Модификация активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов под влиянием глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой
Изменение активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов в критические моменты жизнедеятельности клеток, в том числе при криоконсервировании, может играть важную роль в сохранении их структурной целостности и функциональной полноценности. Эндоцеллюлярный криопротектор глицерол способен концентрационно-зависимым...
Gespeichert in:
| Datum: | 2005 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2005
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137047 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Модификация активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов под влиянием глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой / Н. Г. Землянских, О. А. Кофанова, Л. А. Бабийчук // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 2. — С. 173-183. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-137047 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1370472025-02-23T18:15:46Z Модификация активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов под влиянием глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой Modification of erythrocytes’ Ca²⁺-ATPase activity under glycerol and freezing effect and in media with different ionic strength Землянских, Н.Г. Кофанова, О.А. Бабийчук, Л.А. Теоретическая и экспериментальная криобиология Изменение активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов в критические моменты жизнедеятельности клеток, в том числе при криоконсервировании, может играть важную роль в сохранении их структурной целостности и функциональной полноценности. Эндоцеллюлярный криопротектор глицерол способен концентрационно-зависимым способом модифицировать работу Са²⁺-АТРазы. На модели сапонин-перфорированных клеток было показано, что небольшие концентрации глицерола стимулируют ферментативную активность Са²⁺-насоса, а высокие – тормозят скорость АТРазной реакции. Активирующее действие глицерола в отношении Са²⁺-АТРазы может быть связано как с вовлечением ее эндогенных регуляторов, так и с модифицирующим влиянием параметров среды в контролировании функциональной активности данной ионтранспортирующей системы. Отмечено, что активность Са²⁺-АТРазы может изменяться под влиянием низких температур при консервировании эритроцитов под защитой глицерола, а также в результате деглицеринизации деконсервированных клеток. Зміна активності Са²⁺-АТРази еритроцитів у критичні моменти життєдіяльності клітин, у тому числі при кріоконсервуванні, може відігравати важливу роль у збереженні їхньої структурної цілісності і функціональної повноцінності. Ендоцелюлярний кріопротектор гліцерол здатний концентраційно-залежним способом модифікувати роботу Са²⁺-АТРази. На моделі сапонін-перфорованих клітин було показано, що невеликі концентрації гліцеролу стимулюють ферментативну активність Са²⁺-насоса, а високі – гальмують швидкість АТР-азної реакції. Активуюча дія гліцеролу у відношенні до Са²⁺-АТРази може бути пов’язана як із залученням її ендогенних регуляторів, так і з впливом модифікуючих параметрів середовища в контролюванні функціональної активності даної іонтранспортуючої системи. Зазначено, що активність Са²⁺-АТРази може змінюватися під впливом низьких температур при консервуванні еритроцитів під захистом гліцеролу, а також у результаті дегліцеринізації деконсервованих клітин. The change in erythrocytes’ Ca²⁺-ATPase activity in critical moments of cell life, including cryopreservation, can play an important role in preserving their structural and functional integrity. Endocellular cryoprotectant glycerol is capable to modify the Ca²⁺-ATPase activity by concentration-dependent way. Using the saponin-perforated cells as a model the low concentrations of glycerol were demonstrated to stimulate the Ca²⁺-ATPase-pump enzymatic activity, while the high ones inhibited the rate of ATPase reaction. An activating effect of glycerol in respect of Ca²⁺-ATPase can be related to both the involvement of its endogenous regulators and a modifying effect of medium parameters in controlling this ion-transporting system functional activity. The Ca²⁺-ATPase activity was noted to be changed under low temperature effect during erythrocyte preservation with glycerol protection, as well as a result of frozen-thawed cell deglycerolisation. 2005 Article Модификация активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов под влиянием глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой / Н. Г. Землянских, О. А. Кофанова, Л. А. Бабийчук // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 2. — С. 173-183. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137047 57.043:577.1:577.325.45 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Землянских, Н.Г. Кофанова, О.А. Бабийчук, Л.А. Модификация активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов под влиянием глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Изменение активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов в критические моменты жизнедеятельности клеток, в том числе при криоконсервировании, может играть важную роль в сохранении их структурной целостности и функциональной полноценности. Эндоцеллюлярный криопротектор глицерол способен концентрационно-зависимым способом модифицировать работу Са²⁺-АТРазы. На модели сапонин-перфорированных клеток было показано, что небольшие концентрации глицерола стимулируют ферментативную активность Са²⁺-насоса, а высокие – тормозят скорость АТРазной реакции. Активирующее действие глицерола в отношении Са²⁺-АТРазы может быть связано как с вовлечением ее эндогенных регуляторов, так и с модифицирующим влиянием параметров среды в контролировании функциональной активности данной ионтранспортирующей системы. Отмечено, что активность Са²⁺-АТРазы может изменяться под влиянием низких температур при консервировании эритроцитов под защитой глицерола, а также в результате деглицеринизации деконсервированных клеток. |
| format |
Article |
| author |
Землянских, Н.Г. Кофанова, О.А. Бабийчук, Л.А. |
| author_facet |
Землянских, Н.Г. Кофанова, О.А. Бабийчук, Л.А. |
| author_sort |
Землянских, Н.Г. |
| title |
Модификация активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов под влиянием глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой |
| title_short |
Модификация активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов под влиянием глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой |
| title_full |
Модификация активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов под влиянием глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой |
| title_fullStr |
Модификация активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов под влиянием глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой |
| title_full_unstemmed |
Модификация активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов под влиянием глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой |
| title_sort |
модификация активности са²⁺-атразы эритроцитов под влиянием глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2005 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137047 |
| citation_txt |
Модификация активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов под влиянием глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой / Н. Г. Землянских, О. А. Кофанова, Л. А. Бабийчук // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 2. — С. 173-183. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT zemlânskihng modifikaciâaktivnostisa2atrazyéritrocitovpodvliâniemglicerolazamoraživaniâivsredahsrazličnojionnojsiloj AT kofanovaoa modifikaciâaktivnostisa2atrazyéritrocitovpodvliâniemglicerolazamoraživaniâivsredahsrazličnojionnojsiloj AT babijčukla modifikaciâaktivnostisa2atrazyéritrocitovpodvliâniemglicerolazamoraživaniâivsredahsrazličnojionnojsiloj AT zemlânskihng modificationoferythrocytesca2atpaseactivityunderglycerolandfreezingeffectandinmediawithdifferentionicstrength AT kofanovaoa modificationoferythrocytesca2atpaseactivityunderglycerolandfreezingeffectandinmediawithdifferentionicstrength AT babijčukla modificationoferythrocytesca2atpaseactivityunderglycerolandfreezingeffectandinmediawithdifferentionicstrength |
| first_indexed |
2025-11-24T06:24:45Z |
| last_indexed |
2025-11-24T06:24:45Z |
| _version_ |
1849651873034797056 |
| fulltext |
173
УДК 57.043:577.1:577.325.45
Модификация активности Са2+-АТРазы эритроцитов под влиянием
глицерола, замораживания и в средах с различной ионной силой
Н.Г. ЗЕМЛЯНСКИХ, О.А. КОФАНОВА, Л.А. БАБИЙЧУК
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Modification of Erythrocytes’ Ca2+-ATPase Activity under Glycerol and
Freezing Effect and in Media with Different Ionic Strength
N.G. ZEMLYANSKIKH, O.A. KOFANOVA, L.A. BABIJCHUK
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy
of Sciences of the Ukraine, Kharkov
Изменение активности Са2+-АТРазы эритроцитов в критические моменты жизнедеятельности клеток, в том числе при
криоконсервировании, может играть важную роль в сохранении их структурной целостности и функциональной полноценности.
