Влияние быстрого двухступенчатого замораживания на сохранность клеток костного мозга
Теоретически рассчитано переохлаждение внутриклеточного раствора костного мозга мыши при охлаждении клеточной суспензии с постоянной скоростью и при быстром двухступенчатом замораживании. На основании проведенных расчетов и экспериментов определены оптимальные условия криоконсервирования этих клеток...
Gespeichert in:
| Datum: | 2007 |
|---|---|
| 1. Verfasser: | |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2007
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138196 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Влияние быстрого двухступенчатого замораживания на сохранность клеток костного мозга / М.В. Останков // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 3. — С. 283-289. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-138196 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1381962025-02-23T17:51:02Z Влияние быстрого двухступенчатого замораживания на сохранность клеток костного мозга Effect of rapid two-step freezing on bone marrow cell integrity Останков, М.В. Криоконсервирование биообъектов Теоретически рассчитано переохлаждение внутриклеточного раствора костного мозга мыши при охлаждении клеточной суспензии с постоянной скоростью и при быстром двухступенчатом замораживании. На основании проведенных расчетов и экспериментов определены оптимальные условия криоконсервирования этих клеток под защитой диметилсульфоксида. Теоретично розраховано переохолодження внутрішньоклітинного розчину кісткового мозку миші при охолодженні клітинної суспензії з постійною швидкістю та при швидкому двоступінчастому заморожуванні. На основі проведених розрахунків і експериментів визначено оптимальні умови кріоконсервування цих клітин під захистом диметилсульфоксиду. Supercooling of murine bone marrow intracellular solution under cell suspension cooling with a constant rate and at a rapid twostep freezing has been theoretically calculated. The optimal conditions for these cells cryopreservation under dimethyl sulfoxide protection have been determined, basing on the calculations and experiments performed. 2007 Article Влияние быстрого двухступенчатого замораживания на сохранность клеток костного мозга / М.В. Останков // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 3. — С. 283-289. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138196 576.5:57.043.086.13:577.352 ru Проблемы криобиологии и криомедицины Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Криоконсервирование биообъектов Криоконсервирование биообъектов |
| spellingShingle |
Криоконсервирование биообъектов Криоконсервирование биообъектов Останков, М.В. Влияние быстрого двухступенчатого замораживания на сохранность клеток костного мозга Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Теоретически рассчитано переохлаждение внутриклеточного раствора костного мозга мыши при охлаждении клеточной суспензии с постоянной скоростью и при быстром двухступенчатом замораживании. На основании проведенных расчетов и экспериментов определены оптимальные условия криоконсервирования этих клеток под защитой диметилсульфоксида. |
| format |
Article |
| author |
Останков, М.В. |
| author_facet |
Останков, М.В. |
| author_sort |
Останков, М.В. |
| title |
Влияние быстрого двухступенчатого замораживания на сохранность клеток костного мозга |
| title_short |
Влияние быстрого двухступенчатого замораживания на сохранность клеток костного мозга |
| title_full |
Влияние быстрого двухступенчатого замораживания на сохранность клеток костного мозга |
| title_fullStr |
Влияние быстрого двухступенчатого замораживания на сохранность клеток костного мозга |
| title_full_unstemmed |
Влияние быстрого двухступенчатого замораживания на сохранность клеток костного мозга |
| title_sort |
влияние быстрого двухступенчатого замораживания на сохранность клеток костного мозга |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2007 |
| topic_facet |
Криоконсервирование биообъектов |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138196 |
| citation_txt |
Влияние быстрого двухступенчатого замораживания на сохранность клеток костного мозга / М.В. Останков // Проблемы криобиологии. — 2007. — Т. 17, № 3. — С. 283-289. — Бібліогр.: 19 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT ostankovmv vliâniebystrogodvuhstupenčatogozamoraživaniânasohrannostʹkletokkostnogomozga AT ostankovmv effectofrapidtwostepfreezingonbonemarrowcellintegrity |
| first_indexed |
2025-11-24T04:33:10Z |
| last_indexed |
2025-11-24T04:33:10Z |
| _version_ |
1849644852444135424 |
| fulltext |
283 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №3
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
УДК 576.5:57.043.086.13:577.352
М.В. ОСТАНКОВ
Влияние быстрого двухступенчатого замораживания на сохранность
клеток костного мозга
UDC 576.5:57.043.086.13:577.352
M.V. OSTANKOV
Effect of Rapid Two-Step Freezing on Bone Marrow Cell Integrity
Теоретически рассчитано переохлаждение внутриклеточного раствора костного мозга мыши при охлаждении клеточной
суспензии с постоянной скоростью и при быстром двухступенчатом замораживании. На основании проведенных расчетов и
экспериментов определены оптимальные условия криоконсервирования этих клеток под защитой диметилсульфоксида.
Ключевые слова: быстрое двухступенчатое замораживание, переохлаждение, внутриклеточная кристаллизация,
диметилсульфоксид.
