Влияние режимов криоконсервирования на поведение клеток СПЭВ в культуре
В работе продемонстрирована возможность использования адгезировавших на подложке клеток СПЭВ в качестве объекта для изучения кинетики осмотических реакций при экспозиции их в криозащитных средах. Были определены коэффициенты проницаемости мембран клеток СПЭВ для молекул воды и диметилсульфоксида (...
Збережено в:
| Дата: | 2016 |
|---|---|
| Автори: | , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2016
|
| Назва видання: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137399 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Влияние режимов криоконсервирования на поведение клеток СПЭВ в культуре / И.Ф. Коваленко, С.Е. Коваленко, И.П. Высеканцев, Т.Ф. Петренко, Л.Ф. Розанов, Н.А. Чернобай // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 2. — С. 116–123. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-137399 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1373992025-02-23T20:08:16Z Влияние режимов криоконсервирования на поведение клеток СПЭВ в культуре Effect of cryopreservation regimens on behavior of SPEV cells in culture Коваленко, И.Ф. Коваленко, С.Е. Высеканцев, И.П. Петренко, Т.Ф. Розанов, Л.Ф. Чернобай, Н.А. Теоретическая и экспериментальная криобиология В работе продемонстрирована возможность использования адгезировавших на подложке клеток СПЭВ в качестве объекта для изучения кинетики осмотических реакций при экспозиции их в криозащитных средах. Были определены коэффициенты проницаемости мембран клеток СПЭВ для молекул воды и диметилсульфоксида (ДМСО). На основе физикоматематической модели замораживания клеточных суспензий и рассчитанных коэффициентов проницаемости было проведено теоретическое прогнозирование осмотического поведения клеток СПЭВ при замораживании их суспензии с различными скоростями охлаждения. Экспериментальные исследования по замораживанию суспензии клеток СПЭВ показали, что скорость охлаждения 1,5 град/мин может обеспечить оптимальную защиту клеток от повреждения в присутствии 1 М ДМСО. Показано, что скорости охлаждения ниже и выше оптимальной могут привести к гибели клеток в результате внутриклеточной кристаллизации или дегидратации. У роботі показана можливість використання адгезованих на носії клітин СПЕВ у якості об'єкта для вивчення кінетики осмотичних реакцій клітин під час їх експозиції в кріозахисних середовищах. Були визначені коефіцієнти проникності мембран клітин СПЕВ для молекул води та диметилсульфоксиду (ДМСО). На основі фізико-математичного моделювання процесу заморожування клітинних суспензій та розрахованих коефіцієнтів проникності було проведено теоретичне прогнозування осмотичної поведінки клітин СПЕВ під час заморожування їх суспензій із різними швидкостями. Експериментальні дослідження з заморожування суспензії клітин СПЕВ показали, що швидкість охолодження 1,5 град/хв може забезпечити оптимальний захист клітин від кріопошкоджень у присутності 1 М ДМСО. Показано, що швидкості охолодження нижче та вище оптимальної можуть привести до загибелі клітин унаслідок внутрішньоклітинної кристалізації або дегідратації. This work demonstrates the ability of using the substrate-adhered SPEV cells as the object for studying the kinetics of osmotic reactions when exposing them to cryoprotective media. Permeability coefficients of SPEV cell membranes for the molecules of water and dimethyl sulfoxide (DMSO) have been determined. Using the physical-mathematical model for cell suspension freezing and calculated permeability coefficients the osmotic SPEV cell behavior during cryopreservation with different cooling rates has been simulated. The experiments on freezing the SPEV cell suspension showed that the cooling rate of 1.5 deg/min could ensure the optimal protection of the cells against damage in 1M DMSO presence. It has been demonstrated that the cooling rate above and below the optimum may cause a cell death as the result of intracellular crystallization or dehydration. 2016 Article Влияние режимов криоконсервирования на поведение клеток СПЭВ в культуре / И.Ф. Коваленко, С.Е. Коваленко, И.П. Высеканцев, Т.Ф. Петренко, Л.Ф. Розанов, Н.А. Чернобай // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 2. — С. 116–123. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137399 57.043:579:2:57.086.8 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Коваленко, И.Ф. Коваленко, С.Е. Высеканцев, И.П. Петренко, Т.Ф. Розанов, Л.Ф. Чернобай, Н.А. Влияние режимов криоконсервирования на поведение клеток СПЭВ в культуре Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
В работе продемонстрирована возможность использования адгезировавших на подложке клеток СПЭВ в
качестве объекта для изучения кинетики осмотических реакций при экспозиции их в криозащитных средах. Были определены
коэффициенты проницаемости мембран клеток СПЭВ для молекул воды и диметилсульфоксида (ДМСО). На основе физикоматематической
модели замораживания клеточных суспензий и рассчитанных коэффициентов проницаемости было
проведено теоретическое прогнозирование осмотического поведения клеток СПЭВ при замораживании их суспензии с
