Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500

Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500

Saved in:
Bibliographic Details
Published in:Проблемы криобиологии и криомедицины
Date:2005
Main Authors: Бабийчук, Л.А., Рязанцев, В.В., Зубов, П.М., Тимченко, О.Л.
Format: Article
Language:Russian
Published: Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2005
Subjects:
Биологические особенности криоконсервированных клеток крови и их применение в медицине
Online Access:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138174
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500 / Л.А. Бабийчук, В.В. Рязанцев, П.М. Зубов, О.Л. Тимченко // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 3. — С. 556–560. — Бібліогр.: 9 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-138174
record_format dspace
spelling Бабийчук, Л.А.
Рязанцев, В.В.
Зубов, П.М.
Тимченко, О.Л.
2018-06-18T10:24:03Z
2018-06-18T10:24:03Z
2005
Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500 / Л.А. Бабийчук, В.В. Рязанцев, П.М. Зубов, О.Л. Тимченко // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 3. — С. 556–560. — Бібліогр.: 9 назв. — рос.
0233-7673
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138174
611.018.5.013.8:615.014.41:547.42
ru
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Проблемы криобиологии и криомедицины
Биологические особенности криоконсервированных клеток крови и их применение в медицине
Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500
spellingShingle Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500
Бабийчук, Л.А.
Рязанцев, В.В.
Зубов, П.М.
Тимченко, О.Л.
Биологические особенности криоконсервированных клеток крови и их применение в медицине
title_short Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500
title_full Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500
title_fullStr Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500
title_full_unstemmed Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500
title_sort новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500
author Бабийчук, Л.А.
Рязанцев, В.В.
Зубов, П.М.
Тимченко, О.Л.
author_facet Бабийчук, Л.А.
Рязанцев, В.В.
Зубов, П.М.
Тимченко, О.Л.
topic Биологические особенности криоконсервированных клеток крови и их применение в медицине
topic_facet Биологические особенности криоконсервированных клеток крови и их применение в медицине
publishDate 2005
language Russian
container_title Проблемы криобиологии и криомедицины
publisher Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
format Article
issn 0233-7673
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138174
citation_txt Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500 / Л.А. Бабийчук, В.В. Рязанцев, П.М. Зубов, О.Л. Тимченко // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 3. — С. 556–560. — Бібліогр.: 9 назв. — рос.
work_keys_str_mv AT babiičukla novyemetodykriokonservirovaniâkordovoikrovičelovekapodzaŝitoinepronikaûŝegokrioprotektorapoliétilenoksidamm1500
AT râzancevvv novyemetodykriokonservirovaniâkordovoikrovičelovekapodzaŝitoinepronikaûŝegokrioprotektorapoliétilenoksidamm1500
AT zubovpm novyemetodykriokonservirovaniâkordovoikrovičelovekapodzaŝitoinepronikaûŝegokrioprotektorapoliétilenoksidamm1500
AT timčenkool novyemetodykriokonservirovaniâkordovoikrovičelovekapodzaŝitoinepronikaûŝegokrioprotektorapoliétilenoksidamm1500
first_indexed 2025-11-25T22:23:57Z
last_indexed 2025-11-25T22:23:57Z
_version_ 1850563345619353600
fulltext 556ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №3 УДК 611.018.5.013.8:615.014.41:547.42 Новые методы криоконсервирования кордовой крови человека под защитой непроникающего криопротектора полиэтиленоксида м.м. 1500 Л.А. БАБИЙЧУК, В.В. РЯЗАНЦЕВ, П.М. ЗУБОВ, О.Л. ТИМЧЕНКО Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Адрес для корреспонденции: Бабийчук Л.А., Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38 (057) 373-31-26, факс: +38 (057) 373-30-84, e-mail: cryo@online.kharkov.ua В последнее время кордовая кровь (КК) и полученные из нее препараты находят все большее применение в клинической практике. Все чаще кордовая кровь используется как альтернативный костному мозгу источник гемопоэтических стволовых клеток [9]. Причем в клинических целях используется как концентрат ядросодержащих клеток, так и цельная кордовая кровь, в которой содержится большое количество эритроцитов, ядросодержащих клеток, а также биологически активных веществ плазмы кордовой крови. В связи с этим возникает необходимость создания банков кордовой крови и полученных из нее клеточных препаратов. Решение этой задачи возможно только при долгосрочном хранении клеток в замороженном состоянии. Поэтому разработка методов криоконсервирования