Теоретично розраховано переохолодження внутрішньоклітинного розчину кісткового мозку миші при охолодженні клітинної
суспензії з постійною швидкістю та при швидкому двоступінчастому заморожуванні. На основі проведених розрахунків і
експериментів визначено оптимальні умови кріоконсервування цих клітин під захистом диметилсульфоксиду.
Ключові слова: швидке двоступінчасте заморожування, переохолодження, внутрішньоклітинна кристалізація,
диметилсульфоксид.
Supercooling of murine bone marrow intracellular solution under cell suspension cooling with a constant rate and at a rapid two-
step freezing has been theoretically calculated. The optimal conditions for these cells cryopreservation under dimethyl sulfoxide
protection have been determined, basing on the calculations and experiments performed.
Key-words: rapid two-step freezing, supercooling, intracellular crystallisation, dimethyl sulfoxide.
* Адрес для корреспонденции : ул. Переяславская, 23,
г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38 (057) 373-57-91, факс: +38
(057) 373-30-84, электронная почта: cryo@online.kharkov.ua
* Address for correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
5791, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
Как правило, само по себе охлаждение клеток
до субнулевых температур не приводит к их
повреждению [1, 2, 4-6]. Основная масса повреж-
дений клеточных структур непосредственно или
косвенно связана с образованием кристаллов льда
вне и внутри клеток [4, 7, 9, 11-13, 17]. В зоне же
фазовых превращений, когда вода (доля которой в
биологических объектах составляет около 75-90%)
превращается в лед, на клетки помимо темпе-
ратуры действует ряд факторов, способных
вызвать их повреждение: концентрирование вне- и
внутриклеточных растворов, рост кристаллов вне-
и внутриклеточного льда, их рекристаллизация,
изменения рН и ионной силы среды, образование
трещин в аморфной твердой фазе, изменения
электрического потенциала на мембране клетки,
электрические поля, возникающие при растрес-
кивании аморфной фазы, и другие факторы [9, 11-
13, 17]. Среди перечисленных факторов наиболее
значимым считают образование кристаллов льда
внутри клеток [14, 16, 19]. Поэтому поиск опти-
мальных условий криоконсервирования клеточных
суспензий направлен на предотвращение внутри-
клеточной кристаллизации при их глубоком охлаж-
дении.
The cooling down itself of cells to subzero
temperatures does not generally result in their damage
[1, 2, 4-6]. The bulk of cell structure damages is directly
or indirectly associated to the ice crystal formation both
in cells and beyond them [4, 7, 9, 11-13, 17]. In the
phase transformation area, when water (which part is
about 75-90% in biological objects) is transformed into
ice, cells are affected by some factors besides a
temperature, capable to cause their damage such as:
concentration of extra- and intracellular solutions,
crystal growth of extra- and intracellular ice, their re-
crystallisation, pH and medium ion strength changes,
fracture formation in amorphous solid phase, changes
in electric potential on cell membrane, electric fields,
occurring under amorphous phase fracturing and
another factors [9, 11-13, 17]. Among the mentioned
above factors the ice crystal formation inside cells is
considered to be the most significant one [14, 16, 19].
Therefore the search for optimal conditions of cell
suspension cryopreservation is oriented to prevent an
intracellular crystallisation under its deep cooling down.
Research was aimed to compare the effect of two
cooling regimens (cooling down with a constant rate
and a rapid two-step freezing) on the murine bone
marrow (BM) integrity and morphological composition.
284
Цель работы – сравнительный анализ влияния
двух режимов охлаждения (охлаждения с постоян-
ной скоростью и быстрого двухступенчатого
замораживания) на сохранность и морфологи-
ческий состав костного мозга (КМ) мыши.
Материалы и методы
Исследования были выполнены на половоз-
релых мышах-самцах линии СВА массой 19-22 г.
Все манипуляции с животными выполнены
согласно положениям Европейской конвенции о
защите позвоночных животных, используемых для
экспериментальных и других научных целей
(Страсбург, 1985). Суспензию клеток получали из
бедренных костей вымыванием костномозгового
канала средой 199 с добавлением цитрата натрия.
Количество клеток до и после криоконсервиро-
вания подсчитывали в камере Горяева [8]. Со-
хранность клеток оценивали в световом (ЛОМО)
и люминесцентном (ЛЮМАМ) микроскопе соот-
ветственно после окрашивания клеток КМ виталь-
ными красителями – трипановым синим и акри-
диновым оранжевым. Клеточный состав опреде-
ляли на мазках, окрашенных азур-II-эозином по
Романовскому [8], путем подсчета 500 клеток в
световом микроскопе (ЛОМО).
