Влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов
В работе с использованием метода электронного парамагнитного резонанса спиновых зондов проведено сравнительное изучение влияния низко- и высокомолекулярных криозащитных веществ на микровязкость мембран эритроцитов. Результаты исследований вращательной подвижности жирно-кислотных спиновых зондов в...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Дата: | 2016 |
| Автори: | , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2016
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137371 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов / О.А. Нардид, Я.О. Черкашина, Л.В. Иванов, Э.О. Нардид, А.Н. Ляпунов, В.В. Мамонтов // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 1. — С. 35–44. — Бібліогр.: 28 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-137371 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Нардид, О.А. Черкашина, Я.О. Иванов, Л.В. Нардид, Э.О. Ляпунов, А.Н. Мамонтов, В.В. 2018-06-17T10:40:12Z 2018-06-17T10:40:12Z 2016 Влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов / О.А. Нардид, Я.О. Черкашина, Л.В. Иванов, Э.О. Нардид, А.Н. Ляпунов, В.В. Мамонтов // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 1. — С. 35–44. — Бібліогр.: 28 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137371 57.043:577.382.3:577.334 В работе с использованием метода электронного парамагнитного резонанса спиновых зондов проведено сравнительное изучение влияния низко- и высокомолекулярных криозащитных веществ на микровязкость мембран эритроцитов. Результаты исследований вращательной подвижности жирно-кислотных спиновых зондов в мембранах эритроцитов после 5-минутной икубации свидетельствуют об отсутствии значимых изменений микровязкости мембран в 15%-м растворе пропиленгликоля. Показано, что введение полиэтиленгликоля с м. м. 1500 (ПЭГ-1500) в конечной концентрации 15% в суспензию эритроцитов увеличивает микровязкость мембран при экспозиции до 60 мин. Это объясняется тем, что молекулы ПЭГ-1500 не проходят внутрь клеток, а локализуются на поверхности мембран, вызывают торможение вращательной подвижности спинового зонда. В начальный период наблюдения при таких концентрациях ПЭГ-1500 процесс нарушения жидкокристаллической структуры мембран и белково-липидных взаимодействий в мембране превалирует над процессом дегидратации клеток. У роботі з використанням методу електронного парамагнітного резонансу спінових зондів проведене порівняльне вивчення впливу низько- і високомолекулярних кріозахистних речовин на мікров'язкість мембран еритроцитів. Результати досліджень обертальної рухливості жирно-кислотних спінових зондів у мембранах еритроцитів після 5-хвилинної інкубації в 15%-му розчині пропиленгликолю свідчать про відсутність значимих змін мікров'язкості мембран. Показано, що введення поліетиленгліколю з м. м. 1500 (ПЕГ-1500) у кінцевій концентрації 15% у суспензію еритроцитів збільшує мікров'язкість мембран при експозиції до 60 хв. Це пояснюється тим, що молекули ПЕГ-1500 не проходять усередину клітин, а локалізуються на поверхні мембран, викликають гальмування обертальної рухливості спінового зонда. У початковий період спостереження за таких концентрацій ПЕГ-1500 процес порушення рідкокристалічної структури мембран і білок-ліпідних взаємодій у мембрані превалює над процесом дегідратації клітин. Electron paramagnetic resonance of spin probes was used to study the effect of low and high molecular weight CPAs on microviscosity of erythrocyte membranes. Research data on rotational mobility of the fatty acid spin probes in erythrocyte membranes after 5 min incubation in 15% propylene glycol solution indicate the absence of strong changes in membrane microviscosity. Introduced polyethylene glycol with m. w. 1500 (PEG-1500) at a final concentration of 15% has been shown to increase the membrane microviscosity at 60 min exposure. This is explained by the fact that the molecules of PEG-1500 do not pass inside the cells and are localized on the membrane surface to cause immobilization and inhibiting the rotational mobility of the spin probe. In the initial period of time under these concentrations of PEG-1500 the injury of liquid crystal membrane structure and disorder of the protein-lipid interactions in the membrane prevail over the dehydration of cells. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов Effect of propylene glycol and polyethylene glycol with molecular weight of 1,500 on erythrocyte membrane microviscosity Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов |
| spellingShingle |
Влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов Нардид, О.А. Черкашина, Я.О. Иванов, Л.В. Нардид, Э.О. Ляпунов, А.Н. Мамонтов, В.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title_short |
Влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов |
| title_full |
Влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов |
| title_fullStr |
Влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов |
| title_full_unstemmed |
Влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов |
| title_sort |
влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов |
| author |
Нардид, О.А. Черкашина, Я.О. Иванов, Л.В. Нардид, Э.О. Ляпунов, А.Н. Мамонтов, В.В. |
| author_facet |
Нардид, О.А. Черкашина, Я.О. Иванов, Л.В. Нардид, Э.О. Ляпунов, А.Н. Мамонтов, В.В. |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| publishDate |
2016 |
| language |
Russian |
| container_title |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Effect of propylene glycol and polyethylene glycol with molecular weight of 1,500 on erythrocyte membrane microviscosity |
| description |
В работе с использованием метода электронного парамагнитного резонанса спиновых зондов проведено
сравнительное изучение влияния низко- и высокомолекулярных криозащитных веществ на микровязкость мембран
эритроцитов. Результаты исследований вращательной подвижности жирно-кислотных спиновых зондов в мембранах
эритроцитов после 5-минутной икубации свидетельствуют об отсутствии значимых изменений микровязкости мембран
в 15%-м растворе пропиленгликоля. Показано, что введение полиэтиленгликоля с м. м. 1500 (ПЭГ-1500) в конечной
концентрации 15% в суспензию эритроцитов увеличивает микровязкость мембран при экспозиции до 60 мин. Это
объясняется тем, что молекулы ПЭГ-1500 не проходят внутрь клеток, а локализуются на поверхности мембран, вызывают
торможение вращательной подвижности спинового зонда. В начальный период наблюдения при таких концентрациях
ПЭГ-1500 процесс нарушения жидкокристаллической структуры мембран и белково-липидных взаимодействий в мембране
превалирует над процессом дегидратации клеток.
У роботі з використанням методу електронного парамагнітного резонансу спінових зондів проведене
порівняльне вивчення впливу низько- і високомолекулярних кріозахистних речовин на мікров'язкість мембран еритроцитів.
Результати досліджень обертальної рухливості жирно-кислотних спінових зондів у мембранах еритроцитів після 5-хвилинної
інкубації в 15%-му розчині пропиленгликолю свідчать про відсутність значимих змін мікров'язкості мембран. Показано, що
введення поліетиленгліколю з м. м. 1500 (ПЕГ-1500) у кінцевій концентрації 15% у суспензію еритроцитів збільшує мікров'язкість
мембран при експозиції до 60 хв. Це пояснюється тим, що молекули ПЕГ-1500 не проходять усередину клітин, а локалізуються
на поверхні мембран, викликають гальмування обертальної рухливості спінового зонда. У початковий період спостереження
за таких концентрацій ПЕГ-1500 процес порушення рідкокристалічної структури мембран і білок-ліпідних взаємодій у мембрані
превалює над процесом дегідратації клітин.
Electron paramagnetic resonance of spin probes was used to study the effect of low and high molecular weight CPAs
on microviscosity of erythrocyte membranes. Research data on rotational mobility of the fatty acid spin probes in erythrocyte
membranes after 5 min incubation in 15% propylene glycol solution indicate the absence of strong changes in membrane microviscosity.
