Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования

Проведен сравнительный анализ результатов оценки жизнеспособности свежевыделенных и криоконсервированных клеток эмбриональной печени (КЭП) человека по неспецифическим тестам: витальному окрашиванию клеток трипановым синим, бромистым этидием (БЭ); гидролизу флюоресцеин диацетата (ФДА) во флюоресцеин;...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Published in:	Проблемы криобиологии и криомедицины
Date:	2003
Main Author:	Скоробогатова, Н.Г.
Format:	Article
Language:	Russian
Published:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2003
Subjects:	Криоконсервирование биообъектов
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137555
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования / Н.Г. Скоробогатова // Проблемы криобиологии. — 2003. — № 2. — С. 84–90. — Бібліогр.: 11 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1860185555190415360
author	Скоробогатова, Н.Г.
author_facet	Скоробогатова, Н.Г.
citation_txt	Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования / Н.Г. Скоробогатова // Проблемы криобиологии. — 2003. — № 2. — С. 84–90. — Бібліогр.: 11 назв. — рос.
collection	DSpace DC
container_title	Проблемы криобиологии и криомедицины
description	Проведен сравнительный анализ результатов оценки жизнеспособности свежевыделенных и криоконсервированных клеток эмбриональной печени (КЭП) человека по неспецифическим тестам: витальному окрашиванию клеток трипановым синим, бромистым этидием (БЭ); гидролизу флюоресцеин диацетата (ФДА) во флюоресцеин; способности клеток к адгезии. Проведенные тесты отражают различные аспекты клеточной жизнеспособности. Окрашивание трипановым синим и бромистым этидием давало сходные результаты. ФДА-тест не выявляет действительное количество жизнеспособных КЭП. Комбинацией 3-х методов оценки жизнеспособности была выявлена фракция клеток, устойчивых к витальным красителям, в которых не обнаруживался флюоресцеин. Тест на неспецифическую адгезию позволяет исследовать сохранность клеток адгезивного пула эмбриональной печени. На фоне сохранения количества адгезировавших КЭП после криоконсервирования выявлены морфологические отличия клеток, прикреплявшихся к пластику, по сравнению с нативным контролем. Сочетанное использование указанных тестов позволяет давать более полную первичную характеристику гетерогенных суспензий недифференцированных клеток, в частности эмбриональной печени человека. Проведено порівняльний аналіз результатів оцінки життєздатності нативних і кріоконсервованих клітин ембріональної печінки (КЕП) людини за неспецифічними тестами: вітальним фарбуванням клітин трипановим синім, бромистим етидієм; гідролізом флюоресцеїн діацетату (ФДА) у флюоресцеїн; здатністю клітин до адгезії. Проведені тести відображали різні аспекти клітинної життєздатності. Фарбування трипановим синім і бромистим етидієм давало подібні результати. ФДА-тест не показує дійсну кількість життєздатних КЕП. Комбінацією 3-х методів оцінки життєздатності була виявлена фракція КЕП, стійких до вітальних барвників, в яких не знайдено флюоресцеїну. Тест на неспецифічну адгезію дозволяє досліджувати цілість клітин адгезивного пулу ембріональної печінки. При збереженні кількості адгезуючих КЕП після кріоконсервування було виявлено морфологічні відмінності клітин, що прикріплювались до пластика, у порівнянні з нативним контролем. Сумісне використання зазначених тестів дозволяє давати більш повну первинну характеристику гетерогенних суспензій недиференційованих клітин, зокрема ембріональної печінки людини. There was carried out a comparative analysis of the results on the estimation of viability for freshly isolated and cryopreserved human fetal liver (HFL) cells using non-specific tests: vital staining of cells with trypane blue, ethydium bromide (EB), fluorescein diacetate (FDA) hydrolysis to fluorescein; ability of cell to adhesion. The performed tests reflect various aspects of cell viability. Staining with trypane blue and EB produced the similar results. FDA-test does not reveal a real number of viable HFL cells. The fraction of cells resistant to vital dyes, where no fluoresceine was found, was revealed by the combination of three methods of viability assessment. The non-specific adhesion test allows to estimate the integrity of HFL cells of adhesive pool. Simultaneously with keeping the number of adhesive HFL cells after cryopreservation there were found the morphological differences of cells, being adhered to the plastic, comparing to the native control. Combined usage of stated tests allows to provide the more complete primary characteristics of heterogenous suspensions of non-differentiated cells, in particular, HFL ones.
