation coefficient. If substituting expressions (3) and (4) into expression (2) for viscous plastic flow rate ε& we obtain the Arrhenius type equation:      −= kT Qexp A0 σε& . (5) According to expression (5) the rate of sample 1 plastic flow strongly depends on temperature and it is exponentially increased with temperature growth. It is visually reflected on type of thermoplastic curve (T), presented in the Fig. 2. Observed sharp increase of ε& within the range of temperatures T>Tg and related to this deviation of curve ε=ε(T) from a base B-B line enables the determining of temperature of devitrification beginning of G fractions with a high accuracy, which significantly surpasses the accuracy for the known experimental methods. In addition, when using the obtained thermoplastic curves, we can easily calculate the activation energy of viscosity Q, by rebuilding thermoplastic curves in coordinates ε=ε(T), where t is time of sample heating. Then, when graphically determining the rates of plastic flow of sample 2ε& and 3ε& at T2 and T3 temperatures, correspondingly, (Fig. 2) for viscosity activation energy we have as follows: 2 3 23 32 ln TT TkTQ ε ε & & − ×= . (6) Determination of Q value and its dependencies on temperature, solution concentration and type of cryoprotective substance provides the possibility to analyse not only kinetics of the observed viscous flow, but the mechanisms of different processes, occurring in amorphous fraction G after devitrification. Principal scheme of the device for thermoplastic deformation of frozen solutions of cryoprotectants and biological objects, which one modification is described in the paper [5], is presented in the Fig. 3. It consists of plunger deformation adapter, system of loading, sys- tem for temperature scanning and a block for thermo- plastic curves recording. Stainless steel plunger defor- mation adapter comprises the fixed on a pillar support 1 an immobile piston rod 2 and gliding on it internal 3, middle 4 and external 5 plunger plugs. At the same time an internal plug 3 with screw 6 and internal sup- porting fluoroplastic ring 7 is fixedly mounted in respect of rod 2. Moving middle plug 4 by means of hold-down luminaire 8 and external supporting fluoroplastic ring 9 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №2 141 Определение величины Q и ее зависимостей от температуры, концентрации раствора и типа криопротекторного вещества дает возможность анализировать не только кинетику наблюдаемого вязкого течения, но и механизмы различных процессов, которые происходят в аморфной фракции G после расстеклования. Принципиальная схема устройства для термо- пластической деформации замороженных раство- ров криопротекторов и биологических объектов, одна из модификаций которого описана в [5], показана на рис. 3. Оно состоит из плунжерной деформационной приставки, системы нагружения, системы сканирования температуры и блока регистрации термопластических кривых. Плун- жерная деформационная приставка, выполненная из нержавеющей стали, включает закрепленный на опорной колонне 1 неподвижный плунжерный шток 2 и скользящие по нему внутреннюю 3, среднюю 4 и внешнюю 5 плунжерные втулки. При этом внутрен- няя втулка 3 при помощи гайки 6 и внутреннего опорного фторопластового кольца 7 устанав- ливается неподвижно относительно штока 2. Подвижная средняя втулка 4 с помощью прижимного фонаря 8 и внешнего опорного фторопластового кольца 9 устанавливается во внешней втулке 5. Прижимной фонарь 8 силовой тягой 10 связан с механизмом нагружения, обеспечивающим приложение к замороженному исследуемому образцу постоянной во времени нагрузки F в широком диапазоне значений. При комнатной температуре исследуемые жидкие растворы 11 заливают в специальную форму, образованную тонкой силиконовой мембраной 12, натянутой на опорные кольца 7 и 9. Температура образца 11 в процессе эксперимента измеряется термометром сопротивления 13, конфигурация которого подоб- рана так, чтобы обеспечить оптимальный тепловой контакт с исследуемым образцом. Система сканирования температуры содержит нагреватели 14, блок подачи к