Эндоцеллюлярный криопротектор глицерол способен концентрационно-зависимым способом модифицировать работу Са2+-
АТРазы. На модели сапонин-перфорированных клеток было показано, что небольшие концентрации глицерола стимулируют
ферментативную активность Са2+-насоса, а высокие – тормозят скорость АТРазной реакции. Активирующее действие глицерола
в отношении Са2+-АТРазы может быть связано как с вовлечением ее эндогенных регуляторов, так и с модифицирующим
влиянием параметров среды в контролировании функциональной активности данной ионтранспортирующей системы.
Отмечено, что активность Са2+-АТРазы может изменяться под влиянием низких температур при консервировании эритроцитов
под защитой глицерола, а также в результате деглицеринизации деконсервированных клеток.
Ключевые слова:эритроциты, криоконсервирование, глицерол, Са2+-АТРаза.
Зміна активності Са2+-АТРази еритроцитів у критичні моменти життєдіяльності клітин, у тому числі при кріоконсервуванні,
може відігравати важливу роль у збереженні їхньої структурної цілісності і функціональної повноцінності. Ендоцелюлярний
кріопротектор гліцерол здатний концентраційно-залежним способом модифікувати роботу Са2+-АТРази. На моделі сапонін-
перфорованих клітин було показано, що невеликі концентрації гліцеролу стимулюють ферментативну активність Са2+-насоса,
а високі – гальмують швидкість АТР-азної реакції. Активуюча дія гліцеролу у відношенні до Са2+-АТРази може бути пов’язана
як із залученням її ендогенних регуляторів, так і з впливом модифікуючих параметрів середовища в контролюванні
функціональної активності даної іонтранспортуючої системи. Зазначено, що активність Са2+-АТРази може змінюватися під
впливом низьких температур при консервуванні еритроцитів під захистом гліцеролу, а також у результаті дегліцеринізації
деконсервованих клітин.
Ключові слова: еритроцити, кріоконсервування, гліцерол, Са2+-АТРаза.
The change in erythrocytes’ Ca2+-ATPase activity in critical moments of cell life, including cryopreservation, can play an
important role in preserving their structural and functional integrity. Endocellular cryoprotectant glycerol is capable to modify the
Ca2+-ATPase activity by concentration-dependent way. Using the saponin-perforated cells as a model the low concentrations of
glycerol were demonstrated to stimulate the Ca2+-ATPase-pump enzymatic activity, while the high ones inhibited the rate of ATPase
reaction. An activating effect of glycerol in respect of Ca2+-ATPase can be related to both the involvement of its endogenous regulators
and a modifying effect of medium parameters in controlling this ion-transporting system functional activity. The Ca2+-ATPase activity
was noted to be changed under low temperature effect during erythrocyte preservation with glycerol protection, as well as a result of
frozen-thawed cell deglycerolisation.
Key-words: erythrocytes, cryopreservation, glycerol, Ca2+-ATPase.
UDC 57.043:577.1:577.325.45
Адрес для корреспонденции: Землянских Н.Г., Институт проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины, ул. Переяславская,
23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38 (057) 373-31-26, факс: +38
(057) 373-30-84, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Address for correspondence: Zemlyanskikh N.G., Institute for Prob-
lems of Cryobiology&Cryomedicine of the Natl. Acad. Sci. of Ukraine,
23, Pereyaslavskaya str.,Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3126, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Несмотря на усилия ученых многих стран,
попытки создания высокотехнологичных способов
криоконсервирования эритроцитов, базирующихся
на применении экзоцеллюлярных криопротекторов,
до настоящего момента не увенчались успехом.
Привлекательность таких криопротекторов, как
HES, PEG, PVP основана на возможности их
использования в безотмывочных технологиях [1,
13, 15]. Однако нестабильность клеток, крио-
консервированных под их защитой, в физио-
логических условиях не оставляет альтернативы
In spite of the efforts of many foreign scientists
the attempts on creating the highly technological ways
for erythrocyte cryopreservation, based on the
application of exocellular cryoprotectants, have not
succeeded till now. The attractiveness of such
cryoprotectants as HES, PEG, PVP is based on the
possibility of their usage without washing-out
techniques [1, 13, 15]. However the instability of cells,
cryopreserved under their protection within a long-term
period does not keep a choice for glycerol application
as the main cryoprotectant in cryobanks practice in
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
174
применению глицерола как основного крио-
протектора в практике криобанков разных стран.
Глицерол используется в различных методах
криоконсервирования эритроцитов [9,10,16],
обеспечивает высокую степень сохранности
клеток, которые обладают стабильностью и
физиологической полноценностью, что позволяет
им выполнять свои функции в русле крови при
трансфузии.
Исследование механизмов, обеспечивающих
сохранность клеток под защитой глицерола при
криоконсервировании, заслуживает особого
внимания, поскольку может быть инструментом
целенаправленной модификации метаболизма
клеток, повышающей их стабильность к стрес-
совым воздействиям при разработке новых
способов криоконсервирования эритроцитов.
Влияние глицерола на системы мембранного
транспорта имеет решающее значение для
выживания клеток в стрессовых условиях. Легко
проникая в клетки, он изменяет не только
параметры внешней среды, но и свойства внутри-
клеточного содержимого. Несомненно, часть
молекул криопротектора может находиться и в
структуре плазматической мембраны. Для
эритроцитов, представляющих крайне диффе-
ренцированные клетки, свойства мембраны и
особый режим функционирования транспортных и
сигнальных систем на разных этапах криокон-
сервирования, являются, по-видимому, наиболее
существенными факторами для стабилизации
клеток при замораживании-отогреве. Биохи-
мический аспект модификации метаболизма и
структуры клеток под влиянием криопротекторов
и других неспецифических факторов, сопутству-
ющих замораживанию-отогреву, представляется не
менее важной стороной стабилизации клеток, чем
физико-химические изменения среды в процессе
криоконсервирования.
Цель исследования – изучение изменений
активности Са2+-АТРазы эритроцитов человека
под влиянием различных концентраций глицерола,
солей одновалентных катионов и процесса
замораживания-отогрева под защитой данного
криопротектора.
Материалы и методы
В работе использовали донорскую кровь (А(ІІ)
группа, мужчины), заготовленную на консерванте
“Глюгицир” со сроком хранения 3-5 суток при 4°С.
Эритроциты отделяли от плазмы и компонентов
лейкоцитарной массы центрифугированием при
3000 об/мин на центрифуге ОПН-3. Эритромассу
трижды промывали раствором А (150 мМ NaCl,
10 мМ Трис-HCl, pН 7,4) в соотношении объемов
1:4, каждый раз удаляя верхний слой клеток,
содержащий компоненты белой крови.
different countries. Glycerol is used in different
methods of erythrocyte cryopreservation [9, 10, 16]
and provides a high preservation rate for stable and
physiologically integral cells, that enables them to
perform their functions in blood channel during
transfusion.
