Криочувствительность мезенхимальных стромальных клеток, криоконсервированных в составе носителей на основе скелетов морских губок Ianthella basta
В работе представлены результаты экспериментальных исследований по использованию скелетов морской
 губки Ianthella basta в качестве носителей для мезенхимальных стромальных клеток человека (МСК), их биосовместимости
 с данными клетками, а также оценка чувствительности клеток, растущи...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Дата: | 2016 |
| Автори: | , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2016
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137367 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Криочувствительность мезенхимальных стромальных клеток, криоконсервированных в составе носителей на основе скелетов морских губок Ianthella basta / В.В. Муценко, Е.Ю. Рогульская, Ю.А. Петренко, Г. Эрлих, С.П. Мазур, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 1. — С. 13–23. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860258193251237888 |
|---|---|
| author | Муценко, В.В. Рогульская, Е.Ю. Петренко, Ю.А. Эрлих, Г. Мазур, С.П. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. |
| author_facet | Муценко, В.В. Рогульская, Е.Ю. Петренко, Ю.А. Эрлих, Г. Мазур, С.П. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. |
| citation_txt | Криочувствительность мезенхимальных стромальных клеток, криоконсервированных в составе носителей на основе скелетов морских губок Ianthella basta / В.В. Муценко, Е.Ю. Рогульская, Ю.А. Петренко, Г. Эрлих, С.П. Мазур, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 1. — С. 13–23. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | В работе представлены результаты экспериментальных исследований по использованию скелетов морской
губки Ianthella basta в качестве носителей для мезенхимальных стромальных клеток человека (МСК), их биосовместимости
с данными клетками, а также оценка чувствительности клеток, растущих в составе этих носителей, к криоконсервированию
под защитой 10% ДМСО и 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота по методу, разработанному для суспензии
МСК (медленное охлаждение со скоростью 1 град/мин, быстрый отогрев при 37°С). С помощью кислотно-щелочного гидролиза
из скелетов морской губки Ianthella basta были получены сетчатые носители, состоящие из хитиновых фибрилл. В ходе
культивирования in vitro данные носители обеспечивали адгезию, миграцию и пролиферацию МСК. После криоконсервирования
наблюдалось значительное снижение жизнеспособности клеток, при этом их метаболическая активность составляла
(46,8 ± 5,8)% по отношению к нативным образцам и не уменьшалась на первые сутки рекультивирования. Из полученных
результатов следует, что скелеты морской губки Ianthella basta представляют собой новый перспективный источник носителей
для использования в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Данная работа может послужить основой для
дальнейшей разработки методов криоконсервирования стволовых клеток в составе трехмерных тканеинженерных конструкций.
У роботі представлено результати експериментальних досліджень, спрямованих на використання скелетів
морської губки Ianthella basta в якості носіїв для мезенхімальних стромальних клітин людини (МСК), їх біосумісності з цими
клітинами, а також оцінка кріочутливості клітин, які ростуть у складі цих носіїв, до кріоконсервування під захистом 10%
ДМСО та 20% фетальної сироватки крупної рогатої худоби за методом, розробленим для суспензії МСК (повільне охолодження
зі швидкістю 1 град/хв, швидкий відігрів при 37°С). За допомогою кислотно-лужного гідролізу зі скелетів морської губки
Ianthella basta були отримані сітчасті носії, утворені з хітинових фібрил. У ході культивування in vitro ці носії забезпечували
адгезію, міграцію та проліферацію МСК. Після кріоконсервування спостерігалося значне зниження життєздатності клітин,
при цьому їх метаболічна активність складала (46,8 ± 5,8)% по відношенню до нативних зразків та не зменшувалася на
першу добу рекультивування. На підставі одержаних результатів встановлено, що скелети морської губки Ianthella basta є
новим перспективним джерелом носіїв для використання в тканинній інженерії та регенеративній медицині. Дана робота
може бути основою для подальшої розробки методів кріоконсервування стовбурових клітин у складі тривимірних тканинноінженерних
конструкцій.
This paper presents our findings on using skeletons of marine sponge Ianthella basta as the carriers for human
mesenchymal stromal cells (MSC), evaluating their biocompatibility with the cells, as well as the assessment of cryosensitivity of the
cells, growing within these carriers to cryopreservation under protection of 10% DMSO and 20% fetal bovine serum according to the
method developed for MSC suspension (slow cooling with 1 deg/min rate, rapid thawing at 37°С). Network-like chitin carriers
consisting of chitin fibrils were derived from marine sponge Ianthella basta skeletons by acid-base hydrolysis. During culturing
in vitro these carriers supported adhesion, migration and proliferation of MSCs. After cryopreservation we observed a decrease in
cell viability with their metabolic activity of 46.8±5.8% in respect to the native specimens and it did not reduce to day 1 of reculture.
As proceeded from the reported findings, the skeletons from marine sponge Ianthella basta are the new promising source for
carriers to be used in tissue engineering and regenerative medicine. This research may serve the basis for further developing the
cryopreservation methods for stem cells within 3-D tissue-engineered scaffolds.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:52:19Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 57.043: 576.314.4: 593.4-174.11
В.В. Муценко1*, Е.Ю. Рогульская1, Ю.А. Петренко1,
Г. Эрлих2, С.П. Мазур1, Н.А. Волкова1, А.Ю. Петренко1
Криочувствительность мезенхимальных стромальных клеток,
криоконсервированных в составе носителей на основе скелетов
морских губок Ianthella basta
UDC 57.043: 576.314.4: 593.4-174.11
V.V. Mutsenko1*, O.Yu. Rogulska1, Yu.A. Petrenko1,
H. Ehrlich2, S.P. Mazur1, N.A. Volkova1, A.Yu. Petrenko1
Cryosensitivity of Mesenchymal Stromal Cells Cryopreserved
Within Marine Sponge Ianthella basta Skeleton-Based Carriers
Реферат: В работе представлены результаты экспериментальных исследований по использованию скелетов морской
губки Ianthella basta в качестве носителей для мезенхимальных стромальных клеток человека (МСК), их биосовместимости
с данными клетками, а также оценка чувствительности клеток, растущих в составе этих носителей, к криоконсервированию
под защитой 10% ДМСО и 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота по методу, разработанному для суспензии
МСК (медленное охлаждение со скоростью 1 град/мин, быстрый отогрев при 37°С). С помощью кислотно-щелочного гидролиза
из скелетов морской губки Ianthella basta были получены сетчатые носители, состоящие из хитиновых фибрилл. В ходе
культивирования in vitro данные носители обеспечивали адгезию, миграцию и пролиферацию МСК. После криоконсервирова-
ния наблюдалось значительное снижение жизнеспособности клеток, при этом их метаболическая активность составляла
(46,8 ± 5,8)% по отношению к нативным образцам и не уменьшалась на первые сутки рекультивирования. Из полученных
результатов следует, что скелеты морской губки Ianthella basta представляют собой новый перспективный источник носи-
телей для использования в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Данная работа может послужить основой для
дальнейшей разработки методов криоконсервирования стволовых клеток в составе трехмерных тканеинженерных конструкций.
Ключевые слова: хитин, морские губки, адгезивные клетки, суспензия клеток, тканеинженерные конструкции,
мезенхимальные стромальные клетки, криоконсервирование.
Реферат: У роботі представлено результати експериментальних досліджень, спрямованих на використання скелетів
морської губки Ianthella basta в якості носіїв для мезенхімальних стромальних клітин людини (МСК), їх біосумісності з цими
клітинами, а також оцінка кріочутливості клітин, які ростуть у складі цих носіїв, до кріоконсервування під захистом 10%
ДМСО та 20% фетальної сироватки крупної рогатої худоби за методом, розробленим для суспензії МСК (повільне охолодження
зі швидкістю 1 град/хв, швидкий відігрів при 37°С). За допомогою кислотно-лужного гідролізу зі скелетів морської губки
Ianthella basta були отримані сітчасті носії, утворені з хітинових фібрил. У ході культивування in vitro ці носії забезпечували
адгезію, міграцію та проліферацію МСК. Після кріоконсервування спостерігалося значне зниження життєздатності клітин,
при цьому їх метаболічна активність складала (46,8 ± 5,8)% по відношенню до нативних зразків та не зменшувалася на
першу добу рекультивування. На підставі одержаних результатів встановлено, що скелети морської губки Ianthella basta є
новим перспективним джерелом носіїв для використання в тканинній інженерії та регенеративній медицині. Дана робота
може бути основою для подальшої розробки методів кріоконсервування стовбурових клітин у складі тривимірних тканинно-
інженерних конструкцій.