исследуемому образцу паров жидкого азота 15 и связанный с термометром 13 автоматический регулятор темпе- ратуры 16. Для измерения пластической дефор- мации исследуемых образцов устройство снабже- но дифференциальным датчиком пере-ещения, установленным так, что его корпус 17 связан с си- ловой тягой 10, а сердечник 18 с толкателем 19, установленным на плунжерном штоке 2. Сигналы от датчика перемещения и регулятора темпера- туры 16 фиксируются компьютерной регистри- рующей системой 20. Заливаются исследуемые растворы в дефор- мационную приставку при комнатной температуре, после чего она помещается в криостат 21 и охлаж- дается вместе с исследуемым раствором до за- Рис. 3. Принципиальная схема устройства для термо- пластической деформации замороженных растворов криопротекторов и биологических систем. Fig. 3. Principal scheme of device for thermoplastic defor- mation of frozen solutions of cryoprotectants and biologi- cal systems. is mounted in external plug 5. Hold-down luminaire 8 by means of force draught 10 is connected to loading mechanisms, providing the application of a constant in time load F to frozen studied sample within a wide range of values. At room temperature the studied liquid solutions 11 are placed into a special form, formed by a thin silicon membrane 12, strained on support rings 7 and 9. Temperature of sample 11 during experiment is measured with resistance thermometer 13, which configuration is chosen by such a way to provide the optimal heat contact with the studied sample. System for temperature scanning contains heaters 14, block of liquid nitrogen vapours supply to studied sample 15 and connected to thermometer 13 automatic temperature regulator 16. In order to measure plastic deformation of studied samples the device is supplied with a differential sensor of displacement, mounted in such a way that its body 17 is connected with a force draught 10, and the core 18 is done with the pusher 19, mounted on piston rod 2. Signals from the displacement sensor and temperature regulator 16 are recorded by computer registering system 20. Studied solutions are poured into a deformation device at room temperature, afterwards it is placed 10 17 18 19 20 15 14 21 8 3 4 9 11 12 5 1 13 7 2 6 APT 16 T N2 ε F ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №2 142 0 50 100 150 200 250 Рис. 5. Типичные термопластические кривые заморо- женных криопротекторных растворов при одинаковых нагрузках (σ1=400г/мм2): 1 – 30%-й раствор ДМСО; 2 – 30%-й раствор глицерина; 3 – 30%-й раствор ПЭО-1500. Fig. 5. Typical thermoplastic curves of frozen cryoprotec- tive solutions under equal loads (σ1=400g/mm2). 1 – 30% DMSO; 2– 30% glycerol; 3 – 30% PEO-1500. . Рис. 4. Форма исследуемого образца в процессе его термопластической деформации. Fig. 4. Shape of studied sample during its thermoplastic deformation. данной температуры Т1 в диапазоне Тg≥Т1≥–196°С. При этом скорость охлаждения также задается регулятором 16 и может изменяться в пределах 1…10°С/мин. После охлаждения образца до температуры Т1 и выдержки его при этой тем- пературе в течение 20-30 мин эксперимент по определению температуры расстеклования Тg проводится по указанной схеме. Основные геометрические параметры образцов, дефор- мируемых с помощью описанного устройства, приведены на рис. 4. Результаты и обсуждение На рис.5 представлены типичные термоплас- тические кривые замороженных криопротекторных водных растворов на основе ДМСО, глицерина и ПЭО-1500, содержащие один и тот же весовой процент криопротекторного вещества. Все кривые получены при одинаковом значении внешнего деформирующего напряжения σ1=400 г/мм2. В процессе эксперимента жидкофазные образцы охлаждались от комнатной температуры до –150°С со скоростью Vохл=4°С/мин, а затем после приложения заданного напряжения σ1 отогревались со скоростью Vнагр=1°С/мин. На представленных кривых отчетливо фиксируется температура начала расстеклования Тg аморфной фракции по моменту отклонения кривой ε=ε(T) от линейной базовой линии. Хорошо видно, что после темпера- туры Тg начинается резкое нарастание скорости пластического течения