Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации

В работе проведена экспериментальная проверка адекватности теоретической модели, которая аналитически описывает процессы трансмембранного переноса веществ при росте кристаллов льда в окружающей клетки среде. В рамках принятых в модели допущений получено удовлетворительное совпадение теоретических и...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2006
Автори:	Кулешова, Л.Г., Коваленко, И.Ф.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2006
Назва видання:	Проблемы криобиологии и криомедицины
Теми:	Теоретическая и экспериментальная криобиология
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137078
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации / Л. Г. Кулешова, И. Ф. Коваленко // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 1. — С. 3-12. — Бібліогр.: 7 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-137078
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1370782025-02-23T17:40:12Z Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации Determining transport characteristics for cell plasma membranes under extracellular crystallisation Кулешова, Л.Г. Коваленко, И.Ф. Теоретическая и экспериментальная криобиология В работе проведена экспериментальная проверка адекватности теоретической модели, которая аналитически описывает процессы трансмембранного переноса веществ при росте кристаллов льда в окружающей клетки среде. В рамках принятых в модели допущений получено удовлетворительное совпадение теоретических и экспериментальных зависимостей изменения относительного объема клеток почек сирийского хомячка при различных условиях замораживания. Количественно оценены транспортные характеристики плазматических мембран указанных клеток, проанализированы наиболее вероятные причины их зависимости от исходной концентрации проникающего в клетки криопротектора и скорости охлаждения. В роботі проведена експериментальна перевірка адекватності теоретичної моделі, яка аналітично описує процеси трансмембранного переносу речовин в умовах росту кристалів льоду у позаклітинному середовищі. В рамках прийнятих у моделі припущень одержано задовільний збіг теоретичних та експериментальних залежностей зміни відносного об’єму клітин нирок сірійського хом’ячка в різних умовах заморожування. Кількісно оцінено транспортні характеристики плазматичних мембран вказаних клітин, проаналізовано найбільш імовірні причини їх залежності від початкової концентрації проникаючого в клітини кріопротектора і швидкості охолодження суспензії. Experimental proving of theoretical model adequacy, analytically describing processes of transmembrane substance transfer during ice crystal growth in extracellular medium was carried-out in the work. Within the frames of model’s assuming there was obtained a satisfactory fitting of theoretical and experimental dependencies of a change in relative volume of golden hamster kidney cells under different freezing conditions. Transport characteristics of plasma membranes in mentioned cells were quantitatively estimated and the most probable reasons of their dependency on initial concentration of cell penetrative cryoprotectant and cooling rate were analysed. 2006 Article Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации / Л. Г. Кулешова, И. Ф. Коваленко // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 1. — С. 3-12. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137078 57.043:577.352.4:539.21 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология
spellingShingle	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Кулешова, Л.Г. Коваленко, И.Ф. Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации Проблемы криобиологии и криомедицины
description	В работе проведена экспериментальная проверка адекватности теоретической модели, которая аналитически описывает процессы трансмембранного переноса веществ при росте кристаллов льда в окружающей клетки среде. В рамках принятых в модели допущений получено удовлетворительное совпадение теоретических и экспериментальных зависимостей изменения относительного объема клеток почек сирийского хомячка при различных условиях замораживания. Количественно оценены транспортные характеристики плазматических мембран указанных клеток, проанализированы наиболее вероятные причины их зависимости от исходной концентрации проникающего в клетки криопротектора и скорости охлаждения.
format	Article
author	Кулешова, Л.Г. Коваленко, И.Ф.
author_facet	Кулешова, Л.Г. Коваленко, И.Ф.
author_sort	Кулешова, Л.Г.
title	Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации
title_short	Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации
title_full	Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации
title_fullStr	Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации
title_full_unstemmed	Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации
title_sort	определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2006
topic_facet	Теоретическая и экспериментальная криобиология
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137078
citation_txt	Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации / Л. Г. Кулешова, И. Ф. Коваленко // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 1. — С. 3-12. — Бібліогр.: 7 назв. — рос.
