Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность стволовых кроветворных клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями. Часть 1. Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсервированного костного мозга

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2005
Автори:	Гольцев, А.Н., Дубрава, Т.Г., Козлова, Ю.А., Останков, М.В., Гурина, Т.М.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2005
Назва видання:	Проблемы криобиологии и криомедицины
Теми:	Теоретическая и экспериментальная криобиология
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138511
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность стволовых кроветворных клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями. Часть 1. Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсервированного костного мозга / А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Ю.А. Козлова, М.В. Останков, Т.М. Гурина // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 4. — С. 614-621. — Бібліогр.: 16 назв. — рос., англ.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-138511
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1385112025-02-09T14:15:29Z Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность стволовых кроветворных клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями. Часть 1. Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсервированного костного мозга Effect of Different Cryopreservation Regimens on Integrity of Bone Marrow Stem Hemopoietic Cells in Animals with Autoimmune Diseases. Part 1. In vitro Estimation of Functional Status of Cryopreserved Bone Marrow Hemopoietic Precursors Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Козлова, Ю.А. Останков, М.В. Гурина, Т.М. Теоретическая и экспериментальная криобиология 2005 Article Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность стволовых кроветворных клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями. Часть 1. Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсервированного костного мозга / А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Ю.А. Козлова, М.В. Останков, Т.М. Гурина // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 4. — С. 614-621. — Бібліогр.: 16 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138511 615.018.41.014.41:616.72-002.77 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология
spellingShingle	Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Козлова, Ю.А. Останков, М.В. Гурина, Т.М. Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность стволовых кроветворных клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями. Часть 1. Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсервированного костного мозга Проблемы криобиологии и криомедицины
format	Article
author	Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Козлова, Ю.А. Останков, М.В. Гурина, Т.М.
author_facet	Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Козлова, Ю.А. Останков, М.В. Гурина, Т.М.
author_sort	Гольцев, А.Н.
title	Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность стволовых кроветворных клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями. Часть 1. Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсервированного костного мозга
title_short	Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность стволовых кроветворных клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями. Часть 1. Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсервированного костного мозга
title_full	Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность стволовых кроветворных клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями. Часть 1. Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсервированного костного мозга
title_fullStr	Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность стволовых кроветворных клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями. Часть 1. Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсервированного костного мозга
title_full_unstemmed	Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность стволовых кроветворных клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями. Часть 1. Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсервированного костного мозга
title_sort	влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность стволовых кроветворных клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями. часть 1. оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсервированного костного мозга
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2005
topic_facet	Теоретическая и экспериментальная криобиология
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138511
citation_txt	Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность стволовых кроветворных клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями. Часть 1. Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсервированного костного мозга / А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Ю.А. Козлова, М.В. Останков, Т.М. Гурина // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 4. — С. 614-621. — Бібліогр.: 16 назв. — рос., англ.
series	Проблемы криобиологии и криомедицины
