ПЭО-1500 ингибирует Са²⁺-АТРазу эритроцитов человека
Са²⁺-АТРаза эритроцитов человека обеспечивает поддержание и регуляцию уровня внутриклеточного кальция. Изменение ее функциональной активности при криоконсервировании играет важную роль в выживаемости клеток и сохранении ими структурной целостности. Экзоцеллюлярный криопротектор ПЭО-1500 приводит к и...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Datum: | 2007 |
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2007
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138025 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | ПЭО-1500 ингибирует Са²⁺-АТРазу эритроцитов человека / Н.Г. Землянских, А.Ю. Никольченко, Л.А. Бабийчук // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 2. — С. 115-125. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860268512325402624 |
|---|---|
| author | Землянских, Н.Г. Никольченко, А.Ю. Бабийчук, Л.А. |
| author_facet | Землянских, Н.Г. Никольченко, А.Ю. Бабийчук, Л.А. |
| citation_txt | ПЭО-1500 ингибирует Са²⁺-АТРазу эритроцитов человека / Н.Г. Землянских, А.Ю. Никольченко, Л.А. Бабийчук // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 2. — С. 115-125. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Са²⁺-АТРаза эритроцитов человека обеспечивает поддержание и регуляцию уровня внутриклеточного кальция. Изменение ее функциональной активности при криоконсервировании играет важную роль в выживаемости клеток и сохранении ими структурной целостности. Экзоцеллюлярный криопротектор ПЭО-1500 приводит к ингибированию активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов уже на этапе инкубирования с ним клеток, а последующий цикл замораживания-отогрева (–196...37°С) в его присутствии не влияет на установившийся режим работы данного фермента. Ингибирование, вызванное действием ПЭО-1500, носит обратимый характер и активность Са²⁺-АТРазы эритроцитов восстанавливается после его разведения в клеточной суспензии, что необходимо для нормального функционирования криоконсервированных клеток в русле крови после трансфузии. Торможение работы Са²⁺-АТРазы связано, по-видимому, с модификацией физико-химических характеристик мембран под влиянием данного соединения.
Са²⁺-АТРаза еритроцитів людини забезпечує підтримку і регуляцію рівня внутрішньоклітинного кальцію. Зміна її функціональної активності при кріоконсервуванні виконує важливу роль у виживаності клітин і збереженні їх структурної цілосності. Екзоцелюлярний кріопротектор ПЕО-1500 призводить до інгібування активності Са²⁺-АТРази еритроцитів вже на етапі інкубації з ним клітин, а подальший цикл заморожування-відігрівання (–196...37°С) в його присутності не впливає на встановлений режим роботи даного ферменту. Інгібування, яке викликане дією ПЕО-1500, носить оборотний характер і активність Са²⁺-АТРази еритроцитів відновлюється після його розведення в клітинній суспензії, що необхідно для нормального функціонування кріоконсервованих клітин в руслі крові після трансфузії. Гальмування роботи Са²⁺-АТРази може бути пов’язане з модифікацією фізико-хімічних характеристик мембран під впливом даної сполуки.
Human erythrocyte Ca²⁺-ATPase provides the maintenance and regulation of intercellular calcium level. Change in its functional activity under cryopreservation plays an important role in cell survival and structural integrity preservation. PEO-1500 exocellular cryoprotectant inhibits erythrocyte Ca²⁺-ATPase activity at incubation stage but the following freeze-thawing cycle (–196...37°C) in its presence does not affect the settled regimen of this enzyme functioning. The inhibition caused by PEO-1500 effect has a reversible character and the erythrocyte Ca²⁺-ATPase activity is recovered after its dilution in cell suspension that is essential for cryopreserved cell normal functioning in blood bed after transfusion. The inhibition of Ca²⁺-ATPase activity is apparently associated to physical and chemical membrane modification under this compound effect.
|
| first_indexed | 2025-12-07T19:04:11Z |
| format | Article |
| fulltext |
115
УДК 57.043:577.1:577.325.45
Н.Г. ЗЕМЛЯНСКИХ*, А.Ю. НИКОЛЬЧЕНКО, Л.А. БАБИЙЧУК
ПЭО-1500 ингибирует Са2+-АТРазу эритроцитов человека
UDC 57.043:577.1:577.325.45
N.G. ZEMLYANSKIKH*, A.YU. NIKOLCHENKO, L.A. BABIJCHUK
PEO-1500 Inhibits Human Erythrocyte Ca2+-ATPase
Са2+-АТРаза эритроцитов человека обеспечивает поддержание и регуляцию уровня внутриклеточного кальция. Изменение
ее функциональной активности при криоконсервировании играет важную роль в выживаемости клеток и сохранении ими
структурной целостности. Экзоцеллюлярный криопротектор ПЭО-1500 приводит к ингибированию активности Са2+-АТРазы
эритроцитов уже на этапе инкубирования с ним клеток, а последующий цикл замораживания-отогрева (–196...37°С) в его
присутствии не влияет на установившийся режим работы данного фермента. Ингибирование, вызванное действием ПЭО-1500,
носит обратимый характер и активность Са2+-АТРазы эритроцитов восстанавливается после его разведения в клеточной
суспензии, что необходимо для нормального функционирования криоконсервированных клеток в русле крови после
трансфузии. Торможение работы Са2+-АТРазы связано, по-видимому, с модификацией физико-химических характеристик
мембран под влиянием данного соединения.
Ключевые слова: эритроциты, Cа2+-АТРаза, криоконсервирование, криопротектор, полиэтиленоксид.
Са2+-АТРаза еритроцитів людини забезпечує підтримку і регуляцію рівня внутрішньоклітинного кальцію. Зміна її
функціональної активності при кріоконсервуванні виконує важливу роль у виживаності клітин і збереженні їх структурної
цілосності. Екзоцелюлярний кріопротектор ПЕО-1500 призводить до інгібування активності Са2+-АТРази еритроцитів вже
на етапі інкубації з ним клітин, а подальший цикл заморожування-відігрівання (–196...37°С) в його присутності не впливає
на встановлений режим роботи даного ферменту. Інгібування, яке викликане дією ПЕО-1500, носить оборотний характер і
активність Са2+-АТРази еритроцитів відновлюється після його розведення в клітинній суспензії, що необхідно для нормального
функціонування кріоконсервованих клітин в руслі крові після трансфузії. Гальмування роботи Са2+-АТРази може бути пов’язане
з модифікацією фізико-хімічних характеристик мембран під впливом даної сполуки.
Ключові слова: еритроцити, Cа2+-АТРаза, кріоконсервування, кріопротектор, поліетиленоксид.
Human erythrocyte Ca2+-ATPase provides the maintenance and regulation of intercellular calcium level. Change in its functional
activity under cryopreservation plays an important role in cell survival and structural integrity preservation. PEO-1500 exocellular
cryoprotectant inhibits erythrocyte Ca2+-ATPase activity at incubation stage but the following freeze-thawing cycle (–196...37°C) in
its presence does not affect the settled regimen of this enzyme functioning. The inhibition caused by PEO-1500 effect has a reversible
character and the erythrocyte Ca2+-ATPase activity is recovered after its dilution in cell suspension that is essential for cryopreserved
cell normal functioning in blood bed after transfusion. The inhibition of Ca2+-ATPase activity is apparently associated to physical and
chemical membrane modification under this compound effect.
Key-words: erythrocytes, Ca2+-ATPase, cryopreservation, cryoprotectant, polyethylene oxide.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38
(057) 373-31-26, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya
str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3126, fax: +380 57
373 3084, e-mail:cryo@online.kharkov.ua
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
Изменение концентрации внутриклеточного
Са2+ под воздействием внешнего сигнала (гормона,
нейромедиатора и т.д.) регулирует структурно-
функциональное состояние многих клеточных
систем [13]. В эритроцитах человека единствен-
ным механизмом, обеспечивающим контроль за
поддержанием его уровня в цитоплазме, является
Са2+-АТРаза плазматической мембраны [2]. На мо-
лекулярном уровне транспортная функция Са2+
осуществляется двумя изоформами данного
фермента – РМСА1b и РМСА4b [20]. Энзиматичес-
кие характеристики активности Са-насоса эритро-
цитов определяются структурными особенностями
Change in intracellular Ca2+ concentration under
external signal effect (hormone, neuromediator etc.)
regulates structural and functional state of many cell
systems [13]. In human erythrocytes the single mecha-
nism, controlling the maintenance of its level in
cytoplasm is plasma membrane Ca2+-ATPase [2]. In a
molecular level the Ca2+ transport function is realised
by two isoforms of this enzyme: PMCA1b and
PMCA4b [20]. Enzymatic characteristics of erythro-
cyte Ca-pump activity are determined by structural
peculiarities of these two forms presented in cells.
