Криопротекция полиэтиленгликолем и декстраном модифицированных эритроцитов
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Datum: | 2005 |
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2005
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138514 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Криопротекция полиэтиленгликолем и декстраном модифицированных эритроцитов / В.В. Рамазанов, О.А. Олейник, В.А. Бондаренко // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 4. — С. 622-629. — Бібліогр.: 19 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860246672705060864 |
|---|---|
| author | Рамазанов, В.В. Олейник, О.А. Бондаренко, В.А. |
| author_facet | Рамазанов, В.В. Олейник, О.А. Бондаренко, В.А. |
| citation_txt | Криопротекция полиэтиленгликолем и декстраном модифицированных эритроцитов / В.В. Рамазанов, О.А. Олейник, В.А. Бондаренко // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 4. — С. 622-629. — Бібліогр.: 19 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| first_indexed | 2025-12-07T18:37:23Z |
| format | Article |
| fulltext |
622
УДК 57.043:612.111:547.422
Криопротекция полиэтиленгликолем и декстраном
модифицированных эритроцитов
В.В. РАМАЗАНОВ, О.А. ОЛЕЙНИК, В.А. БОНДАРЕНКО
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Cryoprotection of Modified Erythrocytes with Polyethylene
Glycol and Dextran
V.V. RAMAZANOV, O.A. OLEJNIK, V.A. BONDARENKO
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy
of Sciences of the Ukraine, Kharkov
Исследовали влияние предварительной модификации цитоскелета на сохранность эритроцитов, замороженных с
полиэтиленгликолем (ПЭГ) и декстраном, и на динамику их лизиса после ресуспендирования в изотонических средах с
различными анионами (хлорид, сульфат, цитрат). Показали, что сохранность модифицированных эритроцитов после
замораживания с ПЭГ выше по сравнению с декстраном. В то же время ресуспендирование размороженных эритроцитов в
средах с различными анионами свидетельствует, что клетки, замороженные с ПЭГ, менее осмотически устойчивы, а кривые
лизиса в средах с различными анионами менее отличаются между собой, чем с декстраном. Полученные результаты
подтверждают, что декстран, по сравнению с ПЭГ, в большей степени удерживает развитие повреждений в мембранах при
замораживании, инициируемых обработкой эритроцитов модификаторами цитоскелета.
Ключевые слова: эритроцит, замораживание, ПЭГ, декстран.
Досліджували вплив попередньої модифікації цитоскелета на схоронність еритроцитів, заморожених с поліетиленгліколем
(ПЕГ) і декстраном, і на динаміку їхнього лізису після ресуспендування в ізотонічних середовищах з різними аніонами (хлорид,
сульфат, цитрат). Показали, що схоронність модифікованих еритроцитів після заморожування з ПЕГ вище в порівнянні з
декстраном. Ресуспендування розморожених еритроцитів у середовищах з різними аніонами свідчить, що клітини, заморожені
з ПЕГ, менш осмотично стійкі, а криві лізису в середовищах з різними аніонами менш різняться між собою, ніж з декстраном.
Отримані результати свідчать про те, що декстран, у порівнянні з ПЕГ, більше стримує розвиток ушкоджень у мембранах при
заморожуванні, що ініціюються обробкою еритроцитів модифікаторами цитоскелета.
Ключові слова: еритроцит, заморожування, ПЕГ, декстран.
There was investigated the effect of preliminary cytoskeletal modification on the integrity of erythrocytes, frozen with polyethylene
glycol (PEG) and dextran, as well as on dynamics of their lysis after resuspending in isotonic media with different anions (chloride,
sulfate, citrate). Integrity of modified erythrocytes after freezing with PEG was shown to be higher if comparing with dextran. At the
same time resuspension of frozen-thawed erythrocytes in the media with different anions testifies to the fact, that cells, frozen with
PEG are less osmotically resistant and lysis curves in the media with various anions are less different than with dextran. The results
obtained confirm, that dextran, in comparison with PEG in a greater extent retains the development of damages in membranes during
freezing, which are initiated by erythrocyte treatment with cytoskeletal modifiers.