Клетки КМ охлаждали с постоянной скоростью
1 и 10°С/мин на программном замораживателе
УОП-06 производства СКТБ с ОП ИПКиК НАН
Украины. При быстром двухступенчатом замора-
живании использовали специальный криостат,
разработанный СКТБ с ОП ИПКиК НАН Украины
[10]. В качестве криопротектора был выбран
ДМСО в концентрации 10% с добавлением 3%
телячьей сыворотки и 0,2% цитрата натрия. Ото-
гревали клетки на водяной бане при 41°С. Статис-
тическую обработку полученных результатов
проводили по методу Стьюдента-Фишера [3].
Результаты и обсуждение
Необходимым условием для образования
внутриклеточных кристаллов льда является
переохлаждение внутриклеточного раствора. При
этом вероятность внутриклеточной кристаллиза-
ции экспоненциально растет с увеличением этого
переохлаждения [6]. Как правило, при заморажи-
вании любой клеточной суспензии кристаллы льда
первоначально образуются во внеклеточном раст-
воре. По мере дальнейшего охлаждения количест-
во внеклеточного льда увеличивается в соответст-
вии с диаграммой плавления внеклеточного
раствора и клетки вытесняются в жидкие каналы,
расположенные между кристаллами внеклеточного
льда. Поскольку растворенные во внеклеточном
растворе вещества не захватываются в кристаллы
льда, их концен-трация в жидкой внеклеточной фазе,
Materials and methods
Research was carried-out in 19-22 g’ mature CBA
male rats. All manipulations with animals were done
according to the “European Convention for the
Protection of Vertebrate Animals Used for Experi-
mental and Other Scientific Purposes” (Strasbourg,
1985). Cell suspension was derived from thighbones
by washing-out the bone marrow channel using medium
199, supplemented with sodium citrate. Cell number
prior to and after cryopreservation was calculated in
Goryaev’s chamber [8]. Cell integrity was estimated
under light and luminescent (LUMAM) microscopes,
after bone marrow cell staining with trypane blue and
acridine orange vital dyes. Cell composition was
determined on smears, stained with azure-II-eosin by
Romanovsky [8] by means of calculating 500 cells
under light microscope (LOMO), expressed in per-
centage.
BM cells were cooled down with 1 and 10°C/min
constant rate using UOP-06 programmable freezer
produced by the Special Designing & Technical Bureau
with Experimental Unit of the Institute for Problems
of Cryobiology and Cryomedicine of the National
Academy of Sciences of Ukraine. During rapid two-
step freezing we used the cryostat, specially designed
at the Special Designing & Technical Bureau with
Experimental Unit of the Institute for Problems of
Cryobiology and Cryomedicine of the National
Academy of Sciences of Ukraine. As a cryoprotectant
we used 10% DMSO, complemented with 3% calf
serum and 0.2% sodium citrate. Cells were thawed
on water bath at 41°C. The results obtained were
statistically processed by the Student-Fisher’s method [3].
Results and discussion
The supercooling of intracellular solution is a
necessary condition for intracellular ice crystal forma-
tion. At the same time a probability of intracellular
crystallisation augments exponentially with supercooling
increase [6]. As a rule, the ice crystals are initially
formed in an extracellular solution during any cell
suspension freezing. With further cooling down the
number of extracellular ice increases according to the
melting diagram for extracellular solution and cells are
displaced into liquid channels, located between
extracellular ice crystals. Since the substances, dissol-
ved in extracellular solution are not captured into ice
crystals, their concentration in a liquid extracellular
phase, to which cells are in contact, rises according to
the melting diagram for extracellular solution as well.
Concentration growth of extracellular solution results
in appearance of total concentration differential of
solved substances on cell membranes, causing their
osmotic dehydration and transmembrane differential
reduction of solved substance total concentration due
to some water efflux out of cells. Evidently, the more
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №3
285
с которой контактируют клетки, растет также в
соответствии с диаграммой плавления внеклеточ-
ного раствора. Рост концентрации внеклеточного
раствора приводит к появлению перепада суммар-
ной концентрации растворенных веществ на
мембранах клеток, который вызывает их осмоти-
ческое обезвоживание и уменьшает трансмем-
бранный перепад суммарной концентрации раство-
ренных веществ за счет оттока части воды из
клеток. Выравнивание указанного перепада кон-
центраций, очевидно, происходит тем быстрее, чем
большие значения имеют коэффициент прони-
цаемости консервируемых клеток для молекул
воды и их поверхностно-объемное отношение.
Если скорость охлаждения клеточной суспензии
достаточно мала, то трансмембранный перепад
растворенных веществ в течение всего процесса
кристаллизации оказывается близким к нулю.
Поскольку внеклеточные кристаллы льда находят-
ся в термодинамическом равновесии с омываю-
щим их раствором, этот же перепад концентраций
является и движущей силой внутриклеточной крис-
таллизации. Эффективное переохлаждение внутри-
клеточного раствора равно Ť(Cin)- Ť(Cout), где
Ť(C) – плавление внеклеточного раствора; Cout и
С in – концентрации вне- и внутриклеточных
растворенных веществ. Очевидно, при Cin → Cout
эффективное переохлаждение внутриклеточного
раствора падает, и, следовательно, вероятность
внутриклеточной кристаллизации уменьшается.