образца, температура которого увеличивается пропорционально времени. Это обусловлено деформацией образца путем сдвига в области расстекловавшихся вязких аморфных фракций при условии, что их структура не изменяется с повышением температуры. Отметим, что согласно выражению (4) скорость пластического течения образца зависит от into a cryostat 21 and cooled together with the studied solution down to fixed temperature T1 within the range of Tg ≥T1≥ –196°C. At the same time the cooling rate is also fixed by regulator 16 and can be changed within the limits of 1…10°C/min. After cooling the sample down to the temperature T1 and its exposure at this temperature for 20–30 min the experiment on determining the devitrification temperature Tg is carried-out by the mentioned scheme. Main geometrical parameters of the samples, being deformed using described device, are given in Fig. 4. Results and discussion Fig. 5 shows typical thermoplastic curves of frozen cryoprotective aqueous solutions, based on DMSO, glycerol and PEO-1500, containing the same weight percentage of cryoprotective substance. All curves were obtained at an equal value for external deforming tension of σ1=400g/mm2. During experiment liquid- phase samples were cooled from room temperature down to –150°C with the rate of Vcool=4°C/min, and then after applying fixed tension σ1 were thawed with Vthaw=1°C/min rate. The Tg temperature of devitri- fication beginning for amorphous fraction by the moment of curve ε=ε(T) deviation from a linear base line is distinctly fixed in the presented curves. It is well seen that after Tg1 temperature there is the beginning of a sharp rate augmentation of plastic flow of the sample, which temperature increase is time- proportional. This is stipulated by the sample deformation via a shift in the area of devitrified viscous amorphous fractions when their structure does not change with a temperature increase. Of note is that –160 –140 –120 –100 –80 –60 Температура, °С Temperature, °C h=0,2...0,4 r=6 2 8 12 18 1 2 3 ε, м км ε, µm Tg1 Tg2 Tg3 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №2 143 -150 -140 -130 -120 -110 -100 -90 -80 -70 -60 -50 -40 0 100 200 300 400 500 600 Рис. 6. Зависимость температуры расстеклования различных типов криопротекторных растворов от величины внешней деформирующей нагрузки: 1 – 30%-й раствор ДМСО; 2 – 30%-й раствор глицерина; 3 – 30%-й раствор ПЭО-1500. Fig. 6. Dependency of devitrification temperature of differ- ent types of cryoprotective solutions on value of external deforming load. 1 – 30% DMSO; 2 – 30% glycerol; 3 – 30% PEO-1500. -150 -130 -110 -90 -70 -50 -30 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Рис.7. Зависимость температуры расстеклования крио- протекторных растворов от концентрации при постоян- ной внешней нагрузке σр=400 г/мм2: 1 – ДМСО; 2 – глицерин; 3 – ПЭО-1500. Fig. 7. Dependency of devitrification temperature of cryo- protective solutions on concentration at a constant exter- nal load σр=400g/mm2. 1 – DMSO; 2 – glycerol; 3 – PEO- 1500. according to the expression (4) the rate of sample plastic flow depends on the value of applied shift tension у. At low у values this can result in errors when determining Tg values. Therefore for each type of cryoprotectant the optimal value of shift tensions у to precisely determinate the Tg1 value was established in this work. The obtained Tg=Tg(σ) curves for different cryoprotective substances are shown in Fig. 6. They demonstrate that for studied cryoprotective substances experimentally determined Tg values decrease with an increase in applied tensions у, by approaching certain constant values at σ≥400g/mm2=σp. This enables to conclude that under low у values the Tg one, determined by the moment of thermoplastic flow rate growth (see Fig. 5) depends on the peculiarities of sample structure and device resolution ability. Therefore the σ≥σр tension was used to determine Tg real values. Obtained at these values Tg=Tg (Ccr) dependencies are shown in Fig. 7. Considerable difference in Tg values is seen for various cryoprotectants. So, if cooled down