различными скоростями охлаждения. Экспериментальные исследования по замораживанию суспензии клеток СПЭВ
показали, что скорость охлаждения 1,5 град/мин может обеспечить оптимальную защиту клеток от повреждения в
присутствии 1 М ДМСО. Показано, что скорости охлаждения ниже и выше оптимальной могут привести к гибели клеток в
результате внутриклеточной кристаллизации или дегидратации. |
| format |
Article |
| author |
Коваленко, И.Ф. Коваленко, С.Е. Высеканцев, И.П. Петренко, Т.Ф. Розанов, Л.Ф. Чернобай, Н.А. |
| author_facet |
Коваленко, И.Ф. Коваленко, С.Е. Высеканцев, И.П. Петренко, Т.Ф. Розанов, Л.Ф. Чернобай, Н.А. |
| author_sort |
Коваленко, И.Ф. |
| title |
Влияние режимов криоконсервирования на поведение клеток СПЭВ в культуре |
| title_short |
Влияние режимов криоконсервирования на поведение клеток СПЭВ в культуре |
| title_full |
Влияние режимов криоконсервирования на поведение клеток СПЭВ в культуре |
| title_fullStr |
Влияние режимов криоконсервирования на поведение клеток СПЭВ в культуре |
| title_full_unstemmed |
Влияние режимов криоконсервирования на поведение клеток СПЭВ в культуре |
| title_sort |
влияние режимов криоконсервирования на поведение клеток спэв в культуре |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2016 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137399 |
| citation_txt |
Влияние режимов криоконсервирования на поведение клеток СПЭВ в культуре / И.Ф. Коваленко, С.Е. Коваленко, И.П. Высеканцев, Т.Ф. Петренко, Л.Ф. Розанов, Н.А. Чернобай // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2016. — Т. 26, № 2. — С. 116–123. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT kovalenkoif vliânierežimovkriokonservirovaniânapovedeniekletokspévvkulʹture AT kovalenkose vliânierežimovkriokonservirovaniânapovedeniekletokspévvkulʹture AT vysekancevip vliânierežimovkriokonservirovaniânapovedeniekletokspévvkulʹture AT petrenkotf vliânierežimovkriokonservirovaniânapovedeniekletokspévvkulʹture AT rozanovlf vliânierežimovkriokonservirovaniânapovedeniekletokspévvkulʹture AT černobajna vliânierežimovkriokonservirovaniânapovedeniekletokspévvkulʹture AT kovalenkoif effectofcryopreservationregimensonbehaviorofspevcellsinculture AT kovalenkose effectofcryopreservationregimensonbehaviorofspevcellsinculture AT vysekancevip effectofcryopreservationregimensonbehaviorofspevcellsinculture AT petrenkotf effectofcryopreservationregimensonbehaviorofspevcellsinculture AT rozanovlf effectofcryopreservationregimensonbehaviorofspevcellsinculture AT černobajna effectofcryopreservationregimensonbehaviorofspevcellsinculture |
| first_indexed |
2025-11-24T21:39:04Z |
| last_indexed |
2025-11-24T21:39:04Z |
| _version_ |
1849709396312981504 |
| fulltext |
УДК 57.043:579:2:57.086.8
И.Ф. Коваленко1*, С.Е. Коваленко1, И.П. Высеканцев2,
Т.Ф. Петренко2, Л.Ф. Розанов1, Н.А. Чернобай1
Влияние режимов криоконсервирования
на поведение клеток СПЭВ в культуре
UDC 57.043:579:2:57.086.8
I.F. Kovalenko1*, S.Ye. Kovalenko1, I.P. Vysekantsev2,
T.F. Petrenko2, L.F. Rozanov1, N.A. Chernobay1
Effect of Cryopreservation Regimens
on Behavior of SPEV Cells in Culture
Реферат: В работе продемонстрирована возможность использования адгезировавших на подложке клеток СПЭВ в
качестве объекта для изучения кинетики осмотических реакций при экспозиции их в криозащитных средах. Были определены
коэффициенты проницаемости мембран клеток СПЭВ для молекул воды и диметилсульфоксида (ДМСО). На основе физико-
математической модели замораживания клеточных суспензий и рассчитанных коэффициентов проницаемости было
проведено теоретическое прогнозирование осмотического поведения клеток СПЭВ при замораживании их суспензии с
различными скоростями охлаждения. Экспериментальные исследования по замораживанию суспензии клеток СПЭВ
показали, что скорость охлаждения 1,5 град/мин может обеспечить оптимальную защиту клеток от повреждения в
присутствии 1 М ДМСО. Показано, что скорости охлаждения ниже и выше оптимальной могут привести к гибели клеток в
результате внутриклеточной кристаллизации или дегидратации.
Ключевые слова: клетки СПЭВ, адгезия, криоконсервирование.
Реферат: У роботі показана можливість використання адгезованих на носії клітин СПЕВ у якості об'єкта для вивчення
кінетики осмотичних реакцій клітин під час їх експозиції в кріозахисних середовищах. Були визначені коефіцієнти проникності
мембран клітин СПЕВ для молекул води та диметилсульфоксиду (ДМСО). На основі фізико-математичного моделювання
процесу заморожування клітинних суспензій та розрахованих коефіцієнтів проникності було проведено теоретичне прогнозу-
вання осмотичної поведінки клітин СПЕВ під час заморожування їх суспензій із різними швидкостями. Експериментальні
дослідження з заморожування суспензії клітин СПЕВ показали, що швидкість охолодження 1,5 град/хв може забезпечити
оптимальний захист клітин від кріопошкоджень у присутності 1 М ДМСО. Показано, що швидкості охолодження нижче та
вище оптимальної можуть привести до загибелі клітин унаслідок внутрішньоклітинної кристалізації або дегідратації.