Таким образом, при охлаждении консервируемой
клеточной суспензии с постоянной скоростью
подбор оптимальной скорости охлаждения заклю-
чается в ее уменьшении до такого значения, чтобы
исключить существенное эффективное переохлаж-
дение внутриклеточного раствора и понизить
вероятность образования внутриклеточных крис-
таллов льда практически до нуля. При этом необхо-
димо принять во внимание то обстоятельство, что
снижение скорости охлаждения, в свою очередь,
повышает вероятность повреждения клеток за
счет их более длительной экспозиции в неблаго-
приятных условиях, которые создаются в процессе
замораживания (гипертония, повышение ионной
силы, сдвиг pH и т.п.).
Нами проведен теоретический расчет транс-
мембранного перепада суммарной концентрации
растворенных веществ в процессе кристаллизации
клеточной суспензии при двух указанных выше
режимах охлаждения. Зависимость концентрации
внеклеточного раствора от температуры опре-
делялась по известной диаграмме плавления для
тройного раствора ДМСО-NaCl-вода. Интен-
сивность перераспределения воды между клет-
ками и окружающим их раствором рассчитывали
по уравнению Кедем-Качальского.
rapid levelling of the mentioned concentration diffe-
rential occurs, the higher are the values of permeability
coefficient of cryopreserved cells for water molecules
and their surface-volume ratio. If cooling rate of cell
suspension is quite a low, the transmembrane
differential of solved substances within the whole
crystallisation process is close to zero. Since the extra-
cellular ice crystals are in thermodynamic balance with
flowing them around solution, this concentration
differential is a driving force for intracellular crystal-
lisation as well. Efficient supercooling of intra-cellular
solution equals to Ť(Cin) – Ť(Cout), where Ť(C) is
melting diagrams for extracellular solution, Cout and
Cin are the concentrations of extra- and intracellular
solved substances. Under Cin → Cout an efficient super-
cooling of intracellular solution obviously falls, and as
a result, the probability of intracellular crystallisation
reduces. Thus, when cooling down the preserved cell
suspension with a constant rate the selection for
optimal cooling rate consists in its reduction down to
this value, excluding a significant efficient supercooling
of intracellular solution and decreasing almost to zero
the probability of intracellular ice formation. At the
same time the circumstance, that a decrease in cooling
rate, in its turn, increases the probability of cells damage
due to their more prolonged exposure under unfa-
vourable conditions, created under freezing (hypertony,
increased ion strength, pH shift etc.) should be taken
into account.
We have theoretically calculated a transmembrane
differential of total concentration of solved substances
during cell suspension crystallisation with two mentio-
ned above cooling regimens. The dependency of
extracellular solution concentration on temperature was
determined by the known melting diagram for DMSO-
NaCl-water triple solution. The intensity of water
redistribution between cells and surrounding them
solution was calculated using the Kedem-Katchalsky
equation.
Fig. 1 and 2 demonstrate the dependencies of effi-
cient supercooling of intracellular solution on tempe-
rature at a linear and two-step cooling regimens. As
the data suggest, the supercooling and, consequently,
the probability of intracellular crystallisation at two-
step cooling are lower than at cooling with a constant
rate.
As shown in our experiments, the regimen para-
meters of two-step freezing (cooling rate prior to
temperature stop beginning at adaptation temperature
and after it, cell exposure duration) slightly affect the
murine BM cell integrity (Table 1).
Since under rapid two-step freezing the BM cell
exposure in hypertonic media is less prolonged, than
under linear regimen and shorter than characteristic
time for cryoprotectant penetration into cells, the
cryoprotectant amount in cells slightly increases during
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №3
286
0,91 0,87 0,83 0,79 0,75
20
15
10
5
0
0,91 0,87 0,83 0,79 0,75
20
15
10
5
0
Рис 1. Кинетика изменения переохлаждения внутри-
клеточного раствора δТin на этапе кристаллизации при
охлаждении с постоянной скоростью в растворе ДМСО -
NaCl - вода.
Fig. 1. Kinetics of change in intracellular solution overcooling
дTin at crystallisation stage under cooling with a constant
rate in DMSO-NaCl-water solution.
Рис 2. Кинетика изменения переохлаждения внутри-
клеточного раствора δТin при двухступенчатом режиме
охлаждения. Пунктиром показана зависимость скорости
переохлаждения клеточной суспензии при охлаждении
с постоянной скоростью.
Fig. 2. Kinetics of change in intracellular solution overcooling
дTin at two-step cooling regimen. Dependency of overcooling
rate of cell suspension under constant rate cooling is dotted.