The investigation of mechanisms, providing cell
integrity under glycerol protection during cryo-
preservation is of special attention, since it can be an
instrument for the aimed modification of cell
metabolism, increasing their stability to stress effects,
as well as when elaborating the new ways for
erythrocyte cryopreservation.
Glycerol effect on membrane transport systems is
decisive for cell survival under stress. Due to an easy
penetration into cells it changes not only the
environment parameters but the properties of
intracellular content as well. Evidently, a part of
cryoprotectant molecules may be located in plasmatic
membrane structure too. For the erythrocytes, which
are the extremely differentiated cells, the membrane
properties and a special regimen for the transport and
signalling systems’ functioning at different stages of
cryopreservation are, apparently, the most significant
factors of cell stabilisation under freeze-thawing.
Biochemical aspect of metabolism and cell structure
modification under the effect of cryoprotectants and
some other non-specific factors, accompanying freeze-
thawing, is also an important side of cell stabilisation
as physical and chemical changes in the medium during
cryopreservation.
The research was aimed to study the change in
Ca2+-ATPase activity in human erythrocytes under the
effect of different concentrations of glycerol,
monovalent cation salts and freeze-thawing process
using this cryoprotectant.
Materials and methods
Donor’s blood (A(II) group, men), procured with
“Glygicir” preservative with storage term of 3-5 days
at 4°C was used in the research. Erythrocytes were
separated from plasm and white cell components using
centrifugation at 3000 rot/min with OPN-3 centrifuge.
The erythromass was thrice washed-out with A
solution (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4) in
1:4 volume ratio, with every time removing an upper
cell layer, containing white blood components.
In order to determine the Ca2+-ATPase activity [5]
the erythrocytes’ aliquots were introduced into the
medium B (0.04% saponin, 1 mM ATP, 1 mM EGTA,
0.025 mM MgCl2, 10 mM Tris, 10 mM HEPES, 135
mM KCl and 1.1 mM CaCl2 (pH 7.4)). The Ca2+-
ATPase activity was estimated by the difference of
inorganic phosphate accumulation in Ca2+-containing
samples and parallel Ca2+-free samples. Depending
on specific experimental tasks the medium composition
was varied by additional introducing different
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
175
Для определения Са2+-АТРазной активности [5]
аликвоты эритроцитов вносили в среду В (0,04%
сапонина, 1 мМ АТР, 1 мМ EGTA, 0,025 мМ MgCl2,
10 мМ Трис, 10 мМ HEPES, 135 мМ KCl и 1,1 мМ
CaCl2, рН 7,4). Активность Са2+-АТРазы оцени-
вали по разнице накопления неорганического
фосфата в Са2+-содержащих пробах и параллель-
ных Са2+-несодержащих пробах. В зависимости от
конкретных экспериментальных задач состав
среды варьировали, вводя дополнительно разные
концентрации глицерола (5-60%); NaCl (150-600 мМ);
KCl (150-600 мМ). При оценке Са2+-АТРазной
активности в средах, содержащих NaCl, работу Na+-
насоса блокировали добавлением 1 мМ оуабаина.
Реакцию ферментативного гидролиза АТР отсле-
живали, инкубируя клетки при 37°С в течение 20
мин. После чего реакцию останавливали, добавляя
холодный раствор ТХУ до конечной концентрации
5%. Уровень неорганического фосфора (Рі) в
пробах определяли по методу, описанному в [11].
Удельную активность Са2+-АТРазы эритро-
цитов рассчитывали на 109 клеток. Подсчет клеток
в пробах проводили в камере Горяева.
Для оценки влияния процессов криокон-
сервирования на Са2+-АТРазную активность
эритроцитов были проведены эксперименты по
замораживанию клеток в жидком азоте. Для этого
к эритромассе добавляли равный объем раствора С
(30% глицерола, 150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl,
pН 7,4) и инкубировали в течение 20 мин, после
чего клетки в металлических контейнерах
(объемом 10 мл) погружали в жидкий азот.
Размораживали на водяной бане с температурой
42°С при постоянном покачивании. Деконсер-
вированные клетки были разделены на 2 части.
Клетки первой части осаждали центрифуги-
рованием при 3000 об/мин и аликвоты эритромассы
переносили в среду В для проведения фер-
ментативной реакции. Параллельно оценивали
количество клеток в пробе и уровень гемолиза.
Другую часть деконсервированной эритромассы
использовали при деглицеринизации для оценки
Са2+-АТРазной активности эритроцитов, возвра-
щенных после криоконсервирования в нормальные
физиологические условия. Деглицеринизацию
выполняли по схеме: 1-й этап – осаждение клеток
и удаление надосадка; 2-й этап – отмывание
эритромассы равным объемом 600 мМ NaCl, 10
мМ Трис-HCl (pН 7,4); 3- и 4-й этапы – отмывание
равными объемами среды А. После завершения
отмывочных процедур аликвоты эритромассы
вносили в среду В и определяли активность Са2+-
АТРазы эритроцитов, как описано выше. Парал-
лельно оценивали количество клеток в пробе и
уровень гемолиза.
concentrations of glycerol (5-60%); NaCl (150-600 mM)
and KCl (150-600 mM). When estimating Ca2+-ATPase
activity in NaCl-containing media the Na+-pump work
was blocked by adding 1 mM ouabain. The reaction
of ATP enzymatic hydrolysis was traced by incubating
cells at 37°C within 20 min, then the reaction was
stopped by adding cold TCA solution up to 5% final
concentration. The level of inorganic phosphorus (Pi)
in samples was determined by the described method [11].
The erythrocytes’ Ca2+-ATPase specific activity
was calculated per 109 cells. Cell counting in samples
was carried-out in Goryaev’s chamber.
In order to estimate the cryopreservation effect on
Ca2+-ATPase erythrocyte activity the experiments on
cell freezing in liquid nitrogen were carried-out. For
this purpose the equal volume of C solution (30%
glycerol, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4) was
added to erythromass and incubated for 20 min, then
cells in metal containers (10 ml volume) were immersed
into liquid nitrogen, frozen-thawed on water bath of
42°C temperature with a constant shaking. Frozen-
thawed cells were divided into 2 parts. Cells of the first
part were precipitated by centrifuging at 3000 rot/min
and erythromass aliquots were transferred into the
medium B for the enzyme reaction performance.
Simultaneously there were evaluated the cell number
in a sample and hemolysis level. Another part of frozen-
thawed erythromass was used during deglycerolisation
for estimating Ca2+-ATPase activity of erythrocytes,
returned after cryopreservation under normal
physiological conditions. Deglycerolisation was
performed according to the protocol: 1st stage is cell
precipitation and supernatant removal; 2nd stage is
erythromass washing-out with equal volume of 600 mM
NaCl, 10mM Tris-HCl (pH 7.4); 3rd and 4th stages are
washing-out with equal volumes of the medium A.
After completing the washing-out procedures the
erythromass aliquots were introduced into the medium B
and Ca2+-ATPase erythrocyte activity was deter-
mined as described above. At the same time we
estimated the amount of cells in a sample and the
hemolysis level.