Introduced polyethylene glycol with m. w. 1500 (PEG-1500) at a final concentration of 15% has been shown to increase the
membrane microviscosity at 60 min exposure. This is explained by the fact that the molecules of PEG-1500 do not pass inside the cells
and are localized on the membrane surface to cause immobilization and inhibiting the rotational mobility of the spin probe. In the initial
period of time under these concentrations of PEG-1500 the injury of liquid crystal membrane structure and disorder of the protein-lipid
interactions in the membrane prevail over the dehydration of cells.
|
| issn |
0233-7673 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137371 |
| citation_txt |
Влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов / О.А. Нардид, Я.О. Черкашина, Л.В. Иванов, Э.О. Нардид, А.Н. Ляпунов, В.В. Мамонтов // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 1. — С. 35–44. — Бібліогр.: 28 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT nardidoa vliâniepropilenglikolâipoliétilenglikolâsmolekulârnoimassoi1500namikrovâzkostʹmembranéritrocitov AT čerkašinaâo vliâniepropilenglikolâipoliétilenglikolâsmolekulârnoimassoi1500namikrovâzkostʹmembranéritrocitov AT ivanovlv vliâniepropilenglikolâipoliétilenglikolâsmolekulârnoimassoi1500namikrovâzkostʹmembranéritrocitov AT nardidéo vliâniepropilenglikolâipoliétilenglikolâsmolekulârnoimassoi1500namikrovâzkostʹmembranéritrocitov AT lâpunovan vliâniepropilenglikolâipoliétilenglikolâsmolekulârnoimassoi1500namikrovâzkostʹmembranéritrocitov AT mamontovvv vliâniepropilenglikolâipoliétilenglikolâsmolekulârnoimassoi1500namikrovâzkostʹmembranéritrocitov AT nardidoa effectofpropyleneglycolandpolyethyleneglycolwithmolecularweightof1500onerythrocytemembranemicroviscosity AT čerkašinaâo effectofpropyleneglycolandpolyethyleneglycolwithmolecularweightof1500onerythrocytemembranemicroviscosity AT ivanovlv effectofpropyleneglycolandpolyethyleneglycolwithmolecularweightof1500onerythrocytemembranemicroviscosity AT nardidéo effectofpropyleneglycolandpolyethyleneglycolwithmolecularweightof1500onerythrocytemembranemicroviscosity AT lâpunovan effectofpropyleneglycolandpolyethyleneglycolwithmolecularweightof1500onerythrocytemembranemicroviscosity AT mamontovvv effectofpropyleneglycolandpolyethyleneglycolwithmolecularweightof1500onerythrocytemembranemicroviscosity |
| first_indexed |
2025-11-25T20:54:30Z |
| last_indexed |
2025-11-25T20:54:30Z |
| _version_ |
1850543460501684224 |
| fulltext |
УДК 57.043:577.382.3:577.334
О.А. Нардид1*, Я.О. Черкашина1, Л.В. Иванов2, Э.О. Нардид1, А.Н. Ляпунов2, В.В. Мамонтов1
Влияние пропиленгликоля и полиэтиленгликоля с молекулярной
массой 1500 на микровязкость мембран эритроцитов
UDC 57.043:577.382.3:577.334
O.A. Nardid1*, Ya.O. Cherkashina1, L.V. Ivanov2, E.O. Nardid1, A.N. Lyapunov2, V.V. Mamontov1
Effect of Propylene Glycol and Polyethylene Glycol with
Molecular Weight of 1,500 on Erythrocyte Membrane Microviscosity
Реферат: В работе с использованием метода электронного парамагнитного резонанса спиновых зондов проведено
сравнительное изучение влияния низко- и высокомолекулярных криозащитных веществ на микровязкость мембран
эритроцитов. Результаты исследований вращательной подвижности жирно-кислотных спиновых зондов в мембранах
эритроцитов после 5-минутной икубации свидетельствуют об отсутствии значимых изменений микровязкости мембран
в 15%-м растворе пропиленгликоля. Показано, что введение полиэтиленгликоля с м. м. 1500 (ПЭГ-1500) в конечной
концентрации 15% в суспензию эритроцитов увеличивает микровязкость мембран при экспозиции до 60 мин. Это
объясняется тем, что молекулы ПЭГ-1500 не проходят внутрь клеток, а локализуются на поверхности мембран, вызывают
торможение вращательной подвижности спинового зонда. В начальный период наблюдения при таких концентрациях
ПЭГ-1500 процесс нарушения жидкокристаллической структуры мембран и белково-липидных взаимодействий в мембране
превалирует над процессом дегидратации клеток.
Ключевые слова: криопротекторы, эритроциты, мембраны, микровязкость, электронный парамагнитный резонанс,
спиновые зонды.
Реферат: У роботі з використанням методу електронного парамагнітного резонансу спінових зондів проведене
порівняльне вивчення впливу низько- і високомолекулярних кріозахистних речовин на мікров'язкість мембран еритроцитів.
Результати досліджень обертальної рухливості жирно-кислотних спінових зондів у мембранах еритроцитів після 5-хвилинної
інкубації в 15%-му розчині пропиленгликолю свідчать про відсутність значимих змін мікров'язкості мембран. Показано, що
введення поліетиленгліколю з м. м. 1500 (ПЕГ-1500) у кінцевій концентрації 15% у суспензію еритроцитів збільшує мікров'язкість
мембран при експозиції до 60 хв. Це пояснюється тим, що молекули ПЕГ-1500 не проходять усередину клітин, а локалізуються
на поверхні мембран, викликають гальмування обертальної рухливості спінового зонда. У початковий період спостереження
за таких концентрацій ПЕГ-1500 процес порушення рідкокристалічної структури мембран і білок-ліпідних взаємодій у мембрані
превалює над процесом дегідратації клітин.
Ключові слова: кріопротектори, еритроцити, мембрани, мікров’язкість, електронний парамагнітний резонанс, спінові зонди.
Abstract: Electron paramagnetic resonance of spin probes was used to study the effect of low and high molecular weight CPAs
on microviscosity of erythrocyte membranes. Research data on rotational mobility of the fatty acid spin probes in erythrocyte
membranes after 5 min incubation in 15% propylene glycol solution indicate the absence of strong changes in membrane microviscosity.
Introduced polyethylene glycol with m. w. 1500 (PEG-1500) at a final concentration of 15% has been shown to increase the
membrane microviscosity at 60 min exposure. This is explained by the fact that the molecules of PEG-1500 do not pass inside the cells
and are localized on the membrane surface to cause immobilization and inhibiting the rotational mobility of the spin probe. In the initial
period of time under these concentrations of PEG-1500 the injury of liquid crystal membrane structure and disorder of the protein-lipid
interactions in the membrane prevail over the dehydration of cells.
Key words: cryoprotectants, erythrocytes, membranes, microviscosity, electron paramagnetic resonance, spin probes.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015;
тел.: (+38 057) 373-31-41, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: olnard@mail.ru
*To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.: +380 57 373 3141, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: olnard@mail.ru
1Department of Cryophysiology, Institute for Problems of Cryobiol-
ogy and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of
Ukraine, Kharkov, Ukraine
2Institute of Solid Crystals of the National Academy of Sciences of
Ukraine, Kharkov, Ukraine
1Отдел криобиофизики, Институт проблем криобиологии и
криомедицины НАН Украины, г. Харьков
2Институт монокристаллов НАН Украины, г. Харьков
Поступила 25.08.2015
Принята в печать 09.02.2016
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2016. – Т. 26, №1. – С. 35–44.