ртемарапйынмижеР
яинаворивреснокоирк
retemarapnemigeR
noitavreserpoyrcfo
яинавориьравьтсалбО
egnarnoitairaV
ьтсоннархосанеиняилВ
%,агзомогонтсоккотелк
%,ytirgetnillecMBnotceffE
одяинеджалхоьтсорокС
ним/С°,иицатпадаырутарепмет
noitatpadaerofebetargnilooC
nim/C°,erutarepmet
01-1 9,8
С°,иицатпадаарутарепмеТ
C°,erutarepmetnoitatpadA 53-22- 4,36
ирпиицизопскэямерВ
ним,иицатпадаерутарепмет
noitatpadataemiterusopxE
nim,erutarepmet
03-5 7,11
елсопяинеджалхоьтсорокС
ним/С°,иицатпадаырутарепмет
noitatpadaretfaetargnilooC
nim/C°,erutarepmet
004-05 81
Таблица 1. Влияние режимных параметров быстрого двухступенчатого
замораживания на сохранность клеток КМ
Table 1. Effect of regimen parameters of rapid two-step freezing on BM cell
integrity
На рис.1 и 2 представлены зависимости
эффективного переохлаждения внутриклеточного
раствора от температуры при линейном и двух-
ступенчатом режимах охлаждения. Как видно из
данных, переохлаждение и, следовательно, ве-
роятность внутриклеточной кристаллизации при
двухступенчатом охлаждении меньше, чем при
охлаждении с постоянной скоростью.
Как показывают проведенные нами экспери-
менты, режимные параметры двухступенчатого
замораживания (скорость охлаждения до начала
температурной остановки при
температуре адаптации и после
нее, продолжительность экспози-
ции клеток при температуре
адаптации) слабо влияют на со-
хранность клеток КМ мышей
(табл. 1).
Поскольку при быстром двух-
ступенчатом замораживании
экспозиция клеток костного моз-
га в гипертонических средах
менее продолжительна, чем при
линейном режиме охлаждения, и
меньше характерного времени
проникновения криопротектора в
клетки, в процессе заморажи-
вания и последующего быстрого
отогрева количество криопро-
тектора в клетках увеличивается
незначительно. Поэтому клетки
freezing and following rapid thawing. Therefore cells
are more resistant to hypertonic lysis, occurring when
returning frozen-thawed cells into physiological solution.
The results of experimental data about the number
and integrity of bone marrow cells are presented in
Fig. 3. After rapid two-step freezing the number and
integrity of BM cells reduced only by 6.41±3.50 and
11.32±1.73%, correspondingly. During cell freezing
with a constant 1°C/min rate the cell number and
integrity decreased by 22.21±2.13 and 25.31±2.34%,
correspondingly. Cooling rate increase up to 10°C/min
П
ер
ео
хл
аж
де
ни
е
вн
ут
ри
кл
ет
оч
но
го
ра
ст
во
ра
, °
С
O
ve
rc
oo
lin
g
of
in
tra
ce
llu
la
r
so
lu
tio
n,
°
С
Температура, °С Temperature, °С Температура, °С Temperature, °С
П
ер
ео
хл
аж
де
ни
е
вн
ут
ри
кл
ет
оч
но
го
ра
ст
во
ра
, °
С
O
ve
rc
oo
lin
g
of
in
tra
ce
llu
la
r
so
lu
tio
n,
°
С
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №3
287
котелкпиТ
epytlleC
МКйынвитаН
)ьлортнок(
)lortnoc(MBevitaN
еортсыБ
еотачнепутсхувд
еинеджалхо
gniloocpets-owtdipaR
,яинеджалхоьтсороксяанняотсоП 0 ним/С
nim/C°,etargnilooctnatsnoC
1 01
ытсалболеиМ
stsalboleyM 13,0±17,4 32,0±29,4 25,0±46,4 17,0±12,4
ытицолеиМ
setycoleyM 31,0±31,2 23,0±30,2 33,0±31,2 12,0±23,2
ытицолеиматеМ
setycoleymateM 23,0±28,8 23,0±21,8 41,0±27,5 12,0±32,5
ытицолунарГ
setycolunarG 19,0±21,53 14,1±24,33 13,2±26,62 21,4±17,02
котсорйындиолеиМ
egaenildioleyM 26,1±17,05
11,2±34,84
Р
1
50,0>
32,3±11,53
Р
1
50,0<
Р
2
50,0<
20,5±24,23
Р
1
50,0<
Р
2
50,0<
Р
3
50,0>
ытсалбортирЭ
stsalborhtyrE 18,0±45,3 27,0±41,3 15,0±57,4 43,0±03,3
ытсалбомроН
stsalbomroN 33,2±43,32 12,2±41,32 51,2±25,32 21,3±37,92
котсорйындиортирЭ
egaenildiorhtyrE 21,3±38,62
19,2±32,62
Р
1
50,0>
26,2±12,82
Р
1
50,0>
Р
2
50,0>
23,3±10,33
Р
1
50,0<
Р
2
50,0<
Р
3
50,0>
ытсалбофмиЛ
stsalbohpmyL 23,0±28,1 42,0±29,1 14,0±05,2 31,1±16,3
ытицофмиЛ
setycohpmyL 18,0±11,91 29,1±32,22 33,1±19,12 32,2±39,92
котсорйындиофмиЛ
egaenildiohpmyL 13,1±29,02
13,2±51,42
Р
1
50,0>
28,1±23,42
Р
1
50,0<
Р
2
50,0>
13,3±20,23
Р
1
50,0<
Р
2
50,0<
Р
3
50,0<
иктелкеынредяолоГ
sllec-suelcuneraB 37,0±16,1 15,0±23,1 29,0±34,2 10,1±51,2
Примечание: – вероятность случайных расхождений с данными: P1
– до охлаждения; Р2 – после быстрого
двухступенчатого замораживания; Р3 – после охлаждения с постоянной скоростью 1° С/мин.