Ca2+-ATPase activity may be modified under the effect
of different regulatory effects [17]. The enzyme
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ
КРИОБИОЛОГИЯ
THEORETICAL
AND EXPERIMENTAL
CRYOBIOLOGY
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
116
этих двух изоформ, присутствующих в клетках.
Активность Са2+-АТРазы может быть модифици-
рована под влиянием различных регуляторных
эффектов [17]. Фосфорилирование фермента про-
теинкиназами А и С, протеолиз под действием
кальпаина, взаимодействие с кальмодулином
усиливают активность Са-насоса [17, 20]. Ионы
Са2+ способны как активировать, так и ингибиро-
вать ферментативную реакцию гидролиза АТР
Са2+-АТРазой [2, 10]. Важную роль в регуляции
функциональной активности Са2+-АТРазы играют
липидные компоненты мембраны [2, 10, 17, 20],
поэтому структурное состояние и состав липид-
ного бислоя, которые зависят от температуры и
влияния ряда химических агентов, могут сущест-
венно влиять на работу Са2+-насоса. Принимая во
внимание исключительную роль Са2+-АТРазы в
регулировании концентрации Са2+ в эритроцитах,
исследование изменений ее функциональной
активности в процессе криоконсервирования
является важным аспектом в понимании меха-
низмов выживаемости клеток и сохранении ими
структурной целостности после замораживания-
отогрева.
В процессе криоконсервирования эритроцитов
используются различные криопротекторы, пред-
назначенные для защиты биологических систем от
физико-химических факторов, сопровождающих
процессы замораживания-отогрева клеточных
суспензий и нарушающих барьерную функцию
мембраны [3].
Наряду с глицеролом, в последнее время актив-
но исследуется полиэтиленоксид с молекулярной
массой 1500 (ПЭО-1500) [1]. Одним из важных ас-
пектов исследования действия данного вещества
может быть изучение модификации функциониро-
вания Са2+-АТФазы на разных этапах криоконсер-
вирования, что позволит установить роль Са2+ в
повреждении субклеточных структур или возмож-
ность вовлечения Са2+-индуцированных измене-
ний в адаптацию клеток к экстремальным неблаго-
приятным условиям криоконсервирования.
Особенность механизма защитного действия
ПЭО-1500 в процессе криоконсервирования
эритроцитов связана со способностью данного
вещества оказывать криопротекторный эффект, не
проникая в клетки. Эффективность ПЭО-1500 в
качестве криопротектора [1] зависит от начальной
температуры экспонирования клеток в растворах
данного вещества. Инкубация эритроцитов с
ПЭО-1500 в диапазоне температур 0-4°С на этапе,
предшествующем замораживанию, способствует
большей сохранности клеток после криоконсерви-
рования в сравнении с инкубацией при более
высоких температурах.
Цель данного исследования – анализ изменений
активности Са-АТРазы эритроцитов человека под
phosphorylation with protein kinases A and C, proteo-
lysis under calpain effect, as well as interaction with
calmodulin enhance the Ca-pump activity [17, 20].
Ca2+ ions are capable either to activate or inhibit an
enzyme reaction of ATP hydrolysis with Ca2+-ATPase
[2, 10]. An important role in regulating Ca2+-ATPase
functional activity belongs to membrane lipid compo-
nents [2, 10, 17, 20], therefore a structural state and
composition of lipid bilayer, dependent on temperature
and influence of some chemical agents may signifi-
cantly affect the Ca2+-pump activity. Taking into
consideration an exceptional role of Ca2+-ATPase in
regulating Ca2+ concentration in erythrocytes, study
of the changes in Ca2+-ATPase functional activity in
the process of cryopreservation is of importance for
understanding the mechanisms of cell survival and
preserving structural integrity after freeze-thawing.
Different cryoprotectants, designed to protect
biological systems against chemical factors, accompa-
nying cell suspension freeze-thawing processes and
impairing a membrane barrier function are applied
under erythrocyte cryopreservation [3].
Polyethylene oxide with 1500 molecular weight
(PEO-1500) has been recently actively investigated
along with glycerol [1]. One of the important aspects
in investigating this substance effect may be the study
of Ca2+-ATPase functioning modification at different
cryopreservation stages, that will enable to establish
the Ca2+ role either in damaging subcellular structures
or a possibility to involve Ca2+-induced changes in cell
adaptation to extreme unfavourable cryopreservation
conditions. The peculiarity of PEO-1500 protective
effect mechanism mechanism during erythrocyte cryo-
preservation is associated to this substance capability
to cause a cryoprotective effect without penetrating
into cells. PEO-1500 efficiency as a cryoprotectant
[1] depends on an initial temperature of cell exposure
in this substance solutions. Erythrocyte incubation
with PEO-1500 within 0-4°C temperature range at the
stage being preceded to freezing, contributes to a
higher cell integrity after cryopreservation compared
to the incubation under higher temperatures.
This research was aimed to analyse the changes in
human erythrocyte Ca2+-ATPase activity under
PEO-1500 exocellular cryoprotectant effect at low
temperature preservation different stages, including
those of preliminary cell incubation in cryopreser-
vative solution and transfusion simulation of frozen-
thawed erythrocytes.
Materials and methods
Such reagents as: Trizma base (Sigma), ATP-
disodium (Sigma), HEPES, EGTA (“Serva”), CaCl2
(Sigma), Saponin (Fluka), KCl, MgCl2×6H2O and
other reagents of Ukrainian and Russian production
(chemically pure or especially pure grades) have been
used in the work.
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
117
влиянием экзоцеллюлярного криопротектора
ПЭО-1500 на различных стадиях низкотемпера-
турного консервирования, включая этапы предва-
рительного инкубирования клеток в растворе
криоконсерванта и моделирования трансфузии
деконсервированных эритроцитов.
Материалы и методы
В работе использовали следующие реактивы:
Trizma base (Sigma), ATP-disodium (Sigma), HEPES,
EGTA (“Serva”), CaCl2 (Sigma), Saponin (Fluka),
KCl, MgCl2×6H2O и другие реактивы производства
Украины и России (х.ч. или о.с.ч.).
Объектом исследования служили эритроциты
II (A) группы донорской крови мужчин, заготов-
ленной на консерванте “Глюгицир”. Исследования
проводили на 3-5-е сутки гипотермического хране-
ния крови.
Эритроциты осаждали центрифугированием
при 3000 об/мин (центрифуга ОПН-3). После уда-
ления плазмы и лейкоцитарного слоя эритроциты
трижды промывали 3-4-кратными объемами среды
В (150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,4).
В работе использовали 30%-й раствор ПЭО-1500
на основе среды В. Раствор консерванта добавляли
к эритроцитам в равном объеме и инкубировали в
течение 30 мин при 37°С или температуре, колеб-
лющейся в диапазоне 0-4°С. Перед началом инку-
бации температура эритромассы и растворов была
скорректирована заранее в соответствии с условия-
ми инкубации. Часть эритроцитов после инкуба-
ции с ПЭО-1500 при разных температурах была
использована для замораживания путем быстрого
погружения контейнеров в жидкий азот (–196°С).
Криоконсервированную суспензию эритроцитов
отогревали на водяной бане при температуре
42-44°С с постоянным покачиванием. Для контро-
ля использовали эритроциты, инкубированные в
среде В при температурах 37 и 0-4°С в течение
30 мин.
Перед началом определения АТРазной активно-
сти эритроциты, подвергнутые указанным выше
экспериментальным воздействиям, либо осажда-
ли центрифугированием при 1000 об/мин (ОПН-3),
либо к одному объему эритроцитарной суспензии
добавляли 9 объемов среды В (моделируя разбав-
ление криопротектора в русле крови при транс-
фузии деконсервированных эритроцитов) и затем
центрифугированием осаждали клетки в аналогич-
ном режиме.
Аликвоты эритроцитов из полученных осадков
отбирали для анализа изменений активности
Са2+-АТРазы под влиянием ПЭО-1500 и темпера-
турных воздействий. Оценку активности Са-АТРазы
проводили по методу, описанному в работе [8], с
некоторыми модификациями.
Men donor II (A) blood erythrocytes, procured with
“Glygicir” preservative served as the investigation
object. Investigations were carried-out to the 3rd-5th
days of blood hypertonic storage.
Erythrocytes were pelleted with centrifugation at
3000 rot/min (OPN-3 centrifuge). After plasm and
buffy coat removal the erythrocytes were thrice rinsed
with 3-4-fold volumes of medium B (150 mM NaCl,
10 mM Tris-HCl, pH 7.4).