© 2016 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received August, 25, 2015
Accepted February, 09, 2016
Probl Cryobiol Cryomed 2016; 26(1): 35–44.
© 2016 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
оригинальное исследование research article
За многие годы исследований в криобиологии
накоплено значительное количество работ о высо-
кой чувствительности биологических мембран к
низким температурам и, особенно, к заморажи-
ванию [1, 6, 15, 22, 25]. Чувствительность мембран
к действию замораживания и последующего
отогрева обусловлена их сложной структурной
организацией, обеспечивающей функционирование
Over many years of investigations in cryobiology a
huge number of reports on a high sensitivity of
biological membranes to low temperatures and in
particular to freezing has been accumulated [3, 9,10,
17, 22]. Sensitivity of membranes to freezing and
subsequent thawing is stipulated by their complicated
structural organization, providing the cell functioning
[6, 8, 14]. Using the cryoprotective agents (CPAs) to
36 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
клеток [4, 5, 9]. При использовании криопротекто-
ров для возможной защиты биообъектов от холо-
довых повреждений должны учитываться данные
об их влиянии на структуру и вязкость биологи-
ческих мембран. Причины повреждений клеток в
составе суспензий при замораживании и после-
дующем отогреве окончательно не изучены, как и
не определен до конца механизм действия приме-
няемых криозащитных агентов [15–17, 24]. Среди
описанных в литературе выделяют следующие
механизмы защиты с помощью криопротекторов:
предотвращение повреждений высокими концент-
рациями солей в растворах [26]; снижение повреж-
дения клеток, в частности клеточных мембран, в
результате дегидратации [3, 19, 23]; предотвра-
щение внутриклеточной кристаллизации [6, 17] и
некоторые другие. Однако известно, что данные
соединения могут оказывать повреждающее
действие, степень проявления которого зависит от
температуры среды, концентрации вещества и
времени экспозиции клеток в растворе и может
приводить к увеличению гетерогенности липидно-
го бислоя мембран, нарушению их барьерных
свойств, ингибированию активности цитоплазмати-
ческих и мембранных ферментных комплексов [3,
21, 23]. В суспензиях эритроцитов, содержащих
высокомолекулярный криопротектор полиэтилен-
гликоль с м. м. 1500, были выявлены локальные
изменения микровязкости мембраны, связанные с
адсорбцией молекул криопротектора в местах
белково-липидных контактов [14]. Появление при
этом в спектрах электронного парамагнитного
резонанса (ЭПР) сигнала от более подвижных зон-
дов свидетельствует об увеличении динамической
гетерогенности мембран эритроцитов за счет
появления более текучих областей. В присутствии
низкомолекулярного криопротектора пропиленгли-
коля в суспензии клеток подобные изменения
отсутствуют. Известно, что при добавлении низко-
молекулярных проникающих криопротекторов к
суспензии белых теней эритроцитов снижает тер-
мостабильность мембраносвязанных белковых
комплексов [27]. Авторы считают, что это может
быть вызвано нарушением внутри- и межмоле-
кулярных взаимодействий интегральных и перифе-
рических белков мембран эритроцитов. Показано,
что дестабилизирующий эффект пропиленгликоля
на мембраны связан с его воздействием на ин-
тегральные мембранные белки, в то время как
глицерина – на периферические.
При использовании криопротекторов внутри-
клеточного действия важно определить время,
необходимое для эффективного проникновения ве-
щества в клетку. Как правило, в результате дли-
тельной инкубации криопротектор оказывает
protect the biological objects from cold damages should
consider the data about their impact on the structure
and viscosity of biological membranes. The reasons
of damage in the suspended cells occurring during
freezing and subsequent thawing have not been
completely understood, nor there was finally identified
the acting mechanism of CPAs [16, 22, 24, 25]. The
following protective mechanisms of the CPAs are
among the described in publications: preventing the
damage with high saline concentrations in solution [20];
reduction of cell damage, in particular, of cell membra-
nes during dehydration [5, 12, 28]; preventing an intra-
cellular crystallization [10, 25], etc. However, these
compounds also could render a damaging effect, which
extent depends on a medium temperature, concentra-
tion of substances and duration of exposure in a solution
and can lead to an increased heterogeneity of memb-
rane lipid bilayer, compromised barrier properties,
inhibited activity of cytoplasmic and membrane enzyme
complexes [1, 5, 12]. Local changes in membrane
microviscosity were found in erythrocyte suspensions
containing high molecular weight polyethylene glycol
CPA with molecular weight of 1500, and these were
associated with adsorption of CPA molecules in the
sites of protein-lipid contacts [21]. The signal from more
motile probes appeared in the spectra of electron spin
resonance (ESR), that indicated an increased dynamic
heterogeneity of erythrocyte membranes due to the
emergence of more fluid areas. These changes were
not found if low molecular weight CPA, propylene
glycol, was present in the cell suspension. Adding the
low-molecular penetrating CPAs to the suspension of
erythrocyte white ghosts resulted in a reduction of
thermal stability of the membrane-bound protein
complexes [23]. The authors suggested that this might
be due to a disruption of intra- and intermolecular
interactions of integral and peripheral proteins of
erythrocyte membranes. It has been shown that the
destabilizing effect of propylene glycol on membrane
was related to its influence on integral membrane
proteins, whilst glycerol affected the peripheral ones.
When using the CPAs of intracellular action it is
important to determine the time required for effective
penetration of the substances into a cell. Generally, as
a result of a prolonged incubation, the CPA has a toxic
effect on cells. Optimal incubation time for each cell
type is usually experimentally found [2, 16, 27, 28].
In reference with the above it is relevant to in-
vestigate the effects of CPAs on structure of cell
membranes during their direct interaction. Herewith
the most important was to study the effect of different
CPAs on microviscosity of membranes, since the
irreversible changes of cell membrane microviscosity
could determine the cytotoxicity of CPAs. These
mechanisms have been insufficiently elucidated, and
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
37
токсическое влияние на клетки. Оптимальная
продолжительность инкубации для каждого вида
клеток устанавливается зачастую опытным путем
[19, 20, 24, 28].
В связи с вышеизложенным актуально было
исследовать влияние криопротекторов на струк-
туру мембран клеток при их непосредственном
взаимодействии. При этом наиболее важным
является изучение влияния различных криопротек-
торов на микровязкость мембран, поскольку
необратимые изменения микровязкости мембран
клеток могут определять цитотоксичность исполь-
зуемых криопротекторов. Эти механизмы выясне-
ны недостаточно, что приводит зачастую к эмпи-
рическим подходам при разработке способов и
технологий низкотемпературного консервирова-
ния. Для получения более полной информации о
состоянии мембранных структур в криопротек-
торных средах применяют неинвазивные методы
исследования, в частности метод ЭПР спиновых
зондов.
Цель работы – сравнительное изучение влияния
низкомолекулярного (пропиленгликоль) и высоко-
молекулярного (полиэтиленгликоль с м. м. 1500)
криозащитных веществ на микровязкость мембран
эритроцитов методом ЭПР спиновых зондов.
Материалы и методы
В работе использовали проникающий через
мембраны эритроцитов низкомолекулярный крио-
протектор пропиленгликоль (ПГ) и непроникающий
высокомолекулярный полимер полиэтиленгликоль
с м. м. 1500 (ПЭГ-1500). Растворы криопротекто-
ров готовили на средах суспендирования эритро-
цитов и покапельно вносили в суспензии клеток при
постоянном перемешивании при температуре 0°С
до конечной концентрации 15%.