Results and discussion
Unique role of Ca2+-ATPase in erythrocytes is
explained by the fact, that it is the only system in a
cell, controlling the level of cytosol calcium. In addition,
it is devoted not only to support a 10,000-fold Ca2+
gradient on a membrane under stationary conditions
of cell vital activity, but the regulation at a receptor-
induced increase in its concentration under external
signal effect. The change in catalytic properties of Ca2+-
pump and, consequently its capability to translocate
the Ca2+ ions in erythrocytes at different cryo-
preservation stages can cause a considerable effect
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
176
Результаты и обсуждение
Уникальная роль Са2+-АТРазы в эритроцитах
объясняется тем, что это единственная система
в клетке, обеспечивающая контроль за уровнем
цитозольного кальция. Кроме того, она призвана
не только поддерживать 10 000-кратный градиент
Са2+ на мембране в стационарных условиях
жизнедеятельности клетки, но и осуществлять
регуляцию при рецептор-индуцированном повы-
шении его концентрации под воздействием
внешнего сигнала. Изменение каталитических
свойств Са2+-насоса, следовательно, и его
способности транслоцировать ионы Са2+ в эритро-
цитах на разных этапах криоконсервирования
может оказать значительное влияние на жизне-
способность эритроцитов. Учитывая, что при
инкубации с глицеролом происходит насыщение
эритроцитов криопротектором , и его концентрация
внутри клетки постепенно нарастает, транспортные
системы плазматической мембраны в начальный
период и после достижения равновесного состояния
могут по-разному реагировать на происходящие
изменения параметров среды. Динамику насы-
щения глицеролом и изменение активности Са2+-
АТРазы в ходе этого процесса можно смоде-
лировать исследованием функционирования
фермента в средах с разными концентрациями
криопротектора.
На рис.1 представлена активность Са2+-
АТРазы в сапонин-перфорированных эритроцитах
при изменении уровня глицерола в среде. Видно,
что эта зависимость носит бифазный характер.
Са2+-АТРазная активность растет при небольших
концентрациях глицерола, достигая максимальных
значений при 10%-м содержании криопротектора
в среде. После этого активирующее влияние
глицерола на работу Са2+-АТРазы эритроцитов
начинает снижаться. Но только в условиях, когда
его уровень превышает 20%-ю концентрацию,
отмечается достоверное снижение каталити-
ческой активности ниже контрольных значений.
При дальнейшем повышении концентрации
криопротектора происходит медленное снижение
активности Са2+-АТРазы.
Повышение каталитической активности Са2+-
насоса эритроцитов под влиянием глицерола при
концентрациях, соответствующих начальному
этапу насыщения клеток криопротектором, может
играть важную роль в стабилизации клеток. В этих
условиях потенциально возможно увеличение
скорости входа Са2+ в клетку вследствие пертур-
бации в структуре плазматической мембраны,
вызванной глицеролом. И если в это же время
отмечается активация работы Са2+-АТРазы, то
увеличение скорости входа Са2+ в клетку будет
скомпенсировано ростом Са2+-АТРазной активнос-
on erythrocyte viability. Taking into account the fact,
that during incubation with glycerol the erythrocyte
saturation with cryoprotectant occurs and its
concentration inside a cell gradually increases, the
transport systems of plasmatic membrane in an initial
period and after achieving a balanced state can
differently respond to the occurring changes in medium
parameters. The dynamics of saturation with glycerol
and a change in Ca2+-ATPase activity during this
process can be modelled by studying the enzyme
functioning into the media with different cryoprotectant
concentrations.
Fig. 1 demonstrates the Ca2+-ATPase activity in
saponin-perforated erythrocytes at the glycerol level
change in the medium. It appears that this dependency
is a biphase character. The Ca2+-ATPase activity
increases under low glycerol concentrations by
achieving the maximum values at 10% cryoprotectant
content in the medium. Afterwards an activating effect
of glycerol on the erythrocytes’ Ca2+-ATPase activity
starts to reduce. But only when its level exceeds 20%
concentration a statistically significant decrease in
catalytic activity lower than the control values is
observed. During following increase in cryoprotectant
concentration a slow decrease in Ca2+-ATPase activity
occurs.
An increase in Ca2+-pump catalytic activity of
erythrocytes under glycerol effect at the con-
centrations, corresponding to initial state of cell
saturation with a cryoprotectant, can play an important
role in cell stabilisation process. Under these conditions
the augmentation of Ca2+ entrance rate into a cell is
P i
,м
кМ
×1
0-9
к
л×
м
ин
-1
P i
, µ
M
×1
0-9
c
el
ls
×m
in
-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 20 40 60 80
Концентрация глицерола,%
Glycerol concentration, %
Рис.1. Влияние глицерола на активность Са2+-АТРазы
эритроцитов.
Fig.1. Glycerol effect on Ca2+-ATPase erythrocyte activity.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
177
ти, направленной на восстановление определенного
баланса между этими встречными потоками
катиона через мембрану. Дальнейшее торможение
скорости работы Са2+-АТРазы примерно на 20-25%
при увеличении концентрации глицерола в среде,
очевидно, не может значительно повлиять на рост
внутриклеточной концентрации Са2+ на фоне
предшествующих изменений. Таким образом,
следует ожидать, что перед криоконсерви-
рованием уровень цитозольного кальция, если и
повышается, то все же не выходит резко за рамки
физиологических диапазонов. Тем самым, био-
химическая модификация и изменение физико-
химических параметров среды под влиянием
глицерола, по-видимому, способствуют стаби-
лизации эритроцитов в процессе замораживания-
отогрева.
Следует отметить, что установленные нами
закономерности не вполне согласуются с ранее
полученными результатами [2]. При оценке
удельной АТРазной активности расчет проводился
на 1 л эритроцитов или реставрированных теней
эритроцитов. Этот расчет представляется не
совсем верным, поскольку он не учитывает
изменения объема клеток при инкубации с
глицеролом, в результате чего в единице объема
крови, отобранной для измерения исследуемых
характеристик, окажется меньше функциональных
единиц. Проведенные исследования (таблица)
показывают изменения ряда параметров после
инкубации эритроцитов с глицеролом. Эти данные
подтверждают необходимость применения иного
способа расчета удельной активности, основу
которого составляет количество клеток в пробе.
Кроме того, различия между нашими данными
и результатами, представленными в работе [2],
могут быть связаны с использованием иной
модельной системы (сапонин-перфорированных
эритроцитов) [5], что позволяет сохранить в среде
ферментативного гидролиза все эндогенные
регуляторы, влияющие на активность Са2+-
АТРазы. Тем самым создаются условия для
вовлечения эндогенных модуляторов в регуляцию
активности Са2+-АТРазы при изменении пара-
метров среды. Необходимость учета особенностей
модельной системы при оценке полученных
результатов в ходе исследования Са2+-АТРазы
эритроцитов [3] позволяет избежать непри-
миримых противоречий при сопоставлении данных
различных работ.
Активирующее влияние глицерола на Са2+-
АТРазу было продемонстрировано при гидролизе
псевдосубстрата – Р-нитрофенилфосфата [8].
Авторы показали, что в присутствии глицерола
Са2+ сильно стимулирует фосфатазную активность
дозозависимым способом. Глицерол- и Са2+-
potentially feasible due to the glycerol perturbation in
a plasma membrane structure. And if at the same time
the activation of Ca2+-ATPase activity is observed, an
increase in rate of Ca2+ entrance into a cell will be
compromised by the growth of Ca2+-ATPase activity,
oriented to the a certain balance recovery between
these counter-current cation flows through a
membrane. Further inhibition of Ca2+-ATPase activity
rate approximately by 20-25% at an increase in glycerol
concentration in the medium is evidently not able to
significantly affect the growth of Ca2+ intracellular
concentration at the background of previous changes.