work_keys_str_mv	AT golʹcevan vliânierazličnyhrežimovkriokonservirovaniânasohrannostʹstvolovyhkrovetvornyhkletokkostnogomozgaživotnyhsautoimmunnymizabolevaniâmičastʹ1ocenkainvitrofunkcionalʹnogostatusakrovetvornyhpredšestvennikovkriokonservirovannogokostnogomozga AT dubravatg vliânierazličnyhrežimovkriokonservirovaniânasohrannostʹstvolovyhkrovetvornyhkletokkostnogomozgaživotnyhsautoimmunnymizabolevaniâmičastʹ1ocenkainvitrofunkcionalʹnogostatusakrovetvornyhpredšestvennikovkriokonservirovannogokostnogomozga AT kozlovaûa vliânierazličnyhrežimovkriokonservirovaniânasohrannostʹstvolovyhkrovetvornyhkletokkostnogomozgaživotnyhsautoimmunnymizabolevaniâmičastʹ1ocenkainvitrofunkcionalʹnogostatusakrovetvornyhpredšestvennikovkriokonservirovannogokostnogomozga AT ostankovmv vliânierazličnyhrežimovkriokonservirovaniânasohrannostʹstvolovyhkrovetvornyhkletokkostnogomozgaživotnyhsautoimmunnymizabolevaniâmičastʹ1ocenkainvitrofunkcionalʹnogostatusakrovetvornyhpredšestvennikovkriokonservirovannogokostnogomozga AT gurinatm vliânierazličnyhrežimovkriokonservirovaniânasohrannostʹstvolovyhkrovetvornyhkletokkostnogomozgaživotnyhsautoimmunnymizabolevaniâmičastʹ1ocenkainvitrofunkcionalʹnogostatusakrovetvornyhpredšestvennikovkriokonservirovannogokostnogomozga AT golʹcevan effectofdifferentcryopreservationregimensonintegrityofbonemarrowstemhemopoieticcellsinanimalswithautoimmunediseasespart1invitroestimationoffunctionalstatusofcryopreservedbonemarrowhemopoieticprecursors AT dubravatg effectofdifferentcryopreservationregimensonintegrityofbonemarrowstemhemopoieticcellsinanimalswithautoimmunediseasespart1invitroestimationoffunctionalstatusofcryopreservedbonemarrowhemopoieticprecursors AT kozlovaûa effectofdifferentcryopreservationregimensonintegrityofbonemarrowstemhemopoieticcellsinanimalswithautoimmunediseasespart1invitroestimationoffunctionalstatusofcryopreservedbonemarrowhemopoieticprecursors AT ostankovmv effectofdifferentcryopreservationregimensonintegrityofbonemarrowstemhemopoieticcellsinanimalswithautoimmunediseasespart1invitroestimationoffunctionalstatusofcryopreservedbonemarrowhemopoieticprecursors AT gurinatm effectofdifferentcryopreservationregimensonintegrityofbonemarrowstemhemopoieticcellsinanimalswithautoimmunediseasespart1invitroestimationoffunctionalstatusofcryopreservedbonemarrowhemopoieticprecursors
first_indexed	2025-11-26T17:44:23Z
last_indexed	2025-11-26T17:44:23Z
_version_	1849875837422141440
fulltext	614ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №4 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №4 УДК 615.018.41.014.41:616.72-002.77 Адрес для корреспонденции: Гольцев А.Н., Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38 (057) 373-30-10, факс: +38 (057) 373-30-84, e-mail: cryo@online.kharkov.ua Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность стволовых кроветворных клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями Часть 1. Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсервированного костного мозга А.Н. ГОЛЬЦЕВ, Т.Г. ДУБРАВА, Ю.А. КОЗЛОВА, М.В. ОСТАНКОВ, Т.М. ГУРИНА Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Effect of Different Cryopreservation Regimens on Integrity of Bone Marrow Stem Hemopoietic Cells in Animals with Autoimmune Diseases Part 1. In vitro Estimation of Functional Status of Cryopreserved Bone Marrow Hemopoietic Precursors A.N. GOLTSEV, T.G. DUBRAVA, YU.A. KOZLOVA, M.V. OSTANKOV, T.M. GURINA Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov В системе in vitro определены функциональные характеристики стволовых кроветворных клеток (СКК) костного мозга (КМ) здоровых животных и с аутоиммунными заболеваниями (АИЗ) до и после криоконсервирования с использованием различных режимов. Показаны принципиальные различия изменения функционального статуса кроветворных предшественников здоровых доноров и с АИЗ при аналогичных условиях криоконсервирования. Отмечено, что варьирование концентрацией криопротектора при одной и той же скорости замораживания позволяет выделить оптимум условий, при которых факторы криоконсервирования в равной степени влияют не только на функциональный статус кроветворных клеток разной степени дифференцировки, но и полученного от разных доноров (физиология и патология) КМ. В то же время разные скорости замораживания имеют идентичные параметры селективного влияния на СКК определенного уровня дифференцировки в здоровом и “патологическом” КМ. Установлено, что оптимальными в отношении обеспечения функционального потенциала этих клеток в КМ оказались различные условия криоконсервирования. Так, максимальное количество и наиболее сбалансированный субпопуляционный состав кроветворных предшественников в виде колониеобразующих единиц грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ) и формирующих колонии в селезенке летально облученных реципиентов (КОЕс) КМ здоровых животных был сохранен после замораживания со скоростью 1°С/мин с 10%-м диметилсульфоксидом (ДМСО), а для КМ животных с АИЗ – 40°С/мин с 10%-м ДМСО. Очередной раз на конкретном примере подчеркивается правомочность ранее высказанной авторами идеи о возможности использования криоконсервирования как фактора направленной регуляции состояния биообъекта и, в частности, кроветворных предшественников КМ с различным исходным статусом. Ключевые слова: костный мозг, кроветворные предшественники (КОЕ-ГМ, КОЕс), аутоиммунные заболевания, адъювантный артрит, методы криоконсервирования У системі in vitro визначено функціональні характеристики стовбурових кровотворних клітин (СКК) кісткового мозку (КМ) здорових тварин і з аутоімунними захворюваннями (АІЗ) до і після кріоконсервування з використанням різних режимів. Показано принципові відмінності зміни функціонального статусу кровотворних попередників здорових донорів і з АІЗ при аналогічних умовах кріоконсервування. Зазначено, що варіювання концентрацією кріопротектора при одній і тій же швидкості заморожування дозволяє виділити оптимум умов, при яких чинники кріоконсервування в рівній мірі впливають не тільки на функціональний статус кровотворних клітин різної міри диференціювання, але й отриманого від різних донорів (фізіологія і патологія) КМ. У той же час різні швидкості заморожування мають ідентичні параметри селективного впливу на СКК певного рівня диференціювання в здоровому і “патологічному” КМ. Встановлено, що оптимальними відносно забезпечення