Key-words: erythrocyte, freezing, PEG, dextran.
UDC 57.043:612.111:547.422
Адрес для корреспонденции: Рамазанов В.В., Институт проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины, ул. Переяславская,
23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38 (057) 373-41-35, факс: +38
(057) 373-30-84, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Address for correspondence: Ramazanov V.V., Institute for Problems
of Cryobiology&Cryomedicine of the Natl. Acad. Sci. of Ukraine, 23,
Pereyaslavskaya str.,Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 4135,
fax: +380 57 373 3084, e-mail:cryo@online.kharkov.ua
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №4
В растворе молекулы ПЭГ и декстранов при
контакте с поверхностью образуют специфи-
ческую межфазную структуру, состоящую из
адсорбированного и истощенного слоев полимера,
толщина которых определяется молекулярной
массой, концентрацией полимера и температурой
раствора [12]. Исследование влияния температуры
на взаимодействие белков с криопротектором
показало, что стабилизация белков при снижении
температуры определяется исключением криопро-
текторов из гидратной оболочки белков [9].
Уменьшение связывания ПЭГ-1500 с эритро-
цитами при снижении температуры консерванта
создает положительный эффект для поддержания
структуры цитоскелета, морфологии и сохранности
клеток после замораживания [1]. Использование
In solution PEG and dextran molecules when
contacting with surface form specific interphase
structure, comprising adsorbed and exhausted polymer
layers, which thickness is determined by molecular
mass, polymer concentration and solution temperature
[12]. Studying the temperature effect on interaction
of proteins with a cryoprotectant demonstrated, that
protein stabilisation at temperature decrease was
determined by excluding cryoprotectants from protein
hydrate membrane [9].
Reduction of PEG-1500 binding with erythrocytes
at a decrease in preservative temperature causes a
positive effect to maintain the structure of cytoskeleton,
morphology and integrity of cells after freezing [1].
Even if dextran usage in 30% concentration causes a
positive effect on cell morphology, osmotic fragility of
623ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №4
декстрана в 30%-й концентрации, хотя и оказывает
положительное влияние на морфологию клеток,
однако осмотическая хрупкость отмытых после
замораживания эритроцитов значительно отли-
чается от нормального поведения [13], что
указывает на существенное повреждение мембра-
ны и цитоскелета. Замораживание с гидроксиэтил-
крахмалом изменяет взаимодействия белков
цитоскелета и вызывает потерю мембранами
части спектрина [18]. Модификация взаимо-
действий между белками цитоскелета приводит к
значительной потере чувствительности клеток к холо-
довому и гипертоническому шоку [4], тогда как к
постгипертоническому лизису она повышается [3].
Цель работы – сравнить криопротекторные
свойства ПЭГ и декстрана при замораживании
модифицированных эритроцитов. Как выяснилось,
модификация цитоскелета приводит к значительной
потере устойчивости клеток к замораживанию с
полимерами и, следовательно, используемые в
экспериментах обработки повышают чувстви-
тельность клеток к замораживанию и к лизису после
ресуспендирования. Тем не менее анализ сохранности
клеток после ресуспендирования в изотонических
средах с различными анионами позволяет сравнить
криопротекторные свойства двух различных
полимеров.
Материалы и методы
В работе использовали соли NaCl, Na2SO4, Na-
лимонно-кислый трёхзамещённый, а также
сахарозу марки “чда”, ПЭГ-2000 (Merck) и
декстран-35 с молекулярной массой 35000-50000
(Serva), йодоацетамид (ЙАА) производства Serva,
парахлормеркурийбензоат (ПХМБ) производства
Sigma. Эритроциты человека получали из донор-
ской крови четырехкратным отмыванием раство-
ром с 0,15 М NaCl, 10 мМ трис, рН 7,6. Клетки с
20%-м гематокритом в среде, содержащей 90 мМ
KCl, 45 мМ NaCl, 44 мМ сахарозы, 10 мМ трис,
рН 7,6, обрабатывали гемином (300 мкМ) при 37°С,
время инкубации 10 мин [4]. Обработка ЙАА
проводилась 15 мин с добавлением ПХМБ до
конечной концентрации 1 мМ, время инкубации
60 мин [6] с последующим отмыванием средой
обработки (3 раза) и средой отмывания (2 раза).