first_indexed	2025-12-07T18:04:27Z
format	Article
fulltext	84ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ 2003, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY 2003, №2 Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования Н.Г. СКОРОБОГАТОВА Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Comparison of Tests for Fetal Liver Cells Viability after Cryopreservation SKOROBOGATOVA N.G. Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov Проведен сравнительный анализ результатов оценки жизнеспособности свежевыделенных и криоконсервированных клеток эмбриональной печени (КЭП) человека по неспецифическим тестам: витальному окрашиванию клеток трипановым синим, бромистым этидием (БЭ); гидролизу флюоресцеин диацетата (ФДА) во флюоресцеин; способности клеток к адгезии. Проведенные тесты отражают различные аспекты клеточной жизнеспособности. Окрашивание трипановым синим и бромистым этидием давало сходные результаты. ФДА-тест не выявляет действительное количество жизнеспособных КЭП. Комбинацией 3-х методов оценки жизнеспособности была выявлена фракция клеток, устойчивых к витальным красителям, в которых не обнаруживался флюоресцеин. Тест на неспецифическую адгезию позволяет исследовать сохранность клеток адгезивного пула эмбриональной печени. На фоне сохранения количества адгезировавших КЭП после криоконсервирования выявлены морфологические отличия клеток, прикреплявшихся к пластику, по сравнению с нативным контролем. Сочетанное использование указанных тестов позволяет давать более полную первичную характеристику гетерогенных суспензий недифференцированных клеток, в частности эмбриональной печени человека. Ключевые слова: криоконсервирование, жизнеспособность, эмбриональная печень человека. Проведено порівняльний аналіз результатів оцінки життєздатності нативних і кріоконсервованих клітин ембріональної печінки (КЕП) людини за неспецифічними тестами: вітальним фарбуванням клітин трипановим синім, бромистим етидієм; гідролізом флюоресцеїн діацетату (ФДА) у флюоресцеїн; здатністю клітин до адгезії. Проведені тести відображали різні аспекти клітинної життєздатності. Фарбування трипановим синім і бромистим етидієм давало подібні результати. ФДА-тест не показує дійсну кількість життєздатних КЕП. Комбінацією 3-х методів оцінки життєздатності була виявлена фракція КЕП, стійких до вітальних барвників, в яких не знайдено флюоресцеїну. Тест на неспецифічну адгезію дозволяє досліджувати цілість клітин адгезивного пулу ембріональної печінки. При збереженні кількості адгезуючих КЕП після кріоконсервування було виявлено морфологічні відмінності клітин, що прикріплювались до пластика, у порівнянні з нативним контролем. Сумісне використання зазначених тестів дозволяє давати більш повну первинну характеристику гетерогенних суспензій недиференційованих клітин, зокрема ембріональної печінки людини. Ключові слова: кріоконсервування, життєздатність, ембріональна печінка людини. There was carried out a comparative analysis of the results on the estimation of viability for freshly isolated and cryopreserved human fetal liver (HFL) cells using non-specific tests: vital staining of cells with trypane blue, ethydium bromide (EB), fluorescein diacetate (FDA) hydrolysis to fluorescein; ability of cell to adhesion. The performed tests reflect various aspects of cell viability. Staining with trypane blue and EB produced the similar results. FDA-test does not reveal a real number of viable HFL cells. The fraction of cells resistant to vital dyes, where no fluoresceine was found, was revealed by the combination of three methods of viability assessment. The non-specific adhesion test allows to estimate the integrity of HFL cells of adhesive pool. Simultaneously with keeping the number of adhesive HFL cells after cryopreservation there were found the morphological differences of cells, being adhered to the plastic, comparing to the native control. Combined usage of stated tests allows to provide the more complete primary characteristics of heterogenous suspensions of non-differentiated cells, in particular, HFL ones. Key words: cryopreservation, viability, human fetal liver. УДК 615.361.36.013.014.413 UDC 615.361.36.013.014.413 Адрес для корреспонденции: Скоробогатова Н.Г., Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины,ул. Переяславская,23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38 (057) 7720135, факс: +38 (057) 7720084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua Address for correspondence: Skorobogatova N.G., Institute for Problems of Cryobiology&Cryomedicine of the Natl. Acad. Sci. of Ukraine, 23, Pereyaslavskaya str.,Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+38 (057) 7720135, fax: +38 (057) 7720084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua The attention of researches to progenitor cells of embryonic origin is stipulated by their high proliferative potential and ability to be differentiated to various cell types. The keeping of unique properties of these cells requires the improvement of the cryopreservation protocol. In this case the choice of express-tests for estimation of cell viability is important, which will serve as the base for optimizing