series	Проблемы криобиологии и криомедицины
work_keys_str_mv	AT kulešovalg opredelenietransportnyhharakteristikplazmatičeskihmembrankletokvusloviâhvnekletočnojkristallizacii AT kovalenkoif opredelenietransportnyhharakteristikplazmatičeskihmembrankletokvusloviâhvnekletočnojkristallizacii AT kulešovalg determiningtransportcharacteristicsforcellplasmamembranesunderextracellularcrystallisation AT kovalenkoif determiningtransportcharacteristicsforcellplasmamembranesunderextracellularcrystallisation
first_indexed	2025-11-24T04:32:34Z
last_indexed	2025-11-24T04:32:34Z
_version_	1849644815028846592
fulltext	3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 16, 2006, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 16, 2006, №1 УДК 57.043:577.352.4:539.21 Л.Г. КУЛЕШОВА, И.Ф.КОВАЛЕНКО Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации UDC 57.043:577.352.4:539.21 L.G. KULESHOVA, I.F. KOVALENKO Determining Transport Characteristics for Cell Plasma Membranes under Extracellular Crystallisation В работе проведена экспериментальная проверка адекватности теоретической модели, которая аналитически описывает процессы трансмембранного переноса веществ при росте кристаллов льда в окружающей клетки среде. В рамках принятых в модели допущений получено удовлетворительное совпадение теоретических и экспериментальных зависимостей изменения относительного объема клеток почек сирийского хомячка при различных условиях замораживания. Количественно оценены транспортные характеристики плазматических мембран указанных клеток, проанализированы наиболее вероятные причины их зависимости от исходной концентрации проникающего в клетки криопротектора и скорости охлаждения. Ключевые слова: внеклеточная кристаллизация, плазматические мембраны, проницаемость. В роботі проведена експериментальна перевірка адекватності теоретичної моделі, яка аналітично описує процеси трансмембранного переносу речовин в умовах росту кристалів льоду у позаклітинному середовищі. В рамках прийнятих у моделі припущень одержано задовільний збіг теоретичних та експериментальних залежностей зміни відносного об’єму клітин нирок сірійського хом’ячка в різних умовах заморожування. Кількісно оцінено транспортні характеристики плазматичних мембран вказаних клітин, проаналізовано найбільш імовірні причини їх залежності від початкової концентрації проникаючого в клітини кріопротектора і швидкості охолодження суспензії. Ключові слова: позаклітинне льодоутворення, плазматичні мембрани, проникність. Experimental proving of theoretical model adequacy, analytically describing processes of transmembrane substance transfer during ice crystal growth in extracellular medium was carried-out in the work. Within the frames of model’s assuming there was obtained a satisfactory fitting of theoretical and experimental dependencies of a change in relative volume of golden hamster kidney cells under different freezing conditions. Transport characteristics of plasma membranes in mentioned cells were quantitatively estimated and the most probable reasons of their dependency on initial concentration of cell penetrative cryoprotectant and cooling rate were analysed. Key-words: ехtracellular crystallisation, plasma membrane, permeability. * Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию: ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38 (057) 373-38-71, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта: cryo@online.kharkov.ua * To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslav- skaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3871, fax: +380 57 373 3084, e-mail:cryo@online.kharkov.ua Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na- tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Нарушение термодинамического равновесия в системе “клетка -окружающая среда” при образо- вании и росте внеклеточных кристаллов может компенсироваться двумя путями: за счет непрерыв- ного оттока воды из клетки или образования внутриклеточных кристаллов льда при значитель- ном переохлаждении цитоплазмы. В обоих случаях при достаточно низких температурах повреждение клеток неизбежно или вследствие чрезмерного обезвоживания и сжатия клеток, или в результате явлений, развивающихся при формировании внутриклеточных кристаллов льда (действия кристаллизационного давления на мембрану, рекристаллизации). Следовательно, трансмем- ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ КРИОБИОЛОГИЯ THEORETICAL AND EXPERIMENTAL CRYOBIOLOGY Disorder of thermodynamic equilibrium in “cell- environment” system during formation and growth of extracellular crystal can be compensated by two ways: due to a continuos water flow out of cells or intracellular ice crystal formation at a considerable cytoplasm overcooling. In both cases at quite low temperatures cell damage is inevitable either due to an over- dehydration and cell shrinking or as a result of phenomena, developing during intracellular ice crystal formation (effect of crystallising pressure to a membrane, re-crystallisation). Consequently a transmembrane water flow out of cell should, on one