функціонального потенціалу цих клітин в КМ виявилися різні умови кріоконсервування. Так, максимальна кількість і найбільш збалансований субпопуляційний склад кровотворних попередників у вигляді колонієутворюючих одиниць грануломоноцитопоеза (КУО-ГМ) і формуючих колонії в селезінці летально опромінених реципієнтів (КУОс) КМ здорових тварин був збережений після заморожування зі швидкістю 1°С/хв з 10%-м ДМСО, а для КМ тварин з АІЗ – 40°С/хв з 10%-м ДМСО. На конкретному прикладі підкреслюється правомочність раніше висловленої авторами ідеї про можливість використання кріоконсервування як чинника направленої регуляції стану кровотворних попередників КМ з різним початковим статусом. Ключові слова: кістковий мозок, кровотворні попередники (КУО-ГМ, КУОс), аутоімунні захворювання, адьювантний артрит, методи кріоконсервування. Functional characteristics of hemopoietic stem cells (HSCs) of bone marrow (BM) in healthy animals and those with autoimmune diseases (AIDs) before and after cryopreservation using different regimens were in vitro determined. Fundamental differences of a change in functional status of hemopoietic precursors in healthy and AIDs donors under the same changes in cryopreservation Address for correspondence: Goltsev A.N., Institute for Problems of Cryobiology&Cryomedicine of the Natl. Acad. Sci. of Ukraine, 23, Pereyaslavskaya str.,Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3010, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua UDC 615.018.41.014.41:616.72-002.77 615ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №4 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №4 conditions are shown. It was noted, that varying concentrations of cryoprotectant at the same freezing rate enabled to point out the optimum of conditions, under which the cryopreservation factors equally affected both functional status of hemopoietic cells of different differentiation rate and BM, procured from different donors (physiology and pathology). At he same time different freezing rates have identical parameters of a selective effect on SHCs with a certain differentiation level in healthy and “pathological” BM. Different cryopreservation conditions were established to be the optimal ones in respect to providing functional potential of these cells in both BMs. Thus, the maximum number and the most balanced subpopulation composition of hemopoietic precursors as colony-forming units of granulomonocytopoiesis (CFU-GM) and forming colonies in spleen of lethally irradiated recipients (CFUs) of healthy animals’ BM were preserved after freezing with 1°C/min rate and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and 40°C/min with 10% DMSO for BM of AIDs animals. The relevance of idea, recently given by authors about the possibility to use cryopreservation as a factor of directed regulation of bioobject’s state and, in particular, BM hemopoietic precursors with different initial status is emphasized with a specific example. Key-words: bone marrow, hemopoietic precursors (CFU-GM, CFUs), autoimmune diseases, adjuvant arthritis, cryopreservation methods. Оптимизация методов криоконсервирования КМ с различным исходным морфофункцио- нальным состоянием стала еще более актуальной проблемой в связи с востребованностью аутоло- гичного КМ для лечения ряда АИЗ и соответст- венно необходимостью его хранения при субнуле- вых температурах [5, 7, 15, 16]. Очевидно, что эффективность аутотрансплантации криоконсерви- рованного КМ будет определяться степенью сохранности различных его клеточных популяций, в первую очередь СКК, а также стромальных элементов кроветворного микроокружения, обладающих “трансплантабельностью” и выпол- няющих в отношении этих клеток акцессорные функции [3, 4, 13]. Морфофункциональные характе- ристики клеточно-тканевых субстратов гемо- поэтической системы при АИЗ отличаются от таковых при физиологических условиях [2, 10, 12]. Устойчивость биологического материала к действию факторов низкотемпературного консер- вирования определяется его исходным структурно- функциональным состоянием [3, 8, 11]. Поэтому необходимо в теоретическом и прикладном аспектах изучать особенности изменения функцио- нального статуса СКК костного мозга пациентов с АИЗ после действия физико-химических факторов, реализуемых в процессе криоконсер- вирования, для отработки оптимальных режимов криоконсервирования такого КМ. Цель работы – изучить в сравнительном аспекте особенности влияния различных режимов криоконсервирования на колониеобразующую активность разной степени дифференцировки СКК костного мозга животных с адъювантным артри- том (АА) в системе in vitro. Материалы и методы Эксперименты проведены на мышах-самцах линии СВА/СaLac 4-месячного возраста массой 20-25 г. Все манипуляции с животными выполнены согласно Международным принципам Европейской конвенции о защите позвоночных животных (Страсбург, 1985 г). Адъювантный артрит индуци- Optimizing methods for BM cryopreservation with a different initial morphofunctional state occurred to be more actual task due to a need in autologous BM for treating some AIDs and, correspondingly, to a necessity for its storage under subzero temperatures [5-7, 15, 17]. The efficiency of cryopreserved BM autotransplantation will be evidently determined by the integrity degree of its different cellular populations, primarily HSCs, as well as stromal elements of hemopoietic microenvironment, possessing a “trans- plantability” and realizing accessory functions regarding these cells [3, 4, 13]. Morphofunctional characteristics of hemopoietic system cell-tissue substrates at AIDs differ from those under physio- logical conditions [2, 10, 12]. Resistance of biological material to the effect of factors of low temperature preservation