the further expensive and long-term experimental study of cell functional activity. Testing of heterogeneic suspensions of non-differen- Внимание исследователей к клеткам-предшест- венникам эмбрионального происхождения обуслов- лено их высоким пролиферативным потенциалом и способностью дифференцироваться в различные клеточные типы. Сохранение уникальных свойств этих клеток требует усовершенствования протоко- ла криоконсервирования. При этом важен опти- мальный подбор экспресс-тестов оценки жизне- способности клеток, на основании которых осуществляются дальнейшие дорогостоящие и 85ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ 2003, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY 2003, №2 tiated cells with latent biological potential is of special difficulty. The aim of this work was to evaluate the integrity of HFL cells after cryopreservation on non-specific express-tests: vital staining with trypane blue and ethidium bromide, intracellular accumulation of fluorescein after hydrolysis of fluorescein diacetate, and cell adhesion ability. Materials and methods Primary suspensions of freshly isolated and cryopreserved cells were the object of investigation. The donor material was obtained from 7-9 gestation weeks’ embryos after abortions and delivered in sterile flasks on ice. HFL cells were isolated with non- enzymatic method [3]. Cell suspensions were cryopreserved under protection of 5% DMSO with elaborated program, and stored in liquid nitrogen. Suspensions were thawed on water bath at 40°C [11]. The estimation of cell viability was performed using standard methods of vital staining: with trypane blue [9], ethydium bromide and FDA [5]. Adhesive ability to culture plastic was evaluated during explantation of 1×105/cm2 into 24 well plate (Costar) in the αMEM medium added with 5% FCS, under standard conditions at 37°C, 100% humidity, 5% CO2. Cryopreserved HFL cells before explantation were washed out of DMSO by dropwise adding [4] of sucrose based solution [10] with further centrifugation. In the certain time intervals (1 and 18 hrs) non-adhered cells were collected in a fixed volume of cultural medium and their number was calculated in Goryaev’s chamber. Adherent cells were estimated under inverted microscope after fixation with 70° ethanol. Statistical analysis of results was done by non- parametrical method using the Wilcoxon matched pairs test. The results were presented as M±m. Results and discussion The viability of freshly isolated HFL cells was 87.3±2.1% and 80.1±3.1% on staining with trypane blue and ethidium bromide, correspondingly (Fig. 1a). The results of both tests had no statistically true differences. At the same time the number of the fluorescein–positive cells was significantly lower in comparison with the results of vital staining of HFL cells, and made 48.5±2.0% before freezing (Fig 1a). This fact points that only in a part of HFL primary suspension cells with vital dye exclusion the fluorescein was revealed. In the thawed samples together with the keeping of total cell number the HFL cell viability was significantly lower than that for freshly isolated cells in all three tests: 63.7±8.5% on staining with trypane blue and 54.6±2.6% with ethidium bromide, the number of fluorescein-positive cells decreased down to длительные исследования функциональной активности. Особенно сложно тестировать гетерогенные суспензии недифференцированных клеток, полученных из эмбриональных тканей. Цель данной работы – оценить сохранность КЭП человека после криоконсервирования по неспецифическим экспресс-тестам: прижиз- ненному окрашиванию клеток трипановым синим и БЭ, внутриклеточному накоплению флюорес- цеина в результате гидролиза ФДА, а также по способности клеток к адгезии. Материалы и методы Объектом исследования служили первичные суспензии свежевыделенных и криоконсервиро- ванных КЭП человека. Донорский материал был получен от эмбрионов 7-9 недель гестации после искусственного прерывания беременности и транспортировался в стерильных флаконах на льду. Изолированные КЭП получали неферментативным методом [3]. Клеточные суспензии криоконсерви- ровали под защитой 5%-го ДМСО по программе [2], хранили в жидком азоте, размораживали на водяной бане при 40°С [11]. Оценку жизнеспособ- ности клеток проводили по общепринятым методам прижизненного окрашивания трипановым синим [9] и БЭ/ФДА [5]. Адгезивную способность к культуральному пластику оценивали при эксплан- тации 1×105/см2 в 24-луночные планшеты (“Co- star”) в среде αМЕМ, дополненной 5% эмбрио- нальной телячьей сыворотки, в стандартных условиях при 37°С, 100%-й влажности, 5% СО2. Криоконсервированные КЭП перед эксплантацией отмывали от ДМСО путем капельного добавления [4] сахарозо-солевого раствора [10] с после- дующим центрифугированием. Через определен- ные интервалы времени (1 и 18 ч) неприкре- пившиеся клетки собирали в фиксированном объеме культуральной среды и подсчитывали их количество в камере Горяева. Прикрепившиеся клетки оценивали под инвертированным микроскопом после фиксации этанолом 70°. Статистический анализ результатов проводили непараметрическим методом с помощью крите- рия Уилкоксона для однородных