Данную работу выполняли в соответствии с
«Общими принципами экспериментов на живот-
ных», одобренными V Национальным конгрессом
по биоэтике (Киев, 2013) и согласованными с поло-
жениями «Европейской конвенции о защите
позвоночных животных, используемых для экспе-
риментальных и других научных целей» (Страс-
бург, 1986).
Эритроциты для исследований получали из
крови белых крыс-самцов. Для удаления плазмы
и лейкоцитов кровь центрифугировали 5 мин при
1500g. Лейкоцитарную пленку и супернатант
удаляли методом аспирации. Осадок эритроцитов
трижды отмывали путем центрифугирования при
1500g в течение 3 мин в 10-кратном объеме
фосфатно-солевого буфера (0,15 моль/л NaCl, 0,01
моль/л фосфатный буфер, pH 7,4) и хранили при
4°С в течение 4 ч.
as result the methods and techniques for low-tempera-
ture preservation are developed basing on an empirical
approach. For more complete information about the
state of membrane structures in cryoprotective media
one applies non-invasive research methods, in particular
the method of EPR spin probes.
The research aim was to comparative study the
effect of low (propylene glycol) and high (polyethylene
glycol of 1500 m. w.) molecular weight CPAs on
microviscosity of erythrocyte membranes by means
of spin probes EPR.
Materials and methods
We used an erythrocyte membrane-penetrating
CPA of low molecular weight propylene glycol (PG)
and non-invasive high molecular polymer polyethylene
glycol with m.w. of 1500 (PEG-1500). CPAs solutions
were prepared with erytrocyte re-suspension media
and were dropwise added into cell suspension during
constant stirring at 0°C up to final concentration of 15%.
Experiments were carried out in accordance with
the General Principles of Animal Experiments,
approved by the 5th National Congress in Bioethics
(Kiev, 2013) and consistent with the statements of the
European Convention for the Protection of Vertebrate
Animals Used for Experimental and Other Scientific
Purposes (Strasbourg, 1986).
Erythrocytes for the research were derived from
the blood of white male rats. To remove plasma and
white blood cells the blood was centrifuged 5 min at
1500g. Buffy coat and supernatant were removed by
aspiration. Erythrocyte pellet was three times washed
by centrifugation at 1500g for 3 min in a 10-fold volume
of phosphate-saline buffer (0.15 mol/l NaCl, 0.01 mol/l
phosphate buffer, pH 7.4) and stored at 4°C for 4 hrs.
Spin probes EPR method with a lipophilic organic
substitutive (allowing the stable nitroxyl radicals to build
into lipophilic layer of erythrocyte membranes) was
used to evaluate the time of the rotational diffusion
correlation of the probes in lipid membranes of cells.
To investigate the microviscosity of erythrocyte
membranes in the presence of CPAs we have chosen
two spin probes based on palmitic acid (Fig. 1),
synthesized by the previously described method [13, 26].
The probes 1 and 2 were dissolved in DMSO and
added to the aqueous suspension of erythrocytes to a
final concentration of probes of 10–4 M and DMSO
concentration of 0.5–1%. EPR spectra were recorded
with ESR Spectrometer CMS8400 (Adani, Belarus).
Brownian rotational diffusion of probes and erythro-
cyte membrane microviscosity were assessed by the
parameters of the EPR spectra of nitroxyl radicals,
spin probes 1 and 2 located in the erythrocyte mem-
brane lipid bilayer [7, 15]. To calculate the correlation
time of the Brownian rotational diffusion of the probe
38 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
В работе методом ЭПР спиновых зондов с
липофильным органическим заместителем (что
позволяет стабильным нитроксильным радикалам
внедряться в липофильный слой мембран эритро-
цитов) оценивали время корреляции вращательной
диффузии зондов в липидах мембран клеток.
Для исследования микровязкости мембран
эритроцитов в присутствии криопротекторов были
выбраны два спиновых зонда на основе пальмити-
новой кислоты (рис.1), синтезированных по методу
описанному ранее [8, 18].
Зонды 1 и 2 растворяли в ДМСО, добавляли в
водную взвесь эритроцитов до конечной концент-
рации зондов 10–4 М и концентрации ДМСО 0,5–1%.
Спектры ЭПР регистрировали на радиоспект-
рометре «ESR Spectrometer CMS8400» («Adani»,
Беларусь).
Броуновскую вращательную диффузию зондов
и микровязкость мембран эритроцитов оценивали
по параметрам спектров ЭПР нитроксильных
радикалов – спиновых зондов 1 и 2, находящихся в
липидном бислое мембран эритроцитов [10, 13].
Для расчета времени корреляции броуновской вра-
щательной диффузии зонда (τс) использовали такие
характеристики спектров: ширина центрального
компонента (∆H0), интенсивность компонентов
спектра ЭПР h0, h+1, h–1 с магнитным квантовым
числом ядра 14N (M = 0 + 1 – 1), изотропная конс-
танта сверхтонкого взаимодействия (Aизо).
Вязкость большинства жидких сред опреде-
ляют по уравнению Стокса-Эйнштейна:
τ = 4πa3η/3kT, (1)
где a – радиус частицы, η – вязкость среды.
В случае оценки вязкости среды с помощью спи-
нового зонда a – эффективный радиус спинового
зонда. Для вычисления времени корреляции
вращательной диффузии зонда τc использовали
выражения, полученные Г.И. Лихтенштейном [10]:
1/τс(+1) = 2×108/[(h0/h(+1))
1/2 – 1)]∆H0 с
–1 (2)
τс(+1/–1) = 8,33×10–11[(h(+1)/h(–1))
1/2 – 1)]∆H0 с (3)
Для определения места нахождения нитро-
ксильной головки спинового зонда в мембране
оценивали полярность микроокружения нитро-
ксильного фрагмента в присутствии/отсутствии
криопротекторов с помощью параметра Аизо [10,
13]. При нахождении нитроксильного радикала в
водном окружении Аизо составляет 16,7–17,2 Гс, а
в липофильном окружении в мембране – 14–14,5 Гс.
Ошибка измерения величины 1/τс определяется
дифференцированием формул (1) или (2). Поскольку
(τс) we used the following spectral characteristics: the
core component width (∆H0), intensity of the EPR
spectrum components h0, h+1, h–1 with the magnetic
quantum nucleus number 14N (M = 0 + 1 – 1); isotropic
hyperfine interaction constant (Aiso).
The viscosity of most liquid media is determined
with the Stokes-Einstein equation
τ = 4πa3η/3kT, (1)
where a – particle radius; h – medium viscosity. If the
viscosity of the medium is assessed using the spin
probe, a is an effective radius of the spin probe. To
calculate the correlation time of the probe rotational
diffusion we used the expressions obtained by
G.I. Liechtenstein [14]:
1/τс(+1) = 2×108/[(h0/h(+1))
1/2 – 1)]∆H0 sec–1 (2)
τс(+1/–1) = 8,33×10–11[(h(+1)/h(–1))
1/2 – 1)]∆H0 sec (3)
To determine the location of the spin probe nitroxyl
head in membrane we assessed the microenvironment
polarity of nitroxyl fragment in the presence/absence
of the CPAs using the parameter Aiso [7, 15]. If the
nitroxyl radical was located in an aqueous environment
Aiso was 16.7–17.2 G, and in the lipophilic membrane
environment it was 14–14.5 G.