hand, provide a slight dehydration and, on an other hand, to exclude the probability of intracellular ice 4 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 16, 2006, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 16, 2006, №1 бранный поток воды из клетки должен, с одной стороны, обеспечить щадящее обезвоживание, с другой – исключить вероятность внутриклеточного льдообразования или уменьшить количество внутриклеточного льда. Оптимальная скорость охлаждения соответствует наибольшей скорости, при которой еще не образуются кристаллы льда внутри клеток. Роль проникающих криопро- текторов, прежде всего, состоит в том, чтобы при каждой заданной субнулевой температуре умень- шить количество образующегося льда вне- и внутри клеток. Трансмембранные потоки воды и проникаю- щих криопротекторов лимитируются особеннос- тями строения клеточных мембран различных клеток и характеризуются коэффициентами фильтрации (проницаемости для молекул воды) Lp и проницаемости для молекул криопротектора kp. Определенное значение оптимальной скорости замораживания для данного типа клеток обуслов- лено именно индивидуальностью транспортных характеристик их плазматических мембран. Таким образом, возможность количественного прогноза реакции клеток на замораживание для данного температурного режима и определенного типа клеток базируется на знании a priori таких важных биофизических параметров, как Lp и kp, при субнулевых температурах. В работе [1] разработан алгоритм расчета изменения объема и концентрации растворенных внутриклеточных веществ в процессе кристал- лизации клеточной суспензии при наличии проникающего криопротектора. Указанный алгоритм предполагает, что коэффициенты Lp и kp с уменьшением температуры кристаллизующейся суспензии подчиняются аррениусовым зависи- мостям, и мембрана при этом остается интактной 0 0 p p 0 0 0 U TL (T) L (T )exp 1 R T T   = −     ;            −= T T1 TR Uexp)T(k)T(k 0 00 1 0pp , (1) где T0 – исходная температура клеточной суспен- зии (до начала охлаждения); U0 и U1 – энергии активации процесса переноса через плазма- тическую мембрану молекул воды и растворенного вещества соответственно; R0 – универсальная газовая постоянная. Если охлаждение производится со скоростью β, то , T̂d d dt dT0 β= (2) formation or reduce intracellular ice amount. Optimal cooling rate corresponds to the highest rate, when ice crystals have not formed yet inside cells. Transmembrane water flows and those for penetra- tive cryoprotectants are limited by the peculiarities of cell membrane structure of different cells and are characterised by filtration coefficients Lp (permeability for water molecules) and kp (that for cryoprotectant molecules). Certain value of optimal freezing rate for this type of cells is stipulated namely by distinction of transport characteristics of their plasma membranes. Thus, the possibility for quantitative forecasting cell response to freezing for this temperature regimen and a certain cell type is based on a priori knowing such important biophysical parameters as Lp and kp at subzero temperatures. The algorithm for calculating changes in volume and concentration of dissolved intracellular substances during cell suspension crystallisation at the presence of penetrative cryoprotectant was designed in the paper [1]. The mentioned algorithm suggests that Lp and Kp coefficients with a decrease in temperature of crystallising suspension follow Arrhenius dependen- cies, and membrane remains thereby intact 0 0 p p 0 0 0 U TL (T) L (T )exp 1 R T T   = −     ;            −= T T1 TR Uexp)T(k)T(k 0 00 1 0pp , (1) where T0 is initial temperature of cell suspension (before cooling beginning ); U0 and U1 are the activation energies of transfer process through plasma membrane of water molecules and dissolved substan- ce, correspondingly; R0 is universal gas constant. If cooling is realised with rate β, then , T̂d d dt dT 0 β= (2) where T̂ is relative temperature of suspension 0T TT̂= . Extracellular ice is thought to occur at a zero overcooling of extracellular medium and to be under thermodynamic equilibrium with surrounding solution during freezing. The authors [1] neglect the effect, related to curvature and sizes of ice crystals and corresponding Laplace’s effects. The work was aimed to experimentally verify proposed in the paper [1] algorithm for calculating cell volume by comparing experimental data about change in cell volume during cell suspension crystallisation and those estimated, obtained using the 5 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 16, 2006, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 16, 2006, №1 где T̂ – относительная температура суспензии 0T TT̂= . Считается, что внеклеточный лед возникает при нулевом переохлаждении внеклеточной среды и находится в процессе замораживания в термо- динамическом равновесии с окружающим его раствором. Эффектами, связанными с кривизной и размерами кристаллов льда и соответствующими лаплассовыми эффектами, авторы работы [1] пренебрегают. Цель работы – экспериментальная проверка предложенного в работе [1] алгоритма