is determined by its initial structural and functional state [8, 11]. Therefore the peculiarities of a change in BM HSCs functional status in AIDs patients after the effect of physical and chemical factors, realized during cryopreservation are needed to be investigated in both theoretical and applied aspects in order to work-out the optimal regiments for such BM cryopreservation. The work was aimed to a comparative study of peculiarities of different cryopreservation regimens influence on a colony-forming activity of bone marrow SHCs of different differentiation degree in animals with adjuvant arthritis (AA) in vitro. Materials and methods Experiments were carried-out in 4 months’ CBA/ CaLac male mice with 20-25 g weight. All manipu- lations with animals were performed according to the “European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes” (Strasbourg, 1985). Adjuvant arthritis was induced by subplantar introduction of a complete Freund’s adjuvant [14]. Investigation object was animal’s BM, procured to the 14th day of AA development, which was washed-out from femoral bones with 199 medium with adding 100% embryonic calf serum and 20% sodium citrate. Healthy animal’s 616ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №4 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №4 ровали субплантарным введением полного адъюванта Фрейнда [14]. Объектом исследования был КМ животных, полученный на 14-е сутки развития АА, который вымывали из бедренных костей средой 199 с добавлением 10%-й эмбрио- нальной телячьей сыворотки и 2%-го цитрата натрия. Контролем служил КМ здоровых живот- ных. Суспензию клеток криоконсервировали в той же среде под защитой 5, 7 и 10%-го ДМСО (в конечной концентрации) в полиэтиленовых криокон- тейнерах фирмы Nunc объемом 1мл с концентра- цией 6,0×106 клеток/мл на программном замора- живателе “Cryoson” (Германия). В работе были апробированы программы криоконсервирования со следующими скоростями охлаждения: – 1°C/мин до –40°С с последующим погруже- нием в жидкий азот (режим 1); – 10°C/мин, 10-минутная выдержка при темпе- ратуре –40°С с последующим погружением в жидкий азот (режим 2); – 40°C/мин, 10-минутная выдержка при темпе- ратуре –40°С с последующим погружением в жидкий азот (режим 3). Суспензию отогревали на водяной бане при температуре 38-40°С в течение 40-50 с. После криоконсервирования клетки КМ отмывали от криопротектора медленным добавлением равного объема рабочей среды и последующим центри- фугированием. Для оценки содержания кроветворных пред- шественников КОЕ-ГМ использовали метод культивирования суспензии КМ с концентрацией 1×105 клеток/мл в полужидком агаре при темпе- ратуре 37°C в атмосфере с 5% СО2 и 95% воздуха [9]. Учет КОЕ-ГМ нативного КМ контрольных животных и с АА проводили на 7-е сутки культивирования. При исследовании динамики формирования структур нативным КМ этих групп животных не было отмечено достоверных отличий их количества с 7-х по 14-е сутки. Содержание кроветворных клеток-предшественников в крио- консервированном КМ определяли на 14-е сутки культивирования, учитывая тот факт, что пролифе- ративная активность КОЕ-ГМ после криоконсерви- рования временно ингибирована [7]. Интегральный показатель КОЕ-ГМ – это сумма предшест- венников, формирующих структуры до 20 клеток (кластеры) и более 20 клеток (колонии). Для оценки распределения в КМ кроветворных клеток с различной степенью дифференцировки (менее дифференцированные предшественники форми- руют колонии, более – кластеры [1]) был введен индекс пролиферативной активности (ИПА КОЕ-ГМ), представляющий собой отношение колониеобразующих предшественников к клас- теробразующим. BM served as the control. Cell suspension was cryopreserved in the same medium under 5, 7 and 10% DMSO protection (in final concentration) in 1 ml Nunc polyethylene containers with 6.0x106 cells/ml concentration using “Cryoson” programmable freezer (Germany). In the work we approved the cryoprese- rvation programs with following cooling rates: – 1°C/min down to –40°C with following immersion into liquid nitrogen (1st regimen); – 10°C/min, a 10 min exposure at –40°C with following immersion into liquid nitrogen (2nd regimen); – 40°C/min, a 10 min exposure at –40°C with following immersion into liquid nitrogen (3rd regimen). Suspension was thawed on water bath at 38-40°C during 40-50 sec. After cryopreservation BM cells were washed-out of cryoprotectant by a slow adding of handling medium of equal volume and following centrifuging. In order to estimate the content of hemopoietic precursors (CFU-GM) we used the method for BM suspension culturing with 1×105 cells/ml concentration in a semi-liquid agar at 37°C with 5% CO2 and 95% air in atmosphere [9]. Native BM CFU-GM in control animals and those with AA were counted to the 7th day of culturing. When investigating dynamics of structure formation by native BM in these animal groups no statistical and significant differences in their amount from 7th to 14th days were observed. Content of hemopoietic cells-precursors in a cryopreserved BM was determined to the 14th day of culturing, taking into account the fact, that CFU-GM proliferative activity after cryopreservation was temporarily inhibited [7]. CFU-GM integral index is the sum of precursors, forming structures up to 20 cells (clusters) and more than 20 ones (colonies). To estimate the hemopoietic cell distribution in BM with a different differentiation degree (less differentiated precursors form colonies, more differentiated ones do clusters [1]) we introduced the index of proliferative activity (IPA CFU-GM), representing a ratio of colony-forming precursors to cluster-forming ones. Integral efficiency estimation for the used cryopreservation regimens was carried-out