Notes: – the probability of random divergence with the data: P1 – prior to cooling; P2 – after rapid two-step freezing; P3 –
after cooling with 1°C/min constant rate.
Таблица 2. Клеточный состав костного мозга (%) до и после криоконсервирования с 10% ДМСО + 3% телячьей
сыворотки + 0,2% цитрата натрия
Table 2. BM cellular composition (%) prior to and after cryopreservation with 10% DMSO + 3% calf serum + 0.2% sodium
citrate
являются более устойчивыми к гипертоническому
лизису, который возникает при возвращении декон-
сервированных клеток в физиологический раствор.
Результаты экспериментальных данных о коли-
честве и сохранности клеток костного мозга пред-
ставлены на рис. 3. После быстрого двухступенча-
того замораживания количество клеток костного
мозга уменьшалось только на 6,41±3,50%, а сох-
ранность – на 11,32±1,73%. При замораживании
клеток с постоянной скоростью 1°С/мин количест-
во клеток уменьшалось на 22,21±2,13%, а сохран-
ность – на 25,31±2,34%. Увеличение скорости ох-
лаждения до 10°С/мин приводило к более выражен-
ному снижению количества клеток (47,34±3,72%)
и к уменьшению сохранности (60,11±3,52%) в
сравнении с исходным костным мозгом.
resulted in more manifested reduction in cell number
(47.34±3.72%) and integrity (60.11±3.52%) compared
to the initial BM.
When studying BM cell composition the method of
rapid two-step freezing was shown as capable for cell
preservation of three hemopoietic lineages (Table 2).
Their structure after cryopreservation and placing into
embryonic calf serum did not differ from initial bone
marrow structure. Changes concern some granulocytes
and are manifested in chromatin condensation and
nuclear pycnosis.
BM cell freezing with 1°C/min constant cooling rate
and its increase up to 10°C/min resulted in a manifested
damage of granulocytes structure, which had the
highest surface-nucleus ratio and comprised a great
number of lysosomes and mitochondria. These orga-
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №3
288
При изучении клеточного состава костного моз-
га было показано, что метод быстрого двухсту-
пенчатого замораживания позволяет сохранить
клетки трех ростков кроветворения (табл. 2). Их
структура после криоконсервирования и помеще-
ния в эмбриональную телячью сыворотку не отли-
чается от структуры исходного костного мозга. Из-
менения касаются отдельных гранулоцитов и
выражаются в конденсации хроматина и пикнозе
ядер.
Замораживание клеток костного мозга с посто-
янной скоростью охлаждения 1°С/мин и увели-
чение скорости до 10°С/мин приводили к выражен-
ному повреждению структуры гранулоцитов,
которые имеют наибольшее поверхностно-ядерное
соотношение и содержат большее количество
лизосом и митохондрий. Эти органеллы в первую
очередь реагируют на замораживание с постоян-
ной скоростью. Очевидно, при этом режиме замо-
раживания переохлаждение и образование кристал-
лов льда внутри клеток оказывают влияние на
мембранные структуры клетки в большей степе-
ни. В результате механического повреждения мем-
бран лизосом создаются условия для выхода
гидролитических и протеолитических ферментов,
приводящие к аутолизу гранулоцитов. В костном
мозге, криоконсервированном с использованием
линейной скорости охлаждения, наблюдается дос-
товерное снижение количества гранулоцитов. При
этом в препаратах отмечается перераспределение
клеточного состава в сторону значимого увеличе-
ния количества лимфоцитов и нормобластов
(табл. 2), то есть количества клеток с малым чис-
лом органелл и небольшим ядерно-цитоплазмати-
ческим соотношением.
Выводы
Определен оптимальный для исключения внут-
риклеточной кристаллизации режим охлаждения
клеток костного мозга. Показано, что для данного
вида клеток быстрое двухступенчатое заморажи-
вание является более эффективным, чем охлажде-
ние с постоянной скоростью.