Ключові слова: хітин, морські губки, адгезивні клітини, суспензія клітин, тканинно-інженерні конструкції, мезенхімальні
стромальні клітини, кріоконсервування.
Abstract: This paper presents our findings on using skeletons of marine sponge Ianthella basta as the carriers for human
mesenchymal stromal cells (MSC), evaluating their biocompatibility with the cells, as well as the assessment of cryosensitivity of the
cells, growing within these carriers to cryopreservation under protection of 10% DMSO and 20% fetal bovine serum according to the
method developed for MSC suspension (slow cooling with 1 deg/min rate, rapid thawing at 37°С). Network-like chitin carriers
consisting of chitin fibrils were derived from marine sponge Ianthella basta skeletons by acid-base hydrolysis. During culturing
in vitro these carriers supported adhesion, migration and proliferation of MSCs. After cryopreservation we observed a decrease in
cell viability with their metabolic activity of 46.8±5.8% in respect to the native specimens and it did not reduce to day 1 of reculture.
As proceeded from the reported findings, the skeletons from marine sponge Ianthella basta are the new promising source for
carriers to be used in tissue engineering and regenerative medicine. This research may serve the basis for further developing the
cryopreservation methods for stem cells within 3-D tissue-engineered scaffolds.
Key words: chitin, marine sponges, adherent cells, cell suspension, tissue-engineered constructs, mesenchymal stromal cells,
cryopreservation.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61016;
тел.: (+380 57) 373-41-35, факс: (+380 57) 373-30-84,
электронная почта: v.v.mutsenko@gmail.com
*To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61016;
tel.:+380 57 3734135, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: v.v.mutsenko@gmail.com
1Department of Cryobiochemistry, Institute for Problems of Cryo-
biology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of
Ukraine, Kharkov, Ukraine
2Department of Biomineralogy and Extreme Biomimetics, Institute
of Experimental Physics, Freiberg Technical University, Freiberg,
Germany
1Отдел криобиохимии, Институт проблем криобиологии и
криомедицины НАН Украины, г. Харьков
2Отдел биоминералогии и экстремальной биомиметики, Институт
экспериментальной физики, Фрайбергский технический
университет, г. Фрайберг, Германия
Поступила 25.11.2014
Принята в печать 17.12.2015
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2016. – Т. 26, №1. – С. 13–23.
© 2016 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received November, 25, 2014
Accepted December, 17, 2015
Probl Cryobiol Cryomed 2016; 26(1): 13–23.
© 2016 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
оригинальное исследование research article
14 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
В настоящее время для криоконсервирования
мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в
виде суспензии общепринятым считается метод,
включающий медленное охлаждение (1 град/мин)
до –80°С с последующим погружением в жидкий
азот и быстрый отогрев, а также применение
10%-го ДМСО и 20% эмбриональной сыворотки
крупного рогатого скота, который обеспечивает
высокую жизнеспособность криоконсервирован-
ных МСК [8]. Криоустойчивости клеток в суспен-
зии способствуют их сферическая форма и относи-
тельно свободное расположение в среде, что
облегчает изменение объема клеток в ответ на
увеличение концентрации веществ во внеклеточной
среде и дает возможность избежать механичес-
кого повреждения движущимся фронтом растущих
кристаллов льда [1]. Такие возможности исклю-
чаются, если клетки находятся в распластанном
состоянии, а их положение фиксируется межкле-
точными контактами и/или контактами с субстра-
том [3, 19].
На современном этапе развития тканевой инже-
нерии МСК являются наиболее востребованным
клеточным компонентом, при этом все более ак-
туальной становится разработка методов криокон-
сервирования сформированных тканеподобных
структур со сложной системой межклеточных
контактов. При таком подходе значительно сокра-
щается временной разрыв между клиническим
запросом и возможностью предоставления необхо-
димого тканеинженерного имплантата, поскольку
подготовка носителя, выделение и экспансия
клеток, зеселение их в носитель, а также дальней-
шее культивирование и дифференцировка являются
длительными процедурами.
Большое внимание уделяется также вопросам
модификации уже существующих носителей,
поиску и созданию новых, что обусловлено разно-
образием требований к их характеристикам и
параметрам в зависимости от конечной цели
использования. В настоящее время вызывает
интерес уникальный биотехнологический потен-
циал морских губок, которые могут стать источ-
ником новых альтернативных носителей, структу-
рированность которых имеет природный характер.
Так, в составе морских губок отряда Verongida
был обнаружен α-хитин [6, 7]. В частности, из
губки Ianthella basta, одного из представителей
данного отряда, были получены новые уникально
структурированные плоские сетчатые носители,
состоящие из поперечно сшитых хитиновых
волокон [4]. Однако биосовместимость данных
носителей с МСК человека исследована не была.
Более того, в литературе отсутствуют данные о
криоконсервировании хитиновых носителей, полу-
ченных из морских губок.
Currently, the conventional method for cryopreser-
vation of suspended mesenchymal stromal cells
(MSCs), providing their high post-thaw viability, inclu-
des the application of 10% DMSO and 20% fetal
bovine serum, slow (1 deg/min) cooling down to –80°C,
immersion into liquid nitrogen and rapid thawing [9].
Cryoresistance in suspended cells is supported by
spherical shape of cells and their free floating in the
medium, facilitating an easy change in cell volume in
response to increasing concentrations of substances
in extra-cellular medium and allowing to avoid
mechanical damage by advancing front of growing ice
crystals [3]. These phenomena are not possible if cells
are flattened and their position is fixed by cell-to-cell
and/or cell-substrate contacts [2, 19].
To date the developing tissue engineering widely
utilizes MSCs, that is why there is a need of novel
cryopreservation methods suitable for the ready tissue-
like structures with a complex system of cell-to-cell
contacts. This approach significantly reduces the time
gap between clinical request and the possibility to supply
a necessary tissue-engineered implant, since the
preparation of a carrier, isolation and expansion of cells,
their seeding into a carrier, as well as further culturing
and differentiation require a long time period.
A great attention is also paid to the modification of
the existing carriers, searching and producing the new
types of them, which is stipulated by a highly diverse
requirements to their characteristics and parameters
preconditioned by the intended application. Currently,
marine sponges have unique biotechnological potential
as a source of new alternative carriers with natural
structure. For example, the marine sponges of the
Verongida order showed the presence of α-chitin [7,
8]. In particular, the Ianthella basta sponges, one of
the representatives of this order, were the source of
new unique structured flattened network-like carriers,
consisting of crosslinked chitin fibers [4]. However,
the biocompatibility of these carriers with human MSCs
has not been investigated yet. Moreover, there are no
reported data on cryopreservation of chitin carriers,
derived from marine sponges.
The research was aimed to study the possibility of
using skeletons of marine sponges Ianthella basta as the
carriers for human mesenchymal stromal cells, assess
their biocompatibility, as well as cryosensitivity of the
cells growing within these carriers to the conventional
cryopreservation method under protection of DMSO.
Materials and methods
To isolate chitin samples the frozen-dried skeletons
of marine sponge Ianthella basta were treated by
acid-base hydrolysis [4, 6]. At the first step the
specimens were placed into 20% acetic acid solution
for 12 hrs at 37°C to dissolve the calcium carbonate
component of sponge and to remove a part of proteins
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
15
Цель работы – исследование возможности ис-
пользования скелетов морских губок Ianthella
basta в качестве носителей для мезенхимальных
стромальных клеток человека, их биосовмести-
мости, а также оценка криочувствительности кле-
ток, растущих на этих носителях, к общепринятому
методу криоконсервирования под защитой ДМСО.