PEO-1500-based cryoprotective solutions are vitrified even at –80°C, for DMSO-based ones it occurs under –130°C. Such a significant difference emphasises once again the importance for Tg values determination when elaborating and optimising technologies for bioobject cryopreservation with different cryoprotectants. As shown in Fig. 7, considering the dependencies of devitrification temperature of amorphous fractions on a content in initial solution of cryoprotective substance we can underline four characteristic sites, represented величины приложенного сдвигового напряжения σ. При малых значениях σ это может привести к ошибкам в определении значений Тg. Поэтому для каждого типа криопротекторов в настоящей работе устанавливалось оптимальное с точки зрения точного определения величины Тg значение сдвиговых напряжений σ. Полученные кривые Тg=Тg(σ) для разных криопротекторных веществ показаны на рис.6. Из кривых хорошо видно, что для исследуемых криопротекторных растворов экспериментально определяемые значения Тg уменьшаются с повышением приложенных напряжений σ, выходя на некоторые постоянные значения при σ≥300г/мм2=σр. Это позволяет сделать вывод, что при малых значениях σ величина Тg, определяемая по моменту нарастания скорости термопластического течения (см. рис.5), зависит от особенностей структуры образца и разрешающей способности прибора. Поэтому для определения истинных значений Тg использовали напряжения σ≥σр. Полученные при этих значениях зависимости Тg=Тg(Скр) показаны на рис.7. Видна значительная разница в значениях Тg для разных криопротекторов. Так, если охлаждаемые криопро- текторные растворы на основе ПЭО-1500 стек- луются уже при температуре –80°С, то на основе ДМСО – ниже –130°С. Эта существенная разница лишний раз подчеркивает важность определения значений Тg при разработке и оптимизации технологий криоконсервирования биообъектов с 1 2 3 3 2 1 T g,° C T g,° C σ, г/мм2 σ, g/mm2 Концентрация,% Concentration,% ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №2 144 разными криопротекторами. Согласно данным рис. 7 на зависимостях температуры расстекло- вания аморфных фракций от содержания в исход- ном растворе криопротекторного вещества можно выделить четыре характерных участка, которые схематически изображены на рис. 8. Участок I в диапазоне концентраций 0…С1≈15% характери- зуется резким повышением значений Тg с умень- шением концентрации Скр. На участке II, соответ- ствующем концентрациям С1…С2≈60%, значения Тg не зависят от Скр. На участке III в диапазоне концентраций С2…С3≈70% в зависимости от усло- вий охлаждения и нагрева раствора, а также типа криопротектора может наблюдаться скачкообраз- ное уменьшение величины Тg с последующим ее восстановлением до значений ТgII. На участке IV в диапазоне концентраций С3…100% наблюдается монотонное повышение значений Тg с ростом кон- центрации Скр. Каждая из перечисленных особен- ностей кривой Тg=Тg(Скр) имеет ясную физическую интерпретацию, что делает эти кривые весьма ин- формативными для криобиологических исследова- ний. Так, резкое увеличение значений Тg при малых концентрациях криопротекторного вещества связано с изменением структуры исследуемых образцов, когда аморфная фракция уже не состав- ляет сквозных прослоек, а находится в образце в виде замкнутых включений. В результате этого пластическая деформация образца определяется не вязким течением по жидким прослойкам, а связана с дислокационной пластичностью кристал- лов льда. Кроме того, при замкнутых включениях резко повышается площадь поверхности раздела двух фаз (кристаллической и жидкой аморфной), что энергетически невыгодно и приводит к повы- шению вероятности стеклования и соответственно расстеклования при более высоких температурах. Переход от участка II к участку I при умень- шении концентрации криопротекторного вещества интерпретируется нами как переход к замкнутым аморфным включениям в образце. Так как при этом меняется механизм повреждения био- объектов, регистрация этого перехода необходима для оптимизации технологии криоконсервирования. Постоянство значений Тg на участке II означает, что в данном интервале