using the index of total deviation scope (TDS) [11]. Summary deviation scope is the sum of deviations of selected indices on the control (100%), divided by 100. Results with lower TDS were more satisfactory. The obtained experimental data were statistically processed with “Microsoft Excel 2000” electronic tables. Results and discussion In vitro estimation of functional state of cryopreserved BM hemopoietic precursors in healthy animals. After cryopreservation of healthy animals’ BM with 1°C/min cooling rate (the 1st regimen) the colony-forming activity of hemopoietic 617ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №4 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №4 С помощью индекса суммарной степени отклонения (ССО) исследуемых показателей была проведена интегральная оценка эффективности использованных режимов криоконсервирования [11]. Суммарная степень отклонения - это сумма отклонений выбранных показателей от контроля (100%), разделенная на 100. Более удовле- творительными были результаты с меньшей ССО. Полученные экспериментальные данные статисти- чески обрабатывались с помощью электронных таблиц “Microsoft Excel 2000”. Результаты и обсуждение Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криоконсер- вированного КМ здоровых животных. После криоконсервирования КМ здоровых животных со скоростью охлаждения 1°С/мин (режим 1) колониеобразующая активность кроветворных предшественников ранжировалась примерно от 60 до 95% и повышалась по мере увеличения концентрации криопротектора (рис.1,а), достигая максимального уровня (92,02±3,68 КОЕ-ГМ от контроля) при его 10%-й концентрации. Однако при использовании 5%-го ДМСО отмечено некоторое отклонение ИПА от нормы в сторону повышения содержания колониеобразующих предшест- венников. Увеличение скорости замораживания до 10°С/мин (режим 2) сопровождалось снижением сохранности КОЕ-ГМ при использовании всех концентраций ДМСО по сравнению с режимом 1 (рис. 2, а). И в этом случае 10%-й ДМСО обеспе- чивал максимальную сохранность кроветворных предшественников (64±3,21%), среди которых преобладали колониеобразующие: ИПА был в 1,3 раза выше, чем в контроле. Максимальное количество кроветворных предшественников в криоконсервированном со скоростью 40°С/мин (режим 3) КМ сохранялось при использовании 7%-го ДМСО (рис. 3, а). Этот показатель практически был идентичным полу- ченному при этой же концентрации ДМСО в режиме 1. При этом, превышая оптимальный при режиме 2 (75,61±3,55 и 64,00±3,21% соответст- венно; р<0,05), он все же уступал максимальному при режиме 1 (75,61±3,55 и 92,34±6,44%, р<0,05). Кроме того, при скорости охлаждения 40°С/мин показатель ИПА изменялся в сравнении с контролем: при использовании 5%-го ДМСО он был более чем в 1,5 раза выше, а при 10%-й концентрации – в 2 раза ниже контроля. Сущест- венно, что такие выраженные изменения ИПА при 5 и 10%-й концентрации криопротектора наблю- дались на фоне примерно одинакового снижения общего количества КОЕ-ГМ в этих группах (в среднем в 2 раза). precursors was ranged approximately from 60 to 95% and increased with the augmentation of cryoprotectant concentration (Fig 1, a), by reaching the maximum level (92.02±3.68 CFU-GM of the control) under its 10% concentration. However when using 5% DMSO there was observed a certain IPA deviation on the norm towards an increase in content of colony-forming precursors. An increase in freezing rate up to 10°C/min (the 2nd regimen) was accompanied by a decrease in CFU- GM integrity when using all DMSO concentrations in comparison with the 1st regimen (Fig. 2, a). In this case 10% DMSO provided the maximum integrity of hemopoietic precursors (64±3.21%) among which predominated the colony-forming ones: IPA was in 1.3 times higher than in the control. The maximum amount of hemopoietic precursors in BM, cryopreserved with 40°C/min rate (3rd regimen) was preserved when using 7% DMSO (Fig. 3, a). This index was practically identical to that, obtained at the same DMSO concentration with 1st regimen. At the same time when exceeding the optimal one at the 2nd regimen (75.61±3.55 and 64.00±3.21% correspon- dingly; p<0.05) it was inferior to the maximum at the 1st regimen (75.61±3.55 and 92.34±6.44%, p<0.05). In addition, at 40°C/min cooling rate the index changed in comparison with the IPA control, which was more than 1.5 times higher during 5% DMSO usage and in twice lower the control at 10% concentration. Of note is that such manifested IPA changes at 5 and 10% cryoprotectant concentrations were observed at the background of approximately equal decrease in total number of CFU-GM in these groups (twice). In vitro estimation of functional state of cryopreserved BM hemopoietic precursors in AA animals. Results of a comparative analysis of BM state in healthy and AA animals demonstrated that the BM colony-forming activity in AA animals was lower by approximately 40% than the control one (57.00±2.85%). In addition, IPA augmentation at AA up to 1.75±0.06% testifies to concentration increase of less differentiated precursors, i.e. forming the colonies in such BM (Fig. 1, b). After cryopreserving BM of AA animals with 1°C/ min freezing rate with 7% DSMO the CFU-GM and IPA integrity remained at the level of indices before cryopreservation. Two other DMSO concentrations were equally less efficient in providing integrity of total CFU-GM number (reduction by 25-27%) in comparison with the native BM of AA animals. However if at 5% concentration of cryoprotectant the IPA twice exceeded the control (2.00±0.10), at 10% one it was even lower (0.87±0.06; control was accepted for 1). Dependency of CFU-GM content on cryoprotectant concentration after BM freezing with the 2nd regimen (10°C/min rate) was practically the same