Осадки эритроцитов смешивали со средой
замораживания (20% ПЭГ или декстрана), приго-
товленной на растворе, содержащем 50 мМ NaCl,
200 мМ сахарозы, 10 мМ трис, рН 7,6. Образцы с
объемом суспензии 1 мл замораживали погру-
жением в жидкий азот, выдерживали 15 мин и
размораживали на водяной бане (40°С) в течение
3-х минут. Размороженную суспензию разводили
средой замораживания и центрифугировали для
выявления степени гемолиза в надосадке. Для
erythrocytes, washed-out after freezing considerably
differs from normal behavior [13], that indicates to a
considerable damage in membrane and cytoskeleton.
Freezing with hydroxyethylstarch changes interactions
of cytoskeletal proteins and causes a loss of spectrin
part by membranes [18]. Modification of interactions
between cytoskeletal proteins results in a considerable
loss of cell sensitivity to cold and hypertonic shock
[4], meanwhile it increases to post-hypertonic lysis [3].
The work was aimed to compare cryoprotective
properties of PEG and dextran during modified
erythrocytes freezing. Cytoskeletal modification was
found out to result in a considerable loss of cell
resistance to freezing with polymers and, consequently,
the treatments used in the experiments increase cell
sensitivity to freezing and lysis after resuspending.
However, the analysis of cell integrity after resus-
pending in isotonic media with different anions enables
to compare cryoprotective properties of two different
polymers.
Materials and methods
In the work we used such salts as: NaCl, Na2SO4,
tri-sodium citrate, sucrose with “pure for analysis”
grade, PEG-2000 (Merck), dextran-35 with 35000-
50000 molecular mass (Serva), iodoacetamide (IAA)
(Serva), parachloromercuriobenzoate (PCMB)
(Sigma). Human erythrocytes were procured from
donor blood by fourfold washing-out with the solution,
containing 0.15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7.6. Cells
with 20% hematocrit in the medium with 90 mM KCl,
45 mM NaCl, 44 mM sucrose, 10 mM Tris, pH 7.6
were hemin-treated (300 мM) at 37°C with 10 min
incubation time [4]. IAA treatment duration was 15 min
with following adding PCMB up to 1 mM final
concentration, incubation time was 60 min [6] with
following washing-out with treatment medium (thrice)
and washing-out medium (twice). Erythrocyte
sediments were mixed with freezing medium (20%
PEG or dextran), prepared with the solution, contained
50 mM NaCl, 200 mM sucrose, 10 mM Tris, pH 7.6.
Samples with 1 ml suspension volume were frozen by
immersing into liquid nitrogen, exposed for 15 min and
thawed on water bath (40°C) during 3 min. Frozen-
thawed suspension was diluted with freezing medium
and centrifuged for revealing the hemolysis extent in
supernatant. In order to determine the erythrocyte
resistance to resuspension, 50 мl of frozen-thawed
suspension was transferred into isotonic medium of
1ml volume, exposed up to 60 min, then centrifuged
and the hemolysis extent was calculated by the formula:
H =
−
B
A1 × 100,
were A is a part of residual at resuspension; B is a
part of residual after freeze-thawing.
624ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №4
определения устойчивости эритроцитов к ресус-
пендированию 50 мкл размороженной суспензии
переносили в изотоническую среду объёмом 1 мл
и выдерживали до 60 мин, центрифугировали и
степень гемолиза рассчитывали по формуле:
Г =
−
B
A1 × 100,
где А – доля остатка при ресуспендировании; В –
доля остатка после размораживания.