Ключові слова: клітини СПЕВ, адгезія, кріоконсервування.
Abstract: This work demonstrates the ability of using the substrate-adhered SPEV cells as the object for studying the kinetics
of osmotic reactions when exposing them to cryoprotective media. Permeability coefficients of SPEV cell membranes for the
molecules of water and dimethyl sulfoxide (DMSO) have been determined. Using the physical-mathematical model for cell suspension
freezing and calculated permeability coefficients the osmotic SPEV cell behavior during cryopreservation with different cooling rates
has been simulated. The experiments on freezing the SPEV cell suspension showed that the cooling rate of 1.5 deg/min could ensure
the optimal protection of the cells against damage in 1M DMSO presence. It has been demonstrated that the cooling rate above and
below the optimum may cause a cell death as the result of intracellular crystallization or dehydration.
Key words: SPEV cells, adhesion, cryopreservation.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61016;
тел.: (+38 057) 373-38-71, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: i.kovalenko.ipcic@gmail.com
*To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkiv, Ukraine 61016;
tel.:+380 57 373 3871, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: i.kovalenko.ipcic@gmail.com
1Department of Low Temperature Preservation, and
2Department of Cryomicrobiology, Institute for Problems of Cryobi-
ology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of
Ukraine, Kharkiv, Ukraine
1Отдел низкотемпературного консервирования, Институт проб-
лем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
2Отдел криомикробиологии, Институт проблем криобиологии и
криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Поступила 30.10.2015
Принята в печать 03.03.2016
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2016. – Т. 26, №2. – С. 116–123.
© 2016 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received October, 30, 2015
Accepted March, 03, 2016
Probl. Cryobiol. Cryomed. 2016. 26(2): 116–123.
© 2016 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
оригинальное исследование research article
Успех криоконсервирования клеточных суспен-
зий во многом зависит от согласования условий
замораживания (скорость охлаждения, тип криопро-
тектора и др.) [8] с транспортными характерис-
тиками (проницаемость клеточных мембран для
криопротектора и воды) плазматических мембран
клеток.
Теоретические и экспериментальные исследо-
вания осмотических реакций, возникающих при кон-
такте клеток с криопротекторами или другими
Outcome of cryopreservation of cell suspensions
largely depends on harmonization of freezing conditions
(cooling rate, type of cryoprotective agent etc.) [2]
with transport properties (permeability of cell mem-
branes to water and cryoprotective agent) of plasma
membrane cells.
Theoretical and experimental studies of osmotic
reactions occurring when cells contacting the cryo-
protectants or other substances allow estimating the
cell membrane permeability coefficients for water and
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 2, 2016
117
веществами, позволяют определить коэффициенты
проницаемости клеточных мембран для воды и
криопротекторов [1]. Основной сложностью при
наблюдении за клетками под микроскопом остает-
ся их смещение потоком при замене растворов.
Мы предположили, что клетки, адгезировавшие на
предметном стекле [6, 7], могут служить объектом
для волюмометрических исследований. Опреде-
ленные коэффициенты проницаемости клеточных
мембран для молекул ДМСО и воды могут быть
использованы для прогнозирования осмотического
поведения клеток при охлаждении клеточных
суспензий с разными скоростями. Оценить сохран-
ность клеток после размораживания возможно
путем наблюдения за процессами их адгезии и
распластывания. Сопоставление таких наблюдений
с прогнозом осмотического поведения клеток
может помочь выснить причины повреждения
клеток при отклонении режимов охлаждения от
оптимальных.
Цель данной работы – выяснение особенностей
определения коэффициентов проницаемости
мембран клеток в адгезионной культуре и сопос-
тавление данных о прогнозируемом изменении
объема клеток при замораживании и их сохраннос-
ти после отогрева.
Материалы и методы
Исследования проведены на культуре СПЭВ
(перевиваемая линия клеток эмбриональной почки
свиньи), полученной из коллекции НПО «Биолек»
(Украина).
Клетки культивировали в пластиковых флаконах
(«Costar», Германия) в среде 199 («Sigma», США)
с добавлением 10%-й эмбриональной телячьей
сыворотки («БиолоТ», Россия) (далее – ростовая
среда) при 37°С в воздушной среде, обогащенной
5% СО2. В суспензионное состояние клетки пере-
водили путем обработки клеточного монослоя
смесью 0,25%-го раствора трипсина и 0,02%-го
раствора Версена в соотношении 1:5 с последую-
щим отмыванием суспензии клеток с помощью
ростовой среды и центрифугирования.
Полученную суспензию клеток в контрольных
образцах ресуспендировали в ростовой среде, а
клетки, предназначенные для криоконсервиро-
вания, – в 10%-м растворе ДМСО на эмбриональ-
ной телячьей сыворотке [5].