In research we used a 30% solution of PEO-1500
in medium B. Preservative solution was added into
erythrocytes in an equal volume and incubated for 30
min at 37°C temperature or at that, varying within 0-
4°C range. Before starting incubation the erythrocon-
cetrate and solution temperature was previously cor-
rected according to the incubation conditions. A part
of erythrocytes after incubating with PEO-1500 under
different temperatures was used for freezing when
containers were rapidly immersed into liquid nitrogen
(–196°C). Cryopreserved erythrocyte suspension was
thawed on water bath at 42-44°C. The erythrocytes,
incubated in B medium at 37 and 0-4°C for 30 min
served the control.
Before starting the ATPase activity detection the
erythrocytes subjected to the above mentioned experi-
mental effects were either pelleted by centrifugation
at 1000 rot/min (OPN-3) or 9 volumes of medium B
were added to one volume of erythrocyte suspension
(by modelling cryoprotectant dilution into blood bed
during frozen-thawed erythrocyte transfusion) and
then cells were pelleted by centrifugation with the
same regimen.
Erythrocyte aliquots derived from pellets were
selected to analyse the changes in Ca2+-ATPase activity
under PEO-1500 influence and temperature effects.
Estimation of Ca2+-ATPase activity was performed
using the method, described in the paper [8] with
certain modifications.
A part of erythrocytes was transferred into the A
medium, containing 0.04% saponin, 130 mM KCl, 20
mM HEPES, 20 mM Tris (pH 7.4), 0.25 mM MgCl2,
1 mM ATP, 1 mM EGTA and 1.055 mM CaCl2 (that
corresponded to the concentration of about 10 µM for
a free Ca2+ [8]), the second part was added into the
same A medium but free of CaCl2. Hematocrit in the
incubation medium made 10%. The reaction was car-
ried-out at 37°C and for a part of experiments it was
done at 0-4°C. The Ca2+-ATPase activity was judged
by the difference of inorganic P accumulation in
calcium-containing and calcium-free media. Reaction
was stopped in 20 min with adding cold TCA solution
up to 5% final concentration. Protein was precipitated
with centrifugation at 900 g.
An amount of inorganic phosphorus in samples was
determined according to the method [18]. After protein
precipitation 100 мl of supernatant were added into
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
118
Часть эритроцитов переносили в среду А,
содержащую 0,04% сапонина, 130 мМ KCl, 20 мМ
HEPES, 20 мM Трис (pH 7,4), 0,25 мМ MgCl2, 1 мМ
АТР, 1 мМ EGTA и 1,055 мМ CaCl2 (что соответ-
ствует концентрации свободного Са2+ примерно
10 мкМ [8]), вторую часть добавляли в ту же среду
А, но не содержащую CaCl2. Гематокрит в инкуба-
ционной среде составлял 10%. Реакцию проводили
при температуре 37°С и для части экспериментов –
при 0-4°С. Об активности Са2+-АТРазы судили по
разности накопления неорганического Р в кальций-
содержащей и бескальциевой средах. Реакцию
останавливали через 20 мин добавлением холод-
ного раствора ТХУ до конечной концентрации 5%.
Белок осаждали центрифугированием при 900 g.
Количество неорганического фосфора в пробах
определяли по методу [18]. После осаждения
белков 100 мкл надосадочной жидкости добавляли
к 2 мл 1,5 М ацетатного буфера (CH3COOH-
CH3COONa, pH 4,3), содержащего 3,7% формаль-
дегида и 10 % этанола. После чего к каждой пробе
последовательно добавляли по 0,1 мл 2%-го раст-
вора молибдата аммония и по 0,2 мл приготов-
ленного ex tempore 6,75 мМ SnCl2. Пробы колори-
метрировали при длине волны 660 нм на спектро-
фотометре Ломо СФ-46. Калибровочная прямая
была линейной до 10 мкг неорганического фос-
фора в пробе. Результаты статистически обраба-
тывали с использованием программы Statgraphics
plus 2.1 for Windows. Объем выборки в каждой
экспериментальной группе n=10. Для оценки дос-
товерности различий экспериментальных данных
применяли t-критерий Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Замораживание эритроцитов без криопротек-
тора приводит к полной гибели клеток в результате
нарушения целостности структуры плазматичес-
кой мембраны. Оценка функциональной актив-
ности Са2+-АТРазы после замораживания эритро-
цитов позволяет определить устойчивость данной
системы транспорта катионов в составе мембран-
ного комплекса к действию низких температур.
Как видно на рис. 1, а, б, АТРазная активность
Са2+-насоса эритроцитов после замораживания
эритроцитов без криопротектора не отличается от
контрольных значений. Аналогичные результаты
были получены и при изучении АТРазной актив-
ности везикул саркоплазматического ретикулума
[5], подвергнутых быстрому однократному замо-
раживанию в жидком азоте. Медленное заморажи-
вание мембран саркоплазматического ретикулума
до –196°С приводит к активации Са2+-АТРазы,
однако способность Са2+-насоса аккумулировать
Са2+ в этих условиях резко падает, что свидетель-
ствует о разобщении каталитической и ионтранс-
2 ml of 1.5 M acetate buffer (CH3COOH-CH3COONa,
pH 4.3), containing 3.7% formaldehyde and 10%
ethanol. Afterwards 2% ammonium molibdate
solution and 6.75 mM SnCl2 prepared ex tempore were
gradually added to each sample (by 0.1 and 0.2 ml,
correspondingly). Samples’ calorimet-ration was
performed at 600 nm wavelength with LOMO SP-46
spectrophotometer. Calibration line was linear up to
10 µg inorganic phosphorus in a sample. Results were
statistically processed using Statgraphics plus 2.1 for
Windows Software. Volume of sampling in each
experimental group, n, made 10. To estimate the statis-
tically significance of differences between experi-
mental data the Student t-criterion was applied.
Results and discussion
Cryoprotectant-free erythrocyte suspension freez-
ing-thawing results in a complete cell death due to the
integrity impairment in plasma membrane structure.
Estimation of Ca2+-ATPase functional activity after
erythrocyte freezing enabled to determine this cation
transport system resistance as a part of membrane
complex to low temperature effect. The Fig. 1, a, b
shows that the ATPase activity of erythrocyte Ca2+-
pump after cryoprotectant-free erythrocyte freezing
does not differ from the control values. The similar
results were also obtained when studying ATPase acti-
vity of sarco-plasmic reticulum vesicles [5], subjected
to a rapid single freezing in liquid nitrogen. Slow
freezing of sarcoplasmic reticulum membrane down
to –196°C results in Ca2+-ATPase activation, but the
Ca2+-pump ability to accumulate Ca2+ under these
conditions sharply decreases, that testifies to disinteg-
ration of catalytic and ion-transporting functions [21].
The evaluation of low temperature effect on PMCA
activity in erythrocytes under stationary conditions
could not provide a complete idea about Ca2+-trans-
porting system state, however under these conditions
the structure of catalytic center has apparently re-
mained undamaged.
Preservation of cell integrity during low tempe-
rature effect, that requires the cryoprotectant applica-
tion, results not only in modification of physical and
chemical medium parameters but also considerably
affects biological systems. PEO-1500 cryoprotectant
does not penetrate into cells and directly affects only
an external side of erythrocyte plasma membrane. But
its solution, applied for cryopreservation causes an
osmotic shrinking, that results in a concentration chan-
ge of all intracellular components and a decrease in
solvent (water) content. This may be a significant fac-
tor to modify the enzyme responses that reflects in
changing the rate and character of protein conformatio-
nal transitions. Erythrocyte incubation with cryopro-
tectant at 37°C and within the 0-4°C range (Fig. 1, c,
d) leads to almost two-fold decrease in Ca2+-ATPase
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
119
портирующей функций [21]. Оценка влияния низ-
ких температур на активность РМСА в эритроци-
тах в стационарных условиях, конечно, не дает
полного представления о состоянии Са2+-транспор-
тирующей системы, вместе с тем структура ката-
литического центра в этих условиях, по-видимому,
остается не поврежденной.