расчета объема клеток путем сравнения эксперимен- тальных данных об изменении объема клеток в процессе кристаллизации клеточной суспензии и расчетных данных, полученных по указанному алгоритму в условиях, соответствующих проведен- ным экспериментам. Материалы и методы Экспериментальный материал исследований – перевиваемая культура клеток почек сирийского хомячка (ВНК-21). Проведенные эксперименты не противоречат “Общим принципам экспериментов на животных”, одобренным Национальным конгрессом по биоэтике (20.09.01 г., Киев, Украина) и согласуются с положениями “Европей- ской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей“ (Страсбург, 1985). Кинетику изменения клеточного объема в условиях внеклеточной кристаллизации изучали световой криомикроскопией [5]. Клетки суспенди- ровали в среде Игла, содержащей 10% сыворотки. Концентрация клеток составляла 9,7×105 клеток в 1мл. В качестве криопротектора использовали глицерин, конечную концентрацию которого варьировали от 2,5 до 10% (объем/объем). Для формирования различной первичной морфологии кристаллов, характер которой существенно влияет на массообмен клетки с окружающей средой [3], суспензию клеток охлаждали в рабочей камере криомикроскопа одноэтапно со скоростью 1°С/мин до –25°С или двухэтапно со скоростью 1°С/мин до температуры начала фазового перехода и далее – со скоростью 5°С/мин до –25°С. Для исключения переохлаждения в суспензию дополнительно вносили затравочные кристаллы AgJ. Скорость отогрева составляла 3°С/мин. Экспериментальные кривые изменения клеточного объема в зависи- мости от субнулевой температуры в процессе замораживания были получены обработкой фотоизображений клеток методом вольюмо- метрии. Учитывая, что клетки почек сирийского mentioned algorithm under conditions, corresponding to performed experiments. Materials and methods As experimental material we used golden hamster kidney cell inoculated culture (BHK-21). The performed experiments do not contradict the “General Principles of Experiments in Animals”, approved by the National Congress on bioethics (20.09.01, Kiev, Ukraine) and correlate with statements of the “European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes” (Strasbourg, 1985). Kinetics of cell volume change under conditions of extracellular crystallisation was studied with light cryomicroscopy [5]. Cells were suspended in 10% serum-contained Eagle’s medium. Cell concentration made 9.7×105 cells in 1 ml. As cryoprotectant we used glycerol, which final concentration varied from 2.5 to 10% (v/v). In order to form different primary crystal morphology, which character considerably affects cell mass exchange with environment [3], cell suspension was one-step cooled down in operating chamber of cryomicroscope with 1°C/min rate down to –25°C or by two-step with 1°C/min rate down to phase transfer beginning temperature and then with 5°C/min down to –25°C. Inoculating AgJ crystals were additionally introduced into suspension to exclude overcooling. Thawing rate was 3°C/min. Experimental curves of cell volume change depending on subzero temperature during freezing were obtained by processing cell photo images with volumetry method. Taking into account the fact, that golden hamster kidneys cells are in the shape close to a sphere (10-12 µm big section diameter) and if knowing a relative change in cell visible section square S/S0 on temperature, a change in relative volume was determined by the ratio 2/3 00 S S V V     = , (3) where S is current square, S0 is initial square, V and V0 are current and initial cell volume, correspondingly. According to the theoretical approaches [1] during intracellular crystallisation an osmotic equilibrium in the system of relatively penetrative π1 and non- penetrative π2 through plasma membrane substances with respect of a volume part of freeze-resistant liquid χ fraction is described with following equations: )g1(yg1 g)y(ˆˆ)g1(ˆ 00 0 in 110out 1 −χ−− α−π−πα−=π ∞ ; )g1(yg1 g)1(ˆ)g1(ˆ 00 020out 2 α−χ−− α−−πα−=π ∞ , (4) where ,/ˆ in 20 out 1 out 1 ππ=π in 20 out 2 out 2 /ˆ ππ=π are norma- 6 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 16, 2006, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 16, 2006, №1 хомячка имеют близкую к сферической форму (диаметр большого сечения 10-12 мкм) и зная относительное изменение площади видимого сечения клетки S/S0 от температуры, изменение относительного объема определяли по соотно- шению 2/3 00 S S V V     = , (3) где S – текущая площадь; S0 – исходная площадь; V и V0 – текущий и исходный объем клетки соответственно . Согласно теоретическим подходам [1] при внеклеточной кристаллизации осмотическое равновесие в системе относительно проникающего π1 и непроникающего π2 через плазматическую мембрану веществ с учетом объемной доли незамерзающей жидкой фракции χ описывается следующими равенствами: )g1(yg1 g)y(ˆˆ)g1(ˆ 00 0 in 110out 1 −χ−− α−π−πα−=π ∞ ; )g1(yg1 g)1(ˆ)g1(ˆ 00 020out 2 α−χ−− α−−πα−=π ∞ , (4) где ,/ˆ in 20 out 1 out 1 ππ=π in 20 out 2 out 2 /ˆ ππ=π – приве- денные значения внеклеточного осмотического