Подготовленную суспензию разливали в крио-
пробирки («Costar») по 1,5 мл и охлаждали по режи-
мам: 0,3 град/мин до –20°С (в течение часа в бытовом
холодильнике), 1,5 град/мин до –40°С (в программ-
ном замораживателе) и 8 град/мин до –60°С (в хра-
нилище «ХБ 0,5» над поверхностью жидкого азота)
с последующим погружением в жидкий азот.
cryoprotectants [3]. The main difficulty for observation
of the cells under the microscope is the shifting of the
cells by a stream when replacing the liquids. We
hypothesized that the cells fixed on a microscope slide
due to adhesion [1, 7], could serve as a target for
volumetric studies. Determined in such a way per-
meability coefficients of cell membranes for molecules
of DMSO and water could be used to predict the
osmotic behavior of cells during freezing with different
rates. Post-thaw survival of the cells could be estimated
by monitoring their adhesion and spreading. Comparison
of these observations with predicted osmotic behavior
of the cells could enable to suggest the causes of cell
damage in case of deviation of freezing regimens from
optimal ones.
The purpose of this work was to elucidate the
peculiarities of the permeability coefficients of cell
membranes in culture and to compare the data on
supposed cell volume changes during freezing and their
preservation after thawing.
Materials and methods
Investigations were carried out in SPEV culture
(porcine embryo kidney cell line) procured from the
collection of PJSC Pharmstandard-Biolik (Ukraine).
Cells were cultured in plastic flasks (Costar,
Germany) in 199 medium (Sigma, USA) supplemented
with 10% fetal calf serum (BioloT, Russia) at 37°C in
air with 5% CO2. Cell suspension was procured by
treating the cell culture monolayer with the 0.25%
trypsin and 0.02% Versene mixture (in 1:5 ratio)
followed by washing the cell suspension by growth
medium.
The resulted cell suspension was divided to control
samples, which were re-suspended in growth medium,
and the samples supposed for cryopreservation, which
were transfered to 10% DMSO solution in fetal calf
serum [8].
The prepared suspension was placed into 1.5 ml
cryovials (Costar) and cooled according to the proto-
cols: 0.3 deg/min down to –20°C (1 hr in a fridge),
1.5 deg/min down to –40°C (in a programmable
freezer) or 8 deg/min down to –60°C (in KHB-0.5
tank above the surface of liquid nitrogen), in all the
cases the samples were then immersed into liquid
nitrogen.
After storage at –196°C for 5–10 days the samples
were thawed in a water bath at 41°C.
After thawing the cell suspension was transferred
into test tubes, supplemented with a two-fold volume
of growth medium, then centrifuged at 1000g for
10 min, the supernatant was removed. Cells were re-
suspended in growth medium and transferred into Petri
dishes [8] for culturing and following microscope
observation.
118 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 2, 2016
После хранения при температуре –196°С в
течение 5–10 суток образцы отогревали на водяной
бане при 41°С.
После отогрева суспензию клеток переносили
в пробирки, добавляли двухкратный объем росто-
вой среды, центрифугировали при 1000g в течение
10 мин, супернатант удаляли. Клетки ресуспенди-
ровали в ростовой среде и переносили в чашки
Петри для последующего культивирования и на-
блюдения под микроскопом [5].
Для изучения поведения клеток СПЭВ в куль-
туре интактные и размороженные клетки в среде
культивирования высевали в чашки Петри и куль-
тивировали в СО2-инкубаторе или термостатирован-
ной приставке микроскопа «Axio Observer Z1» («Carl
Zeiss», Германия) при температуре 37°С в течение
5 ч. В приставку микроскопа из газового баллона
через редуктор периодически подавали СО2.
Осмотическое поведение клеток изучали в
растворах 1 М ДМСО с разным содержанием NaCl
(0,0375; 0,075; 0,15; 0,5 и 1 М) под микроскопом
«Axio Observer Z1» (получали микрофотографии)
и оценивали динамику изменения клеточных
размеров с помощью программы «AxioVision
Rel. 4.8» («Carl Zeiss»). Морфометрические дан-
ные использовали для определения коэффициентов
проницаемости клеточных мембран и теоретичес-
кого прогнозирования осмотического поведения
клеток при замораживании [2].
Полученные результаты статистически обраба-
тывали с помощью программ «Excel» («Microsoft»,
США) и «Past Statistic v/3/01» (Швеция). В зави-
симости от характера распределения данных
значимость различий между показателями оцени-
вали, используя параметрический t-критерий
Стьюдента или непараметрический критерий
Манна-Уитни [3]. Различия между выборками
считали значимыми при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Клетки СПЭВ, охлажденные в спиртовой бане
до –28°С с 15-минутной остановкой при этой
температуре и последующим погружением в жид-
кий азот, демонстрировали высокие показатели
сохранности и пролиферативный потенциал после
отогрева [1]. В текущих исследованиях мы оценили
возможность использования для криоконсерви-
рования клеток СПЭВ других режимов заморажи-
вания, а именно: замораживание с контролируемой
скоростью 1,5 град/мин до –40°С с последующим
погружением в жидкий азот; неконтролируемое
замораживание в холодильнике до –20°С (рассчи-
танная скорость охлаждения 0,3 град/мин) с погру-
жением в жидкий азот и замораживание на охлаж-
даемой в парах азота металлической подложке
To study the SPEV behavior in culture the intact
and frozen-thawed cells in culture medium were seeded
into Petri dishes and cultured in a CO2 incubator or
thermostatic unit to microscope Axio Observer Z1
(Carl Zeiss, Germany) at 37°C for 5 hrs. CO2 was
periodically injected from the gas cylinder into the unit
of the microscope through the reducer.