кордовой крови является актуальной проблемой крио- биологии. В настоящее время наиболее широко исполь- зуемым методом для криоконсервирования ядросодержащих клеток КК является метод с применением криопротектора ДМСО [8]. Однако ДМСО, хорошо проникающийо в клетки, обуслов- ливает необходимость его удаления после размораживания. Это существенно усложняет процедуру получения качественных деконсер- вированных клеток и приводит к потере части клеток в процессе отмывания. Проблема криоконсервирования цельной КК является более сложной. Это связано с тем, что во-первых, для эритроцитов и ядросодержащих клеток, входящих в состав цельной КК, эффектив- ными для криоконсервирования являются как различные типы криопротекторов, так и различные режимы замораживания [4]; во-вторых, при криоконсервировании цельной КК использование проникающих криопротекторов делает невозмож- ным сохранить в одном препарате ядросодер- жащие клетки КК и эритроциты, так как при отмывании криопротектора из размороженной суспензии клеток остаются только эритроциты, а теряются плазма и ядросодержащие клетки. Поэтому наиболее перспективным для криокон- сервирования ядросодержащих клеток КК и особенно цельной КК является разработка безотмывочных методов криоконсервирования с использованием непроникающих в клетку крио- протекторов. В наших предыдущих работах было показано, что среди различных непроникающих криопро- текторов наиболее эффективным для криозащиты эритроцитов донорской крови человека является полиэтиленоксид с м.м. 1500 (ПЭО-1500) [4]. Однако, при работе с данным криопротектором, также как и с другими непроникающими криопро- текторами необходимо соблюдать определенные условия для избежания осмотического и темпера- турного шока клеток. В связи с этим нами были проведены иссле- дования механизмов температурно-осмотической стабилизации клеток к действию криопротекторов и низких температур. На модели эритроцитов установлено, что важная роль в механизмах стабилизации клеток к действию факторов криоконсервирования принадлежит белкам цито- скелета клеток [6]. Показано, что направленность структурной модификации плазматических мембран и белков цитоскелета клеток опреде- ляется влиянием температуры и уровнем дегидра- тации на системы, регулирующие их структурно- функциональное состояние. Это связано с измене- нием концентрации внутриклеточного Са2+ и уровнем фосфорилирования белков [1]. На основании этих фундаментальных исследо- ваний обоснованы новые подходы для направ- ленной модификации структурно-функционального состояния клеток на начальных этапах перед криоконсервированием с целью повышения их устойчивости к замораживанию-отогреву. Разра- ботаны оптимальные условия для структурной стабилизации эритроцитов, заключающиеся в предварительной холодовой инкубации клеток и дозированном введении криопротектора. На основании принципа “холодовой” стабилизации разработан безотмывочный метод криокон- сервирования эритроцитов под защитой непро- никающего криопротектора ПЭО-1500 [3], который позволяет в значительной степени повысить устойчивость клеток к замораживанию-отогреву и сохранять их структурно-функциональные показатели на достаточно высоком уровне [2]. 557ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №3 Цель исследования – разработка безотмы- вочных методов криоконсервирования суспензии ядросодержащих клеток кордовой крови и цельной кордовой крови для сохранения в ней клеток различного типа (эритроцитов, ядросодержащих клеток). Материалы и методы В работе использовалась КК человека, получен- ная из вены пульсирующей пуповины, заготов- ленная на общепринятом глюкозо-цитратном растворе. КК замораживали в день взятия крови или после ее хранения при постоянной температуре 2-4°С в течение 48 часов. Объем кордовой крови меньше 60 мл в работе не использовался. Выделение фракции ядросодержащие клетки из кордовой крови проводили с помощью центри- фугирования цельной крови при 200 g в течение 20 минут с последующим фракционированием и отделением слоя ядросодержащих клеток. В части экспериментов ядросодержащие клетки выде- лялись стандартным фикольным методом. В качестве криопротектора использовали 30% раствор ПЭО-1500, приготовленный на физио- логическом растворе NaCl и 0,01 М фосфатном буфере. Добавление криопротектора к суспензии клеток проводили дозировано при низкой положи- тельной температуре 1:1 по объему. Контролем сравнения служили пробы, обработанные крио- протектором при комнатной температуре. Затем взвесь клеток переносили в специальные крио- пробирки фирмы Nunc для замораживания. Замораживание проводили до –196°С по специально разработанной нами индивидуальной для каждого объекта (цельная КК и ядросодер- жащие клетки) двухэтапной программе. Оттаива- ние производили при 42-44°С в водяной