The measurement error of the value 1/τс is deter-
mined by differentiating the formulae (1) or (2). Since
Рис.1 Спиновые зонды на основе пальмитиновой
кислоты: зонд 1 – нитроксильный радикал 4-пальми-
тоиламидо-ТЕМПО и зонд 2 – нитроксильный радикал
4-(N,N-диметил-N-гексадециламмонио)-ТЕМПО ,
содержащий в своём составе четвертичный аммоние-
вый фрагмент.
Fig. 1. Palmic acid-based spin probes: 1 is nitroxide radi-
cal of 4-palmitoylamido-TEMPO and 2 is nitroxide radical
of 4-(N,N-dimethyl-N-hexadecylammonium)-TEMPO, con-
taining quaternary ammonium fragment.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
39
точность измерений величины H0 изменяется в
зависимости от спектра, то величину ошибки для
общего случая оценивали приблизительно. Для 1/τс
в области 10–9 с–1 она не превышает 0,1×10–9 с–1. Для
статистической обработки полученных данных
применяли пакет прикладных программ «Statis-
tica 6.0» (США). Результаты исследования пред-
ставлены в виде средних значений, отклонение –
стандартной ошибки среднего. Статистическую
значимость расхождений между значениями
оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
Значимыми считали отличия при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Структурные особенности и физико-химические
свойства липидной фазы играют важную роль в
поддержании надмолекулярной организации био-
мембран, важным фактором которой является
сохранение нативности белково-липидных комп-
лексов. В связи с этим необходимо исследование
влияния низко- и высокомолекулярных криозащит-
ных веществ, которые обладают свойством прони-
кать через цитоплазматические мембраны клеток,
на микровязкость липидной фазы мембран для
обоснования возможности применения таких
криопротекторов при разработке технологий крио-
консервирования клеточных суспензий.
Криопротекторы ПГ и ПЭГ-1500 вводили во
взвесь эритроцитов в концентрации, близкой к
реально используемым при криоконсервировании
клеток. С одной стороны, такие концентрации
обеспечивают целостность мембран эритроцитов,
а с другой – они близки к критическим, т. е. при
которых отмечаются нарушения мембранных
структур.Такой выбор концентраций необходим для
определения тенденций изменения структуры
мембран под действием криозащитных веществ
при сохранении их барьерных свойств. Спектры
ЭПР регистрировали через 5 и 60 мин после вве-
дения криопротекторов во взвесь эритроцитов, что
позволяло оценить изменение конформационной
подвижности липидов мембран под действием
криозащитных веществ с течением времени и
последствия диффузии молекул криопротекторов
внутрь мембраны.
Используемые липофильные спиновые зонды
по-разному встраиваются в липидный бислой мем-
бран. По-видимому, зонд 2 с положительным заря-
дом встраивается в мембрану подобно фосфати-
дилхолину, имеющему положительно заряженную
холиновую «головку» и два алкильных «хвоста».
На основании полученных нами результатов
установлено, что нитроксильный фрагмент зонда
2 с неспаренным электроном находится вблизи
поверхности мембраны в липидном окружении, так
the measurement accuracy of the parameter H0 varies
depending on the spectrum, the error value in general
was evaluated approximately. For 1/τс in the range of
10–9 с–1 it did not exceed 0,1×10–9 с–1. The data were
statistically processed using Statistica 6.0 software
(USA). Research results were presented as mean
values, the deviation was done as SEM. Statistical
significance of the differences between the groups was
evaluated by Student’s t-test. Differences were
considered significant if p < 0.05.
Results and discussion
Structural peculiarities and physicochemical proper-
ties of the lipid phase play a vital role in maintaining
the supramolecular organization of biological mem-
branes, an important factor of which is to preserve the
native state of protein-lipid complexes. In this regard,
there is a necessity in investigating the effects of low
and high molecular weight CPAs, which are capable
of penetrating through the cell cytoplasmic membrane,
on microviscosity of membrane lipid phase, and using
this knowledge to justify the possibility of application
of these CPAs when developing the techniques to
cryopreserve the cell suspensions.
CPAs PG and PEG-1500 were added into the
suspension of erythrocytes under the concentration
close to those actually used for cryopreservation of
cells. These concentration, on the one hand, ensure
the integrity of erythrocyte membranes, and, on another
hand, they are close to critical ones, i. e. under which
the disorders of membrane structures are noted. Such
a selection of concentrations is necessary to determine
the directions of changes in membrane structure under
the CPAs influence, while maintaining their barrier
properties. EPR spectra were recorded in 5 and 60 min
following introduction of CPAs into erythrocyte sus-
pension that allowed the evaluation of the change in
conformational mobility of the membrane lipids under
the influence of CPAs with the time course and the
consequences of diffusion of CPAs molecules inside
a membrane.
The used lipophilic spin probes are differently incor-
porated into lipid bilayer of membranes. Apparently,
the probe 2 with a positive charge is incorporated into
membrane like phosphatidylcholine, having a positively
charged choline head and 2 alkyl tails. Based on these
results we have found that the nitroxyl fragment of
the probe 2 with an unpaired electron was located near
the membrane surface in lipid environment, since its
Aiso constant was 14.6 G and corresponded to the
position of the nitroxyl fragment in a non-polar
environment [15]. Nitroxyl fragment of probe 2 is
‘sandwiched’ between the phospholipid heads in the
membrane and its rotational mobility can be quite
sensitive to the changes in packing density of the
40 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
Рис. 2. Спектры ЭПР зондов 1 и 2 в эритроцитах при
25°С.
Fig. 2. EPR spectra of probes 1 and 2 in erythrocytes.
как его константа Аизо равна 14,6 Гс и соответствует
нахождению нитроксильного фрагмента в неполяр-
ном окружении [10]. Нитроксильный фрагмент
зонда 2 «зажат» между фосфолипидными головка-
ми в мембране, поэтому его вращательная под-
вижность может быть достаточно чувствительна
к изменению плотности упаковки фосфолипидов
мембран клеток, т. е. к микровязкости поверхности
мембран. Связывание криопротекторов с мембра-
ной эритроцитов и внедрение молекул криопротек-
торов между молекулами фосфолипидов мембран
может изменять плотность упаковки фосфолипидов
в мембране (микровязкость) и параметр Аизо зондов.
Нейтральный зонд 1 из-за отсутствия заряда
более лабилен и менее погружен в липидный би-
слой мембран эритроцитов, чем несущий на себе
положительный заряд зонд 2. Поэтому зонд 1
более чувствителен к приповерхностной области
мембраны, а зонд 2 в большей степени характе-
ризует состояние самого бислоя. В соответствии
с этим вращательная подвижность зонда 1 в
мембране эритроцитов несколько выше, чем
зонда 2, что отражается на соответствующих
спектрах ЭПР (рис. 2).
Анализ полученных нами результатов, а также
данные литературы свидетельствуют о многофак-
торном влиянии криопротекторов на микровязкость
мембран эритроцитов. Такими факторами являют-
ся первоначальная дегидратация и последующее
восстановление объема или возможное набухание
клеток, которые имеют разнонаправленное влия-
ние на изменение микровязкости [11, 15, 27]. Кроме
того, на микровязкость липидов при проникновении
криопротекторов в мембрану будет влиять проис-
ходящее при этом нарушение жидкокристалли-
ческой структуры мембраны, а также изменение
упорядоченности фосфолипидов и белково-липид-
ных взаимодействий в мембранах клеток [7, 14,
15].
