Изучение влияния низких температур на сохранность инфекционности антигенной структуры и ДНК вируса инфекционного ринотрахеита
Исследовано влияние замораживания и длительного хранения при умеренно низких температурах и в жидком азоте на сохранность инфекционных свойств, антигенной структуры и ДНК вакцинного и производственного штаммов вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота. Установлено, что инфекцио...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Date: | 2007 |
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2007
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138041 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Изучение влияния низких температур на сохранность инфекционности антигенной структуры и ДНК вируса инфекционного ринотрахеита / М.Ю. Стегний, А.Н. Гольцев, Б.Т. Стегний // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 2. — С. 162-167. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859756650666131456 |
|---|---|
| author | Стегний, М.Ю. Гольцев, А.Н. Стегний, Б.Т. |
| author_facet | Стегний, М.Ю. Гольцев, А.Н. Стегний, Б.Т. |
| citation_txt | Изучение влияния низких температур на сохранность инфекционности антигенной структуры и ДНК вируса инфекционного ринотрахеита / М.Ю. Стегний, А.Н. Гольцев, Б.Т. Стегний // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 2. — С. 162-167. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Исследовано влияние замораживания и длительного хранения при умеренно низких температурах и в жидком азоте на сохранность инфекционных свойств, антигенной структуры и ДНК вакцинного и производственного штаммов вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота. Установлено, что инфекционность в первом пассаже проявляли вирусы, хранившиеся в течение восьми месяцев и полутора лет при умеренно низких температурах, а также в течение двух с половиной лет в жидком азоте. Иммуноферментный анализ показал отсутствие гликопротеина В в размороженных образцах вируса, хранившихся в диапазоне температур от –18 до –30°С. Специфичность амплифицированного фрагмента ДНК подтверждена методом полимеразной цепной реакции для всех исследованных образцов вируса ИРТ.
Досліджено вплив заморожування і тривалого зберігання при помірно низьких температурах і в рідкому азоті на збереженість інфекційних властивостей, антигенної структури і ДНК вакцинного і виробничого штамів вірусу інфекційного ринотрахеїту (ІРТ) великої рогатої худоби. Установлено, що інфекційність у першому пасажі виявляли віруси, що зберігалися протягом восьми місяців і півтора роки при помірно низьких температурах, а також протягом двох з половиною років у рідкому азоті. Імуноферментний аналіз показав відсутність глікопротеїну В у розморожених зразках вірусу, які зберігалися в діапазоні температур від –18 до –30°С. Специфічність ампліфікованого фрагмента ДНК підтверджена методом полімеразної ланцюгової реакції для всіх досліджених зразків вірусу ІРТ.
Effect of freezing and long-term storage at moderately low temperatures and in liquid nitrogen on the integrity of infectious properties, antigen structure and DNA of vaccine and industrial strains of infectious bovine rhinotracheitis (IBRT) was studied. It has been established that infectivity in the first passage was expressed by the viruses stored for 8 months and 18 months under moderately low temperatures as well as for 30 months in liquid nitrogen. Immune enzyme analysis has shown the absence of glycoprotein B in thawed virus samples, stored within the range from –18 to –30°C. Specificity of amplified DNA fragment is confirmed by PCR for all studied samples of IBRT virus.
|
| first_indexed | 2025-12-02T01:21:38Z |
| format | Article |
| fulltext |
162 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
УДК 57.043;578.71
М.Ю. СТЕГНИЙ1*, А.Н. ГОЛЬЦЕВ2, Б.Т. СТЕГНИЙ3
Изучение влияния низких температур на сохранность инфекционности,
антигенной структуры и ДНК вируса инфекционного ринотрахеита
UDC 57.043;578.71
M.YU. STEGNIY1*, A.N. GOLTSEV2, B.T. STEGNIY3
Study of Low Temperature Effect on Preservation of Infectivity, Antigen
Structure and DNA of Infectious Rhinotracheitis Virus
Исследовано влияние замораживания и длительного хранения при умеренно низких температурах и в жидком азоте на
сохранность инфекционных свойств, антигенной структуры и ДНК вакцинного и производственного штаммов вируса
инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота. Установлено, что инфекционность в первом пассаже проявляли
вирусы, хранившиеся в течение восьми месяцев и полутора лет при умеренно низких температурах, а также в течение двух с
половиной лет в жидком азоте. Иммуноферментный анализ показал отсутствие гликопротеина В в размороженных образцах
вируса, хранившихся в диапазоне температур от –18 до –30°С. Специфичность амплифицированного фрагмента ДНК
подтверждена методом полимеразной цепной реакции для всех исследованных образцов вируса ИРТ.