Thus, one should expect that if there is an increase in
cytosol calcium level before cryopreservation, it does
not overstep the limits of physiological ranges.
Biochemical modification and a change in physical and
chemical medium parameters are thereby appeared
to contribute to erythrocyte stabilisation during freeze-
thawing.
Of note is that the revealed by us regularities do
not quite correlate with previous results [2]. When
estimating the specific ATPase activity the calculation
was performed per 1 l of erythrocytes or restored
erythrocyte ghosts. This calculation appears to be not
quite a correct, since not taking into account a change
in cell volume during incubation with glycerol, resulted
in the fact that the less number of functional units will
occur in the blood volume unit, selected to measure
the studied characteristics. The investigations
performed (Table) show a change in some parameters
after erythrocyte incubation with glycerol. These data
confirm the necessity to apply a different way for
calculating the specific activity based on cell amount
in a sample.
In addition, the differences between our data and
the results presented [2] can be related to the usage
of different model system (saponin-perforated eryth-
rocytes) [5], that enables to preserve in the medium of
enzyme hydrolysis all endogenous regulators, affecting
the Ca2+-ATPase activity. The conditions for endo-
genous modulator involvement into the Ca2+-ATPase
activity regulation at a change in medium parameters
are thereby created. The necessity to take into account
the peculiarities of model system when estimating the
results obtained during erythro-cytes’ Ca2+-ATPase
study [3] allows to avoid the irreconcilable differences
when comparing the data of various works.
An activating glycerol effect on Ca2+-ATPase was
demonstrated at hydrolysis of pseudosubstrate: P-
nitrophenylphosphate [8]. The authors showed that at
glycerol presence Ca2+ strongly stimulated the
phosphatase activity by a dose-dependent way.
Glycerol and Ca2+-induced increase in the activity
correlated with a change in emission wavelength of
own fluorescence of enzyme. Glycerol and Ca2+
synergic effect is considered as related with dehyd-
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
178
Изменение характеристик суспензии эритроцитов после инкубации с глицеролом, криоконсервирования и
деглицеринизации клеток
Change in characteristics of erythrocyte’s suspension after incubation with glycerol,
cryopreservation and cell deglycerolisation
Примечание: при всех условиях эксперимента растворы добавляли к клеточной суспензии в равном объеме.
Notes: under all experimental conditions the solutions were added to cell suspension in equal volume.
индуцированное увеличение активности кор-
релировало с изменением длины волны эмиссии
собственной флуоресценции фермента. Полагают,
что синергический эффект глицерола и Са2+ связан
с эффектом дегидратации на субстрат-связы-
вающий и Са2+-связывающий домены данной
ионтранспортирующей системы.
Таким образом, структурная модификация
белковой молекулы под влиянием глицерола может
быть одной из причин изменения Са2+-АТРазной
активности эритроцитов. Еще одной из причин
роста скорости ферментативной реакции под его
влиянием может быть модификация физико-
химических параметров плазматической мемб-
раны. Глицерол в незначительных концентрациях
способствует росту порядка в структуре мембраны
[6]. Изменение упорядоченности липидного
микроокружения Са2+-АТРазы в этих условиях
может облегчать конформационные переходы в
структуре Са2+-транспортирующей системы в
каталитическом цикле. Известно, что глицерол при
увеличении его концентрации в среде способен
изменять подвижность мембранных белков [7]. Как
было установлено на везикулах саркоплазмати-
ческого ретикулума, средний размер олигомерных
комплексов Са2+-АТРазы в присутствии глицерола
увеличивается за счет агрегации мономеров
фермента. При этом переход фермента из Е1- в
Е2-конформацию сопровождается образованием
короткоживущих олигомерных комплексов [7], что
позволяет рассматривать способность глицерола
влиять на агрегатное состояние молекул фермента
как один из механизмов его активизирующего
ration effect on the substrate-binding and Ca2+-binding
domains of this ion-transporting system.
Thus, a structural modification of protein molecule
under glycerol effect can be one of the reasons of
change in the erythrocytes’ Ca2+-ATPase activity. One
more cause for the rate increase in the enzyme reaction
under its effect can be the modification of physical
and chemical parameters of plasmatic membrane.
Glycerol in slight concentrations contributes to the order
increase in membrane structure [6]. The change in
ordering of Ca2+-ATPase lipid microenvironment under
these conditions can facilitate the conformational
passages in the structure of Ca2+-transporting system
in catalytic cycle. It is known that glycerol with an
increase in its concentration in the medium is capable
to change the membrane protein mobility [7]. As it
was revealed on the vesicles of sarcoplasmic reticulum,
an average size of Ca2+-ATPase oligomeric complexes
augmented at glycerol presence due to the enzyme
monomers’ aggregation. At the same time the enzyme
transfer from E1 to E2- conformation is accompanied
with the formation of short-living oligomer complexes
[7], that enables to consider the glycerol capability to
affect an aggregate state of enzyme’s molecules as
one of the mechanisms of its activating effect on Ca2+-
ATPase. It appears to facilitate the certain confor-
mational transfers in a reaction cycle and accelerate
the ATP hydrolysis.
The Ca2+-ATPase of erythrocyte’s plasmatic mem-
brane is known to be structurally presented by two
isoforms: PMCA1b and PMCA4b [14]. Both isoforms
possess two autoinhibitor domains, enabling the
performance of a delicate regulation of ATPase and
еымеуделссИ
ыртемарап
sretemarapdeidutS
атнемирепскэяиволсУ
snoitidnoctnemirepxE
АедерсвытицортирЭ
AmuidemnisetycorhtyrE
еровтсарвытицортирЭ
атнавреснокоирк
nisetycorhtyrE
noitulosevitavreserpoyrca
яизнепсусяаннаворивреснокеД
едерсввотицортирэ
атнавреснокоирк
etycorhtyredewaht-nezorF
evitavreserpoyrcaninoisnepsus
muidem
елсопытицортирЭ
иицазинирецилгед
retfasetycorhtyrE
noitasilorecylged
котелколсиЧ
лкм1в ×( 01 6)
1nirebmunlleC µl
(× 01 6)
53,0±5,4 92,0±5,4 23,0±8,3 83,0±5,4
тиркотамеГ
tircotameH 2,2±64 8,2±35 0,3±24 1,2±54
азиломегьневорУ
%,екдасоданв
nilevelsisylomeH
%,tnatanrepus
- - 0,3±81 5,2±71
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
179
действия на Са2+-АТРазу. Возможно, это облегчает
определенные конформационные переходы в ходе
реакционного цикла и ускоряет гидролиз АТР.
Известно, что в структурном отношении Са2+-
АТРаза плазматической мембраны эритроцитов
представлена двумя изоформами - РМСА1b и
РМСА4b [14]. Обе изоформы обладают двумя
аутоингибиторными доменами, которые позволяют
осуществлять тонкую регуляцию АТРазной и Са2+-
транслоцирующей активности фермента. Можно
также предположить, что многочисленные
модуляторы могут активировать либо инги-
бировать Са2+-АТРазу нейтрализацией или
активацией этих аутоингибиторных доменов при
изменении физико-химических параметров среды.
Если предположить, что активирующий эффект
глицерола на Са2+-АТРазу связан с влиянием на
структуру аутоингибирующих доменов, то, скорее
всего, этот эффект реализуется с участием
модуляторов Са2+-АТРазной активности.