Материалы и методы
Для выделения хитиновых образцов лиофилизи-
рованные скелеты губки Ianthella basta подверга-
ли обработке с использованием кислотно-щелоч-
ного гидролиза [4, 5]. На первом этапе образцы
помещали в 20%-й раствор уксусной кислоты на
12 ч при 37°С для растворения кальций-карбонат-
ной составляющей губки и устранения части
белков и пигментов, после чего многократно про-
мывали дистиллированной водой. На втором этапе
образцы обрабатывали 2,5 M NaOH в течение
суток при 37°С, что необходимо для удаления
оставшейся части белков, минерализованной
составляющей и пигментов. Затем губки промы-
вали дистиллированной водой для достижения рН
6,5 и повторяли цикл обработки до обесцвечивания
носителей. На завершающем этапе очистки носи-
тели помещали в 35%-й раствор перекиси водорода
на 15–20 мин при комнатной температуре c по-
следующей отмывкой дистиллированной водой. Из
деминерализованных образцов получали носители
размером ~ 3×7×0,4 мм.
Флуоресцентный краситель Calcofluor White
(«Sigma», США) избирательно связывается с
хитином и используется для его визуализации [17].
Образец носителя помещали в 0,1%-й раствор
Calcofluor White и инкубировали в течение 10 мин
в темноте. Затем промывали три раза дистилли-
рованной водой и исследовали с использованием
флуоресцентного микроскопа «CETI EpiFluor»
(«CETI», Бельгия).
Предварительную экспансию МСК дермы че-
ловека проводили в среде культивирования α-MEM
(«Sigma»), дополненной 10% эмбриональной
сыворотки (ЭС) крови крупного рогатого скота
(«РАА», Австрия), 50 ед/мл пенициллина и 50 мг/мл
стрептомицина в СО2-инкубаторе при 37°С, 5%
СО2 и 95% влажности. Носители стерилизовали в
70%-м этиловом спирте, тщательно промывали
раствором Хенкса и насыщали культуральной
средой. В емкости из неадгезивного пластика
объемом 20 мл помещали по 10 носителей и суспен-
зию клеток (2×106 в 10 мл), инкубацию их
осуществляли при 37°С в течение 1 ч на радиаль-
ном шейкере «MS1 Minishaker I KA» («Sigma-Ald-
rich», Германия) при 500 об/мин для обеспечения
равномерного заселения. Через 12 ч заселенные
and pigments, and then repeatedly washed with a
distilled water. At the second step the samples were
treated with 2.5 M NaOH within 24 hrs at 37°C to
remove the remaining proteins, mineralized component
and pigments. Then sponges were washed with distilled
water until reaching pH 6.5, and thereafter the whole
treatment cycles were repeated till the carrier disco-
loration. At the final stage of purification the carriers
were placed into 35% hydrogen peroxide for 15–20 min
at room temperature, and then washed with distilled
water. The demineralised samples were used to obtain
carriers with ~7×3×0.4 mm dimensions.
Fluorescent dye Calcofluor White (Sigma, USA)
selectively binds to chitin and is used for its visualisation
[5]. The carrier specimens were placed into 0.1%
Calcofluor White solution and dark-incubated for 10
min. Then they were thrice washed with distilled water
and examined with fluorescent microscope CETI
EpiFluor (CETI, Belgium).
The human dermal MSCs were preliminarily
expanded in α-MEM culture medium (Sigma), supple-
mented with 10% fetal bovine serum (FBS) (PAA,
Austria), 50 IU/ml Penicillin and 50 mg/ml Strepto-
mycin, in CO2 incubator at 37°C, 5% CO2 and 95%
humidity. The carriers were sterilized with 70% ethanol,
thoroughly washed with Hanks’ solution and saturated
with culture medium. Afterwards 10 carriers and cell
suspension (2×106 in 10 ml) were placed into 20 ml
non-adhesive plastic vessels, and incubated at 37°C
for 1 hr on radial shaker MS1 Minishaker I KA (Sigma-
Aldrich, Germany) at 500 rpm to ensure an uniform
seeding. After 12 hrs the cell-seeded sponge specimens
were transferred into the wells of 24-well plate
containing 0.5 ml of culture medium, and cultured for
21 days in standard conditions.
For cryopreservation the cell-seeded carriers were
placed into 1 ml cryovials (Nunc, USA), which were
slowly filled with 0.5 ml cryoprotective medium,
comprising culture medium with 10% DMSO and 20%
of FBS. After 10 min equilibration at 4°C the samples
were frozen using the cooling rate of 1 deg/min in
Nalgene Mr. Frosty container (Sigma). After keeping
3 hrs at –80°C in a low temperature refrigerator (Jouan,
France) the samples were transferred into liquid
nitrogen for storage. Samples were thawed in a water
bath at 37°C, cryoprotectant was stepwise removed
using DMEM/F-12.
Cell viability prior to and after cryopreservation was
assessed using Fluorescein diacetate (FDA) and
Propidium iodide (PI) staining. For this purpose the
cell-populated carriers were washed with warm Hanks’
solution and dark-incubated for 10 min in Hanks’
solution with FDA (2 µg/ml) and PI (1 µg/ml). Stained
samples were studied using the LSM 510 META laser
scanning microscope (Carl Zeiss, Germany).
16 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
клетками образцы губок переносили в лунки
24-луночного планшета, содержащие по 0,5 мл
среды культивирования, и продолжали культиви-
рование в стандартных условиях (21 сутки).
Для криоконсервирования носители с клетками
помещали в криопробирки объемом 1 мл («Nunc»,
США) и медленно добавляли 0,5 мл криозащитной
среды, состоящей из среды культивирования с 10%
ДМСО и 20% ЭС. После 10 мин эквилибрации при
4°C образцы замораживали со скоростью охлаж-
дения 1 град/мин в контейнере «Nalgene Mr. Frosty»
(«Sigma»). Контейнер 3 ч выдерживали при –80°С
в низкотемпературном холодильнике («Jouan»,
Франция), после чего пробы переносили для хране-
ния в жидкий азот. Образцы отогревали на водяной
бане при температуре 37°C, криопротектор удаляли
поэтапно с использованием среды DMEM/F-12.
Жизнеспособность клеток до и после криокон-
сервирования оценивали окрашиванием флуорес-
цеиндиацетатом (ФДА) и пропидий йодидом (ПЙ).
Для этого заселенные клетками носители промыва-
ли теплым раствором Хенкса и инкубировали в
течение 10 мин в растворе Хенкса с ФДА (2 мкг/мл)
и ПЙ (1 мкг/мл) в темноте. Окрашенные образцы
исследовали с помощью инвертированного конфо-
кального лазерного сканирующего микроскопа
«LSM 510 META» («Carl Zeiss», Германия).
Для определения метаболической активности
в лунки с исследуемыми образцами вносили среду
культивирования с 10% Alamar Blue (АВ; «Serotec»,
Великобритания), инкубацию осуществляли в тече-
ние 2 ч при 37°С. Затем среду отбирали из лунок и
определяли в ней уровень восстановления АВ с
использованием планшетного спектрофлуориметра
(«Tecan GENios», Австрия) при волне возбуждения
550 нм и эмиссии 590 нм. Уровень восстановления
АВ выражали в относительных единицах флуорес-
ценции (ОЕФ) и определяли по формуле: уровень
восстановления = (ОЕФк
– ОЕФф)/ОЕФф, где
ОЕФк – уровень флуоресценции в клетках; ОЕФф –
фоновый уровень флуоресценции.
Метаболическую активность клеток оценивали
до криоконсервирования, непосредственно после
размораживания и удаления от криопротектора, а
также через 24 ч после возвращения образцов в
условия культивирования. В качестве контроля
служили нативные образцы (те же образцы до
криоконсервирования).
Для определения нормальности распределения
результатов использовали критерий Шапиро-Уилка.
Данные выражали как среднее значение ± стан-
дартное отклонение (M ± m). Значимость различий
между группами подтверждали t-критерием
Стьюдента для независимых переменных. Статис-
тически значимыми считали отличия при р < 0,05.