Повреждение эритроцитов при постгипер-
тоническом лизисе или ресуспендировании после
замораживания связано с входом в клетки ионов
натрия и хлорида. Хлоридный анион обладает
высокой проницаемостью и не ограничивает
поступление катионов натрия в клетку. Замена
хлорида на менее проникающий или непро-
никающий анион должна задерживать поступление
катионов в клетку, если мембрана не будет иметь
значительные повреждения, проницаемые для
анионов по Стоксовскому радиусу, превышающие
хлоридный анион [2]. С учетом этого в экспери-
ментах при ресуспендировании использовали
изотонические среды, содержащие 0,15 М NaCl;
0,1 М Na2SO4; 0,1M Na-цитрат; 0,3 М сахарозы,
приготовленные на 10 мМ трис-буфере (рН 7,6).
Результаты и обсуждение
Модификация эритроцитов гемином не вызы-
вает значительного повреждения клеток после
замораживания в растворах с ПЭГ, а с декстраном
отмечается существенная разница между сохран-
ностью нормальных и модифицированных эритро-
цитов (рис. 1). Обработка клеток ЙАА+ПХМБ
снижает устойчивость после замораживания,
однако сохранность при использовании ПЭГ выше
и составляет 79-83%, с декстраном – 55-65%.
Лизис после ресуспендирования в изотонических
средах после замораживания в растворах,
содержащих ПЭГ, несколько выше, чем декстрана
(рис. 2). При ресуспендировании эритроцитов,
модифицированных гемином, гемолиз возрастает
как для эритроцитов, замороженных в средах с
ПЭГ, так и с декстраном, однако степень лизиса
менее зависит от вида аниона для клеток,
замороженных с ПЭГ, чем с декстраном (рис. 3).
Обработка эритроцитов ЙАА+ПХМБ приводит к
ещё большему повышению уровня лизиса при
ресуспендировании эритроцитов, замороженных с
ПЭГ, выраженность между кривыми лизиса
которых в изотонических средах с различными
анионами уже не проявляется (рис. 4, а). В то же
время указанная модификация незначительно
повышает лизис при ресуспендировании эритро-
цитов, замороженных с декстраном, и остаются
различия между кривыми лизиса с различными
Erythrocyte damage at post-hypertonic lysis or
resuspension after freezing is related to sodium and
chloride ion incoming into cells. Chloride anion has a
high permeability and does not limit sodium cation
incoming into a cell. Replacing chloride by less
penetrative or non-penetrative anion should retain
cation entering into a cell, if membrane is not
significantly damaged because of those permeable for
anions by Stoksowsky radius, exceeding chloride anion
[2]. Taking into account this fact, the isotonic media,
containing 0.15 M NaCl; 0.1 M Na2SO4; 0.1 M
NA-citrate; 0.3 M sucrose, prepared on 1 mM Tris-
buffer (pH 7.6) were used in the experiments at
resuspension.
Results and discussion
Hemin-modification of erythrocytes does not cause
a significant cell damage after freezing in solutions with
PEG, but there is a considerable difference between
the integrity of normal and modified erythrocytes
(Fig. 1). IAA+PCMB cell treatment reduces the
resistance after freezing, but when using PEG the
integrity makes 79-83 and 55-65% for dextran. Lysis
after resuspension in isotonic media after freezing in
PEG-contained solutions is slightly higher, than in
dextran-contained ones (Fig. 2). When resuspending
hemin-modified erythrocytes, hemolysis increases for
both erythrocytes, frozen in media with PEG and
dextran, however lysis extent less depends on anion
type for cells, frozen with PEG than with dextran
(Fig. 3). IAA+PCMB erythrocyte treatment results in
much greater augmentation of lysis level when
resuspending erythrocytes, frozen with PEG, where mani-
festation rate between lysis curves in isotonic media
with different anions has not manifested yet (Fig. 4, a).