Замораживание эритроцитов под защитой
глицерола показало, что в суспензии клеток,
сохранивших целостность после замораживания-
отогрева (рис.2), активность Са2+-АТРазы поддер-
живается на уровне ниже контрольных величин.
После удаления глицерола и многоэтапной отмывки
активность Са2+-АТРазы в эритроцитах выше, чем
в нативных клетках. Этот факт не имеет четкого
объяснения. Можно предположить несколько
причин, определяющих поведение Са2+-АТРазы в
этих условиях. Поскольку в процессе замора-
живания и отмывки гибель клеток составляет
примерно 30%, то состав субпопуляций в нативной
суспензии и в суспензии после деглицеринизации
клеток, очевидно, будет отличаться. Субпопуляция
старых эритроцитов характеризуется более
высокими концентрациями внутриклеточного Са2+
из-за снижения активности Са2+-АТРазы и более
чувствительна к различным стрессовым воздей-
ствиям [12]. Очевидно, что значительная часть
клеток, погибших в процессе криоконсервирования,
будет представлена именно старыми эритро-
цитами. Следовательно, средний показатель Са2+-
АТРазной активности в суспензии, состоящей из
более молодых клеток, окажется выше, чем в
нативной эритромассе, где вклад Са2+-АТРазной
активности старых клеток снижает средние
значения. Однако более высокие значения данного
параметра в эритроцитах после завершения всех
этапов отмывки от глицерола в криоконсервиро-
ванной клеточной суспензии можно рассматривать
как компенсаторный механизм, связанный с
временным угнетением работы фермента на
предшествующих этапах.
После размораживания эритроцитов, криокон-
сервированных под защитой глицерола, обяза-
Ca2+-translocating enzyme activity. We can also
assume that numerous modulators can activate or
inhibit Ca2+-ATPase by neutralising or activating these
autoinhibitor domains under change in physical and
chemical parameters of medium. If supposing, that an
activating glycerol effect on Ca2+-ATPase is related
to the effect on the autoinhibiting domains’ structure,
this effect is mostly realised with participation of Ca2+-
ATPase activity modulators.
Erythrocyte freezing under glycerol protection
demonstrated that in cell suspension, kept the integrity
after freeze-thawing (Fig. 2), the Ca2+-ATPase activity
was maintained at the level lower the control values.
After glycerol removal and multi-step washing-out the
Ca2+-ATPase activity in erythrocytes is higher than in
native ones. This fact has no distinct explanation. Some
causes, determining the Ca2+-ATPase behaviour under
these conditions can be assumed. Since during freezing
and washing-out the cell death makes approximately
30%, the subpopulation composition in native
suspension and in that after cell deglycerolisation will
be obviously different. The subpopulation of old
erythrocytes is characterised by higher concentration
of intracellular Ca2+ due to a decrease in Ca2+-ATPase
activity and is more sensitive to different stress effects
[12]. Evidently, a considerable part of dead cells at
cryopreservation will be presented namely by old
erythrocytes. Consequently, an average index of Ca2+-
ATPase activity in the suspension, consisting of younger
cells, will be higher, than in native erythromass, where
the contribution of Ca2+-ATPase activity of old cells
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1 2 3
Рис. 2. Влияние замораживания-отогрева и отмывки на
состояние Са2+-АТРазы эритроцитов: 1– нативные
клетки; 2 – клетки после замораживания-отогрева; 3 –
клетки после завершения многоэтапной отмывки
глицерола.
Fig. 2. Freeze-thawing and washing-out effect on erythro-
cyte Ca2+-ATPase state: 1 – native cells; 2 – cells after freeze-
thawing; 3 – cells after completing the multi-step glycerol
washing-out.
P i,м
кМ
×1
0-9
к
л×
м
ин
-1
P i,
µM
×1
0-9
c
el
ls
×m
in
-1
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
180
тельна деглицеринизация клеток. Наиболее часто
для этой цели используются растворы NaCl,
обеспечивающие поддержание осмотического
баланса и одновременно предназначенные для
снижения концентрации глицерола в среде. В этих
условиях возможно изменение концентрации солей
внутри клетки. Изменение ионной силы среды, в
которой функционируют ионтранспортирующие
системы плазматической мембраны, может быть
важным моментом в регуляции их активности. На
рис.3 представлены результаты, отражающие
изменения активности Са2+-АТРазы при повыше-
нии концентрации NaCl в среде ферментативного
гидролиза в клетках, подвергнутых заморажи-
ванию-отогреву под защитой глицерола (1), в
нативных эритроцитах в среде с 15%-й концентра-
цией глицерола (2) и в среде, его не содержащей (3).
Необходимо обратить внимание на начальную
точку, отражающую отличия между сравни-
ваемыми группами в условиях физиологических
значений ионной силы. Было установлено, что в
нативных эритроцитах без глицерола и в эритро-
цитах с 15%-й концентрацией глицерола в среде
не обнаруживается достоверно значимых различий
в активности Са2+-АТРазы. В то же время после
криоконсервирования эритроцитов под защитой
глицерола уровень АТРазной активности ниже, чем
в контроле. Следовательно, действие низких
температур в определенной степени затрагивает
либо структуру фермента, либо его липидное
микроокружение. Однако падение активности
может отражать также вклад одной из сублеталь-
ных популяций эритроцитов, которые неминуемо
погибают в процессе отмывки, о чем свидетель-
ствует уровень гемолиза по завершении всех
этапов деглицеринизации (таблица).
Как видно из данных, представленных на рис. 3,
с увеличением ионной силы раствора активность
Са2+-АТРазы начинает падать. Кажущееся
повышение ферментативной активности при
введении в среду дополнительно 150 мМ NaCl
недостоверно в сравнении с контрольными
значениями. Достоверно значимое снижение Са2+-
АТРазной активности отмечается лишь при
превышении 350 мМ концентрации NaCl в среде в
дополнение к физиологическим значениям ионной
силы раствора, определяемой составом реак-
ционной среды, применяемой для анализа Са2+-
АТРазной активности. В области высоких
концентраций снова начинают проявляться
особенности поведения Са2+-АТРазной активности
криоконсервированных эритроцитов. В присутствии
600 мМ NaCl каталитическая активность Са2+-
насоса в таких эритроцитах ниже, чем в нативных
клетках, что, по-видимому, отражает структурную
reduces the average values. However, higher values
of this parameter in erythrocytes after completing all
these steps of washing-out of glycerol in a cryo-
preserved cell suspension can be considered as a
compensatory mechanism, related to a temporary
suppression of enzyme activity at previous stages.
After erythrocyte freeze-thawing, cryopreserved
under glycerol protection, the deglycerolisation
procedure is mandatory. The NaCl solutions, providing
the maintenance of osmotic balance and simultaneously
designated to reduce the glycerol concentration in the
medium, are most frequently used for this purpose.
Under these conditions a change in salt concentration
inside a cell is possible. A change in the medium ion
strength, where ion-transporting systems of plasma
membrane are functioning, may be an important
moment in their activity regulation. The Fig. 3 shows
the results, reflecting the changes in Ca2+-ATPase
activity at an increase in NaCl concentration in the
enzyme hydrolysis medium in cells, subjected to freeze-
thawing under glycerol protection (1), in native
erythrocytes in 15% glycerol medium (2) and in
glycerol-free one (3).