Ключевые слова: вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, замораживание, низкотемпературное
хранение, ПЦР, ИФА.
Досліджено вплив заморожування і тривалого зберігання при помірно низьких температурах і в рідкому азоті на
збереженість інфекційних властивостей, антигенної структури і ДНК вакцинного і виробничого штамів вірусу інфекційного
ринотрахеїту (ІРТ) великої рогатої худоби. Установлено, що інфекційність у першому пасажі виявляли віруси, що зберігалися
протягом восьми місяців і півтора роки при помірно низьких температурах, а також протягом двох з половиною років у
рідкому азоті. Імуноферментний аналіз показав відсутність глікопротеїну В у розморожених зразках вірусу, які зберігалися в
діапазоні температур від –18 до –30°С. Специфічність ампліфікованого фрагмента ДНК підтверджена методом полімеразної
ланцюгової реакції для всіх досліджених зразків вірусу ІРТ.
Ключові слова: вірус інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби, заморожування, низькотемпературне зберігання,
ПЛР, ІФА.
Effect of freezing and long-term storage at moderately low temperatures and in liquid nitrogen on the integrity of infectious
properties, antigen structure and DNA of vaccine and industrial strains of infectious bovine rhinotracheitis (IBRT) was studied. It has
been established that infectivity in the first passage was expressed by the viruses stored for 8 months and 18 months under moderately
low temperatures as well as for 30 months in liquid nitrogen. Immune enzyme analysis has shown the absence of glycoprotein B in
thawed virus samples, stored within the range from –18 to –30°C. Specificity of amplified DNA fragment is confirmed by PCR for all
studied samples of IBRT virus.
Key-words: infectious bovine rhinotracheitis virus, freezing, low temperature storage, PCR, IEA.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Пушкинская, 83, г. Харьков, Украина 61002; тел. +38 (057)
707-20-38; факс: +38 (057) 707-10-90; электронная почта:
stegniy@vet.kharkov.ua
* To whom correspondence should be addressed: 83, Pushkinskaya
str., Kharkov, Ukraine 61002; tel.: +380 57 707-20-38; факс: +38
(057) 707-10-90; e-mail: stegniy@vet.kharkov.ua
1National Pharmaceutical University, Kharkov, Ukraine
2Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the
National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
3 Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine of
Ukrainian Academy of Agricultural Sciences, Kharkov, Ukraine
1Национальный фармацевтический университет, г. Харьков
2Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН
Украины, г. Харьков
3Институт экспериментальной и клинической ветеринарной
медицины УААН, Г. Харьков
Вирус инфекционного ринотрахеита крупного
рогатого скота (ИРТ) является возбудителем
высококонтагиозной инфекции, характеризующей-
ся поражением респираторного тракта, конъюн-
ктивитами, вульвовагинитами, абортами, энцефа-
литами и баланопоститами; относится к семейству
Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae,
виду Herpesvirus bovis 1. Геном представлен
двуспиральной нефрагментированной линейной
ДНК [2].
С помощью полимеразной цепной реакции
(ПЦР) можно выявлять низкие концентрации
Virus of infectious bovine rhinotracheitis (IBRT)
is highly contagious germ characterizing with the
damage of respiratory tract, conjuctivites, vulvovagi-
nites, abortions, encephalitis and balanoposthites; is
referred to the Herpesviridae family, Alphaherpes-
virinae subfamily, Herpesvirus bovis 1 species. The
genome is represented by two-helix non-fragmented
DNA [2].
By means of polymerase chain reaction (PCR) it is
possible to reveal low concentrations of virus nucleic
acid which are not found with dot- or blot-hybridiza-
tion. For PCR amplification the genes of either thymi-
КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ
БИООБЪЕКТОВ
CRYOPRESERVATION
OF BIOLOGICAL SYSTEMS
163
нуклеиновой кислоты вируса, которые не опреде-
ляются в дот или блот-гибридизации. Для ПЦР
амплификации применяют или гены фермента
тимидинкиназы, или гликопротеинов gВ, gС, gD,
gЕ этого герпес-вируса [6]. Для генотипической
дифференциации вакцинного штамма, негативного
в отношении гена гликопротеина Е и диких
штаммов вируса, также была разработана методи-
ка постановки ПЦР [7].
Антигены ИРТ выявляют с помощью твердо-
фазного иммуноферментного анализа (ИФА). В
полевых условиях диагностические тесты ИФА на
гликопротеины gB и gЕ показывают специфич-
ность до 96% [1], что подтверждает широкий анти-
генный спектр вируса.