To determine metabolic activity we placed culture
medium with 10% Alamar Blue (AB; Serotec, UK)
into the wells with the studied samples and incubated
the samples for 2 hrs at 37°C. The medium was then
collected from the wells and the level of AB reduction
was determined using the plate spectrofluorimeter
(Tecan GENios, Austria) with excitation at 550 nm
and emission at 590 nm. The level of AB reduction
was expressed in relative fluorescence units (RFU)
and determined by the formulae: Level of reduction =
(RFUc – RFUb)/RFUb, where RFUc was relative fluo-
rescence units for cells and RFUb was the value of
background fluorescence.
Cell metabolic activity was assessed prior to
cryopreservation, immediately post-thaw and cryopro-
tectant removal, as well as 24 hrs following the
specimens return to culture conditions. The native
samples served as the control (the same samples
before cryopreservation).
To determine the normality of distribution of the
parameters we used the Shapiro-Wilk test. Data were
expressed as the mean ± standard deviation (M ± m).
The significance of differences between groups was
confirmed by Student t-test for independent variables.
Differences were considered as statistically significant
at p < 0.05.
Results and discussion
After completing purification procedure for frozen-
dried sponge Ianthella basta skeletons (Fig. 1A) we
obtained the colourless flat skeletal fragments having
a cellular structure with a wall thickness of about
0.4 mm (Fig. 1B). Purified fragments preserved the
original structure of sponge skeleton. After cutting
longitudinal cell walls we obtained the rectangular
carriers, which were further used in the study (Fig. 1C).
Microscopy analysis revealed that the obtained
carriers had numerous pores of different shapes and
diameters (from 50 µm to several millimetres)
(Fig. 2A). After Calcofluor White staining the carriers
had a characteristic blue fluorescence, confirming the
presence of chitin (Fig. 2B).
The cells, seeded into carriers, were attached to
walls and flattened on them, getting fibroblast-like
morphology. After 7 days of culture there was a
gradual filling of carrier pores with the cells from the
periphery to the center (Fig. 3B). After 21 days of
culture the formed cell sheets filled entirely the carrier
pore lumens (Fig. 3C).
Thus, the demineralized chitin carriers from marine
sponge Ianthella basta skeletons showed the biocom-
patibility with MSCs in vitro and enabled cell growth
up to the formation of cell sheets filling the pores.
After 21 days of culture the samples were cryopre-
served under protection of 10% DMSO in the presence
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
17
Результаты и обсуждение
После процедуры очистки
лиофилизированных скелетов
губок Ianthella basta (рис. 1, А)
получали бесцветные плоские
фрагменты скелета, имеющие
ячеистое строение с толщиной
стенок ~ 0,4 мм (рис. 1, В). Очи-
щенные фрагменты сохраняли
оригинальную структуру ске-
лета губки. После разрезания
продольных стенок ячеек полу-
чали носители прямоугольной
формы, которые в дальнейшем
использовали в исследовании
(рис. 1, С).
При микроскопировании бы-
ло выявлено, что полученные
носители пронизаны множест-
вом пор различной формы и диа-
метра (от 50 мкм до нескольких
миллиметров) (рис. 2, А). После
окрашивания с помощью Calco-
fluor White носители имели ха-
рактерную голубую флуорес-
ценцию, свидетельствующую о том, что они состоят
из хитина (рис. 2, В).
Клетки, заселенные в носители, прикреплялись
к стенкам и распластывались на них, приобретая
фибробластоподобный вид. Через 7 суток культи-
вирования наблюдалось постепенное заполнение
пор носителя клетками от периферии к центру
(рис. 3, В). На 21-е сутки культивирования сформи-
рованные клеточные пласты целиком заполняли
просветы пор носителя (рис. 3, С).
Таким образом, деминерализованные хитино-
of 20% FBS according to the standard protocol for
dermal MSCs suspension cryopreservation, which
enabled to preserve metabolic activity of frozen-thawed
cells at the level of (87 ± 5)% by the AB-test [17].
Fig. 4A demonstrates a carrier with FDA/PI-
stained cells prior to cryopreservation (control).
Positive FDA-staining of cells and a small amount of
the cells with PI-stained nuclei testify to a high viability
of cells within the bioengineered scaffold. After
cryopreservation (Fig. 4B) the number of positively
PI-stained cells significantly increased.
Рис. 2. Морфология носителя, полученного из скелета деминерализован-
ной губки Ianthella basta (А, световая микроскопия). Носитель после
окрашивания Calcofluor White. (В, флуоресцентная микроскопия).
Fig. 2. Morphology of carrier derived from demineralized sponge Ianthella Basta
skeleton (А, light microscopy). The carrier after Calcofluor White staining (В,
fluorescence microscopy).
A B
вые носители из скелетов мор-
ской губки Ianthella basta пока-
зали биосовместимость с МСК
in vitro и обеспечивали рост
клеток до образования пластов,
заполняющих поры.
Через 21 сутки культивирова-
ния образцы криоконсервиро-
вали под защитой 10%-го ДМСО
в присутствии 20% ЭС по прото-
колу, общепринятому для крио-
консервирования суспензий
МСК дермы и позволяющему
сохранять метаболическую ак-
тивность деконсервированных
клеток на уровне (87 ± 5)% по
АB-тесту [16].
На рис. 4, А представлен вид
носителя с клетками, окрашен-
ными ФДА/ПЙ, до криоконсер-
Рис. 1. Лиофилизированный скелет
губки Ianthella basta до очистки (А).
Матрица, полученная после очистки
(В). Образец носителя, полученного
из матрицы (C, стереомикрокопия).
Fig. 1. Frozen-dried skeleton of sponge
Ianthella basta prior to purification
procedure (А). The matrix obtained
after purification (B). The sample of
carrier derived from the matrix (C,
stereomicroscopy).
A B
C
18 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
вирования (контроль). Позитивное окрашивание
клеток ФДА и небольшое количество клеток с яд-
рами, окрашенными ПЙ, свидетельствуют о высо-
кой жизнеспособности клеток в составе биоинже-
нерной конструкции. После криоконсервирования
(рис. 4, В) количество клеток, позитивно окрашен-
ных ПЙ, значительно увеличивалось.
Для интегральной оценки метаболической
активности клеток использовали АВ-тест. Как
следует из рис. 5, криоконсервирование приводит
к двукратному снижению этого показателя
(46,8 ± 5,8)% по отношению к контролю (100%).
Через сутки рекультивирования этот уровень
сохранился.
Результаты настоящей работы показали, что
деминерализованные очищенные скелеты морских
губок Ianthella basta, состоящие из хитиновых
волокон, организованных в пористую структуру,
биосовместимы с мезенхимальными стромаль-
ными клетками человека и способны поддержи-
For integral assessment of cell metabolic activity
we used the AB test. As it follows from the Fig. 5,
cryopreservation resulted in a 2-fold decrease of this
index (46.8 ± 5.8)% in respect to the control (100%).
One day after reculture this level remained unchan-
ged.
Our findings demonstrate that demineralized purified
skeletons of marine sponge Ianthella basta comprised
of chitin fibers, arranged in a porous structure, were
biocompatible with human mesenchymal stromal cells,
and capable to maintain their growth. Biocompatibility
of chitin is well known and reported in details [18].
Chitin is commercially procured from shrimps, squids,
crabs, oysters, and used to manufacture the matrices
for tissue engineering, that requires significant financial
costs and technological procedures [11]. The new and
advanced carriers, which unique structure is the result
of a natural evolution, might be procured from the
marine sponges Ianthella basta with the minimum
costs required.
Рис. 3. Носитель без клеток (А); МСК в порах хитинового носителя: 7-е (В) и 21-е (С) сутки в культуре, ×100.
Нативный препарат.
Fig. 3. Cell-free carrier (A); MSCs within the pores of chitin carrier: day 7 (B) and day 21 (C) in culture, ×100. Native
preparation.
A B C
вать их рост. Биосовмести-
мость хитина известна и
подробно описана в литера-
туре [18]. В промышленных
масштабах хитин выделяет-
ся из креветок, кальмаров,
крабов, устриц и использует-
ся с целью изготовления мат-
риц для тканевой инженерии,
что требует значительных
финансовых затрат и техно-
логических манипуляций [10].
Из морских губок Ianthella
bastа можно с минимальны-
ми затратами получить но-
вые и перспективные носите-
ли, уникальная структура
которых определяется процес-
сом эволюции данных губок.