The attention should be paid to the initial point,
reflecting the differences between the compared
groups under conditions of physiological values of ion
strength. It was established that in native glycerol-free
erythrocytes and in those with 15% glycerol con-
centration in the medium, no statistically significant
differences in Ca2+-ATPase activity were observed.
At the same time after erythrocyte cryopreservation
under glycerol protection the level of ATPase activity
is lower than in the control. Consequently, the low
temperature influence affects under certain extent
either enzyme structure, or its lipid microenvironment.
However the activity decrease may reflect the cont-
ribution of one of the sublethal erythrocyte populations,
which inevitably die during washing-out, testified by
the hemolysis level after completing all steps of
deglycerolisation (Table).
The data in Fig.3 show that with an increase in the
solution ion strength the Ca2+-ATPase activity starts
to fall. An apparent increase in the enzyme activity
during an additional introduction of 150 mM NaCl into
the medium is not statistically significant in comparison
with the control values. Statistically significant decrease
in Ca2+-ATPase activity is observed only at exceeding
350 mM of NaCl concentration in the medium, as
addition to physiological values of the solution ion
strength, determined by the composition of a reaction
medium, applied for analysis of Ca2+-ATPase activity.
In the field of high concentrations the behaviour
peculiarities of Ca2+-ATPase activity of cryopreserved
erythrocytes restart their manifestation. At the
presence of 600 mM NaCl a catalytic activity of Ca2+-
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
181
P i,м
кМ
×1
0-9
к
л×
м
ин
-1
P i,
µM
×1
0-9
c
el
ls
×m
in
-1
P i,м
кМ
×1
0-9
к
л×
м
ин
-1
P i,
µM
×1
0-9
c
el
ls
×m
in
-1
Концентрация NaCl, мМ
NaCl concentration, mM
Концентрация KCl, мМ
KCl concentration, mM
0
2
4
6
8
10
12
14
0 200 400 600 800
Рис.3. Зависимость скорости работы Са2+-АТРазы
эритроцитов от концентрации солей в среде: 1 – деконсер-
вированные эритроциты, содержащие глицерол; 2 –
нативные эритроциты в среде с глицеролом; 3 –
нативные эритроциты без глицерола.
Fig. 3. Dependence of erythrocytes’ Ca2+-ATPase activity
rate on salt concentration in medium: 1 – glycerol-contain-
ing frozen-thawed erythrocytes; 2 – native erythrocytes in the
medium with glycerol; 3 – glycerol-free native erythrocytes.
Рис. 4. Зависимость скорости работы Са2+-АТРазы
эритроцитов от концентрации KCl в среде: 1 – KCl; 2 –
KCl + 15%-й глицерол.
Fig. 4. Dependence of erythrocytes’ Ca2+-ATPase activity
rate on KCl concentration in medium: 1 – KCl; 2 – KCl + 15%
glycerol.
модификацию фермента под влиянием низких
температур.
В данной серии экспериментов для подавления
активности Na-насоса использовали ингибитор –
1 мМ оуабаина. Показано [4], что оуабаин при
низких концентрациях Са2+ активирует Са2+-
АТРазу, а при более высоких – ингибирует. Чтобы
убедиться, что в наших экспериментальных
условиях изменения Са2+-АТРазной активности
отражают действительно влияние ионной силы
растворов, а влияние ингибитора оуабаина не было
артефактом, способным повлиять на результаты,
провели еще серию экспериментов, в которых
активность Na-насоса блокировалась отсутствием
в среде необходимых для его работы лигандов. С
этой целью ионную силу раствора изменяли
введением в среду аналогичных концентраций КCl.
Данные, представленные на рис. 4, подтверждают
реальное влияние ионной силы растворов на
поведение Са2+-АТРазы эритроцитов и не отра-
жают специфику модифицирующего влияния ионов
Na+ и K+ в условиях значительного превышения
их физиологической концентрации в среде.
Таким образом, модификация активности Са2+-
АТРаз под влиянием глицерола, низких температур,
высокой ионной силы свидетельствует об участии
ионов Са2+ и систем, регулирующих их уровень в
клетках, в процессах стабилизации и деста-
билизации клеток к стрессовым воздействиям.
pump in such erythrocytes is lower than in native cells,
that, apparently, reflects the enzyme structural
modification under low temperature effect.
In these series of experiments we used the 1mM
ouabain inhibitor to suppress NA+-pump activity. It was
shown [4] that ouabain under low Ca2+ concentrations
activated Ca2+-ATPase, but inhibited it under higher
ones. In order to make certain that under our
experimental conditions the changes in Ca2+-ATPase
activity really reflect the effect of ion strength of
solutions and the influence of ouabain inhibitor was
not the artefact, capable to affect the results, we
carried-out one more experimental series where Na-
pump activity was blocked by the absence of ligands
in the medium, necessary for its work. With this purpose
we measured the solution’s ion strength by introducing
the same KCl concentrations into the medium. The
data in Fig. 4 confirm a real effect of solutions’ ion
strength on Ca2+-ATPase erythrocyte behaviour and
do not reflect the specificity of Na+ and K+ ion
modifying effect under conditions of a considerable
excess of their physiological concentration in the
medium.
Thus, the modification of Ca2+-ATPase activity
under the effect of glycerol, low temperatures, high
ion strength testifies to the participation of Ca2+ ions
and systems, regulating their level in cells, in the
processes of cell stabilisation and destabilisation to
stress effects.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 200 400 600 800
3
2
1
2
1
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
182
Conclusions
Change in Ca2+-ATPase activity in saponin-
perforated erythrocytes under glycerol effect is of
biphase character. Low glycerol concentrations
activate the enzyme activity, by achieving the maximum
effect at 10% cryoprotectant content in the medium.
Its high concentrations cause the inhibition. Modification
of erythrocyte Ca2+-ATPase under glycerol effect is
obviously related to both the changes in physical and
chemical medium parameters and to the involvement
of endogenous modulators into its activity regulation.
Low temperature preservation, high ion strength
and deglycerolisation process change the parameters
of Ca2+-ATPase erythrocyte activity that may affect
cell stability under stress conditions.
Выводы
Изменение активности Са2+-АТРазы в сапонин-
перфорированных эритроцитах под влиянием
глицерола имеет бифазный характер. Небольшие
концентрации глицерола активируют работу
фермента, достигая максимального эффекта при
10%-м содержании криопротектора в среде.
Высокие его концентрации вызывают ингиби-
рование. Очевидно, модификация Са2+-АТФазы
эритроцитов под влиянием глицерола связана как
с изменениями физико-химических параметров
среды, так и с вовлечением эндогенных моду-
ляторов в регуляцию ее активности.
Низкотемпературное консервирование, высокая
ионная сила и процесс деглицеринизации изменяют
параметры работы Са2+-АТРазы эритроцитов, что
может повлиять на стабильность клеток в стрес-
совых условиях.
Литература
Бабийчук Л.А., Землянских Н.Г. Влияние температуры и
криопротектора ПЭО-1500 на характер модификации
белков цитоскелета и устойчивость эритроцитов в
процессе криоконсервирования // Пробл. криобиологии.–
1994.– №2.– С.7-11
Гулевский А.К., Бондаренко В.А., Белоус А.М. Барьерные
свойства биомембран при низких температурах.– Киев:
Наук. думка, 1988.– 207 с.
Орлов С.Н. Кальмодулин // Итоги науки и техники. Общие
проблемы физико-химической биологии.– М., 1987.– 404 с.