Обычно для ПЦР анализа ДНК-содержащих
вирусов применяют одну пару праймеров, компле-
ментарных определенному участку геномной
ДНК. В [4] приведены данные о выявлении ДНК
вируса ИРТ при помощи ПЦР в образцах, получен-
ных от больных животных, а по данным [3]
точность выявления, например вируса иммуноде-
фицита человека, с помощью ПЦР-тестов состав-
ляет 98%, в то время как при использовании ИФА –
до 99,9%. Сравнительная оценка чувствительности
ИФА и ПЦР при идентификации вируса ИРТ также
свидетельствует о высокой чувствительности ИФА
[6].
Цель исследований – изучение влияния режи-
мов криоконсервирования и хранения производ-
ственных и вакцинных штаммов вируса ИРТ на
сохранность его инфекционности, антигенной
структуры и нуклеиновой кислоты с помощью
ИФА и ПЦР, обусловленное необходимостью
разработки эффективных способов сохранения
эталонных вакцинных и производственных
штаммов вирусов, на основе которых производятся
современные иммунобиологические препараты
для диагностики, лечения и профилактики
вирусного ИРТ, отвечающие требованиям Надле-
жащей производственной практики (GMP).
Материалы и методы
Исследовали вирус инфекционного рино-
трахеита – пустуллезного вульвовагинита крупного
рогатого скота: производственный штамм “Мол-
давский” и вакцинный “Монорин”, предостав-
ленные Институтом экспериментальной и клини-
ческой ветеринарной медицины УААН. Штаммы
хранились при умеренно низких температурах в
холодильнике (в диапазоне –18…–30°С) и в жид-
ком азоте (–196°С). Продолжительность хранения
составляла 2 года 6 месяцев при –196°С и от 8 ме-
сяцев до 19 лет 7 месяцев – при умеренно низких
температурах.
dine kinase enzyme or glycoproteins gB, gC, gD, gE
of this herpes virus [6] are applied. For genotype
differentiation of vaccine strain negative in respect of
glycoprotein E gene and wild strains of virus the
formulation method of PCR was designed [7].
IBRT antigens were revealed with solid phase
immune enzyme analysis (IEA). In field conditions
the IEA specificity to glycoproteins gB and gE makes
up to 96% [1] that confirms a wide antigen spectrum
of the virus.
Usually for PCR analysis of DNA-containing
viruses one pair of primers, which are complimentary
to a certain site of genome DNA is applied. In the
paper [4] there are presented the data about the
revealing of DNA virus of IBRT by means of PCR in
the samples obtained from sick animals and according
to the data [3] the accuracy of revealing for example
human immunodeficiency virus by PCR-tests makes
98% meanwhile as when using IEA it was up to 99.9%.
Comparative study of IEA and PCR sensitivity
during identification of IBRT virus corresponds also
to a high sensitivity of IEA [6].
The research aim is the studying of the effect of
cryopreservation protocols and storage of industrial
and vaccine strains of IBRT virus on preserving the
infectivity, antigen structure and nucleic acid using
IEA and PCR. It was necessary to develop effective
ways of preserving reference vaccine and industrial
virus strains on the base of those contemporary
immune biological formulations for diagnostics,
treatment and prophylaxis of IBRT are produced in
accordance with GMP requirements.
Materials and methods
Infectious bovine rhinotracheitis virus: pustulous
vulvovaginitis of the cattle, “Moldavsky” industrial
strain and “Monorin” vaccine one provided by the
Institute of Experimental and Clinical Veterinary
Medicine of Ukrainian Agricultural Academy of
Sciences were under investigation. The strains were
stored at moderately low temperatures in a refrigerator
(within the range from –18 to –30°C) and in liquid
nitrogen (–196°C). The storage duration was 30
months at –196°C and from 8 months to 235 months
under moderately low temperatures.
Virus-containing material was derived during virus
culturing on inoculated culture of sheep kidney cells
in stabilizing medium contained 50% of medium 199,
50% lactal albumin hydrolisate according to the
standard methods [6] after a complete destruction of
cell monolayer at cytopathic effect (CPE) ++++, then
infectious titres of virus suspensions were found and
packed into glass flasks for freezing and storage in
refrigerator and into 1 and 10 ml stainless steel con-
tainers (Special Designing and Technical Bureau with
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
164
Вируссодержащий материал получали культи-
вированием вирусов на перевиваемой культуре
клеток почки овцы в поддерживающей среде,
состоявшей из 50% среды 199, 50% гидролизата
лактальбумина, по стандартной методике [6] после
полного разрушения монослоя клеток при цитопа-
тическом действии (ЦПД) ++++, затем определяли
инфекционные титры вирусных суспензий и
расфасовывали материал в стеклянные флаконы
для замораживания и хранения в холодильнике, a
в металлические контейнеры из нержавеющей ста-
ли (СКТБ и ОП ИПКиК НАН Украины) емкостью
1 и 10 мл – для замораживания и хранения в
жидком азоте. В жидком азоте образцы заморажи-
вали прямым погружением контейнеров с неочи-
щенным вируссодержащим материалом со ско-
ростью 300-400°С/мин.