Рис. 4. Вид МСК в хитиновом носителе до (А) и после (В) криоконсервиро-
вания. Комбинированное окрашивание ФДА/ПЙ.
Fig. 4. Appearance of MSCs within chitin carrier prior to (A) and after (B) cryopre-
servation.Сombined staining with FDA/PI.
A B
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
19
The presented findings show MSCs to be adhered
and flattened on chitin carrier surfaces; during culture
they proliferated and filled free space of carrier pores.
As a result of three-week culture a bioengineered
structure was formed, which could be conventionally
divided to the sites, where the cells grew on the outer
surfaces of chitin carrier and those formed by cell
sheets in a free volume of pores. These structures,
formed by patient’s autologous MSCs may serve as a
basis for developing new tissue-engineered structures,
e .g. for bone or cartilaginous tissue engineering.
Basing on the previously reported data the adherent
cells within 3-D tissue-engineered scaffolds were
assumed to be more sensitive to the conventional
cryopreservation method, comprising slow cooling
under 10% DMSO protection, than the suspended cells
[13, 15]. The main damaging factor accompanying slow
cooling is the influence of high salt concentrations,
resulting from extracellular water crystallization, which
leads to a dehydration of cells, i. e. reduction of their
volume [17]. The volume of cells, cooled in a suspen-
sion, can change in a relatively free way in response
to increasing salt concentrations, thereby avoiding cell
death. We have reported previously that suspended
MSCs, similar to the cells used in the present study,
preserved metabolic activity at the level of (87 ± 5)%
after cryopreservation by the conventional method [5].
At the same time the MSCs being within a bioen-
gineered scaffold are involved into a complex system
of relationships, where the cell-cell and cell-substrate
0
0,25
0,5
0,75
1
1,25
1,5
1,75
2
Контроль
Control
После
отогрева
Post-thaw
Сутки после
отогрева
24hrs post-
thaw
Рис. 5. Метаболическая активность клеток до и после
криоконсервирования в составе носителей; AB-тест;* –
различия значимы по отношению к контролю (p < 0,05).
Fig. 5. Metabolic activity of the cells prior to and after
cryopreservation within the carriers; AB test; * – differences
are significant with respect to control (p < 0.05).
Ф
лу
ор
ес
це
нц
ия
,
О
ЕФ
/о
бр
аз
ец
Fl
uo
re
sc
en
ce
,
R
FU
/s
am
pl
e
Как видно из представленных результатов,
МСК адгезировали и распластывались на поверх-
ностях хитиновых носителей, в ходе культивиро-
вания пролиферировали и заполняли свободное
пространство пор носителя. В результате трехне-
дельного культивирования формировалась биоин-
женерная структура, в которой можно условно
выделить участки, в которых клетки растут на
внешних поверхностях хитинового носителя, и
участки, сформированные пластами клеток в
свободном объеме пор. Такие структуры, образо-
ванные аутологичными МСК пациента, могут
служить основой для разработки новых тканеинже-
нерных конструкций, например, для инженерии
костной или хрящевой тканей.
Исходя из данных литературы предполагалось,
что адгезивные клетки в составе полученных трех-
мерных тканеинженерных конструкций будут
более чувствительными к общепринятому методу
криоконсервирования, включающему медленное
охлаждение под защитой 10% ДМСО, чем клетки
в суспензии [12, 14]. Известно, что при медленном
охлаждении одним из основных повреждающих
факторов является действие высоких концентраций
солей, возникающих вследствие кристаллизации
внеклеточной воды, что ведет к дегидратации
клетки и, соответственно, к уменьшению ее
объема [16]. Объем клеток, охлаждаемых в виде
суспензии, может относительно свободно изме-
няться в ответ на возрастающие концентрации
солей, что позволяет избежать гибели клеток.
Ранее нами было показано, что МСК, использован-
ные в данной работе, после криоконсервирования
по общепринятому методу в виде суспензии сохра-
няют метаболическую активность на уровне (87 ±
5)% [17]. В то же время МСК в составе биоинже-
нерной конструкции вовлечены в сложную систему
взаимоотношений, при которых взаимодействия
типа клетка-клетка и клетка-субстрат во многом
определяют их криобиологические свойства и
большую чувствительность к факторам криопов-
реждения по сравнению с клетками в суспензии.
Наши результаты согласуются с данными работ
B.L. Liu и соавт. [11, 12], в которых показано, что
стромальные клетки, криоконсервированные в
виде монослоя, являются более чувствительными
к повреждающим факторам криоконсервирования,
чем клетки в суспензии. При этом для выжи-
ваемости клеток большое значение имеют степень
адгезии клеток, природа субстрата per se и его
механические свойства. Так, в работе A. Katsen-
Globa и соавт. [9] на примере альгинат-желатино-
вых носителей было показано, что успех криокон-
сервирования МСК в составе трехмерных скаф-
фолдов определяется степенью прикрепления и
20 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
распластывания клеток на субстрате. Используя
медленное охлаждение с начальной скоростью
1 град/мин в присутствии 10%-го ДМСО, авторы
установили, что наиболее высокая эффективность
криоконсервирования достигается, если прикре-
пленная клетка еще не полностью распластана и
сохраняет некоторую подвижность на субстрате
[9].
Роль подложки в криоповреждении монослоев
МСК исследована Х. Хu и соавт. [19]. В качестве
подложки была использована стеклянная поверх-
ность (контроль), которую модифицировали путем
покрытия желатином и матригелем, что обеспечи-
вало более высокую выживаемость МСК челове-
ка. Однако жизнеспособность адгезировавших
МСК была на 35% ниже, чем клеток, криоконсерви-
рованных в виде суспензии.
Криочувствительность клеток в составе трех-
мерных многослойных структур на основе
хитиновых скелетов губок, очевидно, еще выше:
во-первых, объемная структура предполагает
большее количество межклеточных контактов,
чем двумерная, а во-вторых, клетки в этом случае
закреплены на жестком каркасе, сформированном
хитиновыми волокнами.
При обсуждении криочувствительности фибро-
бластоподобных МСК в составе пластов, моно-
слоев и суспензии следует упомянуть фундамен-
тальное сравнительное исследование J.P. Acker и
соавт. [2], в котором показана зависимость крио-
чувствительности фибробластов от взаимодейст-
вий типа клетка-клетка и клетка-субстрат. Авторы
исследовали четыре модели: изолированные
клетки в суспензии; клетки, обособленно прикреп-
ленные к стеклянной поверхности, т. е. имеющие
взаимодействия типа клетка-субстрат; колонии
клеток, прикрепленных к этому же субстрату со
взаимодействиями типа клетка-клетка и клетка-
субстрат; многоклеточные сфероиды с большим
количеством межклеточных контактов. Установ-
лено, что как межклеточные контакты, так и
контакты клеток с субстратом способствуют об-
разованию и распространению внутриклеточного
льда и значительно снижают криоустойчивость
клеток. Обсуждая возможный механизм повреж-
дения адгезивных клеток, следует учитывать роль
внеклеточного льда. Так, B.L. Liu и J. McGrath [11]
было отмечено, что прикрепленные клетки могут
подвергаться более сильному повреждению, по-
скольку они имеют гораздо большую площадь
контакта с внеклеточным льдом и подвергаются
большему механическому напряжению. В процес-
се внеклеточного льдообразования изолированные
клетки «отодвигаются» растущим фронтом льда
в каналы между кристаллами. В то же время
interactions largely determine their cryobiological
properties and high sensitivity to cryodamage factors
as compared to the suspended cells.
Our findings are consistent with the data of B.L. Liu
et al. [12, 13], reported that stromal cells cryopre-
served as a monolayer were more sensitive to da-
maging factors of cryopreservation comparing to the
suspended cells. In this case a cell survival will be
affected by the degree of cell adhesion, the nature of
substrate per se, and its mechanical properties.
A. Katsen-Globa et al. [10] using alginate-gelatin
carriers demonstrated a successful MSCs cryopre-
servation within 3-D scaffolds to be determined by
the degree of cell attachment and flattening on the
substrate. Using slow cooling with initial rate of
1 deg/min in the presence of 10% DMSO, the authors
established the highest efficiency of cryopreservation
in the case when attached cells were not yet fully
flattened and kept certain mobility on a substrate [10].