пар. Результаты представлены как M±m. Результаты и обсуждение В суспензии свежеизолированных КЭП чело- века жизнеспособность клеток составляла: 87,3±2,1 и 80,1±3,1% по окрашиванию трипановым синим и БЭ соответственно (рис. 1,а). Результаты обоих тестов не имели статистически достоверных различий. В то же время количество флюоресцеин- положительных клеток было достоверно ниже показателей прижизненного окрашивания КЭП и 86ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ 2003, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY 2003, №2 �� 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6 + �� 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6 Рис.1. Сохранность КЭП до (а) и после (б) криокон- сервирования, оцененная: 1– по общему количеству клеток; 2 – окрашиванию трипановым синим; 3 – окра- шиванию БЭ; 4 – внутриклеточному накоплению флюоресцеина; 5 – неспецифической адгезии (в течение 1 ч); 6 – неспецифической адгезии (в течение 18 ч). * – различия статистически достоверны по сравнению с данными до криоконсервирования; +–различия статис- тически достоверны по сравнению с результатами прижизненного окрашивания (трипановым синим и БЭ), p < 0,05. Fig.1. HFL cells’ integrity before (a) and after (b) cryopreservation estimated by total cell number (1), trypane blue staining (2), ethydium brimide staining (3), intracellular accumulation of fluoresceine (4), non-specific adhesion during 1 hr (5), and non-specific adhesion during 18 hrs (6). – differences are significant comparing with data before cryopreservation; +– differences are significant comparing with results of vital staining (with trypane blue and ethydium bromide), p<0.05. a a б b составляло 48,5±2,0% (рис. 1,а). Данный факт указывает на то, что только в части клеток первичной суспензии эмбриональной печени человека, неокрашенных витальными красите- лями, обнаруживается флюоресцеин. В размороженных образцах на фоне сохранения общего количества клеток жизнеспособность КЭП была достоверно ниже соответствующих показа- телей свежевыделенных клеток по всем 3-м тестам: по окрашиванию трипановым синим – 63,7±8,5; БЭ – 54,6±2,6%; количество флюорес- цеин-положительных клеток снизилось до 24,3±2,2% (рис. 1,б). Различия в количестве клеток, в которых обнаруживался флюоресцеин до и после криоконсервирования, могли быть обусловлены присутствием ДМСО в деконсервированных суспензиях. Поэтому от каждого образца криокон- сервированных КЭП была отобрана 1/2 часть суспензии и проведена оценка жизнеспособности тех же клеток после отмывания от криопротектора [4]. Жизнеспособность клеток в данной группе по всем тестам оставалась на уровне соответству- ющих результатов в группе криоконсервированных КЭП без отмывания (данные не приведены). Таким образом, снижение количества флюорес- цеин-положительных клеток после криоконсер- вирования не было связано с присутствием ДМСО в реакционной среде. Это могло быть обусловлено гибелью клеток, потерей флюоресцеина живыми клетками вследствие дестабилизации их плазма- тических мембран после замораживания-отогрева, а также ингибированием эстераз после криокон- сервирования, следствием чего было меньшее внутриклеточное накопление флюоресцеина. В процессе криоконсервирования могут проис- ходить повреждения клеточных структур без нарушения целостности плазматической мем- браны. Поэтому следующей важной задачей работы являлось исследование элементарных функциональных свойств криоконсервированных клеток, в частности, способности клеток к адгезии, которая реализуется через сложный комплекс молекул класса адгезионных рецепторов. Эти белки, как известно, опосредуют взаимодействия клеток между собой и с внеклеточным матриксом. В эмбриогенезе адгезионные рецепторы вовле- чены в важнейшие процессы клеточной миграции, пролиферации и дифференцировки и участвуют в морфогенезе тканей и органов [1]. В данной работе исследовали способность свежевыделенных и криоконсервированных КЭП прикрепляться к культуральному пластику в течение 1 и 18 ч. Относительное количество при- крепившихся клеток не зависело от продол- жительности времени адгезии (1 и 18 ч) и не изменялось после криоконсервирования, составляя * * + С ох ра нн ос ть К Э П , % H FL c el ls ’ i nt eg rit y, % С ох ра нн ос ть К Э П , % H FL c el ls ’ i nt eg rit y, % 87ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ 2003, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY 2003, №2 Рис.2. Адгезирующие КЭП человека свежевыделенные (а, б) и криоконсервированные (в,г). Адгезия к культуральному пластику в течение 1 ч. Увел.: ок. × 10, об. ×25. Fig. 2. Adherent HFL cells: freshly isolated (a, b), and freeze-thawed (c, d). Adhesion to culture plastic during 1 hr. Magnification: ocular tube ×10, objective ×25. в среднем около 50% от общего количества эксплантированных клеток (рис. 1, а, б). Во всех исследованных препаратах среди прикрепившихся клеток преобладали округлые клеточные элемен- ты, вариабельные по размеру, без видимых признаков распластывания, с крупным ядром и узким ободком светлой цитоплазмы. Были отмечены некоторые морфологические особен- ности адгезировавших нативных и криоконсер- вированных КЭП. В образцах свежевыделенных клеток наблюдали распластавшиеся