Все образцы размораживали на водяной бане
при 39-40°С в течение 1-2 мин. Размороженные об-
разцы вируса, хранившиеся при умеренно низких
температурах: штамм “Молдавский” от 30.07.2003
года, время хранения которого составляло 8 меся-
цев, и его образцы от 11.08.1984 года, продолжи-
тельность хранения – 19 лет 7 месяцев, а также
штамм “Монорин” от 09.02.1992 г. с продолжитель-
ностью хранения 11 лет 6 месяцев и образцы этого
штамма от 19.09. 2002 г., хранившиеся 1 год 6 меся-
цев, – пассировали на клеточной культуре MDBK
с добавлением 10% лошадиной сыворотки в тече-
ние трех суток.
Иммуноферментный анализ и полимеразную
цепную реакцию проводили на базе отдела вирусо-
логии Ветеринарного института г. Пулавы (Поль-
ша).
Гликопротеин В (gB) вируса ИРТ, хранившегося
при умеренно низких температурах, выявляли с
помощью ИФА с использованием стандартных
диагностических сывороток по методике [6] на
микропланшетах. Учет результатов иммунофер-
ментной реакции проводили по показаниям опти-
ческой плотности при длине волны 450 нм на
считывающем устройстве фирмы Dynex Technolo-
gies. Результат реакции считали позитивным, если
отношение оптической плотности исследуемого
материала и негативного контроля составляло не
меньше 2 [5]. Как положительный контроль в ИФА
использовали гликопротеин В (gB) нативного
вируса ИРТ.
Выявление нуклеиновой кислоты вируса осу-
ществляли методом ПЦР. Размороженные штаммы
пассировали в культуре клеток MDBK. При этом
наличие цитопатического эффекта свидетельст-
вовало о сохранении инфекционных свойств ви-
руса в процессе длительного его хранения в замо-
роженном состоянии. Экстракцию вирусной ДНК
проводили по стандартной методике [6].
Experimental Unit of the IPC&C) for freezing and sto-
rage in liquid nitrogen. The samples in liquid nitrogen
were frozen by direct plunging of the containers with
non-purified virus-containing material with the rate
of 300-400°C per minute.
All the samples were thawed on water bath during
1-2 min at 39-40°C. Thawed virus samples stored
under mode-rately low temperatures: “Moldavsky”
strain dated of July 30, 2007 the storage time of which
made 8 months and its sample of August 11th, 1984,
and storage dura-tion was 235 months as well as
“Monorin” strain of September 1992 with the storage
duration of 138 months was passed in MDBK cell
culture with adding 10% equine serum for 3 days.
Immune enzyme analysis and polymerase chain
reaction were performed at the base of Department of
Virusology at the Veterinary Institute in Pulawy (Po-
land).
Glycoprotein B (gB) of IBRT virus stored at mode-
rately low temperatures was revealed using IEA with
standard diagnostic sera according to the methods [6]
in microtrays. The records of results of immune enzy-
me reaction were performed on the indices of optical
density at 450 nm with the recording device (Dynex
Technologies). Reaction result is considered as positi-
ve if experimental sample vs. negative control optical
density ratio is higher than two. Glycoprotein B (gB)
of native IBRT virus was used in IEA as positive con-
trol.
The virus nucleic acid was revealed with PCR.
Thawed strains were passed in MDBK cell culture.
Herewith the presence of cytopathic effect testified to
the preservation of infectious properties of the virus
during its long-term storage in a frozen state.
Extraction of virus DNA was performed on the
standard method [6].
At PCR the starters for glycoproteid D (gD) of
IBRT virus were used:
D1 5’- GCTGTGGGAAGCGGTACG-3’
D2 5’ - GTCGACTATGGCCTTGTTGC-3’
PCR products were found with electrophoresis
method in polyacryl amide gel. The reactions of
restriction fragment length polymorphism (RFLP)
such restriction fragments as Hind III, Bg1, Ava I, Alu
I were used.
Results and discussion
Manifested cytopathic effect on cell culture in the
first passage was made by the virus strains stored
during 18 months as well as for 8 months within the
range from –18 to –30°C. Herewith cytopathic
changes were characterized with granulation and
rounding of the cells located by groups with their
following exfoliation from the glass and degeneration.