The osmotic behavior of cells was examined in 1 M
DMSO solutions with different concentrations of NaCl
(0.0375; 0.075; 0.15; 0.5 and 1 M) by means of
microscope Axio Observer Z1 (microscopic images
were recorded) and dynamics of changes in cell
dimensions was assessed using the software Axio-
Vision Rel. 4.8 (Carl Zeiss). Morphometric data were
used to determine the permeability coefficients for cell
membranes and theoretical predicting of cell osmotic
behavior during freezing [4].
The findings were statistically processed using
Excel (Microsoft, USA) and Past Statistic v/3/01
(Sweden). Depending on the distribution character of
the data the significance of differences between the
indices was assessed using a parametric Student's t-
test or non-parametric Mann-Whitney one [5].
Differences between the samples were considered as
significant at p < 0.05.
Results and discussion
The SPEV cells cooled in an alcohol bath down to
–28°C with a 15-min stop at this temperature, followed
by immersion into liquid nitrogen, demonstrate a high
survival and proliferative potential [3]. In the present
studies, we have examined the possibility of using other
freezing regimens to cryopreserve SPEV cells, in parti-
cular, freezing with the controlled rate of 1.5 deg/min
down to –40°C, followed by an immersion into liquid
nitrogen; non-controlled freezing in a fridge down to
–20°C (0.3 deg/min estimated cooling rate) with immer-
sion into liquid nitrogen, and, finally, freezing on cooled
in nitrogen vapors metal base with temperature of
–60°C (8 deg/min estimated cooling rate) and following
immersion into liquid nitrogen. Effect of various freezing
protocols was assessed by observing the behavior of
SPEV cells in culture.
Following incubation of the intact SPEV cells for
15 min they sedimented to the bottom of a plastic Petri
dish, when shaking they easily transited into the
suspension. During following 15 min of incubation the
part of the cells was loosely attached, only some cells
transited to a suspended state when shaking. In the
majority of cells the nucleus with nucleoli was clearly
visible. Some cells showed the first stage of adhesion
(the filopodia appearance). More firm attachment to
the substrate was ensured by lamelopodia which were
formed in the majority of cells after an hour of incu-
bation. This was evidenced by the fact that the transi-
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 2, 2016
119
с температурой –60°С (рассчитанная скорость ох-
лаждения 8 град/мин) с погружением в жидкий
азот. Влияние разных режимов замораживания на
выживаемость оценивали с помощью наблюдения
за поведением клеток СПЭВ в культуре.
При 15-минутной инкубации интактные клетки
СПЭВ клетки оседали на дно пластиковой чашки,
при встряхивании легко переходили во взвешенное
состояние. В последующие 15 мин инкубации часть
клеток непрочно прикреплялась; при встряхивании
только некоторые клетки переходили во взвешен-
ное состояние. У большинства клеток было хорошо
видно ядро с ядрышками. У части клеток наблю-
дали первую стадию адгезии (появление филопо-
дий). Более плотное прикрепление к субстрату
обеспечивали ламелоподии, которые формирова-
лись у большинства клеток после часа инкубации,
о чем свидетельствовал тот факт, что для перехода
клеток во взвешенное состояние легкого механи-
ческого встряхивания было недостаточно.
Через 1,5–2 ч часть клеток уплощалась. На пя-
тый час наблюдения около 10–15% клеток приобре-
ли характерный для клеточной культуры СПЭВ
вид (рис. 1).
Сравнение поведения клеток в культуре после
криоконсервирования по трем режимам заморажи-
вания показало, что замораживание со скоростью
Рис. 1. Распластывание клеток СПЭВ при культивировании в СО2-инкубаторе (масштабный отрезок – 20 мкм).
Fig. 1. SPEV cells spreading when cultured in a CO2 incubator (scale bar 20 µm).
начало культивирования
start of culture
15 мин/min 1 час/hr
2 часа/hrs 3 часа/hrs 5 часов/hrs
tion of cells into a suspended state was not provided
by slight mechanical shaking.
In 1.5–2 hrs the part of cells was getting flattened.
On the fifth hour of observation about 10–15% of the
cells have acquired the structure characteristic for
SPEV cell culture (Fig. 1).
When comparing the behavior of cells in culture
after cryopreservation according three freezing pro-
tocols it has been found that freezing with the rate of
1.5 deg/min down to –40°C, followed by immersion
into liquid nitrogen ensured the maximum preservation
of their adhesive properties. Observing the cells during
adhesion and spreading showed the same dynamics
as in intact cells. After 5 hrs of incubation 10–16% of
cells completed spreading (Fig. 2).
The freezing protocol with a rate of 8 deg/min down
to –60°C, followed by an immersion into liquid nitrogen
was unfavorable for cells (Fig. 3). Within an hour of
incubation no tendency to adhesion and spreading of
SPEV cells was observed. In 2 hrs the bulk of the
cells was easily detached from the substrate when
shaking. Cell cytoplasm was vacuolated, about 20%
of the cells had a protrusion on the membrane (vesic-
les). As reported by Ye.A. Porozhan et al. [6] the
formation of vesicles could result from the disorders
in cytoskeletal systems and appearance of sensitive
sites on a cell surface, that collectively prevented a
120 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 2, 2016
Рис. 2. Распластывание клеток СПЭВ, замороженных со скоростью
1,5 град/мин, в процессе культивирования в СО2-инкубаторе (масштаб-
ный отрезок – 20 мкм).