клетки различного размера с одним или несколькими выраженными лучеподобными изменениями клеточной поверхности (рис. 2, а, б). Эти клетки располагались одиночно или в непосредственной близости с одной или несколькими малыми округлыми клетками. В препаратах деконсерви- рованных КЭП преобладали сферические клетки. Изредка встречались округлые распластанные клетки с тонким светлым ободком цитоплазмы (рис. 2, в), иногда они имели 1-2 цитоплазма- 24.3±2,2% (Fig. 1 b). The differences in number of cells with revealed fluorescein before and after cryopreservation could be associated with DMSO presence in thawed suspensions. Therefore we took the half of each sample of cryopreserved HFL cells and examined the viability of these cells after cryoprotectant removal. Cell viability of this group estimated by all tests was at the level of the frozen- thawed cells without washing-out (data are not presented). Thus, reduction of fluorescein-positive cell number after cryopreservation was not associated with DMSO presence in the reaction medium. It may be stipulated by cell damage, loss of fluorescein by alive frozen- thawed cell as a result of plasmatic membrane destabilization, and inhibition of esterase activity after cryopreservation, resulting in lower intracellular accumulation of fluorescein. In cryopreservation process the damage of cell structures can occur without impairment of the cell integrity. Therefore the next important task was the б ba a в с г d 88ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ 2003, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY 2003, №2 investigation of primitive functional properties of cryopreserved cells, in particular, the ability of cells to adhesion, which is realized through a complex of molecules from the adhesion receptors class. These proteins are known to be the mediators of the cells and extracellular matrix interactions. In embryogenesis the adhesion receptors are involved in important processes of cell migration, proliferation and differentiation and take part in tissue and organ morphogenesis [1]. In this work we investigated the ability of freshly isolated and cryopreserved HFL cells to adhere to the culture plastic during 1 and 18 hrs. The relative quantity of adherent cells did not depend on the adhesion time (1 and 18 hrs) and did not change after cryopreser- vation, making in average about 50% of total number of seeded cells (Fig. 1a, b). In all studied samples among the adherent cells we observed the roundish cell elements, varying by size, being without visible indices of sprawling, having large nucleus and narrow edge of light cytoplasm. Some morphological peculiarities of adhered native and cryopreserved HFL cells were noted. In the samples of freshly isolated cells we observed the sprawled cells of various size with one or several marked ray-like alterations of cell surface (Fig. 2a, b). The location of these cells was single or in proximity to one or several small roundish cells. In the samples of thawed HFL cells the roundish cells were predominated. In some cases the roundish sprawled cells with a narrow light edge of cytoplasm were observed (Fig. 2c), some of these cells had 1-2 cytoplasmatic sprouts of insignificant length (Fig. 2d). In all these cells large nuclei were revealed. Cell adhesion is known to be an active multistage process, which depends on the binding of adhesion receptors with their ligands or substrate, cytoskeleton rearrangements and forming of focal contacts, being necessary for adhesion strengthening [6]. It is established that the ability of receptor to bind with its ligand and to strength the adhesion could be altered by other stimuli [8]. It is possible, that short-term contact of HFL cells with DMSO cryoprotectant before freezing and after thawing, and the cryopreservation procedure as well could change the functional state of plasma membranes, cytoskeleton structures and adhesion receptors of HFL cells, that was manifested in various adhesion behaviour of cells investigated in vitro. It was interesting to compare the results of all performed non-specific tests. The viability of freshly isolated HFL cells was above 80% according to vital staining with trypane blue and ethydium bromide. About 50% of the total HFL cell number in the suspensions was fluorescein-positive. In the same time about 50% cells were able to bind to the plastic in an hour as well as 18 hours. These data show, that about 30% of viable тических отростка незначительной длины (рис. 2, г). Во всех клетках выявлялись крупные ядра. Известно, что адгезия клеток – это активный многостадийный процесс, который зависит от связывания адгезионных рецепторов с их лиган- дами или субстратом, цитоскелетных перестроек и формирования фокальных контактов, которые необходимы для усиления прикрепления [6]. Установлено, что способность рецептора связы- ваться с его лигандом и усиливать адгезию может быть изменена действием других стимулов [8]. Возможно, кратковременный контакт КЭП с криопротектором ДМСО до замораживания и после отогрева, а также собственно процедура криоконсервирования могут изменять функцио- нальное состояние плазматических