Slightly manifested CPE effect represented as the
monolayer granulation of MDBK culture with follo-
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
165
При ПЦР применяли стартеры для гликопро-
теида D (gD) вируса ИРТ:
D1 5'-GCTGTGGGAAGCGGTACG-3';
D2 5'-GTCGACTATGGCCTTGTGTGC-3'.
Продукты ПЦР обнаруживали методом электро-
фореза в полиакриламидном геле. В реакции опре-
деления полиморфизма длин рестрикционных
фрагментов (RFLP) применяли такие ферменты
рестрикции, как Hind III, Bgl I, Ava I, Alu I.
Результаты и обсуждение
Выраженное цитопатическое действие на куль-
туру клеток в первом пассаже оказывали штаммы
вируса, хранившиеся полтора года, а также в тече-
ние 8 месяцев в диапазоне температур от –18 до
–30°С. При этом цитопатические изменения харак-
теризовались зернистостью и округлением клеток,
расположенных группами, с последующим их от-
слоением от стекла и дегенерацией.
Нечетко выраженное ЦПД, проявившееся в
зернистости монослоя культуры MDBK с после-
дующей дегенерацией, наблюдали в первом
пассаже штамма “Монорин”, хранившегося при
умеренно низких температурах в течение 11 лет 6
месяцев. В клетках, инфицированных вирусом,
хранившимся в течение 19 лет 7 месяцев, ЦПД
отсутствовало.
Результаты пассирования штамма “Монорин”,
размороженного после 2 лет 6 месяцев хранения в
жидком азоте, показали выраженное ЦПД в кле-
точной культуре MDBK. Следовательно, инфек-
ционные свойства штаммов вируса, хранившихся
при умеренно низких температурах до полутора
лет, и вирусов, хранившихся два с половиной года
в жидком азоте, проявляются в виде характерного
ЦПД на чувствительную культуру клеток.
Важным условием при работе с вирусами в про-
цессе производства иммунобиологических препа-
ратов является сохранность исходной антигенной
структуры вирусного сырья. Поэтому мы изучали
сохранность антигенной структуры вируса после
замораживания, хранения и отогрева в сравнении
с исходной.
Проведенный иммуноферментный анализ пока-
зал, что оптическая плотность исследованных об-
разцов не превышала более чем в 2 раза плотности
негативного контроля. Это свидетельствует об
отсутствии gB у вируса ИРТ после замораживания
и хранения. Очевидно, что гликопротеин В при
замораживании в указанных режимах не сохра-
няется в структуре вируса.
Следующим этапом работы было исследование
влияния использованных режимов замораживания
и хранения на сохранность нуклеотидных последо-
вательностей генома вируса методом ПЦР. Фраг-
wing degeneration was observed in the first passage
of “Monorin” strain stored at moderately low tempe-
ratures for 138 months. In the cells infected with the
virus stored for 235 months the CPE was absent.
The results of the passage of “Monorin” strain
thawed after 30 months storage in liquid nitrogen have
shown the manifested CPE in MDBK cell culture. So,
infectious properties of virus strains being stored up
to 18 months at moderately low temperatures and those
stored for 30 months in liquid nitrogen are manifested
as characteristic CPE on cell sensitive culture.
An important condition when working with the
viruses in the production process of immune biological
preparations is the integrity of initial antigen structure
of virus raw materials. Therefore we have studied the
integrity of virus antigen structure after freezing-
storage if compared with initial one.
Performed immune enzyme analysis has shown that
optical density of the studied samples did not exceed
more than twice the density of negative control. This
testifies to the absence of gB in IBRT virus after
freezing and storage.
It is obvious that glycoprotein B during freezing
with the mentioned above regimens is not preserved
in virus structure.
The next stage of work was the study of used
freezing and storage regimens on the intensity of virus
genome nucleotide sequences by PCR. D1 and D2
fragments of genome of IBRT virus were amplified
on the matrix of virus DNA isolated from native and
cryopreserved samples. During the performing of the
reaction with D1 and D2 primers there was obtained
the amplification product with the size of 466 base
pairs. In the samples with “Moldavsky” strain date of
August 11, 1984 no amplification products were
successfully obtained.
Specificity of obtained product was confirmed with
restriction analysis with Hind III, Bgl I, Ava I, Alu I
restriction endonucleases for DNA fragment, obtained
from “Monorin” strains dated of September 19, 2002;
“Moldavsky” date of July, 30 2003, stored at mode-
rately low temperatures (Fig. 1).
Amplification products of DNA fragment was also
obtained for “Monorin” strain stored at –196°C for
30 months. “Cooper” reference strain served as
positive control (Fig. 2). In this case for hydrolysis
Hind III enzyme was used. Analysis of restriction
fragment length (RFLP) confirmed the specificity of
obtained DNA site (Fig. 3).