концентраций качественно не изменяется структура образца и остается неиз- менным химический состав его аморфных фрак- ций. Однако на участке III это условие может нарушаться при использовании высоких скоростей охлаждения. В этом случае обычная кристаллиза- ция воды заканчивается при достижении концент- раций С2<С3. Поэтому в быстро охлажденных растворах с начальной концентрацией криопро- as schemes in Fig. 8. Site I within the concentration range of 0…C1≈15% is characterised by a sharp increase in Tg values with a decrease in Ccr concentration. In site II, corresponded to the C1…C2≈60% concentrations, the Tg values do not depend on Ccr. In site III within the concentration range of C2…C3≈70% depending on the solution’s cooling and heating conditions, as well as on a cryoprotectant type, a step-like decrease in Tg value with its following recovery up to TgII values can be observed. In the site IV within concentration range of C3…100% a monotonous increase in Tg values with an increase in Ccr concentration is observed. Every mentioned peculiarity of Tg=Tg(Ccr) curve has a distinct physical interpretation, by making these curves to be quite informative for cryobiological research. Thus, a sharp increase in Tg values at low concentration of cryoprotective substance is related to a change in structure of the studied samples, when an amorphous fraction does not even comprise through interlayers, but is in a sample in the form of close inclusions. As a result a plastic deformation of the sample is determined not by a viscous flow on liquid interlayers, but is related to a dislocation plasticity of ice crystals. In addition, at close inclusions there is a sharp increase in interface area of two phases (crystal and liquid amorphous ones), that is energy- disadvantageous and results in the augmentation of vitrification probability and devitrification under higher temperatures, correspondingly. We interpret the transfer from site II to site I at a decrease in concentration of cryoprotective substance as a transfer to close amorphous inclusion in a sample. Since a change in the mechanism of bioobject damaging occurs at this time, it is necessary to record this transfer for optimising cryopreservation technolo- gies. The permanence of Tg values on site II means that in this interval of concentrations there is no qualitative change in sample’s structure and chemical compositions of its amorphous fractions remains unchanged. However on site III this condition can be broken when using high cooling rates. In this case the usual water crystallisation ends when achieving C2<C3 concentrations. Therefore in the solutions, cooled down rapidly with the initial concentration of cryoprotective substance within the range of C2…C3 no ice crystals are formed and solutions are vitrified in a metastable state, that results in a decrease in their vitrification temperature. The evidence of this statement can be easily proved by thawing such samples with slower rates Vheat<Vcool up to T’F2 temperatures. Vitrification in them begins after crossing the G-G line (Fig. 8) and during following heating ice macrocrystals will be formed after crossing the L-L line. If heating rate corresponds to the following conditions: ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №2 145 текторного вещества в диапазоне С2…С3 не образуются кристаллы льда и растворы стеклуют- ся в метастабильном состоянии, что и приводит к понижению их температур стеклования. Справед- ливость этого утверждения легко доказать, проводя отогрев таких образцов с более медлен- ными скоростями Vнагр<Vохл до температур Т’F2. В них расстеклование начинается после пересе- чения линии G–G (рис.8) и при дальнейшем нагреве будут образовываться макрокристаллы льда после пересечения линии L–L. Если скорость нагрева соответствует условию: min охл min нагрнагр VVV == , (7) процесс образования кристаллов льда протекает в интервале температур ТF2…Т’F2 до достижения концентрации С3. При повторном охлаждении от температуры Т’F2 такой образец застеклуется уже при температуре ТgII. Этот факт экспериментально был