Fig. 2. SPEV cells spreading when frozen with the rate of 1.5 deg/min
during culturing in a CO2 incubator (scale bar 20 µm).
1,5 град/мин до –40°С с последую-
щим погружением в жидкий азот
обеспечивало максимальную со-
хранность их адгезивных свойств.
Наблюдение за клетками в процессе
адгезии и распластывания показало
такую же динамику, как и в интакт-
ных клетках. Через 5 ч инкубации
10–16% клеток завершили процесс
распластывания (рис. 2).
Неблагоприятным для клеток
оказался режим замораживания со
скоростью 8 град/мин до –60°С с по-
следующим погружением в жидкий
азот (рис. 3). В течение часа инку-
бации тенденцию к адгезии и рас-
пластыванию клеток СПЭВ не наб-
людали. Через 2 ч основная масса
клеток при встряхивании легко откреп-
лялась от субстрата. Цитоплазма
клеток была вакуолизирована, около
20% клеток имели выпячивания на
мембране (везикулы). По мнению
Е.А. Порожан и соавт. [4], формиро-
вание везикул является следствием
нарушения цитоскелетных систем и
возникновения чувствительных
участков на поверхности клеток, что
и препятствует нормальным процес-
сам адгезии. Через 5 ч инкубации
единичные клетки прикреплялись и
распластывались.
Подвергнутые замораживанию
со скоростью 0,3 град/мин до –20°С
с последующим погружением в
жидкий азот (рис. 4) клетки полнос-
тью теряли свою функциональную
активность. На протяжении 5 ч на-
блюдения клетки не адгезировали,
были округлыми, при легком встря-
хивании переходили во взвешенное
состояние, почти все клетки имели
везикулы, цитоплазма была вакуо-
лизирована.
В дальнейшем было спрогно-
зировано осмотическое поведение
клеток при использованных режимах
замораживания. Вначале были оп-
ределены транспортные характерис-
тики клеточных мембран. В связи с
тем, что в процессе культивирова-
ния происходит распластывание кле-
ток, важно было удостовериться в
сохранении формы адгезировавших
клеток с момента прикрепления к под-
ложке до начала распластывания.
начало культивирования
start of culture
1 час/hr
3 часа/hrs 5 часов/hrs
Рис. 3. Распластывание клеток СПЭВ, замороженных со скоростью
8 град/мин, в процессе культивирования в СО2-инкубаторе (масштаб-
ный отрезок – 20 мкм).
Fig. 3. SPEV cells spreading when frozen with the rate of 8 deg/min during
culturing in a CO2 incubator (scale bar 20 µm).
начало культивирования
start of culture
1 час/hr
3 часа/hrs 5 часов/hrs
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 2, 2016
121
Рис. 4. Распластывание клеток СПЭВ, замороженных со скоростью
0,3 град/мин, в процессе культивирования в СО2-инкубаторе (масштаб-
ный отрезок – 20 мкм).
Fig. 4. SPEV cells spreading when frozen with the rate of 0.3 deg/min during
culturing in a CO2 incubator (scale bar 20 µm).
начало культивирования
start of culture
1 час/hr
3 часа/hrs 5 часов/hrs
Рис. 5. Адгезировавшие (A) и распластывающиеся (S) клетки СПЭВ в
культуре под микроскопом (масштабный отрезок – 10 мкм).
Fig. 5. Adhered (A) and spreading (S) SPEV cells in culture under
microscope (scale bar 10 µm).
начало культивирования
start of culture
1 час/hr
3 часа/hrs 5 часов/hrs
normal adhesion. After 5 hrs of incu-
bation only single cells attached and
flattened.
Subjected to freezing with a rate of
0.3 deg/min down to –20°C followed
by an immersion into liquid nitrogen
(Fig. 4) the cells completely lost their
functional activity. Within 5 hrs of ob-
servation the cells did not adhere, were
of round shape, when being gently
shaken easily transited to a suspended
state, almost all the cells had vesicles,
the cytoplasm was vacuolated.
Based on these results, we predic-
ted the osmotic behavior of cells under
the used freezing conditions. Initially
we identified the transport characteris-
tics of cell membranes. During cultu-
ring the cells were spread, therefore it
was important to ensure keeping the
shape of adhered cells from the mo-
ment of attachment to the substrate up
to the spreading start.
As Fig. 5 demonstrates the cultur-
ing under the microscope allowed us
to observe both the changes in the
shape and movement of adherent cells.
It should be noted that even up to the
beginning of spreading the adhered
cells did not change their sizes. This
allowed to suggest the cell shape prior
to the spreading as a spherical one.
Fig. 6 presents data on osmotic
reactions of SPEV cells in 1M DMSO
solutions: in the ones isotonic by NaCl
(0.15 M NaCl) the cells restored
an initial volume after dehydration, in
the hypertonic solutions (0.5 and 1 M
NaCl) they remained dehydrated and
in hypotonic ones (0.075 and 0.0375 M
NaCl) they swell. The calculated using
the mathematical model coefficients
of filtration and permeability for
DMSO molecules are shown in the
Table.