мембран, цитоскелетных структур и адгезионных рецепторов КЭП, что и проявилось в различном адгезивном поведении in vitro исследованных клеток. Интересным было сравнение результатов всех проведенных неспецифических тестов. Жизне- способность свежеизолированных КЭП человека составила свыше 80% согласно прижизненному окрашиванию трипановым синим и БЭ. В среднем около 50% КЭП в первичной суспензии были флюоресцеин-положительными. В то же время 50% от общего количества нативных КЭП были способны прикрепляться к пластику как через 1 ч, так и через 18 ч. Эти данные свидетельствуют, что около 30% жизнеспособных КЭП были неадгезирующими и такое же количество КЭП, в которых не обнаруживался флюоресцеин. Как известно, большинство КЭП ранних сроков гестации являются гемопоэтическими, среди которых эритроидные предшественники преобла- дают. Кроме того, установлено, что гемоглобин оказывает сильный маскирующий эффект на флюоресценцию флюоресцеина [7]. Можно предположить, что более зрелые эритробласты эмбриональной печени человека, содержащие фетальный гемоглобин, являются кандидатами в те 30% жизнеспособных нефлюоресциирующих КЭП, и, возможно, неспособны к неспецифической адгезии. После криоконсервирования по разработанной программе было отмечено сохранение общего количества клеток и снижение количества КЭП, устойчивых к прижизненным красителям по сравнению с нативным контролем. Гибель клеток, оцененная по окрашиванию трипановым синим, составляла около 24%, БЭ – 26%; потеря флюо- ресцеин-положительных КЭП была в среднем 24%. Можно было бы считать, что указанные тесты выявляют одни и те же поврежденные клетки. Но при этом количество адгезировавших деконсервированных КЭП оставалось на уровне 89ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ 2003, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY 2003, №2 нативного контроля – в среднем около 50% как через 1ч, так и через 18 ч адгезии. Таким образом, неясно, какие именно КЭП становятся поврежден- ными. В то же время было установлено, что после размораживания только часть адгезировавших клеток были флюоресцеин-положительными, возможно, в результате ингибирования эстераз после криоконсервирования. Выводы Рассмотренные тесты отражают отдельные аспекты жизнеспособности клеток и являются взаимодополняющими. Сочетанное их применение может быть использовано для более полной первичной характеристики гетерогенных суспен- зий криоконсервированных клеток, в частности, эмбриональной печени, для которых характерен скрытый биологический потенциал. Прижизненное окрашивание КЭП трипановым синим и БЭ дает сходные результаты. ФДА-тест не отражает действительное количество жизнеспособных КЭП. При этом комплексная оценка жизнеспособности по описанным 3-м тестам позволила определить не только количество КЭП человека с поврежден- ными мембранами, но и наличие фракции клеток, устойчивых к витальным красителям, в которых не обнаруживался накапливавшийся флюоресцеин. Статус и судьба последних остаются не ясными и требуют более детальных исследований. Тест на неспецифическую клеточную адгезию к культу- ральному пластику имеет важное значение как обязательный этап перед культивированием in vitro и как предварительная функциональная харак- теристика адгезивного пула КЭП человека. Необходимо отметить, что количественная оценка пула адгезирующих клеток должна быть дополнена исследованием их морфологических свойств. Выявление же криочувствительности отдельных клеточных типов в гетерогенных суспензиях – это следующая задача, решение которой возможно при условии привлечения методов фенотипирования исследуемых эмбриональных клеток и культи- вирования. HFL cells were not adherent cells, and the same number of the HFL cells did not reveal the fluorescein presence. The majority of HFL cells of early gestation stage are known to be hemopoietic progenitor cells, among them erytropoietic cells predominate. Furthermore it is established, that hemoglobin exhibits a strong masking effect on the fluorescence of fluorescein [7]. So we can suppose, that more mature HFL erytroblasts, containing fetal hemoglobin, can be the candidates for those 30% viable non-fluorescent HFL cells, which may be unable to nonspecific adhesion. After cryopreservation procedure according to the elaborated program we have found the preservation of total cell number and decrease of cell amount, being resistant to vital dyes, comparing to the native control. The cell death was about 24% on trypane blue staining, and for ethidium bromide it was 26%. Loss of the fluorescein-positive cell quantity was about 24%. These tests were supposed to detect the same damaged cells. However the amount of adherent cells remained at the native level, about 50%. So it is unknown what cells became damaged. Whereas it is clear, that only a part of the adherent cells were fluorescein-positive. It may be as a result of esterase inhibition after cryo- preservation. Conclusions Performed tests demonstrated some aspects of cell viability and amplify each other. Their combined application could be used for more complete primary characteristics of heterogeneous suspensions of cryopreserved cells, in particular of embryonic liver, being