The role of the substrate in MSCs monolayer
cryodamage has been studied by H. Xu et al. [19]. As
a substrate they used a glass surface (control), modified
by coating with gelatin and matrigel, that provided a
higher survival rate for human MSCs. However, the
viability of adhered MSCs was 35% lower than that
of the cells cryopreserved in a suspension.
Obviously, the cryosensitivity of the cells being
within the sponge chitin skeleton-based 3D multi-
layered structures could be even higher: first, a 3D
structure assumes a greater amount of cell-cell
contacts, than the 2D one, and secondly, in this case
the cells are fixed to a rigid scaffold formed by chitin
fibers.
When discussing the cryosensitivity of fibroblast-
like MSCs being within the sheets, monolayers and
suspension we should mention the fundamental
comparative study of J.P. Acker et al. [1], where the
authors showed the dependency of fibroblast cryo-
sensitivity on the cell-cell and cell-substrate inter-
actions. The authors studied following four models:
the isolated cells in suspension; separate cells attached
to glass surface, i. e. with solely cell-substrate
interactions; cell colonies attached to the same sub-
strate having cell-cell and cell-substrate interactions;
and multicellular spheroids with a large number of the
cell-cell contacts. Both the cell-cell and cell-substrate
contacts were established to contribute to intracellular
ice formation and spreading, as well as significantly
reduce the cell cryoresistance. When speaking about
a possible mechanism of damage of adherent cells the
role of extracellular ice should be taken into account.
Thus, B.L. Liu and J. McGrath [12] noted the fact
that the attached cells might undergo more severe
damage because they had a much larger area of
contact with extracellular ice and underwent higher
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
21
адгезировавшие клетки фиксированы и повреж-
даются по мере продвижения фронта льда.
Необходимо учитывать также метаболический
и эпигенетический ответы клеток в суспензии и
трехмерных носителях на стресс, вызванный
процедурой криоконсервирования. В публикации
K. Liu и соавт. [13] на молекулярном уровне было
показано, что фибробласты, криоконсервированные
в суспензии и составе скаффолдов на основе сопо-
лимера молочной и гликолевой кислоты, в процессе
рекультивирования проявляли различия по профи-
лю стресс-белков и активации сигнальных путей.
В частности, для трехмерной культуры отмеча-
лась повышенная экспрессия белков р38, ERK, ряда
ростовых факторов и шаперонов по сравнению с
суспензией, что свидетельствует о более выражен-
ной реакции на стрессорные воздействия, связан-
ные с процессом криоконсервирования.
Все вышеперечисленные механизмы криопов-
реждения адгезивных клеток могут реализовы-
ваться и при криоконсервировании трехмерных
биоинженерных конструкций на основе МСК и
хитиновых скелетов губок Ianthella basta, что
неизбежно приводит к увеличению процента по-
врежденных клеток. С целью оценки возможности
применения общепринятых методов криоконсер-
вирования для сложных трехмерных структур нами
было проведено криоконсервирование полученных
биоинженерных конструкций. Оказалось, что
деконсервированные образцы содержат значитель-
ное количество ПЙ-позитивных клеток, а метаболи-
ческая активность размороженных образцов со-
храняется на уровне (46,8 ± 5,8)%. Важно отме-
тить, что уровень метаболической активности не
снижался в первые сутки рекультивирования, что
происходило бы в случае отсроченной гибели
поврежденных в процессе криоконсервирования
клеток.
Такой уровень выживаемости в составе трех-
мерной биоинженерной структуры, с одной сторо-
ны, является достаточно высоким показателем для
адгезивных клеток и, учитывая высокую пролифе-
ративную активность МСК, позволяет рассматри-
вать общепринятый протокол как основу для
разработки и усовершенствования методов крио-
консервирования трехмерных структур. С другой
стороны, полученные данные свидетельствуют о
перспективности поиска новых методов и подходов
криоконсервирования биоинженерных конструкций.
Криочувствительность хитиновых носителей
может объясняться (см. рис. 2) их сложной трех-
мерной структурой с полостями и мелкими отвер-
стиями различного диаметра. Детальный анализ
структуры, проведенный с помощью сканирующей
mechanical stress. During extracellular ice formation
the isolated cells are ‘shifted’ by growing ice front
into the channels between ice crystals. At the same
time the adhered cells are fixed and damaged as far
as the ice front advances.
Metabolic and epigenetic responses of cells being
in suspension or 3D carriers to the cryopreservation-
induced stress should be also taken into account.
K. Liu et al. [14] demonstrated differences in the
stress-protein profile and signalling pathways activa-
tion arised during reculture in the fibroblasts cryopreser-
ved in suspension and within scaffolds, based on lactic
and glycolic acid copolymer. In particular, an increased
expression of p38 and ERK proteins, some growth
factors and chaperones were observed in the cells of
3-D culture comparing with the suspended cells, indica-
ting a more pronounced response to the cryopreser-
vation-associated stress impacts.
All the mentioned above cryodamage mechanisms
of adherent cells may be also implemented during cryo-
preservation of 3-D bioengineered scaffolds based on
MSCs and Ianthella basta sponge chitin skeletons,
which inevitably leads to an increased content of dama-
ged cells. To assess the possibility of using the conven-
tional cryopreservation methods for complex 3-D
scaffolds, we cryopreserved the obtained bioengineer-
ed scaffolds. It was found that the frozen-thawed
samples contained a significant amount of PI-positive
cells, and metabolic activity of frozen-thawed samples
preserved (46.8 ± 5.8)% of pre-freeze level. It is im-
portant to emphasize that the level of metabolic activity
did not reduce through the first day of reculture, that
would occur in case of delayed death of cells damaged
during cryopreservation.
On the one hand, this level of survival obtained
for the 3D bioengineered structure is quite a high value
for adherent cells and, considering a high proliferative
activity of MSCs, thereby allows treating the used
conventional protocol as a basis for developing and
optimizing the methods for 3D scaffolds cryopre-
servation. On another hand, our findings testify to
a promising search for new methods and approaches
in bioengineered structures cryopreservation.
Cryosensitivity of chitin carriers may be explained
(see Fig. 2) by their complex 3D structure with cavities
and small pores of various diameters. Detailed analysis
of the structure, performed by scanning electron
microscopy showed the chitin fiber of the carrier to
have a loose internal structure [4]. We may assume,
that cavities are filled with an aqueous solution, crystal-
lized during freezing. Therefore, the ice crystal
formation may result in an increased mechanical stress
and damage of chitin scaffold from inside, and thus in
the death of adjacent cells.
22 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
электронной микроскопии, показал, что хитиновые
волокна носителя имеют рыхлую внутреннюю
структуру [4]. Можно предположить, что в полости
проникает водный раствор, который кристалли-
зуется при замораживании. Следовательно, образо-
вание кристаллов льда может приводить к повы-
шению механического напряжения и повреждению
хитинового каркаса изнутри и, соответственно, к
гибели прилегающих к нему клеток.
Выводы
В настоящей работе получены носители для
тканевой инженерии на основе скелетов морской
губки Ianthella basta и впервые показана их био-
совместимость с мезенхимальными стромаль-
ными клетками человека.
Результаты первых исследований по криокон-
сервированию данных носителей, заселенных
МСК, показали их высокую криочувствительность.
Литература
1. Белоус A.M., Грищенко В.И. Криобиология. – К.: Наукова
думка, 1994. – 430 с.
2. Acker J.P., Larese A., Yang H. et al. Intracellular ice formation
is affected by cell interactions // Cryobiology. – 1999. – Vol. 38,
№4. – P. 363–371.
3. Armitage W., Juss B. Freezing monolayers of cells without gap
junctions // Cryobiology. – 2003. – Vol. 46, №2. – P. 194–196.
4. Brunner E., Ehrlich H., Schup P. et al. Chitin-based scaffolds
are an integral part of the skeleton of the marine demosponge
Ianthella basta // J. Struct. Biol. – 2009. – Vol. 168, №3. –
P. 539–547.
5. Ehrlich H., Ilan M., Maldonado M. Three-dimensional chitin-based
scaffolds from Verongida sponges (Demospongiae: Porifera).