термо- статируемой бане при постоянном покачивании. После размораживания цельной КК определяли уровень гемолиза клеток и основные структурно- функциональные показатели эритроцитов – АТФ [7] и 2,3-ДФГ [5]. Биологически активные вещества плазмы КК измеряли с использованием лабораторных тест- систем методом иммуноферментного анализа. Исследование ядросодержащих клеток (CD45+) КК, в том числе и гемопоэтических (CD34+) до и после криоконсервирования были проведены методом проточной цитофлуориметрии на проточ- ном цитометре FACS Calibur фирмы Becton Dickinson (США) с использованием реагентов Becton Dickinson по международному ISHAGE протоколу. Результаты и обсуждение Проведенные исследования показали, что разработанный метод криоконсервирования цельной КК с непроникающим криопротектором ПЭО-1500 с использованием “холодовой” обработ- ки клеток и специальной двухэтапной программы замораживания позволяет сохранять до 96% эритроцитов после размораживания, при этом основные функциональные показатели клеток (АТФ и 2,3-ДФГ) сохраняются на уровне контрольных величин (рис. 1). Биологически активные вещества плазмы КК (трийодтиронин, тироксин, тирео- тропный гормон, тестостерон и α-фетопротеин) полностью сохраняются после криоконсерви- рования (таблица). Исследование ядросодержащих клеток (CD45+) КК, в том числе и гемопоэтических (CD34+/CD45+), до и после размораживания показало, что разработанный метод криокон- сервирования цельной КК позволяет сохранять после размораживания до 80% CD45+-клеток по отношению к контролю. Сохранность же CD34+- клеток еще более высокая и составляет 86% от контроля (рис. 2), что может свидетельствовать о большей криоустойчивости популяции CD34+- клеток по отношению к CD45+-клеткам. При этом Содержание биологически активных веществ в плазме после криоконсервирования цельной кордовой крови еыньлатнемирепскЭ яиволсу втсещевеинажредоС л/Mн,норетсотсеТ ,ниноритдойирТ л/Mн л/Mн,нискориТ йынпортоериТ л/ЕМ,номрог α ,ниеторпотеф- л/гм яаксронод(ьлортноK )амзалп 2,2-5,0 8,2-2,1 061-06 0,4-5,0 02 яаводрокяанвитаН амзалп 0,5 1,1 56 7,4 0033 елсопамзалпяаводроK яинаворивреснокоирк C°691-ирп 8,4 1,1 16 6,4 0592 558ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №3 Рис. 1. Содержание АТФ (а) и 2,3-ДФГ (б) в изолирован- ных эритроцитах и в составе цельной кордовой крови после криоконсервирования С ПЭО-1500: 1 – контроль, нативные клетки; 2 – холодовая дозированная обработка клеток криопротектором ПЭО-1500; 3 – обработка клеток ПЭО-1500 при комнатной температуре; 4 – холодовая дозированная обработка клеток ПЭО-1500 и замора- живание по двухэтапной программе; 5 – обработка клеток ПЭО-1500 при комнатной температуре и замо- раживание по двухэтапной программе. 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 4 1 2 3 4 5 1 2 4 Цельная кровь Эритроциты АТ Ф , м кМ /г H b 12,5 12,6 12,7 12,8 12,9 13 13,1 13,2 13,3 13,4 13,5 1 2 3 4 5 1 2 4 Цельная кровь Эритроциты 2, 3- ДФ Г, м кМ /г H b а б Рис. 2. Сохранность ядросодержащих клеток (CD45+) (а) и CD34+-клеток (б) при криоконсервировании цельной кордовой крови в зависимости от способа обработки и режима замораживания (данные представлены в % от контроля): 1-5 как на рис. 1; 6 – холодовая дозированная обработка клеток ПЭО-1500 и замораживание погруже- нием в жидкий азот; 7 – обработка клеток ПЭО-1500 при комнатной температуре и замораживание погружением в жидкий азот. 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 С ох ра нн ос ть к ле то к, % 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 С хр ан но ст ьл к ле то к, % а б использование процедуры “холодовой” обработки клеток цельной КК ПЭО-1500 обеспечивает максимальные уровни сохранности после размора- живания как эритроцитов, так и ядросодержащих клеток по сравнению со способом обработки ПЭО- 1500 при комнатной температуре (рис.2, группы 4 и 5). Для сравнения также был использован общепринятый метод криоконсервирования доно- рской крови погружением в жидкий азот при –196°С, который показал более низкие показатели сохранности CD45+ и CD34+/CD45+ клеток цельной КК (рис.2, группы 6 и 7). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что разработанный безотмы- вочный метод криоконсервирования цельной кордовой крови обеспечивает высокую сохран- ность одновременно в препарате двух типов клеток (эритроциты, ядросодержащие клетки, в том числе и гемопоэтические CD34+-клетки) и биологически активных веществ плазмы кордовой крови. Нами был также разработан безотмывочный метод криоконсервирования концентрата ядросо- держащих клеток, выделенных из КК человека. Метод концентрирования ядросодержащих клеток 559ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №3 Рис. 3. Сохранность CD45+-клеток при криоконсерви- ровании концентрата ядросодержащих клеток в зависи- мости от способа обработки клеток криопротектором ПЭО-1500 и режима замораживания (данные представ- лены в % от контроля): обозначения групп см. рис. 1 и 2. 