давления веществ: проникающего 00 0 in 101out 1 V/Vg1 )V/V(g − α−π−π=π ∞ ; непроникающего 00 in 2002out 2 V/Vg1 g)1( − πα−−π =π ∞ , in 1π̂ – приведенное значение внутриклеточного осмотического давления проникающего через плазматическую мембрану вещества in 20 in 1 in 1 /ˆ ππ=π , in 1π – осмотическое давление проникающего через плазматическую мембрану вещества внутри клетки; in 20π – начальное значение суммарного осмотического давления непроникающих веществ внутри клетки; ∞∞ ππ 21 , – асимптотические значе- ния осмотического давления проникающего и непроникающего через плазматическую мембрану веществ, соответствующие равномерному их рас- пределению вдоль системы; ∞∞ ππ 21 ˆ,ˆ – приведен- lised values of extracellular osmotic pressure of substances: for penetrative 00 0 in 101out 1 V/Vg1 )V/V(g − α−π−π=π ∞ ; non-penetrative 00 in 2002out 2 V/Vg1 g)1( − πα−−π =π ∞ , in 1π̂ is normalised value of intracellular osmotic pressure of penetrative through plasma membrane substance in 20 in 1 in 1 /ˆ ππ=π , in 1π is osmotic pressure of penetrative through plasma membrane substance inside a cell; in 20π is initial value of total osmotic pressure of non-penetrative substances inside a cell; ∞∞ ππ 21 , are asymptotic values of osmotic pressure of penetrative and non-penetrative through plasma membrane substances, corresponding to their uniform distribution along the system; ∞∞ ππ 21 ˆ,ˆ are normalised asymptotic values of osmotic pressure of substances : for penetrative in 2011 /ˆ ππ=π ∞∞ ; non-penetrative in 2022 /ˆ ππ=π ∞∞ ; y is relative cell volume 0V Vy = ; g0 is initial value ratio of cell total volume to the whole volume of cell suspension; α is a volume part of osmotically inactive intracellular substances. Differential equation system, describing kinetics of change in cell relative volume and concentrations of penetrative and non-penetrative through plasma membrane substances inside a cell during extracellular crystallisation is of the following form : [ ] y 1ˆT̂/)1T̂(aexpp T̂d dy in 11     − α− α−+πσ−= ,ˆ g)1()g1(ˆ g)y(ˆ)g1(ˆ 1 out 2 002 0 in 101 1     π      α−−α−π α−π−α−πσ+− ∞ ∞ y 1ˆ{[ y p T̂d ˆd in 11 in 1 − α− α−+πσ α− =π (5) 7 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 16, 2006, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 16, 2006, №1 ные асимптотические значения осмотического давления веществ: проникающего in 2011 /ˆ ππ=π ∞∞ ; непроникающего in 2022 /ˆ ππ=π ∞∞ ; y – относительный объем клетки 0V Vy = ; g0 – начальное значение отношения суммарного объема клеток к полному объему клеточной суспензии; α – объемная доля осмотически неактивных внутриклеточных веществ. Система дифференциальных уравнений, опи- сывающая кинетику изменения относительного объема клетки и концентраций проникающего и непроникающего через плазматическую мембрану веществ внутри клетки в процессе внеклеточной кристаллизации, имеет вид: [ ] y 1ˆT̂/)1T̂(aexpp T̂d dy in 11     − α− α−+πσ−= ,ˆ g)1()g1(ˆ g)y(ˆ)g1(ˆ 1 out 2 002 0 in 101 1     π      α−−α−π α−π−α−πσ+− ∞ ∞ y 1ˆ{[ y p T̂d ˆd in 11 in 1 − α− α−+πσ α− =π ]ˆˆ)1[(]ˆ)Ф1( in 111 out 2out1 ×π−πσ−×πσ+− ∞ )ˆФˆ(q]T̂/)1T̂(exp[ out 2out in 1 π−π−−α× × × ]},T̂/)1T̂(bexp[) − (5) где in 1 0 1 0 out 2 0 0 ˆ(1 g ) (y )gФ ; ˆ (1 g ) (1 )g ∞ ∞ π − α − π − α= π − α − − α 0 0Tp βτ ≡ ; 0 0 1 0 (T )q ; (T ) τ≡ τ 0 0 0 Ua ; R T ≡ 1 0 0 Ub ; R T ≡ 1in 20p00 )L( −πγ=τ ; 1 p01 )k( −γ=τ , здесь γ0 – исходное поверхностно-объемное отношение клетки; σ1 – коэффициент отражения плазматической мембраны для проникающего через мембрану вещества. Уравнения (5) решали численно методом Рунге- Кутта 4-го порядка. Кинетику изменения концентрации C внекле- точного раствора при расчетах задавали аналити- ]ˆˆ)1[(]ˆ)Ф1( in 111 out 2out1 ×π−πσ−×πσ+− ∞ )ˆФˆ(q]T̂/)1T̂(exp[ out 2out in 1 π−π−−α× × × ]},T̂/)1T̂(bexp[) − (5) where in 1 0 1 0 out 2 0 0 ˆ(1 g ) (y )gФ ; ˆ (1 g ) (1 )g ∞ ∞ π − α − π − α= π − α − − α 0 0Tp βτ ≡ ; 0 0 1 0 (T )q ; (T ) τ≡ τ 0 0 0 Ua ; R T ≡ 1 0 0 Ub ; R T ≡ 1in 20p00 )L( −πγ=τ ; 1 p01 )k( −γ=τ here γ0 is initial surface-volume cell ratio; σ1 is coefficient of plasma membrane reflection for penetrative through membrane substance. Equation (5) was solved with Runge-Kutta method of the 4th order. Kinetics of change in extracellular solution concentration C during calculations was analytically approximated using melting phase diagram of glycerol aqueous solution [4] С=–8,19⋅10–4T3+0,58T2–1,40⋅102+1,12⋅104, (6) where T is current temperature. Transport coefficients Lp and kp in equations (5) were chosen as the best matching of estimated data with experimental dependencies of cell volume change on temperature during crystallisation. Results and discussion Fig. 1 shows an osmotic reaction of golden hamster kidney cells during formation and develop-ment of extracellular ice crystals of different morphology. There is a considerable decrease in cell size with temperature decrease. During thawing a rehydration and gradual recovery of initial cell size are observed. Fig.2 demonstrates the estimated and experimental kinetic curves of change in relative cell volume