Петруняка В.В., Панюшкина Е.А., Северена Е.А.
Активация и ингибирование Na+,K+-ATPазы мембран
эритроцитов эндогенными Са2+ -зависимыми регуля-
торами. Са2+ -зависимое действие оуабаина на Са2+-
АТРазу // Биол. мембраны.– 1990.– Т. 7,№4.– С. 352-357.
Покудин Н.И., Петруняка В.В., Орлов С.Н. Участвует ли
кальмодулин в регуляции активности Са-насоса в
эритроцитах in vivo // Биохимия.– 1988.– Т. 53, №5.–С. 753-758.
Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В.
Криопротекторы.– Киев: Наук.думка, 1978.– 204 с.
Рубцов А.М., Болдырев А.А., Личунь Янг и др. Исследо-
вание вращательной подвижности Е1- и Е2- конфор-
меров Са2+-АТРазы в мембранах саркоплазматического
ретикулума с использованием метода анизотропии
фосфоресценции с высоким временным разрешением //
Биохимия.– 1994.– Vol. 59, №11.– С.1698-1705.
Alves G.G., Lima L.M., Favero-Retto M.P. et al. P-nitro-
phenylphosphatase activity catalyzed by plasma membrane
(Ca2+ + Mg2+ ATPase): correlation with structural changes
modulated by glycerol and Ca2+ // Biosci. Rep.– 2001.– Vol. 21,
N1.– Р.25-32.
Lelkens C.C., Noorman F., Koning J.G. et al. Stability after
thawing of red blood cells frozen with high - and low-glycerol
method // Transfusion.– 2003.– Vol. 43, N2.– Р.157-164.
Lippert S., Bock H., Rahring S. et al. Cryopreservation of
erythrocytes detailed quality control // Beitr. Infusionsther.
Transfusitionsmed.– 1996.– Vol. 33.– Р. 117-120.
Rathbum W., Betlark V. Estimation of enzymically produced
orthophosphate in the present of cystein and adenosin
triphosphate // Anal. Biochem. – 1969.– Vol. 28, N1-3.–- Р. 436-445.
References
Babiychuk L.A., Zemlyanskikh N.G. Effect of temperature
and PEO-1500 cryoprotectant on the nature cytoskeletal
protein modification and red blood cell stability during
cryopreservation // Problemy kriobiologii.– 1994.– N2.– P.7-11.
Gulevsky A.K., Bondarenko V.A., Belous A.M. Barrier
properties of biomembranes under low temperatures.– Kiev:
Naukova Dumka, 1988.– 207p.
Orlov S.N. Calmodulin // Itogi Nauki i tekhniki. Issue: General
problems of physical and chemical biology.– Moscow, 1987.–
404 p.
Petrunyaka V.V., Panyushkina E.A., Severena E.A. Activation
and inhibition of Na+, K+-ATPase of erythrocyte membranes
by endogenous Ca2+-dependent regulators. Ca2+-dependent
effect of ouabain on Ca2+-ATPase // Biologicheskie
membrany.– 1990.– Vol. 7, N4.– P. 352-357.
Pokudin N.I., Petrunyaka V.V., Orlov S.N. Does calmodulin
participate in regulation of Ca-pump activity in erythrocytes
in vivo?// Biokhimiya.– 1988.– Vol. 53, N5.– P.753-758.
Pushkar N.S., Shrago M.I., Belous A.M., Kalugin Yu.V.
Cryoprotectants.– Kiev: Naukova Dumka, 1978.– 204p.
Rubtsov A.M., Boldyrev A.A., Lichun’ IA, McStay et al. Study
of the rotation mobility of E1- and E2-conformers of Ca-ATPase
in sarcoplasmic reticulum membranes using a time-resolved
phosphorescence anisotropy method // Biokhimiya.– 1994.–
Vol. 59, N11.– P.1698-1705.
Alves G.G., Lima L.M., Favero-Retto M.P. et al. P-nitro-
phenylphosphatase activity catalyzed by plasma membrane
(Ca2++ Mg2+ ATPase): correlation with structural changes
modulated by glycerol and Ca2+// Biosci. Rep.– 2001.– Vol. 21,
N1.– P.25-32.
Lelkens C.C., Noorman F., Koning J.G. et al. Stability after
thawing of red blood cells frozen with high- and low-glycerol
method // Transfusion.– 2003.– Vol. 43, N2.– P. 157-164.
Lippert S., Bock H., Rahring S. et al. Cryopreservation of
erythrocytes detailed quality control // Beitr. Infusionsther.
Transfusitionsmed.– 1996.– 33.– P. 117-120.
Rathbum W., Betlark V. Estimation of enzymically produced
orthophosphate in the person of cystein and adenosin
triphosphate // Anal. Biochem.– 1969.– Vol. 28, N1-3.–
P.436-445.
Romero P.J., Romero E.A. The role of calcium metabolism in
human red blood cell ageing: a proposal // Blood Cell Mol.
Dis.- 1999.– Vol. 25, N1.– P.9-19.
Sputtek A., Horn E.P., Schulte Am Esch J., Kuhnl P.
Cryopreservation of red blood cells using hydroxyethyl
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
183
starch (HES) – From laboratory investigation to clinical
application // Anasthesiol. Intesivmed. Notfallmed. Schmerz-
ther.– 2001.– Vol. 36, N2.– P.162-164.
Strehler E.E., Zacharias D.A. Role of alternative splicing in
generating isoforms diversity among plasma membrane
calcium pumps // Physiol. Rev.– 2001.– Vol. 81, N1.– P. 21-50.
Thomas M.J., Parry E.S., Nash S.G., Bell S.H. A method for
the cryopreservation of red blood cells using hydroxyethyl
starch as a cryoprotectant // Transfus. Sci.– 1996.– Vol. 17,
N3.– P.385-396.
Wagner C.T., Martowicz M.L., Livesey S.A., Connor J.
Biochemical stabilization enhances red blood cell recovery
and stability following cryopreservation // Cryobiology.–
2002.– Vol. 45, N2.– P.153-166.
Accepted in 21.12.2004
Romero P.J., Romero E.A. The role of calcium metabolism in
human red blood cell ageing: a proposal // Blood Cell Mol.
Dis.–1999.– Vol. 25, N1.– Р. 9-19.
Sputtek A., Horn E.P., Schulte Am Esch J., Kuhnl P. Cryo-
preservation of red blood cells using hydroxyethyl starch
(HES) – From laboratory investigation to clinical application //
Anasthesiol. Intensivmed. Notfallmed. Schmerzther.– 2001.–
Vol. 36, N2.– Р. 162-164.
Strehler E.E., Zacharias D.A. Role of alternative splicing in
generatig isoforms diversity among plasma membrane calcium
pumps // Physiol. Rev.– 2001.– Vol. 81, N1.– Р. 21-50.
Thomas M.J., Parry E.S., Nash S.G., Bell S.H. A method for
the cryopreservation of red blood cells using hydroxyethyl
starch as a cryoprotectant // Transfus. Sci.– 1996.– Vol. 17,
N3.–Р. 385-396.
Wagner C.T., Martowicz M.L., Livesey S.A., Connor J.
Biochemical stabilization enhances red blood cell recovery
and stability following cryopreservation // Cryobiology.–
2002.– Vol. 45, N2.– Р. 153-166.
Поступила 21.12.2004
12.
13.
14.
15.
16.
14.
15.
16.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №2
|