characterised with a latent biological potential. Vital staining of HFL cells with trypane blue and ethydium bromide shows the similar results. FDA-test does not display a real number of viable HFL cells. In this case co-application of FDA-test with the vital staining allowed to determine the presence of HFL cells, excluding the vital dyes, but not revealing the fluorescein accumulation. Their state and fate are not clear and it requires more detailed investigations. The test for non-specific cell adhesion on culture plastic has a great importance as the essential step before culturing in vitro and the initial functional test for HFL cells adhesive pool. It should be noted, that quantitative evaluation of adherent cells needs to be combined with investigation of morphological properties of these cells. Revealing of cryosensitivity of separate cell types in heterogenous suspensions is the next task, the solving of which is possible in case of involving the methods of phenotyping of studied fetal cells and culturing. Литература Боценовский В.А., Барышников А.Ю. Молекулы клеточной адгезии человека // Успехи совр. биологии.– 1994.– Т.114.– №6.– С. 741-753. Грищенко В.И., Тарасов А.И., Руденко С.В., Петренко А.Ю. Чувствительность к программному и циклическому замораживанию – отогреву клеток эмбриональной печени человека 7-12 недель гестации // Пробл. крио- биологии.– 2000.– №4.– С.37-44. Петренко А.Ю., Сукач А.Н., Росляков А.Д., Мазур С.П. Выделение гепатоцитов крыс неферментативным методом: детоксикационная и дыхательная активности // Биохимия.– 1991.– Т.56, №9.– С. 1647-1651. 1. 2. 3. 90ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ 2003, №2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY 2003, №2 Скоробогатова Н.Г., Грищук В.П., Петренко А.Ю. Влияние условий удаления криопротектора ДМСО на жизнеспо- собность и колониеобразующую активность клеток эмбриональной печени человека // Пробл. криобиологии.– 2002.– №4.– С. 16-23. Dankberg F., Persidsky M.D. A test of granulocyte integrity and phagocytic function // Cryobiology.– 1976.– Vol.13.– P. 430-432. Pavalko F.M., Otey C.A. Role of adhesion molecule cytoplasmic domains in mediating interactions with the cytoskeleton // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.– 1994.– Vol.205(4).– P. 282-293. Persidsky M. D., Baillie G. S. Fluorometric test of cell membrane integrity // Cryobiology.–1977.– Vol. 14, N3.– P.322- 331. Sanchez-Mateos P., Cabanas C., Sancez- Madrid F. Regulation of integrin function // Semin. Cancer Biol.– 1996.– Vol.7(3).– P. 99-107. Seglen P.O. Preparation of isolated rat liver cells // Meth. Cell. Biol.– 1976.– N13.– P. 29-83. Shanina I., Kravchenko l., Fuller B., Grischenko V. A comparison of a sucrose-based solution with others preservation media for cold storage of isolated hepatocytes // Cryobiology.– 2000.– Vol.41.– P. 315-318. Zhao J., Hao H. N., Thomas R. L. et al. An efficient method for the cryopservation of fetal human liver hematopoeitic progenitor cells // Stem Cells.– 2001.– Vol.19, N3.- P. 212- 218. Поступила 26.05.2003. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. References Botsenovskiy B.A., Baryshnikov A.Yu. Cell adhesion molecules in human // Uspekhi Sovr. Biol.– 1994.– Vol.114, N6.– P. 741-753. Grischenko V.I., Tarasov A.I., Rudenko S.V., Petrenko A.Yu. Sensitivity to a programmed and cyclic freeze-thawing of human embryonic liver cells of 7-12 weeks of gestation // Problems of Cryobiology.– 2000.– N4.– P.37-44. Petrenko A.Yu., Sukach A.N., Roslyakov A.D. Isolation of rat hepatocytes by a non-enzymatic method: detoxication and breathing activity // Biokhimiya.– 1991.– Vol.56, N9.– P. 1647- 1651. Skorobogatova N.G., Grischuk V.P., Petrenko A.Yu. Influence of Me2SO Cryoprotectant removal conditions to viability and colony forming activity of cryopreserved cells of human fetal liver // Problems of Cryobiology.– 2002.– N4.– P. 16-23. Dankberg F., Persidsky M.D. A test of granulocyte integrity and phagocytic function // Cryobiology.– 1976.– Vol.13.– P. 430-432. Pavalko F.M., Otey C.A. Role of adhesion molecule cytoplasmic domains in mediating interactions with the cytoskeleton // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.– 1994.– Vol.205(4).– P. 282-293. Persidsky M. D., Baillie G. S. Fluorometric test of cell membrane integrity // Cryobilogy.–1977.– Vol. 14, N3.– P.322- 331. Sanchez-Mateos P., Cabanas C., Sancez- Madrid F. Regulation of integrin function // Semin. Cancer Biol.– 1996.– Vol.7(3).– P. 99-107. Seglen P.O. Preparation of isolated rat liver cells // Meth. Cell. Biol.– 1976.– N13.– P. 29-83. Shanina I., Kravchenko l., Fuller B., Grischenko V. A comparison of a sucrose-based solution with others preservation media for cold storage of isolated hepatocytes // Cryobiology.– 2000.– Vol.41.– P. 315-318. Zhao J., Hao H. N., Thomas R. L. et al. An efficient method for the cryopservation of fetal human liver hematopoeitic progenitor cells // Stem Cells.– 2001.– Vol.19, N3.- P. 212- 218. Accepted in 26.05.2003. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-137555
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	0233-7673
language	Russian
last_indexed	2025-12-07T18:04:27Z