under different conditions of cell suspension freezing, testifying to their satisfactory coincidence. Fig. 3 and 4 show the obtained in crystallisation area of cell suspension dependencies of efficient coefficients for membrane permeability of golden hamster kidney cells for glycerol, Kp and water, Lp molecules on the initial cryoprotectant concentration in the medium, and on cooling rate as well. Permea- bility coefficients reduce with the augmentation of cryoprotectant initial concentration in suspension according to the mentioned below regression equations: during cooling cell suspension by one-step program Lp= 11.3760 – 1.0741C; kp=8.9655–0.8467C 8 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 16, 2006, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 16, 2006, №1 чески аппроксимацией фазовой диаграммы плавления водного раствора глицерина [4] С=–8,19⋅10–4T3+0,58T2–1,40⋅102+1,12⋅104, (6) где Т – текущая температура. Транспортные коэффициенты Lp и kp в уравне- ниях (5) подбирали из условия наилучшего совпадения расчетных данных с эксперимен- тальными зависимостями изменения клеточного объема от температуры в процессе кристал- лизации. Результаты и обсуждение Осмотическая реакция клеток почек сирий- ского хомячка в процессе формирования и развития внеклеточных кристаллов льда различной морфо- логии показана на рис. 1. По мере снижения температуры размер клеток заметно уменьшается. При отогреве наблюдаются регидратация и постепенное восстановление исходного размера клеток. На рис.2 приведены расчетные и эксперимен- тальные кинетические кривые изменения относи- Рис. 1. Кинетика процесса замораживания-отогрева клеток почек сирийского хомячка по программам: одноэтапной (а) и двухэтапной (б) при содержании в суспензионной среде 10%-й концентрации глицерина. Fig. 1. Kinetics of freeze-thawing process of golden hamster kidney cells by the programs: one-step (a) and two-step (b) at the presence of 10% glycerol concentration in suspension medium. a a б b 1 T=24°C 2 T=–3°C 3 T=–10°C 4 T=–25°C 5 T=–10°C 6 T=–6°C 7 T=–3,5°C 8 T=–3°C 9 T=0°C 1 T=24°C 2 T=–4°C 3 T=–4,5°C 4 T=–10°C 5 T=–25°C 6 T=–4,5°C 7 T=–2,5°C 8 T=–2°C 9 T=24°C by two-step one Lp=22.3170–9.02411n(C); kp=17.5720– 7.10531n(C) Permeability coefficients Lp and kp are inter- dependent kp=Lp υ σ− K RT)1( , where υ is partial molal volume of dissolved substance; K is the constant, determined for this membrane and this dissolved substance [2, 6, 7]. Therefore dependencies of these coefficients on freezing conditions for cell suspension are similar. According to theoretical notions of the paper [1] the coefficient of membrane permeability for penetrative cryoprotectant kp molecules depends on temperature (see formula 1) but does not depend on cooling rate. By our data the value of efficient permeability coefficient for glycerol molecules kp reduces with the augmentation of initial concentration of solution (see Fig. 3), that can be stipulated by a decrease in crystallisation temperature of extracellular solution at 9 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 16, 2006, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 16, 2006, №1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 -25 -20 -15 -10 -5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 -25 -20 -15 -10 -5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 -25 -20 -15 -10 -5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 -25 -20 -15 -10 -5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 -25 -20 -15 -10 -5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 -25 -20 -15 -10 -5 0 Рис. 2. Зависимость относительного объема клеток почек сирийского хомячка от субнулевой температуры при замораживании клеточной суспензии по программам: одноэтапной (а, б, в) и двухэтапной (г, д, е): a, г – 2,5% глицерина, б, д – 5,0% глицерина, в, е – 10% глицерина в суспензионной среде; – экспериментальные данные, сплошная линия – теоретический расчет. Fig. 2. Dependence of relative volume of golden hamster kidney cells on subzero temperature during freezing cell suspension by the programs: one-step (a, b, c) and two-step (d, e, f): a, d – 2.5% glycerol, b, e – 5.0% glycerol, c, e – 10% glycerol in suspension medium; open circles represent experimental data, solid line represents theoretical calculation. a a б b в c е f г d д e Температура, °С Temperature, °C Температура, °С Temperature, °C Температура, °С Temperature, °C Температура, °С Temperature, °C Температура, °С Temperature, °C Температура, °С Temperature, °C О тн ос ит ел ьн ы й об ъе м R el at iv e vo lu m e О тн ос ит ел ьн ы й об ъе м R el at iv e vo lu m e О тн ос ит ел ьн ы й об ъе м R el at iv e vo lu m e О тн ос ит ел ьн ы й об ъе м R el at iv e vo lu m e О тн ос ит ел ьн ы й об ъе м R el at iv e vo lu m e О тн ос ит ел ьн ы й об ъе м R el at iv e vo lu m e 10 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 16, 2006, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 16, 2006, №1 тельного объема клеток в различных условиях замораживания клеточной суспензии, свидетельст- вующие об