Ранее показано [12, 15], что добавление в доста-
точно высоких концентрациях (20%)проникающих
криопротекторов, в частности глицерина, 1,2-ПД,
ДМСО, приводит к двухфазному характеру изме-
нений в клетке, связанному с начальной быстрой
дегидратацией эритроцитов и уменьшением их
объема, а затем к последующему восстановлению
объема при диффузии молекул криопротекторов и
воды внутрь клеток. При этом в начале объем
клетки уменьшается, что приводит к уплотнению
мембраны и увеличению ее микровязкости, затем
микровязкость мембраны вследствие последую-
щего восстановления клеточного объема умень-
шается. Результаты проведенных нами исследова-
ний вращательной подвижности спиновых зондов
phospholipid cell membranes, i. e. to the membrane
surface microviscosity. Binding of CPAs with the
erythrocyte membrane and the insertion of the CPAs
molecules between membrane phospholipids can alter
the packing density of phospholipids in membrane
(microviscosity), as well as the Aiso parameter of
probes.
Neutral probe 1 has no charge and is more labile
and less immersed into the lipid bilayer of erythrocyte
membranes than the probe 2, carrying a positive
charge. Therefore, the probe 1 is more sensitive to the
membrane near-surface region and the probe 2 in a
greater extent characterizes the state of the bilayer
itself. Accordingly, the rotational mobility of the probe 1
in the erythrocyte membrane is slightly higher vs. the
probe 2, that is reflected in the corresponding EPR
spectra (Fig. 2).
The analysis of our findings and the previously
reported data indicate multifactor effect of CPAs on
microviscosity of erythrocyte membranes. These
factors are the initial dehydration and subsequent vo-
lume recovery or vice versa swelling of the cells, which
differently affect the changes in microviscosity [19,
22, 23]. In addition, during CPAs penetration into
membrane the lipid microviscosity will be affected by
occurring impairment of liquid crystal structure of the
membrane as well as the change in the order of phos-
pholipids and protein-lipid interactions in cell membranes
[11, 21, 22].
It has been previously shown [18, 22] that the
addition of relatively high concentrations (20%) of
penetrating CPAs, such as glycerol, 1,2-PD, DMSO
led to the biphasic nature of the changes in a cell
associated with an initial rapid dehydration of
erythrocytes and their volume reduction, and later to
the following recovery of the volume during diffusion
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
41
Значения времени корреляции вращательной диффузии τс
спиновых зондов в мембранах эритроцитов в присутствии 15%
криопротекторов при температуре 25°С
Correlation time of rotational diffusion τс of spin probes in erythrocyte
membranes in presence of 15% cryoprotectant (at 25°C)
роткеторпоирK
tnatcetorpoyrC
ямерВ
,иицизопскэ
ним
erusopxE
nim,emit
τ )1+(с × 01 9 с,
τ )1+(с × 01 9 ces, τ )1-/1+(с × 01 9 с,
2дноЗ
τ )1-/1+(с × 01 9 ces,
2eborP2дноЗ
2eborP
1дноЗ
1eborP
ьлортноK
lortnoC – 1,0±2,8 2,0±6,1 1,0±2,5
0051-ГЭП
0051-GEP
5 3,0±1,7 3,0±2,2 3,0±5,3
06 3,0±9,7 3,0±2,2 3,0±1,5
ГП
GP
5 2,0±4,8 2,0±0,2 2,0±4,5
06 3,0±8,7 2,0±7,1 3,0±8,4
мембране, превалирующими над процессом де-
гидратации эритроцитов с уплотнением мембраны
под действием ПЭГ-1500. Эти данные совпадают
с ранее полученными [14, 15]. С помощью спин-
меченой в пятом положении доксилстеариновой
жирной кислоты, которая локализуется на глубине
8 нм в липидной фазе, авторами было установлено
увеличение динамической гетерогенности мембран
эритроцитов за счет появления более текучих
областей при добавлении в суспензию клеток
ПЭГ-1500.
Данные вращательной подвижности зонда 1,
находящегося на поверхности раздела мембрана-
вода (Аизо =16,8 Гс), свидетельствуют о том, что
при введении ПЭГ-1500 в суспензию эритроцитов
увеличивается микровязкость в приповерхностной
области мембраны как в начальный период
наблюдения (5 мин), так и через 60 мин (таблица).
Это обусловлено тем, что молекулы ПЭГ-1500, ко-
торые располагаются на поверхности мембран в
результате гидрофобных взаимодействий, вызы-
вают уплотнение приповерхностной области
мембраны и торможению вращательной подвиж-
ности спинового зонда.
Полученные результаты подтверждаются дан-
ными А.К. Гулевского [7], согласно которым глице-
рин и ПЭГ даже в более высоких концентрациях
(40% и выше), не нарушая целостность мембран,
увеличивают микровязкость в анизотропной зоне.
Иммобилизация поверхности мембраны может
быть вызвана дегидратацией полярных областей
мембраны в присутствии криопротекторов. Такой
модифицирующий эффект усиливается с ростом
концентрации криозащитных агентов [15].
of water molecules and CPAs into the cells. At first
the cell volume decreases, and then the membrane
microviscosity reduces as a result of following reco-
very of cell volume. Our findings on rotational mobility
of spin probes 1 and 2 in erythrocyte membranes have
shown that the microviscosity of membranes was not
significantly altered 5 min later the addition of PG in a
final concentration of 15% into erythrocyte suspension
(Table), indicating the fast recovery of cell volume and
diffusion of CPA into the cells at room temperature
[18].
In 5 min after the addition into the erythrocyte
suspension of PEG-1500 at a final concentration of
15% the membrane microviscosity decreases (Table,
probe 2). This is stipulated by the changes in the liquid
crystalline structure of membrane due to lyotropic
mesomorphism and impaired protein-lipid interactions
in membrane, prevailing over the dehydration of red
blood cells and membrane compaction under the effect
of PEG-1500. These findings are consistent with
previous results [21, 22]. Using a doxylstearic fatty
acid spin-labeled in the fifth position, which localized
at a depth of 8 nm in lipid phase, a rise in dynamic
heterogeneity of erythrocyte membranes the authors
have found due to appearance of more fluid areas when
PEG-1500 was added to cell suspensions.
The rotational mobility data for the probe 1, being
on the surface of the membrane-water interface
(Aiso = 16.8 G), indicate that the introduction of
PEG-1500 into erythrocyte suspension increases the
microviscosity in the near-surface region of membrane
both at the start of observation (5 min) and 60 min
later (see Table). This is stipulated by the fact that
PEG-1500 molecules, located on the membrane surface,
1 и 2 в мембранах эритроцитов
показали, что микровязкость мем-
бран через 5 мин после добавления
в суспензию эритроцитов ПГ в
конечной концентрации 15% значимо
не изменяется (таблица), что свиде-
тельствует о быстрых процессах
восстановления клеточного объема
и диффузии внутрь клеток при ком-
натной температуре [12].
Через 5 мин после добавления
в суспензию эритроцитов ПЭГ-1500 в
конечной концентрации 15% микровяз-
кость мембран уменьшается (таблица,
зонд 2). Это обусловлено изменения-
ми в жидко-кристаллической струк-
туре мембраны из-за лиотропного
мезоморфизма и нарушениями бел-
ково-липидных взаимодействий в
42 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
Результаты проведенных исследований позво-
ляют предположить, что степень и характер воз-
действия криопротекторных веществ на мембраны
эритроцитов зависят не только от молекулярной
массы и пространственной структуры, а также от
размера и проникающей способности молекул этих
веществ. На взаимодействие молекул криопротек-
торов с мембранами может влиять и степень
гидрофобности. На основании результатов преды-
дущих исследований [3, 7, 11, 12, 14, 15] можно
полагать, что взаимодействие криопротекторов с
мембранами осуществляется в результате их
связывания с поверхностными группами фосфоли-
пидов и белковых молекул.