Сохранение целостности клеток в процессе
низкотемпературного воздействия, предполагаю-
щее использование криопротекторов, влечет за со-
бой не только модификацию физико-химических
параметров среды, но и оказывает значительное
влияние на биологические системы. Криопротек-
тор ПЭО-1500 не проникает в клетки и непосред-
ственно влияет только на внешнюю сторону плаз-
матической мембраны эритроцитов. Однако его
раствор, используемый для криоконсервирования,
вызывает осмотическое сжатие, что ведет к измене-
нию концентрации всех компонентов внутрикле-
точного содержимого и уменьшению концентра-
ции растворителя (воды). Это может быть сущест-
венным фактором для модификации фермента-
тивных реакций, что находит свое отражение в из-
менении скорости и характера конформационных
переходов белков. Инкубация эритроцитов с крио-
протектором при 37°С и в диапазоне 0-4°С (рис. 1,
в, д) приводит к снижению активности Са2+-АТРазы
почти в 2 раза независимо от температуры, при
которой ПЭО-1500 воздействует на клетки. Разли-
чия, связанные с температурой инкубации эритро-
цитов с криопротектором, статистически не обна-
руживаются, если ферментативный гидролиз АТР
происходит при 37°С. Но в реальных условиях,
когда эритроциты инкубируются с ПЭО-1500 при
разных температурах, ферментативная реакция,
катализируемая Са2+-АТРазой, также происходит
в клетке в различных температурных условиях. В
связи с этим были проведены эксперименты, в ко-
торых после инкубации эритроцитов с ПЭО-1500
при температуре 0-4°С клеточная суспензия была
разделена на две части, и оценку ферментативной
активности Са2+-АТРазы проводили при нормотер-
мических условиях или при сохранении гипотер-
мии. Как видно из рис. 2, а, б, температура влияет
на функциональную активность Са2+-АТРазы
эритроцитов, оцениваемую в условиях выбранной
нами модельной системы. Использование других
экспериментальных подходов может выявить
несколько иные особенности температурного влия-
ния на данную каталитическую реакцию, посколь-
ку характеристики работы Са2+-АТРазы очень
сильно зависят от применяемого методического
подхода [7]. При инкубации клеток с ПЭО-1500
снижение температуры оказывает дополни-
тельный ингибирующий эффект на Са2+-АТРазу
(рис. 2, г). В этих условиях активность фермента
0
200
400
600
800
1000
Рис. 1. Активность Са2+-АТРазы эритроцитов в присут-
ствии непроникающего криопротектора ПЭО-1500 и
при действии низких температур: а – нативные
эритроциты (37°С); б – эритроциты, замороженные без
криопротектора до –196°С; в – эритроциты, инкубиро-
ванные с ПЭО-1500 при 37°С; г – криоконсервиро-
ванные эритроциты, преинкубированные с ПЭО-1500
при 37°С; д – эритроциты, инкубированные с ПЭО-1500
при температуре 0-4°С; е – криоконсервированные
эритроциты, преинкубированные с ПЭО-1500 при
температуре 0-4°С; * – выборки достоверно отличаются
от контроля с уровнем значимости Р<0,05.
Fig. 1. Ca2+-ATPase activity of erythrocytes in presence of
PEO-1500 non-penetrative cryoprotectant and under low
temperature effect: a – native erythrocytes (37°C); b –
cryoprotectant-free frozen erythrocytes down to –196°C;
c – cells incubated with PEO-1500 at 37°C; d – cryo-
preserved erythrocytes, preliminarily incubated with
PEO-1500 at 37°C; e – those, incubated with PEO-1500 at
0-4°C; f – cryopreserved erythrocytes, preliminarily incuba-
ted with PEO-1500 at 0-4°C; * – samplings statistically and
significantly differ from the control with P<0.05 significance
level.
a
a
б
b
в
c
г
d
д
e
е
f
*
*
*
*
activity independently on the temperature at which
PEO-1500 affects the cells. Differences associated to
the temperature of erythrocyte incubation with
cryopro-tectant are not statistically revealed if the ATP
enzyme hydrolysis occurs at 37°C. But under actual
conditions when erythrocytes are incubated with PEO-
1500 under different temperatures an enzyme reaction,
catalysed by Ca2+-ATPase occurs in cell under various
temperature conditions as well. That is why cell
suspension was divided in two parts after erythrocyte
incubation with PEO-1500 at 0-4°C and the estimation
of Ca2+-ATPase enzyme activity was carried out under
both normothermic conditions and hypothermia. As
the Fig. 2, a, b shows, the temperature affects the Ca2+-
ATPase functional activity of erythrocytes, being
estimated in the model system selected by us. The
usage of other experimental approaches may reveal
slightly different peculiarities of temperature effect
on this catalytic reaction, since the characteristics of
Ca2+-ATPase activity mostly depends on the applied
methodical approach [7]. When incubating cells with
Ак
ти
вн
ос
ть
C
a2+
-A
TP
аз
ы
,
нм
ол
ь
Р i
/м
ин
н
а
м
л
кл
ет
ок
C
a2+
-A
TP
as
e
ac
tiv
ity
,
nm
ol
o
f P
i/m
in
p
er
m
l o
f c
el
ls
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
0
200
400
600
800
120
ниже в сравнении не только с контролем (рис. 2, а),
но и с эритроцитами, инкубировавшимися с
ПЭО-1500 при 0-4°С с последующей оценкой
функционирования Са2+-АТРазы в нормотерми-
ческих условиях (рис. 2, в). Учитывая, что
ПЭО-1500 изменяет текучесть липидного бислоя
[3], мы ожидали, что он способен поддерживать
функциональную активность Са2+-АТРазы на
более высоком уровне при снижении температуры
ферментативного гидролиза в сравнении с натив-
ными эритроцитами (рис. 2, б, г). Однако устано-
вить достоверно значимых различий не удалось.
По-видимому, торможение, вызванное термодина-
мическими причинами [11], превалирует над физи-
ко-химической модификацией мембраны в контро-
лировании скорости ферментативной реакции,
осуществляемой Са2+-зависимой АТРазой.
Криоконсервирование эритроцитов под защи-
той ПЭО-1500 не вносит существенных изменений
в режим работы Са2+-АТРазы, который устанавли-
вается на этапе инкубирования клеток с данным
криопротектором. Сравнение ферментативной ак-
тивности Са2+-транспортирующей системы эри-
троцитов, инкубированных с ПЭО-1500 при
различных температурах (см. рис. 1, в, д) с анало-
гичными вариантами после замораживания-отог-
рева клеток (см. рис. 1, г, е), не выявляет ста-
тистически достоверных различий. Не обнару-
живаются различия и между двумя группами
деконсервированных эритроцитов, отличавшихся
изначально температурными режимами экспони-
рования клеток с криопротектором (см. рис. 1, д, е).
В данных условиях все экспериментальные груп-
пы достоверно отличаются только от контроля и
эритроцитов, замороженных без криопротектора.
Следовательно, основной причиной изменения
активности Са2+-АТРазы эритроцитов является
модификация мембраны под влиянием ПЭО-1500,
а эффекты низкотемпературного консервирования
в этих условиях не проявляются.
Полученные результаты свидетельствуют, что
ингибирующий эффект ПЭО-1500 обусловлен его
непосредственным присутствием в среде и не
связан, по-видимому, с какой-либо спецификой
взаимодействия ПЭО-1500 с клетками при различ-
ных температурах, поскольку уровень активности
Са2+-АТРазы эритроцитов, инкубированных с
криопротектором при различных температурах, не
имеет достоверных отличий при нормотермичес-
ких условиях проведения ферментативной реак-
ции.
Возникает вопрос об обратимости изменений
данной функциональной системы эритроцитов
после удаления криопротектора. Безотмывочный
метод криоконсервирования эритроцитов под
защитой ПЭО-1500 позволяет переливать реци-
Рис. 2. Влияние температуры на активность Са2+-
АТРазы эритроцитов в присутствии непроникающего
криопротектора ПЭО-1500: а – нативные эритроциты
(37°С) с последующим определением активности при
той же температуре; б – нативные эритроциты (0-4°С)
с последующим определением активности при той же
температуре; в – эритроциты, инкубированные с
ПЭО-1500 при температуре 0-4°С, с последующим
определением активности при 37°С; г – эритроциты,
инкубированные с ПЭО-1500 при 0-4°С, с последую-
щим определением активности при данной темпера-
туре; * – отличия достоверны от контроля с уровнем
значимости Р<0,05; ** – достоверные различия при
сравнении экспериментальных групп в и г с уровнем
значимости Р<0,05.
Fig. 2. Temperature effect on erythrocyte Ca2+-ATPase
activity in presence of PEO-1500 non-penetrative cryo-
protectant: a – native erythrocytes (37°C) with following
activity determination at the same temperature; b – those
(0-4°C) with following activity determination at the same
temperature; c – erythrocytes incubated with PEO-1500 at
0-4°C with following activity determination at 37°C; d –
those incubated with PEO-1500 at 0-4°C with following
activity determination at this temperature; * – differences
are statistically significant compared to the control with
P<0.05 significance level; ** – differences are statisticaly
siginificant when comparing data of groups c and d with
P<0.05 significance level.
a
a
б
b
в
c
г
d
*
*
*
**
**
PEO-1500 a temperature decrease causes an additional
inhibiting effect on Ca2+-ATPase (Fig. 2, d). Under
these conditions the enzyme activity is lower compared
not only to the control (Fig. 2, a), but the erythrocytes,
incubated with PEO-1500 at 0-4°C with following
estimation of Ca2+-ATPase functioning under normo-
thermic conditions (Fig. 2, c). Taking into account the
fact that PEO-1500 changes the lipid bilayer fluidity
[3] we expected it to be capable of Ca2+-ATPase
functional activity maintaining at a higher level in the
process of enzyme hydrolysis at a reduced temperature
compared to native erythrocytes (Fig. 2 b, c). However
we did not manage to establish the statistically signi-
ficant differences. Apparently, the inhibition caused
by thermodynamic reasons [11] dominates the physical
and chemical membrane modifications in controlling
the rate of enzyme reaction, realised by Ca2+-dependent
ATPase.