их удовлетворительном совпадении. На рис.3 и 4 представлены полученные в области кристаллизации клеточной суспензии зависимости эффективных коэффициентов прони- цаемости мембран клеток почек сирийского хомячка для молекул глицерина kp и воды Lp от исходной концентрации криопротектора в среде, а также скорости охлаждения. Коэффициенты проницаемости уменьшаются с увеличением исходной концентрации криопротектора в суспен- зии согласно нижеприведенным уравнениям регрессии: при охлаждении клеточной суспензии по одноэтапной программе Lp=11,3760–1,0741С; kp=8,9655–0,8467C, двухэтапной Lp=22,3170–9,0241ln(C); kp=17,5720–7,1053ln(C). Коэффициенты проницаемости Lp и kp взаимо- связаны kр = Lр υ σ− K RT)1( , где υ – парциальный моляльный объем раство- ренного вещества; K – константа, определенная для данной мембраны и данного растворенного вещества [2, 6, 7]. Поэтому зависимости этих коэффициентов от условий замораживания клеточной суспензии аналогичны. Согласно теоретическим представлениям работы [1] коэффициент проницаемости мембраны для молекул проникающего криопротектора kp зависит от температуры (см. формулу 1) и не зависит от скорости охлаждения. По нашим данным значение эффективного коэффициента проницаемости для молекул глицерина kp уменьшается с повышением исходной концентрации раствора (см. рис. 3), что может быть обусловлено понижением температуры кристал- лизации внеклеточного раствора при росте концентрации криопротектора в криозащитной среде (закон Аррениуса). Другие расхождения экспериментальных и расчетных данных объяс- няются не учтенными в теоретическом алгоритме расчета эффектами кривизны кристаллов льда, образующихся в процессе замораживания клеточ- ной суспензии, и переохлаждения, возникающего в тонкой пленке кристаллизующегося раствора. В соответствии с полученными результатами скорость охлаждения при более низких концентра- циях криопротектора влияет на кривизну образую- щихся кристаллов льда значительней, чем при высоких концентрациях. Другими словами, 0 2 4 6 8 10 12 2 4 6 8 10 Концентрация,% Concentration, % Ко эф ф иц ие нт п ро ни ца ем ос ти , k p× 10 9 , м /с Pe rm ea bi lit y co ef fic ie nt , k p× 10 9 , m /s Рис. 3. Зависимость коэффициента проницаемости плазматических мембран клеток почек сирийского хомячка для молекул глицерина kp от его исходной концентрации в суспензионной среде при заморажи- вании по программам: – одноэтапной; – двух- этапной. Fig. 3. Dependency of permeability coefficient of plasma membranes of golden hamster kidney cells for glycerol mol- ecules kp on its initial concentration in suspension medium during freezing by the programs: – one-step; – two- step. 0 2 4 6 8 10 12 14 2 4 6 8 10 Концентрация,% Concentration, % Ко эф ф иц ие нт ф ил ьт ра ци и, L p× 10 14 , м /H ⋅с Fi ltr at io n co ef fic ie nt , L p× 10 14 , m /H ⋅с Рис. 4. Зависимость коэффициента фильтрации Lp плазматических мембран клеток почек сирийского хомячка от исходной концентрации глицерина в суспензионной среде при замораживании по програм- мам: – одноэтапной; – двухэтапной. Fig. 4. Dependency of filtration coefficient, Lp of plasma membranes of golden hamster kidney cells on initial con- centration of glycerol in suspension medium during freez- ing by the programs: – one-step; – two-step. a growth of cryoprotectant concentration in cryo- protective medium (Arrhenius law). Other divergence in experimental and estimated data are explained by 11 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 16, 2006, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 16, 2006, №1 unaccounted in theoretical calculation algorithm effects of curvature in ice crystals, formed during cell suspension freezing and overcooling, occurring in a thin film of crystallised solution. According to the results obtained cooling rate at lower cryoprotectant concentrations affects the curvature of formed ice crystals in greater extent than under high concen- trations. By other words, an increase in initial concentration of cryoprotectant into extracellular medium much strongly affects the curvature of extracellular crystals than cooling rate. As a result, the effect of crystal curvature dependency on cooling rate under high initial cryoprotectant concentrations is levelled. During freezing cell membrane can undergo significant physical and chemical changes, not leading to its simple damage. Therefore the suggestion about preservation of membrane intactness during cell suspension freezing may also make some corrections in divergence of experimental and estimated data. Values of membrane transport characteristics possibly depend on water and cryoprotectant flow rate through it. The distortion of cell membrane shape during dehydration may also affect the rate of mass exchange with surrounding medium due to diffusive limitations in membrane-adjacent layers of liquid [2]. In spite of mentioned divergence in theoretical and estimated data the degree of their coincidence, taking into account theoretical model approximations accepted, can be considered as satisfactory. Conclusions Described theoretical