The data of the Table demonstrate
that the permeability of SPEV cell
membranes for DMSO depends on the
medium composition. At the same
time, the calculated permeability
coefficients of adherent cells for
DMSO were of the same order and
close to the values of the permeability
coefficient, determined for cell suspen-
sions, fixed in a collagen matrix [1].
A
S
A
S
A
S
A
S
ыдерсватсоС
noitisopmocmuideM
тнеициффэоK
,иицартьлиф
Lp × 01 41 м/H 3 с·
ciluardyH
,ytilibaemrep
Lp × 01 41 m/N 3 s·
тнеициффэоK
ялдитсомеацинорп
K,ОСМД 1× 01 8 с/м
ytilibaemrepOSMD
,tneiciffeoc
K1× 01 8 s/m
lCaNМ1+ОСМДМ1
lCaNM1+OSMDM1 20,0±51,0 –
lCaNМ5,0+ОСМДМ1
lCaNM5.0+OSMDM1 40,0±52,0 –
lCaNМ51,0+ОСМДМ1
lCaNM51.0+OSMDM1 75,2±82,8 70,2±63,7
+ОСМДМ1
lCaNМ570,0
+OSMDM1
lCaNM570.0
18,0±32,4 14,0±46,3
+ОСМДМ1
lCaNМ5730,0
+OSMDM1
lCaNM5730.0
46,0±32,4 25,2±1,11
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
0 50 100 150 200 250 300 350 400
1
2
5
3
4
122 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 2, 2016
Как видно из рис. 5, культивирование под микро-
скопом позволяет наблюдать как за изменением
формы, так и перемещением адгезировавших клеток.
Следует отметить, что вплоть до начала расплас-
тывания адгезировавшие клетки не изменялись в
размере. Это позволило считать форму клеток до
начала распластывания близкой к сферической.
На рис. 6 представлены данные об осмотичес-
ких реакциях клеток СПЭВ в растворах 1 М
ДМСО: в растворах изотонических по NaCl
(0,15 М NaCl) клетки после дегидратации восста-
навливали исходный объем, в гипертонических
(0,5 и 1 М NaCl) оставались обезвоженными, а в
гипотонических (0,075 и 0,0375 М NaCl) набухали.
Рассчитанные с помощью математической мо-
дели коэффициенты фильтрации и проницаемости
для молекул ДМСО представлены в таблице.
Из приведенных в таблице данных следует, что
проницаемость мембран клеток СПЭВ для ДМСО
зависела от состава среды. В то же время значения
рассчитанных коэффициентов проницаемости
адгезировавших клеток для ДМСО находились в
пределах одного порядка со значениями коэффи-
циентов проницаемости, определенным в клетках,
закрепленных в матрице коллагена [7].
В дальнейшем для моделирования процесса
обезвоживания клеток в суспензии при разных
скоростях охлаждения была использована физико-
математическая модель процесса замораживания
клеточной суспензии в присутствии ДМСО [1].
Рис. 6. Экспериментальные данные и теоретические
зависимости изменения объема сферических клеток
СПЭВ от времени в 1 М растворах ДМСО, содержащих
1 М (1), 0,5 М (2), 0,15 М (3), 0,075 М (4) и 0,0375 М (5) NaCl.
Fig. 6. Experimental data and theoretical dependencies
of volume change of spherical SPEV cells vs. time in
1 M DMSO solutions containing 1 М (1), 0.5 М (2), 0.15 М (3),
0.075 М (4) and 0.0375 М (5) of NaCl.
In the following studies we simulated the cell
dehydration in a suspension at various cooling rates
using the mathematical model of cell suspension
freezing in DMSO presence [3].
Fig. 7 represents the calculated data of the relative
volume change of SPEV cells during freezing according
three protocols. Analysis of these dependencies
allowed to suggest that during the freezing with optimal
rate (1.5 deg/min) the dehydration protected the cells
against intracellular crystallization, at the rates under
the optimum (0.3 deg/min) the dehydration can cause
the death of the cells, and at those above the optimal
one the cells do not dehydrate and are damaged due
to intracellular crystallization.
Conclusions
Thus, the substrate-adhered cells retaining the shape
close to spherical one are the proper object to study
the kinetics of osmotic cell responses which can be
used to assess cell membrane permeability parameters
for cryoprotectants and water molecules.
The theoretical prediction of osmotic behavior of
SPEV cells showed that the cooling rates of
1.5 deg/min could ensure optimal protection of the cells
in 1 M DMSO presence, and the cooling rates above
and below the optimal one might be detrimental as a
result of intracellular crystallization or dehydration. The
results of the performed experiments on freezing of
SPEV cells using various cooling regimens which
involved the assessment of their preservation rate by
analysis of cells’ behavior in culture confirmed this
assumption.