Part I. Isolation and identification of chitin // Int. J. Biol.
Macromol. – 2010. – Vol. 47, №2. – P. 132–140.
6. Ehrlich H., Krautter M., Hanke T. et al. First evidence of the
presence of chitin in skeletons of marine sponges. Part II.
Glass sponges (Hexactinellida: Porifera) // J. Exp. Zool. Mol.
Dev. Evol. – 2007. – Vol. 308B, №4. – P. 473–483.
7. Ehrlich H., Maldonado M., Spindler K. et al. First evidence of
chitin as a component of the skeletal fibers of marine sponges.
Part I. Verongidae (demospongia: Porifera) // J. Exp. Zool. Mol.
Dev. Evol. – 2007. – Vol. 308B, №4. – P. 347–356.
8. Hunt C.J. Cryopreservation of human stem cells for clinical
application: a review // Transfus. Med. Hemotherapy. – 2011. –
Vol. 38, №2. – P. 107–123.
9. Katsen-Globa A., Meiser I., Petrenko Yu. et al. Towards ready-
to-use 3-D scaffolds for regenerative medicine: adhesion-
based cryopreservation of human mesenchymal stem cells
attached and spread within alginate-gelatin cryogel scaffolds //
J. Mater. Sci. Mater. Med. – 2014. – Vol. 25, №3. – P. 857–871.
10.Khor E. Chitin: Fulfilling a biomaterials promise. – Elsevier
Science, 2001. – 148 p.
11.Liu B.L., McGrath J. Freezing osteoblast cells attached to
hydroxyapatite discs and glass coverslips: Mechanisms of
damage // Sci. China Ser. E Technol. Sci. – 2007. – Vol. 50,
№2. – P. 248–256.
12.Liu B.L., McGrath J., McCabe L. et al. Cellular response of
murine osteoblasts to cryopreservation?: the influence of
References
1. Acker J.P., Larese A., Yang H. et al. Intracellular ice formation
is affected by cell interactions. Cryobiology 1999; 38(4): 363–
371.
2. Armitage W., Juss B. Freezing monolayers of cells without gap
junctions. Cryobiology 2003; 46(2): 194–196.
3. Belous A.M., Grischenko V.I. Cryobiology. Kyiv: Naukova dumka;
1994.
4. Brunner E., Ehrlich H., Schup P. et al. Chitin-based scaffolds
are an integral part of the skeleton of the marine demosponge
Ianthella basta. J Struct Biol 2009; 168(3): 539–547.
5. Custodio M.R., Lobo-Hajdu G., Hajdu E., Muricy G., editors.
Porifera research: biodiversity, innovation & sustainability. Rio
de Janeiro, Museu Nacional; 2007.
6. Ehrlich H., Ilan M., Maldonado M. Three-dimensional chitin-based
scaffolds from Verongida sponges (Demospongiae: Porifera).
Part I. Isolation and identification of chitin. Int J Biol Macromol
2010; 47(2): 132–140.
7. Ehrlich H., Krautter M., Hanke T. et al. First evidence of the
presence of chitin in skeletons of marine sponges. Part II.
Glass sponges (Hexactinellida: Porifera). J Exp Zool Mol Dev
Evol 2007; 308B(4): 473–483.
8. Ehrlich H., Maldonado M., Spindler K. et al. First evidence of
chitin as a component of the skeletal fibers of marine sponges.
Part I. Verongidae (demospongia: Porifera). J Exp Zool Mol
Dev Evol 2007; 308B(4): 347–356.
9. Hunt C.J. Cryopreservation of human stem cells for clinical
application: a review. Transfus Med Hemotherapy 2011; 38(2):
107–123.
10.Katsen-Globa A., Meiser I., Petrenko Yu. et al. Towards ready-
to-use 3-D scaffolds for regenerative medicine: adhesion-
based cryopreservation of human mesenchymal stem cells
attached and spread within alginate-gelatin cryogel scaffolds.
J Mater Sci Mater Med 2014; 25(3): 857–871.
11.Khor E. Chitin: Fulfilling a biomaterials promise. Elsevier Science;
2001.
12.Liu B.L., McGrath J. Freezing osteoblast cells attached to
hydroxyapatite discs and glass coverslips: Mechanisms of
damage. Sci China Ser E Technol Sci 2007; 50(2): 248–256.
13.Liu B.L., McGrath J., McCabe L. et al. Cellular response of
murine osteoblasts to cryopreservation: the influence of
attachment to hydroxyapatite (HA) scaffolds. African Journal
of Biotechnology 2014; 5(21): 2014–2019.
14.Liu K., Yang Y., Mansbridge J. Comparison of the stress
response to cryopreservation in monolayer and three-
dimensional human fibroblast cultures: stress proteins, MAP
kinases, and growth factor gene expression. Tissue Eng 2000;
6(5): 539–554.
15.Malpique R., Ehrhart F., Katsen-Globa A. et al. Cryopreser-
vation of adherent cells: strategies to improve cell viability and
function after thawing. Tissue Eng Part C Methods 2009; 15(3):
373–386.
Conclusions
Performed investigations allowed to obtain the
carriers based on marine sponge Ianthella basta
skeletons suitable for tissue engineering and, for the
first time, demonstrated their biocompatibility with
human mesenchymal stromal cells.
The results of pilot studies on cryopreservation of
these MSCs-seeded carriers showed their high
cryosensitivity.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
23
attachment to hydroxyapatite (HA) scaffolds // African Journal
of Biotechnology. – 2014. – Vol. 5, №21. – P. 2014–2019.
13.Liu K., Yang Y., Mansbridge J. Comparison of the stress respon-
se to cryopreservation in monolayer and three-dimensional
human fibroblast cultures: stress proteins, MAP kinases, and
growth factor gene expression // Tissue Eng. – 2000. – Vol. 6,
№5. – P. 539–554.
14.Malpique R., Ehrhart F., Katsen-Globa A. et al. Cryopre-
servation of adherent cells: strategies to improve cell viability
and function after thawing // Tissue Eng. Part C. Methods. –
2009. – Vol. 15, №3. – P. 373–386.
15.Mazur P., Leibo S.P., Chu E.H. A two-factor hypothesis of
freezing injury. Evidence from Chinese hamster tissue-culture
cells // Exp. Cell Res. – 1972. – Vol. 71, №2. – P. 345–355.
16.Petrenko Yu.A., Rogulska O.Yu., Mutsenko V.V. et al. A sugar
pretreatment as a new approach to the Me2SO- and xeno-
free cryopreservation of human mesenchymal stromal cells //
CryoLetters. – 2014. – Vol. 35, №3. – P. 239–246.
17.Porifera research: biodiversity, innovation & sustainability/ Eds.
M.R. Custodio, G. Lobo-Hajdu, E. Hajdu, G. Muricy. – Rio de
Janeiro: Museu Nacional, 2007. – 684 p.
18.Wan A.C., Tai B.C. Chitin – a promising biomaterial for tissue
engineering and stem cell technologies // Biotechnol. Adv. –
2013. – Vol. 31, №8. – P. 1776–1785.
19.Xu X., Liu Y., Cui Z.F. Effects of cryopreservation on human
mesenchymal stem cells attached to different substrates //
J. Tissue Eng. Regen. Med. – 2014. – Vol. 8, №8. – P. 664–
672.
16.Mazur P., Leibo S.P., Chu E.H. A two-factor hypothesis of
freezing injury. Evidence from Chinese hamster tissue-culture
cells. Exp Cell Res 1972; 71(2): 345–355.
17.Petrenko Yu.A., Rogulska O.Yu., Mutsenko V.V. et al. A sugar
pretreatment as a new approach to the Me2SO- and xeno-
free cryopreservation of human mesenchymal stromal cells.
CryoLetters 2014; 35(3): 239–246.
18.Wan A.C., Tai B.C. Chitin – a promising biomaterial for tissue
engineering and stem cell technologies. Biotechnol Adv 2013;
31(8): 1776–1785.
19.Xu X., Liu Y., Cui Z.F. Effects of cryopreservation on human
mesenchymal stem cells attached to different substrates.