Ак
ти
вн
ос
ть
C
a2+
-A
TP
аз
ы
,
нм
ол
ь
Р i
/м
ин
н
а
м
л
кл
ет
ок
C
a2+
-A
TP
as
e
ac
tiv
ity
,
nm
ol
o
f P
i/m
in
p
er
m
l o
f c
el
ls
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
121
пиентам кровь после размораживания без удаления
криопротектора. В кровеносном русле происходит
постепенное снижение его концентрации. Процесс
разбавления ПЭО-1500 моделировали в экспери-
ментальных условиях, добавляя физиологический
раствор в суспензию клеток. Такой методический
подход был применен к клеткам, подвергнутым
инкубированию с ПЭО-1500, и к эритроцитам,
замороженным под его защитой. Следует отметить,
что разбавление криоконсервированных клеток
изотонической средой сопровождается гемолизом
(~25%). Представленные на рис. 3 данные свиде-
тельствуют о восстановлении функциональной
активности Са2+-АТРазы эритроцитов после
разбавления ПЭО-1500, что предполагает обрати-
мость торможения, возникающего под влиянием
криопротектора. Все экспериментальные варианты
не имеют достоверных отличий от контроля.
Вместе с тем можно выделить две особенности
восстановления Са2+-АТРазной активности эритро-
цитов, связанные с температурными условиями.
Во-первых, наиболее ярко выраженное восстанов-
ление активности Са2+-АТРазы после разбавления
ПЭО-1500 в клеточных суспензиях отмечается в
группах криоконсервированных эритроцитов.
Возможно, причина, объясняющая эту особен-
ность, связана с гетерогенностью популяции
эритроцитов и неодинаковой устойчивостью
клеточных субпопуляций в процессе криоконсер-
вирования. Эритроциты на этапе инкубирования
с ПЭО-1500 полностью сохраняют свою целост-
ность и активность Са2+-АТРазы представлена
усредненными показателями всех субпопуляций
эритроцитов. Известно, что в старых эритроцитах
уровень внутриклеточного кальция выше, чем в
молодых клетках, что связывают с торможением
активности Са2+-АТРазы [19]. Старые эритроциты
чувствительны к различным неблагоприятным
воздействиям и, вероятно, первыми погибают при
криоконсервировании. Поэтому их удаление в
результате гибели при замораживании и последую-
щем разведении клеточной суспензии изотоничес-
ким раствором из эритромассы, в которой опреде-
ляется активность Са2+-АТРазы, обусловливает ее
более высокие значения. Во-вторых, мы обнару-
жили при сравнении двух групп, отличающихся
начальными температурными условиями экспони-
рования эритроцитов с ПЭО-1500 (рис. 3, б, в) и
(рис. 3, г, д), что тенденция восстановления
Са2+-АТРазной активности в большей мере прояв-
ляется для клеток, инкубированных с криопротек-
тором при температуре 0-4°С. Как показали про-
веденные исследования [4], температура может
модулировать взаимодействие ПЭО-1500 с биоло-
гическими мембранами. При понижении темпе-
ратуры количество ПЭО-1500, образующего
Erythrocyte cryopreservation under PEO-1500
protection does not significantly change the Ca2+-
ATPase activity regimen, settled at the stage of cell
incubation with this cryoprotectant. Comparing the
enzyme activity of Ca2+-transporting system of
erythrocytes, incubated with PEO-1500 under various
temperatures (see Fig. 1, c, d) with similar versions
after cell freeze-thawing (Fig. 1, d, e) does not reveal
statistically significant differences. No differences
between two groups of frozen-thawed erythrocytes,
originally differing by temperature regimens of cell
exposure with cryoprotectant were revealed (Fig. 1,
e, f). Under these conditions all experimental groups
statistically and significantly differ from the control
and cryoprotectant-free frozen erythrocytes only.
Consequently, the main reason of change in erythro-
cyte Ca2+-ATPase activity is the membrane modifica-
tion under PEO-1500 effect, but the effects of low tem-
perature preservation under these conditions are not
revealed.
The results obtained testify to the fact that an
inhibiting PEO-1500 effect is stipulated by its direct
presence in the medium and is not apparently asso-
ciated to any specificity of PEO-1500 interaction with
cells under various temperatures, because the level of
erythrocyte Ca2+-ATPase activity, incubated with
cryoprotectant under different temperatures has no
statistically significant differences under normother-
mic conditions of enzyme reaction performance.
The question arises about a reversible character of
changes in this functional erythrocyte system after
cryoprotectant removal. Washing-out free method for
erythrocyte cryopreservation under PEO-1500 protec-
tion enables transfusion of blood to recipients after
freeze-thawing without cryoprotectant removal. A
gradual decrease in its concentration occurs in a blood
bed. The process of PEO-1500 dilution was simulated
under experiment conditions by adding physiological
solution into cell suspension. This methodical appro-
ach was applied to cells, incubated with PEO-1500
and to erythrocytes, frozen under its protection. Of
note is the fact that the cryopreserved cell dilution
with isotonic medium is accompanied with hemolysis
(~25%). The data presented in Fig. 3 testify to the
erythrocyte Ca2+-ATPase functional activity recovery
after PEO-1500 dilution that suggests the reversible
character of inhibition, occurring under cryoprotectant
effect. All experimental variants have no statistically
significant differences from the control. However two
peculiarities of erythrocyte Ca2+-ATPase activity
recovering, associated to the temperature conditions
may be emphasised. First, the most manifested Ca2+-
ATPase activity recovery after PEO-1500 dilution in
cell suspension is observed in cryopreserved erythro-
cyte groups. The reason, explaining this peculiarity is
probably associated to the heterogeneity in erythrocyte
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
0
200
400
600
800
1000
122
достаточно прочные связи с мембранами, умень-
шается. Поэтому при разведении суспензии эрит-
роцитов физиологическим раствором количество
остаточного ПЭО-1500 в мембранах будет меньше
в условиях экспонирования клеток с криопротек-
тором при 0-4°С в сравнении с инкубацией при
37°С. Очевидно, это способствует лучшему восста-
новлению структурно-функциональных парамет-
ров мембраны. Обратимость ингибирующего
эффекта ПЭО-1500 на Са2+-АТРазную активность
эритроцитов позволяет предположить, что после
трансфузии эта функциональная система сможет
нормально выполнять свою работу, что необхо-
димо для поддержания и регуляции концентрации
внутриклеточного Са2+.
Изменения активности Са2+-АТРазы эритроци-
тов играют важную роль в регуляции различных
метаболических процессов [13, 17] и индуцируют
определенную сбалансированность структурно-
функционального состояния субклеточных систем
в изменившихся условиях жизнедеятельности
клеток. Подобным примером могут служить
изменения в эритроцитах людей, страдающих
гипертензией [14]. Как показали исследования,
активность Са2+-АТРазы сапонин-пермеаби-
лизированных эритроцитов сохраняется после
действия ультранизких температур, что свидетель-
ствует о ее криостабильности. Однако применение
криопротекторов для защиты клеток в процессе
замораживания-отогрева влияет на каталитичес-
кую активность Са-насоса. Экзоцеллюлярный
криопротектор ПЭО-1500 модифицирует парамет-
ры как вне- так и внутриклеточной среды в силу
своей осмотической активности и адсорбционной
способности [6]. Изменения активности Са2+-
АТРазы и уровня внутриклеточного кальция в
данных условиях могут играть определенную роль
в контроле метаболических процессов в эритро-
цитах. Поскольку во внеклеточной среде ионы Са2+
содержатся в остаточных количествах, торможение
Са2+-АТРазной активности в эритроцитах под
Ак
ти
вн
ос
ть
C
a2+
-A
TP
аз
ы
,
нм
ол
ь
Р i
/м
ин
н
а
м
л
кл
ет
ок
C
a2+
-A
TP
as
e
ac
tiv
ity
,
nm
ol
o
f P
i/m
in
p
er
m
l o
f c
el
ls
a
a
б
b
в
c
г
d
д
e
*
Рис. 3. Влияние удаления криопротектора на активность
Са2+-АТРазы эритроцитов, инкубированных и криокон-
сервированных в присутствии непроникающего
криопротектора ПЭО-1500: а – нативные эритроциты
при 37°С; б – эритроциты, инкубированные с ПЭО-1500
при температуре 0-4°С; в – криоконсервированные
эритроциты, преинкубированные с ПЭО-1500 при
температуре 0-4°С; г – эритроциты, инкубированные с
ПЭО-1500 при 37°С; д – криоконсервированные
эритроциты, преинкубированные с ПЭО-1500 при 37°С;
* – отличия достоверны в сравнении с аналогичным
вариантом до разбавления криопротектора в суспензии.