Conclusions
The performed studies that infective properties ma-
nifested in characteristic for this virus CPE were ob-
served in the viruses stored for 8 months “Moldavsky”
and for 18 months “Monorin” strains within the
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
166
менты D1 и D2 генома вируса ИРТ амплифициро-
вали на матрице вирусной ДНК, выделенной из
нативного и криоконсервированных образцов. При
проведении реакции с праймерами D1 и D2 был
получен продукт амплификации размером 466 пар
оснований. В образцах со штаммом “Молдавский”
от 11.08.1984 года не удалось получить продуктов
амплификации.
Специфичность полученного продукта была
подтверждена с помощью рестрикционного анали-
за с эндонуклеазами рестрикции Hind III, Bgl I,
Ava I, Alu I для фрагмента ДНК, полученного из
штаммов “Монорин” от 09.02.1992 года и “Мо-
норин” от 19.09.2002 года; “Молдавский” от
30.07.2003 года, хранившихся при умеренно
низких температурах (рис. 1).
Продукты амплификации фрагмента ДНК
также были получены для штамма “Монорин”,
хранившегося при –196°С в течение 2 лет 6 меся-
цев. Положительным контролем служил референт-
ный штамм Cooper (рис.2). В этом случае для
гидролиза использовали фермент Hind III. Анализ
длины рестрикционных фрагментов (RFLP)
подтвердил специфичность полученного участка
ДНК (рис. 3).
M 1 2 3 4
Рис. 1. Рестрикционный анализ продуктов ПЦР.
Дорожки: М-маркер; 1-4 – продукт амплификации (466
пар оснований) при использовании энзимов рестрикции
Hind III, Bgl I, Ava I, Alu I.
Fig. 1. Restriction analysis of PCR products. Trace strips:
M-marker, 1-4 – amplification subsistence (466 base pairs)
at using Hind III, Bg1 I, Ava I, Alu I restriction enzymes.
Рис. 2. Продукты амплификации фрагмента ДНК для
штамма “Монорин”, хранившегося при –196°С в тече-
ние 2 лет 6 месяцев и референтного штамма “Cooper”.
Дорожки: M – маркер; 1 – штамм “Монорин”; 2 –
отрицательный контроль; 3 –референтный штамм
“Cooper”
Fig. 2. Amplification products of DNA fragments for
“Monorin” strain stored at –196°C during 30 months, and
“Cooper” reference strain. Trace strips: M – marker, 1 –
“Monorin” strain; 2 – negative control; 3 – “Cooper” refer-
ence strain.
M 1 2 3
Рис. 3. RFLP штаммов BHV1, рестрикция ферментом
Hind III. Дорожки: M – маркер; 1-штамм “Cooper”; 2 –
штамм “Монорин; 3-7 – территориальные изоляты.
Fig. 3. RFLP BHV1 strains, by Hind III enzyme restriction.
Lanes: M – marker, 1 – “Cooper” strain; 2 – “Monorin”
strain; 3-7 – territorial isolates.
M 1 2 3 4 5 6 7
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
167
temperature range from –18 down to –30°C as well as
the strain “Monorin” stored in liquid nitrogen for 30
months.
Studying of the integrity of glycoprotein gB using
IEA in the samples stored at moderately low tempera-
tures has demonstrated negative result. Since the IEA
is highly sensitive method it may be concluded that
during the processes of freezing and storage under
moderately low temperatures either loss or destruc-
tion of gB of the IBRT virus took place. Glycoprotein
B during freezing using the proposed regimens is not
likely preserved in virus structure.
Investigations of the effect of low temperature pres-
ervation at –196°C and within the temperature range
from –18 down to –30°C on the integrity of DNA struc-
ture have proved that specificity of amplified frag-
ment of DNA is confirmed for all the studied samples
except the “Moldavsky” strain stored for 235 months
within the range of –18 down to –30°C. Therefore in
the rest samples stored using the proposed by us freez-
ing regimens the specific DNA fragments correspond-
ing to the primers D1 and D2 for this virus were pre-
served.
Выводы
Проведенные исследования показали, что ин-
фекционные свойства, проявлявшиеся характер-
ным для данного вируса ЦПД, наблюдались у ви-
русов, хранившихся в течение 8 месяцев штамма
“Молдавский” и 1 год 6 месяцев штамма “Моно-
рин” в диапазоне температур от –18 до –30°С, а
также штамма “Монорин”, хранившегося в жид-
ком азоте в течение двух с половиной лет.