as at the 1st one (Fig. 2, b). However, if judging by IPA, the rate б ba a 0 20 40 60 80 100 120 Контроль 5 7 10 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 20 40 60 80 100 120 Контроль АА 5 7 10 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 б ba a 618ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №4 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №4 0 20 40 60 80 100 120 Контроль 5 7 10 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 20 40 60 80 100 120 Контроль АА 5 7 10 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Рис. 1. Сравнительная оценка содержания КОЕ-ГМ и индекса пролиферативной активности КМ здоровых животных (а) и с АА (б) до и после криоконсервирования в режиме 1 (скорость охлаждения 1°С/мин). Fig. 1. Comparative estimation of CFU-GM content and IPA of bone marrow in healthy (a) and AA animals (b) before and after cryopreservation at the 1st regimen (1°C/min cooling rate). Control Криоконсервирование с ДМСО, концентрация, % Cryopreservation with DMSO, concentration, % Control С од ер жа ни е КО Е- ГМ , % C FU -G M c on te nt , % С од ер жа ни е КО Е- ГМ , % C FU -G M c on te nt , % И П А, у сл . е д. IP A, re la tiv e un its И П А, у сл . е д. IP A, re la tiv e un its АА + криоконсервирование с ДМСО, концентрация, % AA + cryopreservation with DMSO, concentration, % Control Криоконсервирование с ДМСО, концентрация, % Cryopreservation with DMSO, concentration, % Control АА + криоконсервирование с ДМСО, концентрация, % AA + cryopreservation with DMSO, concentration, % С од ер жа ни е КО Е- ГМ , % C FU -G M c on te nt , % С од ер жа ни е КО Е- ГМ , % C FU -G M c on te nt , % И П А, у сл . е д. IP A, re la tiv e un its И П А, у сл . е д. IP A, re la tiv e un its Рис. 2. Сравнительная оценка содержания КОЕ-ГМ и индекса пролиферативной активности КМ здоровых животных (а) и с АА (б) до и после криоконсервирования в режиме 2 (скорость охлаждения 10°С/мин). Fig. 2. Comparative estimation of CFU-GM content and index of proliferative activity of bone marrow in healthy (a) and AA animals (b) before and after cryopreservation at the 2nd regimen (10°C/min cooling rate). Оценка in vitro функционального статуса кроветворных предшественников криокон- сервированного КМ животных с АА. Результаты сравнительного анализа состояния КМ здоровых животных и с АА показали, что колониеобразую- щая активность КМ животных с АА была примерно на 40% ниже, чем контрольного (57,00±2,85%). Кроме того, увеличение ИПА при АА до 1,75±0,06 свидетельствует о повышении в augmentation obviously inhibited functional potential of colony-forming cell-precursors, moreover in a greater extent within cryoprotectant concentration increase. At the 3rd regimen (Fig. 3, b) the maximum integrity of CFU-GM was provided by 10% DMSO concen- tration (50.4±4.56%) but not 7% one in contrast to 1st regimen (51.2±4.84%) and 2nd one (55.37±3.97%). However for the 3rd regimen the regularity of reduction б b a a 619ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №4 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №4 таком КМ концентрации менее дифференци- рованных предшественников, т.е. формирующих колонии (см. рис. 1, б). После криоконсервирования КМ животных с АА со скоростью замораживания 1°С/мин только при использовании 7%-го ДМСО сохранность КОЕ- ГМ и ИПА оставались на уровне показателей до криоконсервирования. Две другие концентрации ДМСО были в равной степени менее эффективны в обеспечении сохранности общего количества КОЕ-ГМ (снижение на 25-27%) по сравнению с нативным КМ животных с АА. Однако, если при 5%-й концентрации криопротектора ИПА в два раза превышал контроль (2,00±0,10), то при 10%-й был даже ниже (0,87±0,06; контроль принят за 1). Зависимость содержания КОЕ-ГМ от концент- рации криопротектора после замораживания КМ в режиме 2 (скорость 10°С/мин) практически была такая же, как при режиме 1 (рис. 2, б). Судя по ИПА, повышение скорости явно ингибировало функциональный потенциал клеток-предшест- венников, формирующих колонии, причем, в большей степени при увеличении концентрации криопротектора. При режиме 3 (рис.3, б) максимальную сохран- ность КОЕ-ГМ, в отличие от режимов 1 (51,24±4,84%) и 2 (55,37±3,97%), обеспечивала не 7, а 10%-я концентрация ДМСО (50,4±4,56% от контроля и 88±3,45% от показателя до замора- живания). Однако для режима 3 прослеживалась (характерная для режима 2) закономерность снижения в КМ концентрации более потентных предшественников по мере повышения концент- рации ДМСО. Оценка степени модификации функцио- нального статуса in vitro КМ с помощью интегрального показателя ССО. После замо- раживания КМ здоровых животных в режиме 1 лучшие результаты ССО (0,08±0,005) получены при использовании 10%-го ДМСО (рис. 3). При этой же концентрации криопротектора были получены лучшие результаты ССО для КМ, криоконсер- вированного в режиме 2, однако в данном случае показатель был хуже предыдущего в 5 раз (0,39±0,02). Для режима 3 минимальное отклонение показателя было отмечено с 7%-м ДМСО. В этом случае ССО хотя и была хуже, чем при режиме 1, но лучше, чем при режиме 2 (0,24±0,02 и 0,39±0,02; р<0,05). Для предшественников КМ животных с АА, наоборот, лучшие результаты ССО при режимах 1 и 2 отмечены с 7%-м ДМСО (0,55±0,04 и 0,52±0,05 соответственно), а при режиме 3 с 10%-м ДМСО (0,55±0,03). При этом, в отличие от КМ здоровых животных, лучшие результаты КМ животных с АА существенно не отличались между собой при of more potent precursor concentration in BM with an increase in DMSO concentration (typical for the 2nd one) was traced. Estimation of modification degree of functional status in vitro of BM using TDS integral index. After freezing healthy animals’ BM with the 1st regimen the best results of TDS 0.08±0.005 