Fig. 3. Effect of cryoprotectant removal on erythrocyte
Ca2+-ATPase activity incubated and cryopreserved in pre-
sence of PEO-1500 non-penetrative cryoprotectant: a –
native erythrocytes at 37°C; b – erythrocytes incubated with
PEO-1500 at 0-4°C; c – cryopreserved erythrocytes prelimi-
narily incubated with PEO-1500 at 0-4°C; d – erythrocytes
incubated with PEO-1500 at 37°C; e – cryopreserved ones,
preliminarily incubated with PEO-1500 at 37°C; * –
differences are statistically significant compared to the same
variant before cryoprotectant dilution in suspension.
population. Erythrocytes at the stage of incubation
with PEO-1500 entirely preserve their integrity and
the Ca2+-ATPase activity is represented by averaged
indices in all erythrocyte subpopulations. The level
of intracellular calcium is known to be higher in
senescent erythrocytes, than in young cells, that is
related to the Ca2+-ATPase activity slowdown [19].
Senescent erythrocytes are sensitive to different
unfavourable effects and are probably the first des-
troyed during cryopreservation. Therefore their
removal because of death during freezing and follo-
wing cell suspension dilution with isotonic solution
from erythroconcentrate, where Ca2+-ATPase activity
is determined, stipulates its higher values. Secondly,
when comparing two groups differed by initial
temperature conditions of erythrocyte exposure with
PEO-1500 (Fig. 3, b, c) and (Fig. 3, d, e) we have
revealed that the tendency of Ca2+-ATPase activity
recovery is mostly manifested in the cells, incubated
with cryoprotectant at 0-4°C. As shown in the
researches accomplished [4] the temperature may
modulate the PEO-1500 interaction with biological
membranes. Under temperature decrease the PEO-
1500 amount, forming quite the tight bonds with mem-
branes reduces. Therefore when diluting erythrocyte
suspension with physiological solution the amount of
residual PEO-1500 in membranes will be lower under
cell exposure with cryoprotectant at 0-4°C compared
to 37°C incubation. Evidently, this contributes to better
recovery of structural and functional membrane para-
meters. The reversibility of PEO-1500 inhibiting effect
on a erythrocyte Ca2+-ATPase activity enables assu-
ming this functional system to be able of normal func-
tioning after transfusion, that is necessary to maintain
and regulate Ca2+ intracellular concentration.
Changes in erythrocyte Ca2+-ATPase activity play
an important role in regulating different metabolic
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
123
влиянием ПЭО-1500, по-видимому, является ос-
новным физиологическим механизмом повышения
его внутриклеточного уровня. Увеличение концен-
трации Са2+ в эритроцитах, вызванное ингибиро-
ванием Са2+-АТРазы, дополняется осмотическими
эффектами раствора ПЭО-1500, вызывающего
дегидратацию клеток и концентрирование всех
внутриклеточных компонентов. Повышение уров-
ня Са2+ в данных условиях может вызвать регу-
ляторные изменения структурного и функциональ-
ного состояния ряда субклеточных систем.
Последствия роста уровня внутриклеточного Са2+,
по-видимому, неоднозначны для клеток на разных
этапах криоконсервирования. Увеличение механи-
ческой прочности мембраны, индуцированное
ростом концентрации Са2+ в эритроцитах [15],
возможно, повышает их устойчивость к заморажи-
ванию-отогреву. Однако перенос клеток в физио-
логические условия может активировать Са2+-
зависимые процессы, ведущие к структурно-функ-
циональным нарушениям.
Механизм ингибирующего воздействия ПЭО-
1500 на Са2+-АТРазу в структуре плазматической
мембраны эритроцитов представляется весьма
непростым, поскольку действие данного вещества
на клетку затрагивает целый ряд параметров ее
структурного состояния. Молекулы ПЭО-1500
образуют водородные связи с различными структу-
рами [6, 9, 16]. При взаимодействии ПЭО с
гидратными оболочками макромолекул, состав-
ляющих плазматическую мембрану, полимер
может образовывать покров вокруг клетки и огра-
ничивать доступность молекул воды к той части
Са2+-АТРазы, которая экспонирована на внешнюю
поверхность. Кроме того, адсорбируясь на плаз-
матической мембране, ПЭО-1500 может нарушать
структуру гидратной оболочки поверхностных час-
тей Са2+-АТРазы, вступая во взаимодействие с
полярными группировками макромолекулы, что
затрудняет конформационные превращения фер-
мента в ходе каталитической реакции.
Изменение активности Са2+-АТРазы может
быть также следствием модификации липидной
фазы мембраны в присутствии ПЭО-1500. Извест-
на способность молекул ПЭО и ПЭГ с различными
молекулярными массами вызывать агрегацию и
слияние биологических мембран и липосом [3, 16],
что связывают с участием данных соединений в
образовании водородных связей с молекулами
воды, сольватирующими полярные головки фос-
фолипидов. Взаимодействие ПЭГ с мембранами
вызывает модификацию физических параметров
бислоя, в частности, увеличивается текучесть ли-
пидов, изменяются энтропия, энтальпия и коопе-
ративность фазовых переходов [16]. Отмечено
возникновение полиморфных превращений в ли-
processes [13, 17] and inducing certain balance of
structural and functional state of subcellular systems
under changed conditions of cell vital activity. The
alterations in erythrocytes of patients with hyper-
tension may be such an example [14]. The investiga-
tions demonstrated that the Ca2+-ATPase activity of
saponin-permeabilised erythrocytes was maintained
after ultra low temperature effect that testified to its
cryostability. However applying cryoprotectants for
cell protection under freeze-thawing affects the
Ca-pump catalytic activity. PEO-1500 exocellular
cryoprotectant modifies parameters either of extra- or
intracellular media due to its osmotic activity and
adsorption capability [6]. Ca2+-ATPase activity and
intracellular calcium level alterations under these
conditions can play a certain role in the regulation of
erythrocyte metabolism. Since the Ca2+ ions in extra-
cellular medium are in a residual amount, the inhibition
of Ca2+-ATPase activity in erythrocytes under
PEO-1500 effect is apparently the main physiological
mechanism of its intracellular level augmentation.
Increase in Ca2+ concentration in erythrocytes, caused
by Ca2+-ATPase inhibition is complemented by os-
motic effects of PEO-1500 solution, causing cell
dehydration and concentrating all intracellular compo-
nents. Augmentation of Ca2+ level under these condi-
tions may cause regulatory changes in structural and
functional state of some subcellular systems. Con-
sequences of elevated intracellular Ca2+ level are not
apparently uniform for cells at different cryopreser-
vation stages. Increase in mechanical stability, induced
by Ca2+ concentration increase in erythrocytes [15]
possibly improves their resistance to freeze-thawing.
However cell transfer into physiological conditions
may activate Ca2+-dependent processes, resulting in
structural and functional disorders.
Mechanism of PEO-1500 inhibiting effect on Ca2+-
ATPase in erythrocyte plasma membrane structure
appears to be quite intricate, because this substance
affects a number of parameters of cell structure.
PEO-1500 molecules form hydrogen bonds with dif-
ferent structures [6, 9, 16]. Under PEO interaction with
macromolecule hydrate coat, composing a plasma
membrane, the polymer may form the cover around
of cell and limit water molecule availability to that
part of Ca2+-ATPase, which is exposed to an external
surface. In addition, being absorbed on plasmatic
membrane PEO-1500 may impair the structure of
hydrate coat of Ca2+-ATPase surface parts, by inter-
acting with polar groups of the macromolecule, that
complicates the conformational enzyme transforma-
tions during catalytic reaction.
Change in Ca2+-ATPase activity may also result
from membrane lipid phase modification at PEO-1500
presence. The capability of PEO and PEG molecules
with different molecular mass values is known to cause
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
124
пидной фазе, связанных с нарушением бислойной
ламеллярной структуры [3, 12]. Таким образом,
изменения структурных свойств липидного бислоя
мембраны и, возможно, зарядовых характеристик
микроокружения Са2+-АТРазы под влиянием
ПЭО-1500 может быть одной из причин торможе-
ния работы данной ферментативной системы.