publishDate	2003
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
record_format	dspace
spelling	Скоробогатова, Н.Г. 2018-06-17T12:50:42Z 2018-06-17T12:50:42Z 2003 Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования / Н.Г. Скоробогатова // Проблемы криобиологии. — 2003. — № 2. — С. 84–90. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137555 615.361.36.013.014.413 Проведен сравнительный анализ результатов оценки жизнеспособности свежевыделенных и криоконсервированных клеток эмбриональной печени (КЭП) человека по неспецифическим тестам: витальному окрашиванию клеток трипановым синим, бромистым этидием (БЭ); гидролизу флюоресцеин диацетата (ФДА) во флюоресцеин; способности клеток к адгезии. Проведенные тесты отражают различные аспекты клеточной жизнеспособности. Окрашивание трипановым синим и бромистым этидием давало сходные результаты. ФДА-тест не выявляет действительное количество жизнеспособных КЭП. Комбинацией 3-х методов оценки жизнеспособности была выявлена фракция клеток, устойчивых к витальным красителям, в которых не обнаруживался флюоресцеин. Тест на неспецифическую адгезию позволяет исследовать сохранность клеток адгезивного пула эмбриональной печени. На фоне сохранения количества адгезировавших КЭП после криоконсервирования выявлены морфологические отличия клеток, прикреплявшихся к пластику, по сравнению с нативным контролем. Сочетанное использование указанных тестов позволяет давать более полную первичную характеристику гетерогенных суспензий недифференцированных клеток, в частности эмбриональной печени человека. Проведено порівняльний аналіз результатів оцінки життєздатності нативних і кріоконсервованих клітин ембріональної печінки (КЕП) людини за неспецифічними тестами: вітальним фарбуванням клітин трипановим синім, бромистим етидієм; гідролізом флюоресцеїн діацетату (ФДА) у флюоресцеїн; здатністю клітин до адгезії. Проведені тести відображали різні аспекти клітинної життєздатності. Фарбування трипановим синім і бромистим етидієм давало подібні результати. ФДА-тест не показує дійсну кількість життєздатних КЕП. Комбінацією 3-х методів оцінки життєздатності була виявлена фракція КЕП, стійких до вітальних барвників, в яких не знайдено флюоресцеїну. Тест на неспецифічну адгезію дозволяє досліджувати цілість клітин адгезивного пулу ембріональної печінки. При збереженні кількості адгезуючих КЕП після кріоконсервування було виявлено морфологічні відмінності клітин, що прикріплювались до пластика, у порівнянні з нативним контролем. Сумісне використання зазначених тестів дозволяє давати більш повну первинну характеристику гетерогенних суспензій недиференційованих клітин, зокрема ембріональної печінки людини. There was carried out a comparative analysis of the results on the estimation of viability for freshly isolated and cryopreserved human fetal liver (HFL) cells using non-specific tests: vital staining of cells with trypane blue, ethydium bromide (EB), fluorescein diacetate (FDA) hydrolysis to fluorescein; ability of cell to adhesion. The performed tests reflect various aspects of cell viability. Staining with trypane blue and EB produced the similar results. FDA-test does not reveal a real number of viable HFL cells. The fraction of cells resistant to vital dyes, where no fluoresceine was found, was revealed by the combination of three methods of viability assessment. The non-specific adhesion test allows to estimate the integrity of HFL cells of adhesive pool. Simultaneously with keeping the number of adhesive HFL cells after cryopreservation there were found the morphological differences of cells, being adhered to the plastic, comparing to the native control. Combined usage of stated tests allows to provide the more complete primary characteristics of heterogenous suspensions of non-differentiated cells, in particular, HFL ones. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Криоконсервирование биообъектов Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования Comparison of Tests for Fetal Liver Cells Viability after Cryopreservation Article published earlier
spellingShingle	Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования Скоробогатова, Н.Г. Криоконсервирование биообъектов
title	Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования
title_alt	Comparison of Tests for Fetal Liver Cells Viability after Cryopreservation
title_full	Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования
title_fullStr	Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования
title_full_unstemmed	Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования
title_short	Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования
title_sort	сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования
topic	Криоконсервирование биообъектов
topic_facet	Криоконсервирование биообъектов
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/137555
work_keys_str_mv	AT skorobogatovang sravneniemetodovocenkižiznesposobnostikletokémbrionalʹnoipečeničelovekaposlekriokonservirovaniâ AT skorobogatovang comparisonoftestsforfetallivercellsviabilityaftercryopreservation

Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования

Institution

Similar Items