Скорее всего, мембранотропный эффект крио-
протекторов обусловлен их влиянием как на поляр-
ные (вблизи поверхности), так и на гидрофобные
взаимодействия липидных компонентов мембраны
[7, 14, 15]. Полярные взаимодействия в присутст-
вии криопротекторных веществ могут изменяться
вследствие встраивания молекул веществ в бислой
и дегидратации полярных «головок» фосфолипидов,
а также при действии молекул криопротекторов
на структуру воды и опосредованно на упаковку
фосфолипидов.
Выводы
Результаты анализа вращательной подвижности
жирно-кислотных спиновых зондов в мембранах
эритроцитов показали, что 15%-я концентрация ПГ
в суспензии клеток значимо не влияет на микровяз-
кость мембран уже после 5 мин инкубации. Это
подтверждает наличие достаточно быстрых про-
цессов восстановления клеточного объема и диф-
фузии внутрь клеток при комнатной температуре.
Введение ПЭГ-1500 в конечной концентрации
15% в суспензию эритроцитов увеличивает микро-
вязкость мембран при экспозиции до 60 мин.
Данный факт объясняется тем, что молекулы
ПЭГ-1500 не проходят внутрь клеток, а локали-
зуются на поверхности мембран, вызывая иммоби-
лизацию поверхности мембран и торможение
вращательной подвижности спинового зонда. Из
анализа данных по подвижности спинового зонда,
нитроксильный радикал которого расположен
между фосфолипидными головками мембранных
липидов, следует, что на начальном этапе экспо-
зиции (5 мин) микровязкость мембран снижается
с тенденцией к повышению в течение часа.
Наблюдаемое снижение микровязкости обуслов-
лено изменениями в жидкокристаллической струк-
туре мембраны и нарушениями белково-липидных
взаимодействий, превалирующими над процессом
дегидратации эритроцитов.
in the result of hydrophobic interactions, cause the
compaction of near-surface region of membrane and
inhibition of spin probe rotational mobility.
These results are confirmed by the data of
A.K. Gulevsky [11], according to which even higher
concentrations (40% and higher) of glycerol and PEG
increase the microviscosity in a anisotropic zone
without compromising the integrity of membranes.
Immobilization of the membrane surface may be
caused by dehydration of the membrane polar regions
in the presence of CPAs. This modifying effect is
strengthened with a rise in concentration of CPAs.
[22].
The results of performed studies suggest that the
extent and nature of the CPAs effect on erythrocyte
membranes depend not only on the molecular weight
and the spatial structure, but also on the size and
penetrating ability of the molecules of these substan-
ces. Hydrophobicity extent also can affect the inter-
action of CPAs molecules with membranes. Based on
the findings of previous studies [5, 11, 18, 19, 21, 22],
one can assume that CPAs interaction with membranes
is implemented by their binding to the surface groups
of phospholipids and protein molecules.
The membrane effect of CPAs is rather due to
their influence on both polar (near the surface) and
hydrophobic interaction of the lipid membrane
components [11, 21, 22]. Polar interactions in the
presence of CPAs may vary due to incorporation of
the molecules and substances into the bilayer and the
dehydration of polar heads of phospholipids, as well as
during the CPAs molecules influence on water structure
and indirectly on packaging of phospholipids.
Conclusions
The results of the analysis of rotational mobility of
fatty acid spin probes in erythrocyte membranes have
shown that presence of 15% PG in the cell suspension
does not significantly affect the membrane microvisco-
sity following 5 min incubation. This confirms the
presence of quite rapid recovery of cell volume and
diffusion into the cells at room temperature.
Introduction of PEG-1500 at a final concentration
of 15% into erythrocyte suspension increases the
membrane microviscosity during the exposure up to
60 min. This fact could be explained by the pheno-
menon that the molecules of PEG-1500 do not pene-
trate into the cells but are localized on the surface of
membranes, causing the immobilization of membrane
surface and inhibition of the spin probe rotational
mobility. The analysis of the mobility data on the spin
probe with the nitroxyl radical located between the
phospholipid heads of membrane lipids, demonstrated
that at the start of exposure (5 min) the microviscosity
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
43
of membranes was reduced and risen in an hour. The
observed decrease in microviscosity was due to the
changes in the liquid crystal membrane structure and
impaired protein-lipid interactions, prevailing over the
dehydration of red blood cells.
References
1. Anchordoguy T.J., Rudolph A.S., Carpenter J.F., Crowe J.H.
Modes of interaction of cryoprotectants with membrane
pospholipids during freezing. Cryobiology 1987; 24(4): 324–
331.
2. Babiychuk L.O., Grischenko V.I., Sumida S. et al., inventors.
Cryopreservation method for erythrocytes. Patent of Ukraine
N30888A. 2000 Dec. 15.
3. Baust J.G., Baust J.M., Shnayder K. et al. Biopreservation –
molecular-based mitigation of the preservation challenges.
Problems of Cryobiology 2008; 18(2): 163.
4. Belous A.M., Bondarenko V.A. Structural changes of biological
membranes under cooling. Kiev: Naukova Dumka; 1982.
5. Belous A.M., Grischenko V.I. Cryobiology. Kiev: Naukova Dumka;
1994.
6. Bergelson L.D. Biological membranes: Facts and hypotheses.
Moscow: Nauka; 1975.
7. Berliner L.J., editor. Spin labeling. Theory and applications.
New York – San Francisco – London: Academic press; 1979.
8. Bogach P.G., Kurskiy M.D., Kucherenko N.E., Rybalchenko V.K.
The structure and function of biological membranes. Kiev:
Vyshcha shkola; 1981.
9. Farrant J., Walter C.A., Lee H. et al. Use of two-step cooling
procedures to examine factors influencing cell survival
following freezing and thawing. Cryоbiology 1977; 14(3):
273–286.
10.Gordienko E.A., Pushkar N.S. Physical grounds of low tempe-
rature preservation of cell suspensions. Kiev: Naukova Dumka;
1994.
11.Gulevsky A.K., Bondarenko V.A., Belous A.M. Barrier proper-
ties of biomembranes at low temperatures. Kiev: Naukova
Dumka; 1988.
12.Hеber U.W. Freezing injury is relation to loss of enzyme
activities and protection against freezing. Cryobiology 1968;
5: 188–201.
13.Ivanov L.V., Lyapunov O.M., Kartel M.Т. et al. Delivery of spin
probes by carbon nanotubes in erythrocytes and plasma of
blood. Surface 2014; 6(21): 292–304.
14.Lev A. A. The ion selectivity of cell membranes. Leningrad:
Nauka; 1975.
15.Likhtenshtein G.I. Method of spin probes in molecular biology.
Moscow: Nauka; 1974.
16.Lovelock J.E., Bishop M.W.H. Prevention of freezing damage
to living cells by dimethyl sulphoxide. Nature 1959; 183: 1394–
1395.
17.Meryman H.T. Freezing injury and its prevention in living cells.
Ann Rev Biophys Bioenrg 1974; 3(4): 341–363.
18.Mezhhidov S.Kh., Nardid O.A., Moiseyev V.A. EPR spin probe
method to study the permeability of red blood cells for the
cryoprotectants. Biophysics 1996; 41(6): 1278–1283.