Изучение сохранности гликопротеина gB с
помощью ИФА в образцах, хранившихся при
умеренно низких температурах, показало отрица-
тельный результат. Поскольку ИФА – высокочув-
ствительный метод, можно сделать вывод, что в
процессе замораживания и хранения в условиях
умеренно низких температур произошла потеря
или разрушение gB вируса ИРТ. Очевидно, что
гликопротеин В при замораживании с использо-
ванием предложенных режимов не сохраняется в
структуре вируса.
Исследования влияния низкотемпературного
хранения при –196°С и в диапазоне от –18 до
–30°С на сохранность структуры ДНК показали,
что специфичность амплифицированного фраг-
мента ДНК подтверждена для всех исследованных
образцов, кроме штамма “Молдавский”, хранив-
шегося 19 лет 7 месяцев при температурах в диа-
пазоне от –18 до –30°С. Следовательно, во всех
остальных образцах, хранившихся с использова-
нием предложенных нами режимов заморажива-
ния, были сохранены специфические фрагменты
ДНК соответствующие праймерам D1 и D2 для
данного вируса.
Литература
Волосянко О.В. Засоби діагностики та профілактики інфек-
ційного ринотрахеїту великої рогатої худоби в Україні: Авто-
реф. дис. ... д-ра ветеринарних наук.– Харків, 2003.– 46 с.
Гусева Е.В. Практический каталог современной классифи-
кации возбудителей наиболее распространенных болезней
животных и птиц.– Владимир, 2002.– 121 c.
Дикий И.Л., Стегний М.Ю., Стегний Б.Т. и др. Микро-
биология. Лабораторная диагностика вирусных и прионных
инфекций: Метод. рекомендации.– Харьков, 2002.– 17 с.
Жираковская Е.В., Орешкова С.Ф., Глотов А.Г. и др.
Дифференциация изолятов вируса ИРТ КРС с помощью
ПЦР-ПДРФ анализа // Ветеринария.– 2004.– №11.–
С. 17-21.
Кузнецов Д.П., Самуйленко А.Я., Кузнецова С.В. и др.
Диагностика инфекционного ринотрахеита крупного
рогатого скота методом иммуноферментного анализа //
Ветеринария.– 1990.– №10.– С. 59-60.
Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial
Animals.– Paris, 2004.– Vol. 1.– 1178 p.
Schynts F., Baranowski E., Lemaire M., Thiry E. A specific
PCR to differentiate between gE negative vaccine and wildtype
bovine herpesvirus type 1 strains // Vet. Microbiol.– 1999.–
Vol. 66, N3.– P. 187-195.
Поступила 10.02.2006
References
Volosyanko O.V. Diagnostic and prophylactic methods of trace
strip of cattle in Ukraine. Author’s abstract of thesis of doctor
of veterinary sciences. Kharkov, 2003.– 46 p.
Guseva E.V. Practical catalogue of the agents of modern
classification of the most widespread diseases in the animals
and birds.– Vladimir, 2002. – 121 p.
Dikiy I.L., Stegniy M.Yu., Stegniy B.T. et al. Microbiology.
Laboratory diagnostics of viral and prion infections. Methodical
recommendations.– Kharkov, 2002. – 17 p.
Zhirakovskaya E.V., Oreshkova S.F., Glotov A.G et al. Differen-
tiation of cattle infectious rhinotracheitis virus isolates by
means of PCR-RFLP analysis // Veterinariya.– 2004.– N11.–
P. 17-21.
Kuznetsov D.P., Samuylenko A.Ya., Kuznetsova S.V. et al.
Diagnostic of trace of cattle infectious rhinotracheitis with
immunoenzyme analysis method // Veterinariya.– 1990.–
N10.– P. 59-60.
Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial
Animals.– Paris, 2004.– Vol. 1.– 1178 p.
Schynts F., Baranowski E., Lemaire M., Thiry E. A specific
PCR to differentiate between gE negative vaccine and wildtype
bovine herpesvirus type 1 strains // Vet. Microbiol.– 1999.–
Vol. 66, N3.– P. 187-195.