Поскольку ПЭО-1500 влияет на различные
свойства плазматических мембран, то логично
предположить, что его ингибирующее влияние на
Са2+-АТРазу эритроцитов является суммирующим
результатом модификации всех физико-химичес-
ких характеристик мембраны под влиянием дан-
ного криопротектора.
Обнаруженное нами изменение Са2+-АТРазной
активности в эритроцитах под влиянием ПЭО-1500
ставит вопрос о механизме ее ингибирования и
требует проведения оценки кинетических характе-
ристик функционирования данной системы, ее
чувствительности к регуляторным воздействиям
разных концентраций Са2+, анализа Са2+ транспор-
тирующей способности в этих условиях. Ответы
на эти вопросы позволят в перспективе предста-
вить роль Са2+-регулирующих систем в изменениях
структурно-функционального состояния клеток
при изучении механизмов их стабилизации к
действию стрессовых факторов низкотемператур-
ного воздействия при использовании экзоцеллю-
лярных криопротекторов.
Выводы
1. Экзоцеллюлярный криопротектор ПЭО-1500
ингибирует активности Са2+-АТРазы эритроцитов
при инкубировании с ним клеток, а последующий
цикл замораживания-отогрева (–196...37°С) в его
присутствии не влияет на установившийся режим
работы данного фермента.
2. Ингибирование, вызванное действием
ПЭО-1500, носит обратимый характер и актив-
ность Са2+-АТРазы эритроцитов восстанавливается
после его разведения в клеточной суспензии, что
необходимо для нормального функционирования
криоконсервированных клеток в русле крови после
трансфузии.
Литература
Бабийчук Л.А., Землянских Н.Г. Влияние температуры и
криопротектора ПЭО-1500 на характер модификации
белков цитоскелета и устойчивость эритроцитов в
процессе криоконсервирования // Пробл. криобиологии.–
1994.– №2.– C. 7-11.
Болдырев А.А. Биологические мембраны и транспорт
ионов.– М., 1985. – 208 с.
Гулевский А.К., Бондаренко В.А., Белоус А.М. Барьерные
свойства биомембран при низких температурах.– Киев:
Наук. думка. – 1988. – 208 с.
1.
2.
3.
aggregation and fusion of biological membranes and
liposomes [3, 16], that is associated to the participation
of these compounds in formation of hydrogen bonds
with water molecules, solvating polar heads of phos-
pholipids. PEG interaction with membranes causes the
modification of bilayer physical parameters, in parti-
cular, there is an increase in lipid fluidity, changes in
entropy, enthalpy and cooperativity of phase transi-
tions [16]. The appearance of polymorphous transfor-
mations in lipid phase, associated to a disorder in bi-
layer lamellar structure was noted [3, 12]. Thus, the
changes in structural properties of membrane lipid
bilayer and probably the charge characteristics of Ca2+-
ATPase microenvironments may be one of the causes
of inhibiting activity of this enzyme system.
Since PEO-1500 affects different properties of
plasma membranes, it is logic to suppose that its inhi-
biting effect on erythrocyte Ca2+-ATPase is a summari-
sing result of modification of all physical and chemical
membrane characteristics under this cryoprotectant
effect.
Revealed by us change in erythrocyte Ca2+-ATPase
activity under PEO-1500 effect arises a question about
the mechanism of its inhibition and requires perfor-
ming estimation of kinetic characteristics of this sys-
tem functioning, its sensitivity to regulatory effects
of different Ca2+ concentrations, analysis of Ca2+ trans-
porting ability under these conditions. Answers on
these questions will enable in future to imagine the
role of Ca2+-regulating systems in changing structural
and functional state of cells when studying the me-
chanisms of their stabilisation to the effect of stress
factors of low temperature effect when using exocel-
lular cryoprotectants.
Conclusions
1. PEO-1500 exocellular cryoprotectant inhibits
the erythrocyte Ca2+-ATPase activity under cell
incubation with it, but a following cycle of freeze-
thawing (–196÷37°C) at its presence does not affect
the settled functioning regimen of this enzyme.
2. Inhibition, caused by PEO-1500 effect has a
reversible character and erythrocyte Ca2+-ATPase
activity recovers after its dilution in cell suspension,
that is necessary for normal functioning of cryopre-
served cells in blood bed after transfusion.
References
Babijchuk L.A., Zemlyanskikh N.G. Effect of temperature and
PEO-1500 cryoprotectant on the nature of cytoskeletal protein
modification and red blood cell stability during cryopre-
servation // Problems of Cryobiology.– 1994.– N2.– P. 7-11.
Boldyrev A.A. Biological membranes and ion transport.–
Moscow: Moscow State University, 1985.– 208 p.
1.
2.
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
125
Землянских Н.Г., Белоус А.М. Взаимодействие ПЭО с
плазматической мембраной эритроцитов после охлаж-
дения и замораживания // Доп. НАН України.– 1995.– №3.–
C.119-121.
Кузьмина Л.Н. Криочувствительность системы транспорта
кальция мембран саркоплазматического ретикулума мышц
кролика в процессе развития: Автореф. дис. ... канд. биол.
наук.– Харьков, 1991– 16 с.
Новиков А.Н., Липина О.В., Олейник С.Т. Адсорбционная
активность этиленгликоля и криопротекторная активность
ряда ПЭО // Криобиология и криомедицина.– 1983.– №13.–
C. 39-42.
Орлов С.Н. Кальмодулин // Итоги науки и техники. Общие
проблемы физико-химической биологии.– 1987.– Т. 8.–
204 с.
Покудин Н.И., Петруняка В.В., Орлов С.Н. Участвует ли
кальмодулин в регуляции активности Са-насоса в
эритроцитах in vivo? // Биохимия.– 1988.– Т. 53, №5.–
С. 753-758.
Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В.
Криопротекторы.– Киев: Наук. думка, 1978.– 204 с.
Рыбина В.В., Еленская И.А., Каймачников Н.П. Регуляция
активности Ca2+-AТФазы ионами Са2+ и кальмодулином в
эритроцитах человека при различном времени хранения //
Биол. мембраны.– 2001.– Т. 18, №4.– С. 287-293.
Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация.– М.:
Мир, 1988.– 586 с.
Boni L.T., Stewart T.P., Alderfer J.L., Hui S.W. Lipid-polyethy-
lene glycol interactions: II. Formation of defects in bilayer // J.
Membrane Biol.– 1981.– Vol. 62, N1-2.– P. 71-77.
Carafoli E. Calcium signaling: a tale for all seasons // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA.– 2002.– Vol. 99, N3.– P. 1115-1122.
Fu Y., Wang S., Lu Z. et al. Erythrocyte plasma Ca2+,Mg2+ and
cell membrane adenosin triphosphatase activity in patients
with essential hypertension // Chin. Med. J. (Engl.).–1998.–
Vol. 111, N2.– P. 147-149.
Liu F., Mizukami H., Sarnaik S., Ostafin A.J. Calcium-
dependent human erythrocyte cytoskeleton stability analуsis
through atomic force microscopy // J. Struct. Biol.– 2005. –
Vol. 150, N2 .– P. 200-210.
Morgan C.G., Thomas E.W., Yianni Y.P. The use of fluo-
rescence energy transfer to distinguish between poly(ethylene
glycol)-induced aggregation and fusion of phospholipid
vesicles // Biochim. Biophys. Acta.– 1983.– Vol. 728, N3.–
P. 356-362.
Penniston J.T., Enyedi A. Modulation of the plasma calcium
pump // J. Membr. Biol.– 1998.– Vol. 165, N2.– P. 101-109.
Rathbun W., Betlarсh V. Estimation of enzymically produced
orthophosphate in the presence of cystein and adenosin
triphosphate // Anal. Biochem.– 1969.– Vol. 28, N1.–
P. 436-445.
Romero P.J., Romero E.A. Effect of cell aging on Ca2+ influx
into human red cells // Cell Calcium.–1999.– Vol. 26, N3-4.–
P. 131-137.
Strehler E.E., Zacharias D.A. Role of alternative splicing in
generating isoform diversity among plasma calcium pumps//
Physiol. Rev.– 2001.– Vol. 81, N1.– P. 21-50.
Zhegunov G.F., Belous A.M. The effect of cryoprotectants on
the structure and function of Ca-transport system in
sarcoplasmic reticulum membranes // Cryoletters.– 1980.–
Vol. 1, N13.– P. 461-470.
Поступила 21.04.2006
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Gulevsky A.K., Bondarenko V.A., Belous A.M. Barrier
properties of biomembranes under low temperatures.– Kiev:
Naukova Dumka.– 1988.– 208 p.