Процедура быстрого двухступенчатого замора-
живания очень проста, ее реализация не требует
использования дорогостоящего оборудования и
заключается в погружении консервируемой клеточ-
ной суспензии в заранее охлажденную до заданной
температуры спиртовую баню на определенный
промежуток времени с последующим погружением
контейнера непосредственно в жидкий азот.
Теоретически обосновано и экспериментально
доказано, что режим криоконсервирования КМ
обеспечивает высокую сохранность трех ростков
кроветворения – эритроидного, гранулоцитарного
и лимфоидного.
nelles are primarily responding to constant rate freez-
ing. Obviously, under this freezing regimen the
supercooling and ice crystal formation inside cells affect
mostly the cell membrane structures. Due to mecha-
nical damage of lysosome membranes the conditions
for hydrolytic and proteolytic enzyme release, resulting
in granulocyte autolysis, are created. In BM cryo-
preserved with linear cooling rate a statistically signifi-
cant decrease in granulocyte number is observed. At
the same time a redistribution of cellular composition
towards significant increase in lymphocyte and
normoblast number (Table 2), i.e. cell amount with low
number of organelles and small nucleus-cytoplasm ratio
is noted in preparations.
Conclusions
There has been determined the BM cell optimal
cooling regimen for excluding an intracellular crys-
tallisation. A rapid two-step freezing was shown as
more efficient for this cell type, than the constant rate
cooling.
The procedure of rapid two-step freezing is very
simple. Its realisation does not require any expensive
equipment and consists in immersing the preserved cell
suspension into an alcohol bath, preliminarily cooled
down to the fixed temperature for the certain time
period with following container immersion directly into
liquid nitrogen.
The designed cryopreservation regimen was theo-
retically substantiated and experimentally proved as
�������
�������
�������
�������
�������
�������
�������
�������
�������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
�������
�������
�������
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3
Рис. 3. Количество и сохранность клеток КМ до и после
криоконсервирования. 1– количество клеток КМ; 2 –
сохранность клеток КМ в световом микроскопе; 3 –
сохранность клеток КМ в люминесцентном микроскопе.
– нативный КМ; – двухступенчатое замораживание;
123
123
123
– V=1°C/мин;
12
12 – V=10° C/мин.
Fig. 3. BM cell number and integrity prior to and after
cryopreservation. 1 – BM cell number; 2 – BM cell integrity
under light microscope; 3 – BM cell integrity under lumi-
nescent microscope. – native BM; – two-step freezing;
123
123
123 – V=1° C/min;
123
123
123 – V=10° C/min.
П
ро
це
нт
о
т
ко
нт
ро
ля
Pe
rc
en
ta
ge
in
re
cp
ec
t o
f c
on
tro
l
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №3
289
providing a high integrity for three hemopoietic lineages:
erythroid, granulocyte and lymphoid ones.
The selected regimen of rapid two-step freezing
was cryomicroscopically and cytologically shown as
preserving the structure integrity in bone marrow cells.
References
Aksenov A.I. Effect of freezing on water and biostructure
interactions. Achievements and perspectives of cryobiology
and cryomedicine development: Proceedings of International
Conference.– Kharkov, 1988.– P. 7-8.
Actual problems of cryobiology /Ed. by N.S. Pushkar, A.M.
Belous.– Kiev: Naukova dumka, 1981.– 608 p.
Ashmarin I.P., Vorobyev A.A. Statistical methods in
microbiological research.- Leningrad: Meditsina, 1962.– 180 p.
Belous A.M., Gordienko E.A., Rozanov L.F. Freezing and
cryoprotection.– Moscow: Vyssh. Shkola, 1987.– 187 p.
Belous A.M., Grischenko V.I. Cryobiology.- Kiev: Naukova
dumka.– 1994.– 431 p.
Gordienko E.A., Pushkar N.S. Physical grounds of cell
suspension low temperature preservation.- Kiev: Naukova
dumka, 1994.- 143p.
Kuleshova L.G. Kinetics of ice formation in living cells and
model systems: Author’s abstract of thesis of candidate of
biological sciences.– Kharkov, 1983.– 24 p.
Laboratory methods for clinical research / Ed. by V.V.
Menshikov.– Moscow: Meditsina, 1987.– 368 p.
Pushkar N.S., Belous A.M., Itkin Yu.A. et al. Low temperature
crystallisation in biological systems.– Kiev: Naukova dumka,
1977.– 243p.
Pushkar N.S., Gordienko E.A., Osetsky A.I. et al. Study of
physical processes in biological systems during profound
cooling // Problems of Cryobiology.– 1995.– N3.– P. 30-37.
Repin N.V. Study of extra- and intracellular crystallisation in
human erythrocytes at different conditions of cooling //
Cryobiology.– 1986.– N3.– P. 31-36.