were obtained when using 10% DMSO. Using the same concentration of cryoprotectant the best TDS results were obtained for BM, cryopreserved with the 2nd regimen, but in this case the index was 5 times lower than the previous one (0.39±0.02). For the 3rd regimen the minimum index deviation was noted at 7% DMSO. In this case even though TDS was lower than at the 1st regimen, it was 0 20 40 60 80 100 120 Контроль АА 5 7 10 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Control АА + криоконсервирование с ДМСО, концентрация, % AA + cryopreservation with DMSO, concentration, % 0 20 40 60 80 100 120 Контроль АА 5 7 10 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 Control АА + криоконсервирование с ДМСО, концентрация, % AA + cryopreservation with DMSO, concentration, % С од ер жа ни е КО Е- ГМ , % C FU -G M c on te nt , % И П А, у сл . е д. IP A, re la tiv e un its С од ер жа ни е КО Е- ГМ , % C FU -G M c on te nt , % И П А, у сл . е д. IP A, re la tiv e un its Рис. 3. Сравнительная оценка содержания КОЕ-ГМ и индекса пролиферативной активности КМ здоровых животных (а) и с АА (б) до и после криоконсерви- рования в режиме 3 (скорость охлаждения 40°С/мин). Fig. 3. Comparative estimation of CFU-GM content and index of proliferative activity of bone marrow in healthy (a) and AA animals (b) before and after cryopreservation at the 3rd regimen (40°C/min cooling rate). 620ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №4 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №4 каждом режиме криокон- сервирования. Результаты ССО, отражающие разли- чия ответа предшествен- ников КОЕ-ГМ костного мозга здоровых животных и с АА на изменение условий криоконсервирования, при- ведены на рис. 4. В част- ности, зоны варьирования показателей при разных режимах и концентрациях криопротекторов для КМ животных с АА значительно меньше (0,52-0,67), чем для контрольного КМ (0,08- 0,60). К тому же для различ- ных режимов вне зависи- мости от вида КМ наглядно видна максимальная сте- пень отклонения показателя при использовании 5%-го ДМСО. Исходя из этого, в дальнейших исследованиях колониеобразующей актив- higher than at the 2nd one (0.24±0.02 and 0.39±0.02; p<0.05). For BM precursors of AA animals the best TDS results at the 1st and 2nd regimens were conversely observed with 7% DMSO (0.55±0.04 and 0.52±0.05, correspondingly), and with 10% DMSO at the 3rd one (0.55±0.03). At the same time in contrast to BM of healthy animals the best results of BM in AA animals did not significantly differ among themselves at each cryopreservation regimen. The TDS results, reflecting differences of response of BM CFU-GM precursors of healthy and AA animals on a change in cryopreser- vation conditions, are shown in the Fig. 4. In particular, the areas of indices variation at different regimens and cryoprotectant concentrations for BM of AA animals are significantly lower (0.52-0.67) than for the control BM (0.08-0.60). In addition, for different cryopreser- vation regimens independently on BM type the maximum degree of index deviation when using 5% DMSO is dramatically seen. Proceeding from this we considered as expedient to use only 7 and 10% DMSO concentrations in further investigations of BM colony- forming activity in vivo. Conclusions The problem with estimating the peculiarities of cryopreservation influence on functional status of BM SHCs, forming hemopoietic structures in vivo, i.e. more potent in comparison with CFU-GM, is of not less interest. Solving of this problem will be shown in the second part of the work. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 5 7 10 5 7 10 5 7 10 Концентрация ДМСО, % DMSO concentration, % С С О К О Е- ГМ , у сл . е д. TD S of C FU -G M , r el at iv e un its Рис. 4. Суммарная степень отклонения (ССО) показателей и индекса пролифера- тивной активности КОЕ-ГМ криоконсервированного КМ здоровых животных ( ) и животных с АА (•) в зависимости от режима замораживания. Fig. 4. Freezing regimen dependent total deviation scope of CFU-GM indices and index of proliferative activity of cryopreserved BM from healthy animals ( ) and those with AA (•). Режим 1 1st regimen Режим 2 2nd regimen Режим 3 3rd regimen ности КМ в системе in vivo мы сочли целесооб- разным использовать только 7 и 10%-ю концентра- цию ДМСО. Выводы Не меньший интерес представляет проблема оценки особенностей влияния криоконсервирования на функциональный статус СКК костного мозга, формирующих гемопоэтические структуры в системе in vivo, т.е. более потентных в сравнении с КОЕ-ГМ. Решение этих вопросов будет пред- ставлено во второй части работы. Установлен факт изменения функционального потенциала кроветворных предшественников (КОЕ-ГМ) КМ при развитии АИЗ и различного их ответа на одни и те же условия криоконсер- вирования. Литература Афанасьев Б.В., Алмазов В.А. Родоначальные крове- творные клетки человека: физиология и патология.– Л.: Наука, 1985.– 204 с. Гембицкий Е.В., Мазуров В.И., Лила А.М. и др. Изменение функциональной активности грануломоноцитопоэза у больных ревматоидным артритом // Клин. мед.– 1991.– Т. 69., №3.– С. 51-54. Гольцев А.Н. Влияние факторов криоконсервирования на иммунологические свойства кроветворных клеток костного мозга: Автореф. дис…доктора мед.наук.– Харьков, 1988.– 35 с. Гольцев А.Н., Луценко Е.Д. Криоконсервирование как возможный метод оценки роли компонентного состава миелотрансплантата в проявлении функциональной 1. 2. 3. 4. 621ПРОБЛЕМЫ КРИОБИОЛОГИИ Т. 15, 2005, №4 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 15, 2005, №4 The fact of a change in functional potential of hemopoietic precursors (CFU-GM) at AIDs develop- ment and their different response on the same cryopreservation conditions was established. активности кроветворных клеток // Пробл. криобиологии.