J Tissue Eng Regen Med 2014; 8(8): 664–672.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-137367 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:52:19Z |
| publishDate | 2016 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Муценко, В.В. Рогульская, Е.Ю. Петренко, Ю.А. Эрлих, Г. Мазур, С.П. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. 2018-06-17T10:38:19Z 2018-06-17T10:38:19Z 2016 Криочувствительность мезенхимальных стромальных клеток, криоконсервированных в составе носителей на основе скелетов морских губок Ianthella basta / В.В. Муценко, Е.Ю. Рогульская, Ю.А. Петренко, Г. Эрлих, С.П. Мазур, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 1. — С. 13–23. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137367 57.043: 576.314.4: 593.4-174.11 В работе представлены результаты экспериментальных исследований по использованию скелетов морской
 губки Ianthella basta в качестве носителей для мезенхимальных стромальных клеток человека (МСК), их биосовместимости
 с данными клетками, а также оценка чувствительности клеток, растущих в составе этих носителей, к криоконсервированию
 под защитой 10% ДМСО и 20% фетальной сыворотки крупного рогатого скота по методу, разработанному для суспензии
 МСК (медленное охлаждение со скоростью 1 град/мин, быстрый отогрев при 37°С). С помощью кислотно-щелочного гидролиза
 из скелетов морской губки Ianthella basta были получены сетчатые носители, состоящие из хитиновых фибрилл. В ходе
 культивирования in vitro данные носители обеспечивали адгезию, миграцию и пролиферацию МСК. После криоконсервирования
 наблюдалось значительное снижение жизнеспособности клеток, при этом их метаболическая активность составляла
 (46,8 ± 5,8)% по отношению к нативным образцам и не уменьшалась на первые сутки рекультивирования. Из полученных
 результатов следует, что скелеты морской губки Ianthella basta представляют собой новый перспективный источник носителей
 для использования в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Данная работа может послужить основой для
 дальнейшей разработки методов криоконсервирования стволовых клеток в составе трехмерных тканеинженерных конструкций. У роботі представлено результати експериментальних досліджень, спрямованих на використання скелетів
 морської губки Ianthella basta в якості носіїв для мезенхімальних стромальних клітин людини (МСК), їх біосумісності з цими
 клітинами, а також оцінка кріочутливості клітин, які ростуть у складі цих носіїв, до кріоконсервування під захистом 10%
 ДМСО та 20% фетальної сироватки крупної рогатої худоби за методом, розробленим для суспензії МСК (повільне охолодження
 зі швидкістю 1 град/хв, швидкий відігрів при 37°С). За допомогою кислотно-лужного гідролізу зі скелетів морської губки
 Ianthella basta були отримані сітчасті носії, утворені з хітинових фібрил. У ході культивування in vitro ці носії забезпечували
 адгезію, міграцію та проліферацію МСК. Після кріоконсервування спостерігалося значне зниження життєздатності клітин,
 при цьому їх метаболічна активність складала (46,8 ± 5,8)% по відношенню до нативних зразків та не зменшувалася на
 першу добу рекультивування. На підставі одержаних результатів встановлено, що скелети морської губки Ianthella basta є
 новим перспективним джерелом носіїв для використання в тканинній інженерії та регенеративній медицині. Дана робота
 може бути основою для подальшої розробки методів кріоконсервування стовбурових клітин у складі тривимірних тканинноінженерних
 конструкцій. This paper presents our findings on using skeletons of marine sponge Ianthella basta as the carriers for human
 mesenchymal stromal cells (MSC), evaluating their biocompatibility with the cells, as well as the assessment of cryosensitivity of the
 cells, growing within these carriers to cryopreservation under protection of 10% DMSO and 20% fetal bovine serum according to the
 method developed for MSC suspension (slow cooling with 1 deg/min rate, rapid thawing at 37°С). Network-like chitin carriers
 consisting of chitin fibrils were derived from marine sponge Ianthella basta skeletons by acid-base hydrolysis. During culturing
 in vitro these carriers supported adhesion, migration and proliferation of MSCs. After cryopreservation we observed a decrease in
 cell viability with their metabolic activity of 46.8±5.8% in respect to the native specimens and it did not reduce to day 1 of reculture.
 As proceeded from the reported findings, the skeletons from marine sponge Ianthella basta are the new promising source for
 carriers to be used in tissue engineering and regenerative medicine. This research may serve the basis for further developing the
 cryopreservation methods for stem cells within 3-D tissue-engineered scaffolds. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Криочувствительность мезенхимальных стромальных клеток, криоконсервированных в составе носителей на основе скелетов морских губок Ianthella basta Cryosensitivity of mesenchymal stromal cells cryopreserved within marine sponge Ianthella basta skeleton-based carriers Article published earlier |
| spellingShingle | Криочувствительность мезенхимальных стромальных клеток, криоконсервированных в составе носителей на основе скелетов морских губок Ianthella basta Муценко, В.В. Рогульская, Е.Ю. Петренко, Ю.А. Эрлих, Г. Мазур, С.П. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Криочувствительность мезенхимальных стромальных клеток, криоконсервированных в составе носителей на основе скелетов морских губок Ianthella basta |
| title_alt | Cryosensitivity of mesenchymal stromal cells cryopreserved within marine sponge Ianthella basta skeleton-based carriers |
| title_full | Криочувствительность мезенхимальных стромальных клеток, криоконсервированных в составе носителей на основе скелетов морских губок Ianthella basta |
| title_fullStr | Криочувствительность мезенхимальных стромальных клеток, криоконсервированных в составе носителей на основе скелетов морских губок Ianthella basta |
| title_full_unstemmed | Криочувствительность мезенхимальных стромальных клеток, криоконсервированных в составе носителей на основе скелетов морских губок Ianthella basta |
| title_short | Криочувствительность мезенхимальных стромальных клеток, криоконсервированных в составе носителей на основе скелетов морских губок Ianthella basta |
| title_sort | криочувствительность мезенхимальных стромальных клеток, криоконсервированных в составе носителей на основе скелетов морских губок ianthella basta |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137367 |
| work_keys_str_mv | AT mucenkovv kriočuvstvitelʹnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokkriokonservirovannyhvsostavenositeleinaosnoveskeletovmorskihgubokianthellabasta AT rogulʹskaâeû kriočuvstvitelʹnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokkriokonservirovannyhvsostavenositeleinaosnoveskeletovmorskihgubokianthellabasta AT petrenkoûa kriočuvstvitelʹnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokkriokonservirovannyhvsostavenositeleinaosnoveskeletovmorskihgubokianthellabasta AT érlihg kriočuvstvitelʹnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokkriokonservirovannyhvsostavenositeleinaosnoveskeletovmorskihgubokianthellabasta AT mazursp kriočuvstvitelʹnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokkriokonservirovannyhvsostavenositeleinaosnoveskeletovmorskihgubokianthellabasta AT volkovana kriočuvstvitelʹnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokkriokonservirovannyhvsostavenositeleinaosnoveskeletovmorskihgubokianthellabasta AT petrenkoaû kriočuvstvitelʹnostʹmezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokkriokonservirovannyhvsostavenositeleinaosnoveskeletovmorskihgubokianthellabasta AT mucenkovv cryosensitivityofmesenchymalstromalcellscryopreservedwithinmarinespongeianthellabastaskeletonbasedcarriers AT rogulʹskaâeû cryosensitivityofmesenchymalstromalcellscryopreservedwithinmarinespongeianthellabastaskeletonbasedcarriers AT petrenkoûa cryosensitivityofmesenchymalstromalcellscryopreservedwithinmarinespongeianthellabastaskeletonbasedcarriers AT érlihg cryosensitivityofmesenchymalstromalcellscryopreservedwithinmarinespongeianthellabastaskeletonbasedcarriers AT mazursp cryosensitivityofmesenchymalstromalcellscryopreservedwithinmarinespongeianthellabastaskeletonbasedcarriers AT volkovana cryosensitivityofmesenchymalstromalcellscryopreservedwithinmarinespongeianthellabastaskeletonbasedcarriers AT petrenkoaû cryosensitivityofmesenchymalstromalcellscryopreservedwithinmarinespongeianthellabastaskeletonbasedcarriers |