Zemlyanskikh N.G., Belous A.M. PEO interaction with
erythrocyte plasmatic membrane after cooling and freezing //
Dopovidi NAN Ukrainy.– 1995.– N3.– P. 119-121.
Kuzmina L.N. Cryosensitivity of calcium transport system of
sarcoplasmic reticulum membranes of rabbit muscles during
development: Authors’ abstract of thesis of candidate of biol.
sciences.– Kharkov, 1991.– 16p.
Novikov A.N., Lipina O.V., Olejnik S.T. Adsorption activity of
ethylene glycol and cryoprotective activity of PEO series //
Kriobiologiya i Kriomeditsina.– 1983.– N13.– P. 39-42.
Orlov S.N. Calmodulin // Itogi Nauki i Tekhniki. Common
problems of physical and chemical biology.– 1987, Vol. 8.–
204 p.
Pokudin N.I., Petrunyaka V.V., Orlov S.N. Does calmodulin
participate in regulating Ca-pump activity in erythrocytes in
vivo? // Biokhimiya.– 1988.– Vol. 53, N5.– P. 753-758.
Pushkar N.S., Shrago M.I., Belous A.M., Kalugin Yu.V.
Cryoprotectants.– Kiev: Naukova Dumka.– 1978.– 204 p.
Rybina V.V., Elenskaya I.A., Kajmachnikov N.P. Regulation
of Ca2+-ATPase activity with Ca2+ ions and calmodulin in
human erythrocytes under various storage time // Biol.
membrany.– 2001.– Vol. 18, N4.– P. 287-293.
Hochachka P., Somero J. Biochemical adaptation.– Moscow:
Mir, 1988.– 586 p.
Boni L.T., Stewart T.P., Alderfer J.L., Hui S.W. Lipid-polyethy-
lene glycol interactions: II. Formation of defects in bilayer // J.
Membrane Biol.– 1981.– Vol. 62, N1-2.– P. 71-77.
Carafoli E. Calcium signaling: a tale for all seasons // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA.– 2002.– Vol. 99, N3.– P. 1115-1122.
Fu Y., Wang S., Lu Z. et al. Erythrocyte plasma Ca2+,Mg2+ and
cell membrane adenosin triphosphatase activity in patients
with essential hypertension // Chin. Med. J. (Engl.).–1998.–
Vol. 111, N2.– P. 147-149.
Liu F., Mizukami H., Sarnaik S., Ostafin A.J. Calcium-
dependent human erythrocyte cytoskeleton stability analуsis
through atomic force microscopy // J. Struct. Biol.– 2005. –
Vol. 150, N2 .– P. 200-210.
Morgan C.G., Thomas E.W., Yianni Y.P. The use of fluo-
rescence energy transfer to distinguish between poly(ethylene
glycol)-induced aggregation and fusion of phospholipid
vesicles // Biochim. Biophys. Acta.– 1983.– Vol. 728, N3.–
P. 356-362.
Penniston J.T., Enyedi A. Modulation of the plasma calcium
pump // J. Membr. Biol.– 1998.– Vol. 165, N2.– P. 101-109.
Rathbun W., Betlarсh V. Estimation of enzymically produced
orthophosphate in the presence of cystein and adenosin
triphosphate // Anal. Biochem.– 1969.– Vol. 28, N1.–
P. 436-445.
Romero P.J., Romero E.A. Effect of cell aging on Ca2+ influx
into human red cells // Cell Calcium.–1999.– Vol. 26, N3-4.–
P. 131-137.
Strehler E.E., Zacharias D.A. Role of alternative splicing in
generating isoform diversity among plasma calcium pumps//
Physiol. Rev.– 2001.– Vol. 81, N1.– P. 21-50.
Zhegunov G.F., Belous A.M. The effect of cryoprotectants on
the structure and function of Ca-transport system in
sarcoplasmic reticulum membranes // Cryoletters.– 1980.–
Vol. 1, N13.– P. 461-470.
Accepted in 21.04.2006
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-138025 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T19:04:11Z |
| publishDate | 2007 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Землянских, Н.Г. Никольченко, А.Ю. Бабийчук, Л.А. 2018-06-17T21:19:58Z 2018-06-17T21:19:58Z 2007 ПЭО-1500 ингибирует Са²⁺-АТРазу эритроцитов человека / Н.Г. Землянских, А.Ю. Никольченко, Л.А. Бабийчук // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 2. — С. 115-125. — Бібліогр.: 21 назв. — рос. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138025 57.043:577.1:577.325.45 Са²⁺-АТРаза эритроцитов человека обеспечивает поддержание и регуляцию уровня внутриклеточного кальция. Изменение ее функциональной активности при криоконсервировании играет важную роль в выживаемости клеток и сохранении ими структурной целостности. Экзоцеллюлярный криопротектор ПЭО-1500 приводит к ингибированию активности Са²⁺-АТРазы эритроцитов уже на этапе инкубирования с ним клеток, а последующий цикл замораживания-отогрева (–196...37°С) в его присутствии не влияет на установившийся режим работы данного фермента. Ингибирование, вызванное действием ПЭО-1500, носит обратимый характер и активность Са²⁺-АТРазы эритроцитов восстанавливается после его разведения в клеточной суспензии, что необходимо для нормального функционирования криоконсервированных клеток в русле крови после трансфузии. Торможение работы Са²⁺-АТРазы связано, по-видимому, с модификацией физико-химических характеристик мембран под влиянием данного соединения. Са²⁺-АТРаза еритроцитів людини забезпечує підтримку і регуляцію рівня внутрішньоклітинного кальцію. Зміна її функціональної активності при кріоконсервуванні виконує важливу роль у виживаності клітин і збереженні їх структурної цілосності. Екзоцелюлярний кріопротектор ПЕО-1500 призводить до інгібування активності Са²⁺-АТРази еритроцитів вже на етапі інкубації з ним клітин, а подальший цикл заморожування-відігрівання (–196...37°С) в його присутності не впливає на встановлений режим роботи даного ферменту. Інгібування, яке викликане дією ПЕО-1500, носить оборотний характер і активність Са²⁺-АТРази еритроцитів відновлюється після його розведення в клітинній суспензії, що необхідно для нормального функціонування кріоконсервованих клітин в руслі крові після трансфузії. Гальмування роботи Са²⁺-АТРази може бути пов’язане з модифікацією фізико-хімічних характеристик мембран під впливом даної сполуки. Human erythrocyte Ca²⁺-ATPase provides the maintenance and regulation of intercellular calcium level. Change in its functional activity under cryopreservation plays an important role in cell survival and structural integrity preservation. PEO-1500 exocellular cryoprotectant inhibits erythrocyte Ca²⁺-ATPase activity at incubation stage but the following freeze-thawing cycle (–196...37°C) in its presence does not affect the settled regimen of this enzyme functioning. The inhibition caused by PEO-1500 effect has a reversible character and the erythrocyte Ca²⁺-ATPase activity is recovered after its dilution in cell suspension that is essential for cryopreserved cell normal functioning in blood bed after transfusion. The inhibition of Ca²⁺-ATPase activity is apparently associated to physical and chemical membrane modification under this compound effect. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология ПЭО-1500 ингибирует Са²⁺-АТРазу эритроцитов человека PEO-1500 inhibits human erythrocyte Ca²⁺-ATPase Article published earlier |
| spellingShingle | ПЭО-1500 ингибирует Са²⁺-АТРазу эритроцитов человека Землянских, Н.Г. Никольченко, А.Ю. Бабийчук, Л.А. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | ПЭО-1500 ингибирует Са²⁺-АТРазу эритроцитов человека |
| title_alt | PEO-1500 inhibits human erythrocyte Ca²⁺-ATPase |
| title_full | ПЭО-1500 ингибирует Са²⁺-АТРазу эритроцитов человека |
| title_fullStr | ПЭО-1500 ингибирует Са²⁺-АТРазу эритроцитов человека |
| title_full_unstemmed | ПЭО-1500 ингибирует Са²⁺-АТРазу эритроцитов человека |
| title_short | ПЭО-1500 ингибирует Са²⁺-АТРазу эритроцитов человека |
| title_sort | пэо-1500 ингибирует са²⁺-атразу эритроцитов человека |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138025 |
| work_keys_str_mv | AT zemlânskihng péo1500ingibiruetsa2atrazuéritrocitovčeloveka AT nikolʹčenkoaû péo1500ingibiruetsa2atrazuéritrocitovčeloveka AT babiičukla péo1500ingibiruetsa2atrazuéritrocitovčeloveka AT zemlânskihng peo1500inhibitshumanerythrocyteca2atpase AT nikolʹčenkoaû peo1500inhibitshumanerythrocyteca2atpase AT babiičukla peo1500inhibitshumanerythrocyteca2atpase |