19.Moiseyev V.A., Mezhhidov S.Kh., Nardid O.A. Study of
erythrocyte dehydration by the method of spin probe. Biofizika
1989; 34(6): 993–996.
20.Moiseyev V.A., Nardid O.A., Belous A.M. On a possible
mechanism of the protective action of cryoprotectants.
CryoLetters 1982; 3: 17–26.
21.Nardid O.A., Tsymbal L.V., Gulevsky A.K. Influence of cryo-
protectants on the protein-lipid interactions in the membranes
of red blood cells. Physical and chemical processes in
Литература
1. Бауст Дж.Г., Бауст Дж.М., Шнайдер К., Ван Баскирк Р.
Биосохранение – уменьшение отрицательных последст-
вий консервирования на молекулярном уровне //
Проблемы криобиологии. – 2008. – Т. 18, №2 – С. 163.
2. Белоус А.М., Бондаренко В.А. Структурные изменения
биологических мембран при охлаждении. – К.: Наук.
думка, 1982. – 256 с.
3. Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология. – К.: Наук.
думка, 1994. – 432 с.
4. Бергельсон Л.Д. Биологические мембраны: Факты и гипо-
тезы. – М.: Наука, 1975. – 183 с.
5. Богач П.Г., Курский М.Д., Кучеренко Н.Е., Рыбальченко В.К.
Структура и функции биологических мембран. – К.: Вища
школа, 1981. – 336 с.
6. Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низко-
температурного консервирования клеточных суспен-
зий. – К.: Наук. думка, 1994. – 144 с.
7. Гулевский А.К., Бондаренко В.А., Белоус А.М. Барьерные
свойства мембран при низких температурах. – К.: Наук.
думка, 1988. – 208 с.
8. Иванов Л.В., Ляпунов А.Н., Картель Н.Т. и др. Доставка
липофильных спиновых зондов углеродными нанотруб-
ками в эритроциты и плазму крови // Поверхность. –
2014. – Вып. 6(21). – С. 292–304.
9. Лев А.А. Ионная избирательность клеточных мембран. –
Л.: Наука,1975. – 323 с.
10.Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной
биологии. – М.: Наука, 1974. – 256 с.
11.Моисеев В. А., Межидов С.Х., Нардид О.А. Исследование
дегидратации эритроцитов методом спинового зонда //
Биофизика. – 1989. – Т. 34, Вып. 6. – С. 993–996.
12.Межидов С.Х., Нардид О.А., Моисеев В.А. Метод ЭПР-
спинового зонда в исследовании проницаемости эритро-
цитов для криопротекторов // Биофизика. – 1996. – Т. 41,
Вып. 6. – С. 1278–1283.
13.Метод спиновых меток. Теория и применения / Под ред.
Л. Берлинера. – М.: Мир, 1979. – 639 с.
14.Нардид О.А., Цымбал Л.В., Гулевский А.К. Влияние крио-
протекторов на белок-липидные взаимодействия в мем-
бранах эритроцитов // Физико-химические процессы в
криобиологических системах: Сб. статей. – Харьков,
1991. – С. 102–106.
15.Нардид О.А. Внутри- и межмолекулярные взаимодейст-
вия и их роль в криоповреждении и криозащите биологи-
ческих структур: Дис. … д–ра. биол. наук. – Харьков,
2012. – С. 373.
16.Осецкий А.И., Гурина Т.М., Кирилюк А.Л., Репин Н.В. О ме-
ханизме защиты криоконсервируемых биообъектов с
помощью многокомпонентных криопротекторных раство-
ров // Проблемы криобиологии. – 2008. – Т. 18, №2. – С. 231.
17.Розанов Л.Ф. Кінетика реакцій клітин на дію факторів кріо-
консервування: Автореф. дис. … д–ра. биол. наук. –
Харків, 1995. – 35 с.
18.Розанцев Э.Г. Свободные иминоксильные радикалы. – М.:
Химия, 1970. – 216 с.
19.Смольянинова Е.И., Пишко О.В., Лисина Е.Г. и др. Анализ
влияния различных этапов криоконсервирования
методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной
среде на жизнеспособность 2-клеточ-ных эмбрионов
миши // Проблемы криобиологии. – 2007.– Т. 17, №4. –
С. 385–393.
20.Пат. №30888А, Україна, МПК 6А01N 1/02. Спосіб консер-
вування еритроцитів / Л.О. Бабійчук, В.І. Грищенко,
С. Сусіда та ін. – заявл. 16.06.98; опубл. 15.12.2000,
Бюл. №7.
21.Anchordoguy T.J., Rudolph A.S., Carpenter J.F., Crowe J.H.
Modes of interaction of cryoprotectants with membrane
pospholipids during freezing // Cryobiology. – 1987. – Vol. 24,
№4. – P. 324–331.
44 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 1, 2016
22. Farrant J., Walter C.A., Lee H. et. al. Use of two-step cooling
procedures to examine factors influencing cell survival
following freezing and thawing // Cryоbiology. – 1977. –
Vol. 14, №3. – P. 273–286.
23.Hеber U.W. Freezing injury is relation to loss of enzyme activi-
ties and protection against freezing // Cryobiology. – 1968. –
Vol. 5. – P. 188–201.
24.Lovelock J.E., Bishop M.W.H. Prevention of freezing damage
to living cells by dimethyl sulphoxide // Nature. – 1959. –
Vol. 183. – P.1394–1395.
25.Meryman H.T. Freezing injury and its prevention in living cells //
Ann. Rev. Biophys. Bioenrg. – 1974. – Vol. 3, №4. – P. 341–
363.
26.Moiseyev V.A., Nardid O.A., Belous A.M. On a possible
mechanism of the protective action of cryoprotectants //
CryoLetters. – 1982. – Vol. 3. – P. 17–26.
27.Nardid O.A., Dyubko T.S., Soloviova A.S et. al. Influence of
some polyols on erythrocyte cytoskeleton proteins // Cellular
& Molecular Biology Letters.– 1998.– Vol. 3, № 2.– P. 187–
188.
28.Simione F.P. Cryopreservation manual. – American Type Culture
Collection (ATCC) in cooperation with Nalge Nunc International
Corp. – 1998. – 8 p.
cryobiological systems: Collection of scientific papers. Kharkiv;
1991: 102–106.
22.Nardid O.A. Intra- and intermolecular forces and their role in
cryodamage and cryoprotection of biological structures
[dissertation]. Kharkov; 2012.
23.Nardid O.A., Dyubko T.S., Soloviova A.S et al. Influence of
some polyols on erythrocyte cytoskeleton proteins. Cellular &
Molecular Biology Letters 1998; 3(2): 187–188.
24.Osetsky A.I., Gurina T.M., Kirilyuk A.L., Repin N.V. About
mechanism of cryopreserved bioobject protection with multi-
component cryoprotectant solutions. Problems of Cryobiology
2008; 18(2): 231.
25.Rozanov L.F. Kinetics of cell reactions on effect of cryopre-
servation factors. [Author's abstract of dissertation]. Kharkov;
1995.
26.Rozantsev E.G. Free iminoxyl radikals. Moscow: Khimiya; 1970.
27.Simione F.P. Cryopreservation manual. American Type Culture
Collection (ATCC) in cooperation with Nalge Nunc International
Corp; 1998.
28.Smolyaninova Ye.I., Pishko O.V., Lisina E.G. et al. Analysis of
effect of different steps of vitrification protocol for cryopre-
servation with ethylene glycol-sucrose medium on 2-cell
murine embryo viability. Problems of Cryobiology 2007; 17(4):
385–393.
|