– 1994.– №1.– С. 3-13. Гольцев А.Н., Луценко Е.Д., Дубрава Т.Г., Останков М.В. Модификация состояния кроветворных клеток костного мозга после криоконсервирования // Материалы Междунар. конф. “Сохранение генетических ресурсов”.– Санкт-Петербург, 2004.– С. 783-784. Грищенко В.И. Роль криобиологии в создании биотехно- логий клеточной и тканевой трансплантации // Пробл. криобиологии.– 2001.– №3.– С. 7-9. Дубрава Т.Г. Эффективность криоконсервирования кроветворных клеток в зависимости от их исходных свойств: Автореф. дис. …канд. биол. наук.– Харьков, 1986.– 25 с. Козлова Ю.А., Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Гурина Т.М. Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования костного мозга животных с аутоиммунной патологией // Пробл. криобиологии.– 2004.– №2.– С. 76-83. Шерешков С.И. Культивирование гемопоэтических клеток на полутвердых питательных средах // Лаб. дело.– 1974.– №3.– С. 146-150. Шмаров Д.А. Оценка пролиферативной активности клеток костного мозга методом проточной цитофлюоро- метрии // Клин. лаб. диагностика.– 1993.– №5.– С. 40-43. Пат. №2004031694 Україна, МПК А61В5/00. Спосіб порівняльної оцінки ефективності лікування / А.М. Гольцев, Л.В. Останкова, О.Д. Луценко, Т.Г. Дубрава, Н.М. Бабенко, І.В. Рассоха, А.Ю. Горська, Козлова Ю.О. Заявлено 09.03.04; Опубл. 15.12.2004.– Бюл. №12.– С. 3.12. Kawamura M., Hisha H., Lia Y. et al. Distinct qualitative differences between normal and abnormal hemopoietic stem cells in vivo and in vitro // Stem cells.– 1997.– №1.– P. 56-62. Papadaki H.A., Kritikos H.D., Gemetzi C. et al. Bone marrow progenitor cell reserve and function and stromal cell function are defective in rheumatoid arthritis: evidence for a tumor necrosis factor alpha-mediated effect // Blood.– 2002.– Vol. 99, N5.– P. 1610-1619. Pearson C.M., Wood F.D. Studies of arthritis and other lesions induced in rats by the injection of mycobacterial adjuvant // Am. J. Pharmacol.– 1963.– Vol.42.– P. 73-95. Рorta C., Capolari R., Elis O. et al. Impaired bone marrow hematopoietic progenitor cell function in rheumatoid arthritis patients candidate to autologous hematopoietic stem cell transplantation // Bone Marrow Transplant.– 2004.– Vol. 33, N7.– P. 721-728. Tyndall A. Haematological stem cell transplantation in the treatment of severe autoimmune diseases: first experiences from an international project // J. Rheumatol. – 1999.– Vol.38, N4.– P.482-488. Поступила 21.06.2005 References Afanasiev B.V., Almazov V.A. Progenitor human hemopoietic cells: physiology and pathology.– Leningrad: Nauka, 1985.– 204 p. Gembitsky E.V., Mazurov V.I., Lila A.M. et al. Change in functional activity of granulomonocytopoiesis in patients with rheumatoid arthritis // Klinicheskaya meditsina.– 1991.– Vol. 69, N3.– P. 51-54. Goltsev A.N. Effect of cryopreservation factors on immunological properties of bone marrow hemopoietic cells: Author’s thesis of doctor of medical sciences.– Kharkov, 1988.– 35p. Goltsev A.N., Lutsenko E.D. Cryopreservation as a possible method of estimation of the role of myelograft component composition in the functional activity of hemopoietic cells // Problems of Cryobiology.– 1994.– N1.– P. 3-13. Goltsev A.N., Lutsenko E.D., Dubrava T.G., Ostankov M.V. Modification of state of bone marrow hemopoietic cells after cryopreservation // Proceedings of International Conference “Preservation of genetic resources”.– Saint-Petersburg, 2004.– P. 783-784. Grischenko V.I. The role of cryobiology in creation of biotechnologies for cellular and tissue transplantation // Problems of Cryobiology.– 2001.– N3.– P. 7-9. Dubrava T.G. Efficiency of cryopreservation of hemopoietic cells depending on their initial properties: Author’s thesis of candidate of biological sciences.– Kharkov, 1986.– 25 p. Kozlova Yu.A., Goltsev A.N., Dubrava T.G., Gurina T.M. Premises for optimizing the method of bone marrow cryopreservation in animals with autoimmune pathologies // Problems of Cryobiology.– 2004.– N2.– P. 76-83. Shereshkov S.I. Culturing of hemopoietic cells on semi-solid nutrient media // Lab. Delo.– 1974.– N3.– P. 146-150. Shmarov D.A. Estimation of proliferative activity of bone marrow cells using flow cytometry method // Klinicheskaya laboratornaya diagnostika.– 1993.– N5.– P. 40-43. Patent N2004031694 Ukraine, IPC A61B5/00. Way for comparative estimation of treatment efficiency / A.N. Goltsev, L.V. Ostankova, O.D. Lutsenko, T.G. Dubrava, N.N. Babenko, I.V. Rassokha, A.Yu. Gorskaya, Yu.O. Kozlova. Filed 09.03.04; Published 15.12.2004.– Bull. N12.– P.3.12. Kawamura M., Hisha H., Lia Y. et al. Distinct qualitative differences between normal and abnormal hemopoietic stem cells in vivo and in vitro // Stem cells.– 1997.– №1.– P. 56-62. Papadaki H.A., Kritikos H.D., Gemetzi C. et al. Bone marrow progenitor cell reserve and function and stromal cell function are defective in rheumatoid arthritis: evidence for a tumor necrosis factor alpha-mediated effect // Blood.– 2002.– Vol. 99, N5.– P. 1610-1619. Pearson C.M., Wood F.D. Studies of arthritis and other lesions induced in rats by the injection of mycobacterial adjuvant // Am. J. Pharmacol.– 1963.– Vol.42.– P. 73-95. Рorta C., Capolari R., Elis O. et al. Impaired bone marrow hematopoietic progenitor cell function in rheumatoid arthritis patients candidate to autologous hematopoietic stem cell transplantation // Bone Marrow Transplant.– 2004.– Vol. 33, N7.– P. 721-728. Tyndall A. Haematological stem cell transplantation in the treatment of severe autoimmune diseases: first experiences from an international project // J. Rheumatol. – 1999.– Vol.38, N4.– P.482-488. Accepted in 21.06.2005 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.

Репозитарії

Схожі ресурси