Acker J.P., Mcgann L.E. The role of cell – cell contact on intracellular
ice formation // Cryo-Lett.– 1998.– Vol.19,N4.– P. 367-374.
Armitage W.J. and Juss B.K. The influence of cooling rate
on survival of frozen cells differs in monolayers and in
suspensions // Cryo-Lett.– 1996.– Vol.17,N2.– P. 213–218.
Diller K.R., Cravalho E.G., Huggins C.E. Intracellular freezing
in biomaterials // Cryobiology.– 1972.– Vol.9, N5.– P. 429-440.
Diller K.R. Intracellular freezing: Effect of extracellular
supercooling // Cryobiology.– 1975.– Vol.12, N5.– P. 480-485.
Dowgert M.F., Steponkus P.L., Levin R.L., Fergyson J.R.
Cryobiology of isolated plant protoplast: II.Intracellular ice
formation // Cryobiology.– 1979.– Vol.16, N6.– P. 593.
Jackson T.H. Novel microwave technology for cryo-
preservation of biomaterials by suppression of apparent ice
formation // Cryobiology.– 1997.– Vol.34, N4.– P. 363-372.
McGrath J.J., Cravalho E.C., Huggins C.E. An experimental
comparison of intracellular ice formation and freeze-thaw
survival of HeLa S-3 cells // Cryobiology.– 1975.– Vol.12,
N6.– P. 540-550.
Smith A.U. Biological effects of freezing and supercooling //
Baltimore, Williams and Wilkins.– 1961.– 182 p.
Accepted in 06.06.2007
Литература
Аксенов А.И. Влияние замораживания на взаимо-
действие воды с биоструктурами. Достижения и
перспективы развития криобиологии и криомедицины:
Тезисы докладов Междунар. конференции.–Харьков,
1988.– С. 7-8.
Актуальные проблемы криобиологии / Под ред.
Н.С.Пушкаря, А.М.Белоуса.– Киев: Наук. думка, 1981.–
608 с.
Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в
микробиологических исследованиях.– Л.: Медицина,
1962.– 180 с.
Белоус А.М., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Заморажи-
вание и криопротекция.– М.: Высш. школа, 1987.– 187 с.
Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология.– Киев: Наук.
думка.– 1994.– 431 с.
Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы
низкотемпературного консервирования клеточных
суспензий. – Киев: Наук. думка, 1994. – 143 с.
Кулешова Л.Г. Кинетика льдообразования в живых
клетках и модельных системах: Автореф. дис… канд.
биол. наук.– Харьков, 1983.– 24 с.
Лабораторные методы исследования в клинике / Под
ред. В.В.Меньшикова – М.: Медицина, 1987.– 368 с.
Пушкарь Н.С., Белоус А.М., Иткин Ю.А. и др. Низко-
температурная кристаллизация в биологических
системах.– Киев: Наук. думка, 1977.– 243 с.
Пушкарь Н.С., Гордиенко Е.А., Осецкий А.И. и др.
Исследование физических процессов в биологических
объектах при глубоком охлаждении // Пробл. криобио-
логии.– 1995.– № 3.– С. 30-37.
Репин Н.В. Изучение вне- и внутриклеточной кристал-
лизации в эритроцитах человека при различных
условиях охлаждения // Криобиология.– 1986.– №3.–
С.31-36.
Acker J.P., Mcgann L.E. The role of cell – cell contact on intracellular
ice formation // Cryo-Lett.– 1998.– Vol.19,N4.– P. 367-374.
Armitage W.J. and Juss B.K. The influence of cooling rate
on survival of frozen cells differs in monolayers and in
suspensions // Cryo-Lett.– 1996.– Vol.17,N2.– P. 213–218.
Diller K.R., Cravalho E.G., Huggins C.E. Intracellular freezing
in biomaterials // Cryobiology.– 1972.– Vol.9, N5.– P. 429-440.
Diller K.R. Intracellular freezing: Effect of extracellular
supercooling // Cryobiology.– 1975.– Vol.12, N5.– P. 480-485.
Dowgert M.F., Steponkus P.L., Levin R.L., Fergyson J.R.
Cryobiology of isolated plant protoplast: II.Intracellular ice
formation // Cryobiology.– 1979.– Vol.16, N6.– P. 593.
Jackson T.H. Novel microwave technology for cryo-
preservation of biomaterials by suppression of apparent ice
formation // Cryobiology.– 1997.– Vol.34, N4.– P. 363-372.
McGrath J.J., Cravalho E.C., Huggins C.E. An experimental
comparison of intracellular ice formation and freeze-thaw
survival of HeLa S-3 cells // Cryobiology.– 1975.– Vol.12,
N6.– P. 540-550.
Smith A.U. Biological effects of freezing and supercooling //
Baltimore, Williams and Wilkins.– 1961.– 182 p.
Поступила 06.06.2007
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 17, 2007, №3
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 17, 2007, №3
|