Accepted in 10.02.2006
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №2
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №2
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-138041 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-02T01:21:38Z |
| publishDate | 2007 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Стегний, М.Ю. Гольцев, А.Н. Стегний, Б.Т. 2018-06-17T21:28:28Z 2018-06-17T21:28:28Z 2007 Изучение влияния низких температур на сохранность инфекционности антигенной структуры и ДНК вируса инфекционного ринотрахеита / М.Ю. Стегний, А.Н. Гольцев, Б.Т. Стегний // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 2. — С. 162-167. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138041 57.043;578.71 Исследовано влияние замораживания и длительного хранения при умеренно низких температурах и в жидком азоте на сохранность инфекционных свойств, антигенной структуры и ДНК вакцинного и производственного штаммов вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота. Установлено, что инфекционность в первом пассаже проявляли вирусы, хранившиеся в течение восьми месяцев и полутора лет при умеренно низких температурах, а также в течение двух с половиной лет в жидком азоте. Иммуноферментный анализ показал отсутствие гликопротеина В в размороженных образцах вируса, хранившихся в диапазоне температур от –18 до –30°С. Специфичность амплифицированного фрагмента ДНК подтверждена методом полимеразной цепной реакции для всех исследованных образцов вируса ИРТ. Досліджено вплив заморожування і тривалого зберігання при помірно низьких температурах і в рідкому азоті на збереженість інфекційних властивостей, антигенної структури і ДНК вакцинного і виробничого штамів вірусу інфекційного ринотрахеїту (ІРТ) великої рогатої худоби. Установлено, що інфекційність у першому пасажі виявляли віруси, що зберігалися протягом восьми місяців і півтора роки при помірно низьких температурах, а також протягом двох з половиною років у рідкому азоті. Імуноферментний аналіз показав відсутність глікопротеїну В у розморожених зразках вірусу, які зберігалися в діапазоні температур від –18 до –30°С. Специфічність ампліфікованого фрагмента ДНК підтверджена методом полімеразної ланцюгової реакції для всіх досліджених зразків вірусу ІРТ. Effect of freezing and long-term storage at moderately low temperatures and in liquid nitrogen on the integrity of infectious properties, antigen structure and DNA of vaccine and industrial strains of infectious bovine rhinotracheitis (IBRT) was studied. It has been established that infectivity in the first passage was expressed by the viruses stored for 8 months and 18 months under moderately low temperatures as well as for 30 months in liquid nitrogen. Immune enzyme analysis has shown the absence of glycoprotein B in thawed virus samples, stored within the range from –18 to –30°C. Specificity of amplified DNA fragment is confirmed by PCR for all studied samples of IBRT virus. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Криоконсервирование биообъектов Изучение влияния низких температур на сохранность инфекционности антигенной структуры и ДНК вируса инфекционного ринотрахеита Study of low temperature effect on preservation of infectivity, antigen structure and DNA of infectious rhinotracheitis virus Article published earlier |
| spellingShingle | Изучение влияния низких температур на сохранность инфекционности антигенной структуры и ДНК вируса инфекционного ринотрахеита Стегний, М.Ю. Гольцев, А.Н. Стегний, Б.Т. Криоконсервирование биообъектов |
| title | Изучение влияния низких температур на сохранность инфекционности антигенной структуры и ДНК вируса инфекционного ринотрахеита |
| title_alt | Study of low temperature effect on preservation of infectivity, antigen structure and DNA of infectious rhinotracheitis virus |
| title_full | Изучение влияния низких температур на сохранность инфекционности антигенной структуры и ДНК вируса инфекционного ринотрахеита |
| title_fullStr | Изучение влияния низких температур на сохранность инфекционности антигенной структуры и ДНК вируса инфекционного ринотрахеита |
| title_full_unstemmed | Изучение влияния низких температур на сохранность инфекционности антигенной структуры и ДНК вируса инфекционного ринотрахеита |
| title_short | Изучение влияния низких температур на сохранность инфекционности антигенной структуры и ДНК вируса инфекционного ринотрахеита |
| title_sort | изучение влияния низких температур на сохранность инфекционности антигенной структуры и днк вируса инфекционного ринотрахеита |
| topic | Криоконсервирование биообъектов |
| topic_facet | Криоконсервирование биообъектов |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138041 |
| work_keys_str_mv | AT stegniimû izučenievliâniânizkihtemperaturnasohrannostʹinfekcionnostiantigennoistrukturyidnkvirusainfekcionnogorinotraheita AT golʹcevan izučenievliâniânizkihtemperaturnasohrannostʹinfekcionnostiantigennoistrukturyidnkvirusainfekcionnogorinotraheita AT stegniibt izučenievliâniânizkihtemperaturnasohrannostʹinfekcionnostiantigennoistrukturyidnkvirusainfekcionnogorinotraheita AT stegniimû studyoflowtemperatureeffectonpreservationofinfectivityantigenstructureanddnaofinfectiousrhinotracheitisvirus AT golʹcevan studyoflowtemperatureeffectonpreservationofinfectivityantigenstructureanddnaofinfectiousrhinotracheitisvirus AT stegniibt studyoflowtemperatureeffectonpreservationofinfectivityantigenstructureanddnaofinfectiousrhinotracheitisvirus |