подтвержден в [1]. Естественно, что при условии Vохл ≈ min охлV участок III исчезает и значения температуры расстеклования будут равны ТgII вплоть до концентрации С3. Указанный эффект наглядно демонстрирует кривая на рис.7, получен- ная для водных растворов ДМСО, которая сог- ласуется с данными [3]. В этом случае скорость охлаждения Vохл лежит вблизи min охлV и участок III исчезает. Участок IV характеризуется монотон- ным повышением температуры расстеклования с ростом концентрации криопротекторного вещества. Этот эффект легко объясняется тем, что химический состав аморфной фазы на участке IV также монотонно изменяется в связи с уменьшением соотношения NH2O/Nкр, где NH2O и Nкр – количество молекул воды и криопротекторного вещества соответственно. Таким образом, представленные на рис.7 зависимости Тg=Тg(Скр) обусловлены тем, что в интервале концентраций 0%…С2 в иссле- дуемых образцах уменьшается общий объем кристаллов льда, но остается неизменной струк- тура аморфной фракции, в то время как в интервале концентраций С2…100% непрерывно изменяется структура самой аморфной фракции в связи с уменьшением количества молекул воды в исход- ном растворе. Тот факт, что показанные на рис. 7 зависимости Тg=Тg(Скр) хорошо согласуются с представленной на рис. 8 схемой, указывает на общность рассмот- ренных закономерностей для водных криопро- текторных растворов. Выводы Описанный в работе метод определения тем- ператур расстеклования растворов криопротек- торов имеет ряд преимуществ перед известными Те м пе ра ту ра Т T em pe ra tu re T TF1 T ’F2 TF2 TgII 0 C1 C2 C3 100 L L F2 G G I I I I I I I V F1 Концентрация криопротектора С, % Concentration of cryoprotectant C, % Рис.8. Схематическое изображение стадийности концент- рационной зависимости температуры расстеклования криопротекторных растворов. Fig. 8. Schematic picture of staging of concentration de- pendency of devitrification temperature of cryoprotective solutions. min cool min heatheat VVV == , (7) the process of ice crystal formation proceeds within temperate interval of TF2… T’F2 up to the con- centration C3 achieving. During repeated cooling down from T’F2 temperature such a sample is vitrified even at TgII temperature. This fact was experimentally confirmed in the paper [1]. Naturally, under the Vcool≈ min coolV condition the site III disappears and the values of devitrification temperature will be equal to TgII up to C3.concentration. The mentioned effect is demo-nstrated by curve in Fig. 7, obtained for aqueous DMSO solutions, correlated with the data [3]. In this case the cooling rate Vcool is near min coolV and the site III disappears. The site IV is characterised by monotonous increase in devitrification temperature with the growth of cryoprotective substance concentration. This effect is easy to explain by the fact, that the chemical composition of amorphous phase in site IV monotonously changes as well due to a decrease in NH2O/Ncr, where NH2O and Ncr are the number of water and cryoprotective substance molecules, cor- respondingly. Thus, the dependencies Tg=Tg(Ccr) shown in Fig. 7 are stipulated by the fact that within the concentration interval of 0% …C2 in the studied samples there is a decrease in total volume of ice crystals, but the structure of amorphous fraction remains unchanged, meanwhile within the interval of C2…100% concentrations there is a continuos change in the structure of amorphous structure itself due to a reduction of water molecule number in the initial solution. min охлVmax охлV min coolVmax coolV ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №2 146ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №2 экспериментальными подходами. Прежде всего это относится к высокой разрешающей способ- ности метода, связанной с тем, что модули упру- гости или сдвига аморфного вещества при его рас- стекловании изменяются на несколько порядков, в то время как теплоемкость или объем изменяется не более, чем на 10–15%. Это обстоятельство позволяет точно фиксировать начало процесса рас- стеклования и регистрировать кинетику его проте- кания даже при незначительных