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 С ох ра нн ос ть к ле то к, % Рис. 4. Сохранность CD34+-клеток при криоконсервиро- вании концентрата ядросодержащих клеток в зависи- мости от способа обработки и режима замораживания (а – данные представлены в % от контроля, б – количество клеток в мкл суспензии): – фиколл; – концентрат; обозначения групп см. рис. 1 и 2. 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 С ох ра нн ос ть к ле то к, % 0 50 100 150 200 250 1 2 3 4 5 6 7 ко ли че ст во к ле то к а б КК позволил добиться более высокого удельного содержания ЯСК и особенно CD34+-клеток по сравнению с цельной КК и даже с традиционным методом выделения мононуклеаров с помощью Ficoll, в частности, по нашему способу концент- рирование достигается в среднем в 3,5 раза по сравнению с первоначальным содержанием CD34+- клеток в цельной КК. В дальнейших исследованиях для криоконсервирования концентрата ядросо- держащих клеток КК также был применен метод холодовой обработки клеток ПЭО-1500 и создан специальный режим двухэтапного замораживания до –196°С. Данный метод позволяет сохранять после размораживания до 75% CD45+-клеток (рис. 3) и до 83% CD34+-клеток (рис. 4, а). Важно отметить, что такая сохранность CD34+-клеток значительно выше их удельного содержания в концентрате клеток, полученного с помощью Ficoll и заморо- женного с ПЭО-1500 в таких же условиях (рис. 4, б), что свидетельствует о более высоком качестве концентрата ядросодержащих клеток, полученного и криоконсервированного нашим методом, хотя у нас отмечается некоторая примесь эритроцитов. Еще одним положительным результатом использования метода криоконсервирования с ПЭО-1500 является отмеченная более высокая сохранность после криконсервирования гемопоэ- тических клеток CD34+ по отношению к ядросо- держащим клеткам CD45+, что позволяет говорить о большей криоустойчивости популяций гемопоэ- тических стволовых клеток в данных условиях. Выводы 1. Разработан безотмывочный метод криокон- сервирования цельной кордовой крови, основанный на применении непроникающего криопротектора ПЭО-1500 в сочетании с “холодовой” обработкой клеток перед замораживанием и специальной двухэтапной программой замораживания, который обеспечивает высокую сохранность одновременно в препарате двух типов клеток (эритроциты, ядросодержащие клетки, в том числе гемопоэ- тические) и биологически активных веществ плазмы кордовой крови. 2. Разработан безотмывочный метод криокон- сервирования концентрата ядросодержащих клеток с использованием криопротектора ПЭО- 1500, “холодовой” обработки клеток и специально разработанной для ядросодержащих клеток по двухэтапной программе . 3. При криоконсервировании как цельной КК, так и концентрата ядросодержащих клеток, разработанными безотмывочными методами, 560ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №3 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №3 обнаружена более высокая сохранность гемопоэ- тических клеток (CD34+) по отношению к CD45+- клеткам, что свидетельствует о большей крио- устойчивости популяции гемопоэтических стволо- вых клеток. Литература Бабийчук Л.А., Землянских Н.Г., Белоус А.М. Влияние полиэтиленоксида и сахарозы на содержание Са2+ и фосфорилирование белков спектрин-актинового комп- лекса эритроцитов при охлаждении и замораживании- отогреве // Проблемы криобиологии.– 1995.– №2.– С. 9-14. Бабійчук Л.О., Землянських Н.Г., Кузьміна Л.М. Новий метод кріоконсервування еритроцитів для клінічної практики // Трансплантологія.– 2000.– Т.1, №1.– С. 296-298. Пат. України № 30888 А Спосіб кріоконсервування еритроцитів / Л.О. Бабійчук, В.І. Грищенко, С. Сумида та ін. Заявл. 16.06.98. Опубл. 15.12.2000.– Бюл. № 7.– С. 1.20. Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы.– Киев: Наукова думка, 1978.– 204 с. Шарова Ю.А., Бирюкова Т.В., Шаноян С.А. Нефер- ментативный метод определения 2,3-дифосфоглице- риновой кислоты эритроцитов и возможности его использования в клинической практике // Лаб. дело.– 1978.– №7.– С. 413-415. Babiychuk L.A., Zemlyanskikh N.G., Belous A.M. The role of cytoskeletal proteins in cell stability // Cell Biol. Int.– 1997.– Vol.21, N12.– P. 847-849. Beutler E. Red cell metabolism: A manual of biochemical methods.– New York, 1975.– 160 p. U.S. Patent 5.004.681. Preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood / Boyse E.A., Broxmeyer H.E., Douglas G.W (1991) Broxmeyer H.E., Douglas G.W., Hangoc G. et al. Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.– 1989.– Vol. 86.– Р. 3828-3832. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Similar Items