model can be applied for calculating important for cryobiology effects of cell dehydration and overcooling, as well as for concentra- ting extra- and intracellular substances. Experimental dependencies of cell volume on temperature during cell suspension crystallisation can be used to determine transport parameters of cell membranes: filtration coefficient, LP and the one of permeability for cryopro- tectant kP. In addition, described in this work approach of combining experimental investigations and theoretical calculations can be applied for evaluating concentrations of intracellular substances and efficient overcooling of cytoplasm using only the data about cell volume dependency on temperature during freezing. повышение исходной концентрации криопро- тектора во внеклеточной среде влияет на кривизну внеклеточных кристаллов сильнее, чем скорость охлаждения. В результате эффект зависимости кривизны кристаллов от скорости охлаждения при больших исходных концентрациях криопротектора нивелируется. В процессе замораживания мем- брана клеток может претерпевать существенные физико-химические изменения, не приводящие к ее однозначному повреждению. Поэтому предпо- ложение о сохранении интактности мембраны при замораживании клеточной суспензии также может внести коррективы в расхождение экспери- ментальных и расчетных данных. Возможно, что значения транспортных характеристик мембран зависят от скорости потоков воды и криопро- тектора через них. Искажение формы клеточной мембраны в процессе обезвоживания также может влиять на скорость массообмена клеток с окружающей их средой вследствие диффузионных ограничений в примембранных слоях жидкости [2]. Несмотря на указанные расхождения в теоре- тических и расчетных данных, степень их совпаде- ния, учитывая принятые в теоретической модели приближения, можно считать удовлетворительной. Выводы Описанную теоретическую модель можно применить для расчета важных с точки зрения криобиологии эффектов обезвоживания и пере- охлаждения клеток, а также концентрирования вне- и внутриклеточных веществ. Экспериментальные зависимости клеточного объема от температуры в процессе кристаллизации клеточной суспензии могут быть использованы для определения транспортных параметров клеточных мембран – коэффициентов фильтрации Lp и проницаемости для криопротектора kp. Кроме того, описанный в данной работе подход сочетания экспериментальных исследований и теоретических расчетов может быть применен для оценки концентрации внутри- клеточных веществ и эффективного переохлаж- дения цитоплазмы с использованием только данных о зависимости объема клеток от температуры при замораживании. Литература Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспен- зий.– Киев: Наук.думка, 1994.-143 с. Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт: Пер.с англ.– М.: Мир,1980.– 150 с. Кулешова Л.Г., Розанов Л.Ф. Роль структуры внеклеточного льда в процессе криоповреждения клеток // Модели- рование криобиологических процессов.– Харьков, 1988.– С. 25-34. 1. 2. 3. References Gordienko E.A., Pushkar N.S. Physical grounds of low temperature preservation of cell suspensions.– Kiev: Naukova Dumka, 1994.– 143 p. Kotyk A., Yanachek K. Membrane transport: Transl. from Engl.– Moscow: Mir, 1980.– 150 p. Kuleshova L.G., Rozanov L.F. Role of intracellular ice structure in process of cell cryodamages / In: Modelling of cryobiological processes.– Kharkov, 1988.– P. 25-34. 1. 2. 3. 12 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 16, 2006, №1 ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 16, 2006, №1 Pushkar N.S., Belous A.M., Itkin Yu.A. et al. Low temperature crystallisation in biological systems.– Kiev: Naukova Dumka, 1977.– 243 p. Patent 13671 (Ukraine) IPC4 G02B21/28. Device for cryomicroscopic investigations / O.M. Novikov, L.G. Kulesho- va, S.V. Blokhin, S.T. Olejnik. Applied for 24.02.84. Published 25.04.97.– Bull. N2.– P.3.1.309. Kedem O., Katchalsky A. Thermodynamic analysis of the permeability of biological membranes to non-electrolytes // Biochim. Biophys. Acta.– 1958.– Vol. 27, N2.– P.229-246. Kedem O., Katchalsky A. A physical interpretation of the phenomenological coefficients of membrane permeability // J. Gen. Physiol.– 1961.– Vol. 45, N2.– P. 143-179. Accepted in 3.08.2004 Пушкарь Н.С., Белоус А.М., Иткин Ю.А. и др. Низко- температурная кристаллизация в биологических систе- мах.– Киев: Наук. думка, 1977.– 243 с. Пат. 13671(Україна) МПК4G02В21/28. Пристрій для кріомікроскопічних досліджень / О.М. Новіков, Л.Г. Кулє- шова, С.В. Блохін, С.Т. Олійник. Заявлено 24.02.84. Опубл.25.04.97.– Бюл. №2.-С.3.1.309. Kedem O., Katchalsky A. Thermodynamic analysis of the permeability of biological membranes to non-electrolytes // Biochim. Biophys. Acta.– 1958.– Vol. 27, N2.– P.229-246. Kedem O., Katchalsky A. A physical interpretation of the phenomenological coefficients of membrane permeability // J. Gen. Physiol.– 1961.– Vol. 45, N2.– P. 143-179. Поступила 3.08.2004 4. 5. 6. 7. 4. 5. 6. 7.

Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации

Репозитарії

Схожі ресурси