количествах криопротекторных веществ. Одновременно по тер- мопластическим кривым можно определить изме- нение пластических свойств как замороженных криопротекторных растворов, так и криоконсер- вируемых биологических систем, что важно для исследования механизмов их повреждения вблизи Тg. В работе впервые получены зависимости Тg=Тg(Скр) в диапазоне весовых концентраций криопротекторных веществ 5…100% и установ- лены закономерности этих зависимостей. Получен- ные результаты имеют не только практическое значение, но дают возможность построить более полные, чем существующие, диаграммы состоя- ний водных растворов криопротекторов. The fact that the shown in Fig.7 dependencies Tg=Tg (Ccr) correlate well with the scheme presented in Fig. 8 indicates to the common character of considered regularities for aqueous cryoprotective solutions. Conclusions The method described in this paper for determining devitrification temperature of cryoprotective solutions has some advantages if compared with known experimental approaches. First of all this relates to a high resolution ability of the method, related to the fact that the elasticity or shift moduli of amorphous substance during its devitrification change by some orders, meanwhile heat capacity or volume change not more than by 10-15%. This circumstance enables a distinct fixing of the devitrification process beginning and recorder of its proceeding kinetics even under insignificant numbers of cryoprotective substances. Simultaneously using thermoplastic curves we can find out a change in plastic properties of both frozen cryoprotective solutions and biological systems being cryopreserved, that is important for investigating the mechanisms of their damaging about Tg. For the first time in the research we obtained the Tg=Tg (Ccp) dependencies within the range of weight concentrations of cryoprotective substances of 5…100% and the regularities for these dependencies were found out. The results obtained are not only of practical value but provide the possibility to build more complete diagrams than current ones of cryoprotectant aqueous solutions states. Литература Бронштейн В.Л., Бидный С.Ю., Кулешова Л.Г., Кощий С.В. Диаграмма состояния бинарной системы 1,1–ди-(β’- гидроксиэтокси)-2,3 пропандиол-вода // Криобиология.– 1988.– №2. – С. 51-52. Грищенко В.И., Калугин Ю.В., Лучко Н.А. Сверхбыстрые скорости охлаждения и витрифицирующие растворы в криобиологии // Пробл. криобиологии.– 1993.– №3.– С. 3-13. Зинченко А.В., Боброва Е.Н., Щетинский М.И. Влияние ДМСО на фазовые переходы и стеклование в суспензии эритроцитов кордовой крови ниже 0°С // Пробл. криобиологии.– 2003.– №2.– C. 16-21. Зінченко О.В. Фізико-хімічні процеси в кріобіологічних системах при склуванні і в твердій фазі: Автореф. дис... д -ра біол. наук.– Харків, 1987.– 37 с. Осецкий А.И., Гурина Т.М. Исследование фазовых состояний замороженных растворов и биосистем методом термопластической деформации // Пробл. криобиологии.– 1992.– №2.– C. 24-28. Поступила 14.09.2004 References Bronshtein V.L., Bidny S.Yu., Kuleshova L.G., Koschiy S.V. State diagram of 1,1-di-(β’-hydroxyetoxy)-2,3 propanediol– water binary system // Cryobiology.– 1988.– N2.– P. 51-52. Grischenko V.I., Kalugin Yu.V., Luchko N.A. Ultrarapid coling rates and vitrifying solutions in cryobiology// Problems of Cryobiology.– 1993.– N3.– P. 3-13. Zinchenko A.V., Bobrova E.N., Schetinsky M.I. DMSO effect on phase transitions and vitrification in cord blood erythrocyte suspension under 0°C // Problems of Cryobiology.– 2003.– N2.– P.16-21. Zinchenko A.V. Physical and chemical processes in cryobiological systems during vitrification and in solid phase: Author‘s abstract of thesis for doctor’s degree obtaining (biology).– Kharkov, 1987.– 37 p. Osetsky A.I., Gurina T.M. Research of phase states of frozen solutions and biosystems using the method of thermoplastic deformation // Problems of Cryobiology.– 1992.– N2.– P.24-28. Accepted in 14.09.2004 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5.

Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации

Репозитарії

Схожі ресурси