Коэффициенты проницаемости мембран клеток
СПЭВ для молекул ДМСО
Permeability coefficients of SPEV cell membranes
for DMSO molecules
О
тн
ос
ит
ел
ьн
ы
й
об
ъе
м
v
/V
0
N
or
m
al
iz
ed
v
ol
um
e
v/
V 0
Время, с
Time, sec
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 26, №/issue 2, 2016
123
На рис. 7 приведены данные расчета изменения
относительного объема клеток СПЭВ при трех
режимах замораживания. На основе приведенных
зависимостей можно предположить, что при режи-
ме замораживания со скоростью 1,5 град/мин де-
гидратация защищает клетки от внутриклеточной
кристаллизации, при меньшей скорости (0,3 град/мин)
дегидратация может стать причиной гибели клеток,
а при большей – клетки не дегидратируют и по-
вреждаются вследствие внутриклеточной крис-
таллизации.
Выводы
Таким образом, адгезировавшие на подложке
клетки, сохраняющие форму близкую к сферичес-
кой, являются удобным объектом для изучения
кинетики осмотических реакций клеток, которая
может быть использована для оценки параметров
проницаемости клеточных мембран для молекул
криопротекторов и воды.
Теоретическое прогнозирование осмотического
поведения клеток СПЭВ показало, что скорость
охлаждения 1,5 град/мин может обеспечивать
оптимальную защиту клеток в присутствии 1 М
ДМСО, тогда как скорости охлаждения ниже и
выше оптимальной могут оказаться губительными
в результате внутриклеточной кристаллизации или
дегидратации. Результаты проведенных экспери-
ментов по замораживаю клеток СПЭВ при разных
режимах охлаждения с оценкой их сохранности по
поведению в культуре подтвердили данное пред-
положение.
Рис. 7. Теоретически рассчитанные зависимости,
демонстрирующие осмотическое поведение клеток
СПЭВ при трех режимах замораживания.
Fig. 7. Theoretically calculated dependencies demon-
strating osmotic behavior of SPEV cells during freezing
according three regimens.
Литература
1. Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низко-
температурного консервирования клеточных суспензий. –
К.: Наукова думка, 1994. – 142 с.
2. Коваленко И.Ф., Кощий С.В., Тимофеева Е.В. и др. Прони-
цаемость мембран клеток СПЭВ для молекул воды и
ДМСО // Проблемы криобиологии. – 2009. – Т. 19, №1. –
С. 25–31.
3. Орлов А.И. Прикладная статистика. – М.: Экзамен, 2006. – 671 с.
4. Порожан Е.А., Бабенко Н.Н., Дубрава Т.Г., Гольцев А.Н.
Адгезивный потенциал криоконсервированных феталь-
ных нервных клеток как критерий их функциональной
полноценности // Вісник проблем біології і медицини. –
2012. – Вип. 2, Т. 2, №93. – С. 139–144.
5. Сергеев В.А., Собко Ю.А. Культура клеток в ветеринарии
и биотехнологии. – К.: Урожай, 1990. – 152 с.
6. Щипицын М.А., Дмитриева Е.А., Воропаева О.В. Иссле-
дование влияния состава сред инкубации и субстрата
на адгезию эритробластических островков // Современ-
ные наукоемкие технологии. – 2006. – №3. – С. 44.
7. Curtis A.S.G., Forrester J.V., Mcinnes C., Lawrie F. Adhesion
of cells to polystyrene surfaces // J. Cell Biol. – 1983. –
Vol. 97. – P. 1500–1506.
8. Farrant J. Mechanism of cell damage during freezing and
thawing and its prevention // Nature. – 1965. – Vol. 205,
№4978. – P. 1284–1289.
References
1. Curtis A.S.G., Forrester J.V., Mcinnes C., Lawrie F. Adhesion of
cells to polystyrene surfaces. J. Cell Biol 1983; 97: 1500–1506.
2. Farrant J. Mechanism of cell damage during freezing and thawing
and its prevention. Nature 1965; 205(4978): 1284–1289.
3. Gordienko E.A., Pushkar N.S. Physical grounds of low-temperature
preservation for cell suspensions. Kiev: Naukova dumka; 1994.
4. Kovalenko I.F., Koschiy S.V., Timofeeva E.V. et al. Permeability of
SPEV cell membranes for water and DMSO molecules. Problems
of Cryobiology 2009; 19(1): 25–31.
5. Orlov A.I. Applied Statistics. Moscow: Ekzamen; 2006.
6. Porozhan Ye.A., Babenko N.N., Dubrava T.G., Goltsev A.N. Adhe-
sive potential of cryopreserved fetal neural cells as a сriterion
for their functional integrity. Visnyk Problem Biologii i Medytsyny
2012; 2(93): 139–144.
7. Schipitsyn M.A., Dmitrieva E.A., Voropaeva O.V. Investigation of
influence of incubation medium composition and substrate on
adhesion of erythroblastic islands. Modern High Technologies
2006; 3: 44.
8. Sergeev V.A., Sobko Y.A. Cell culture in veterinary and biotech-
nology. Kiev: Urozhay; 1990.
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
-60 -50 -40 -30 -20 -10 0
0,3 град/мин
0.3 deg/min
1,5 град/мин
1.5 deg/min
8 град/мин
8 deg/min
О
тн
ос
ит
ел
ьн
ы
й
об
ъе
м
v
/V
0
N
or
m
al
iz
ed
v
ol
um
e
v/
V 0
Температура, °С
Temperature, °C
|