At the same time the mentioned modification not so
significantly increases lysis when resuspending dextran-
frozen erythrocytes and the differences between lysis
curves with different anions (Fig. 4, b) as well as for
hemin-treated erythrocytes (Fig. 3, b) are kept.
Thus, significant differences of PEG and dextran
effect on the integrity of pre-modified frozen
erythrocytes, are revealed. Differences in protection,
revealed after freeze-thawing (see Fig. 1) and after
transferring into isotonic media (Fig. 2-4) testify to
better protection with PEG and dextran, cor-
respondingly. Such contradiction can be explained by
more manifested PEG capability to hide damages
development during freeze-thawing cycle, initiated by
mentioned modifications, which are manifested during
cell resuspension in isotonic media. The situation is
quite opposite when using dextran and less manifested
hemolysis development at resuspension confirms higher
cryoprotective properties of this polymer.
It was mentioned previously to apparent cryo-
protective properties of polymers [19], related to a
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20
625ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №4
Рис. 1. Сохранность эритроцитов после замораживания в присутствии различных концентраций ПЭГ (а) или декст-
рана (б); 1 – контрольные эритроциты; 2 – эритроциты, обработанные гемином.
Fig. 1. Erythrocyte integrity after freezing at the presence of different concentrations of PEG (a) or dextran (b): 1 – control
erythrocytes; 2 – hemin-treated ones.
С
ох
ра
нн
ос
ть
, %
In
te
gr
ity
, %
С
ох
ра
нн
ос
ть
, %
In
te
gr
ity
, %
Концентрация ПЭГ, %
PEG concentration, %
Концентрация декстрана, %
Dextran concentration, %
анионами (рис. 4, б) как и для эритроцитов,
обработанных гемином (см. рис. 3, б).
Таким образом, выявляются существенные
различия влияния ПЭГ и декстрана на сохранность
замороженных эритроцитов, которые были пред-
варительно модифицированы. Отличия в протек-
ции, выявляемые после размораживания (см.
рис. 1), свидетельствуют о лучшей протекции с
ПЭГ, а после перенесения в изотонические среды
(рис. 3, 4) – с декстраном. Такое противоречие
можно объяснить более выраженной способнос-
тью ПЭГ скрывать развитие повреждений в цикле
замораживания-оттаивания, инициируемых указан-
ными модификациями, которые выявляются при
ресуспендировании клеток в изотонических средах.
При использовании декстрана ситуация противо-
положная, а менее выраженное развитие гемолиза
при ресуспендировании подтверждает лучшие
криопротекторные свойства данного полимера.
Указывалось на кажущиеся криопротекторные
свойства полимеров [19], связанные со снижением
поверхностной энергии растворов криопротекторов,
которая становится ниже, чем у раствора гемо-
глобина. На поверхности поврежденных клеток
полимеры образуют устойчивую интерфазу,
которая создает не только протекторный эффект,
но и скрывает мембранные дефекты, через
которые гемоглобин не может легко проходить.
Однако ПЭГ по сравнению с декстраном не
обладает достаточным потенциалом, снижающим
поверхностную энергию раствора при повышении
его концентрации [19]. Такой факт находится в
противоречии с результатом настоящей работы,
так как ПЭГ в большей степени, чем декстран
скрывает повреждения эритроцитов, которые
decrease in surface energy of cryoprotectant solution,
which became lower than in hemoglobin solution. On
a surface of damaged cells polymers form a resistant
interphase, which creates not only a protective effect
but hides membrane defects, through which hemoglobin
can not easily pass. But PEG in comparison with
dextran does not have a sufficient potential, decreasing
a surface energy of solution with an increase of its
concentration [19]. Such a fact contradicts this work
results, because PEG in a greater extent than dextran
hides erythrocyte damages, manifesting only during
resuspension. It proceeds that PEG has a damaging
effect at its desorption from cell surface due to
erythrocyte resuspension.
Cryoprotectants interact with membranes via
hydrophobic contacts or hydrogen bonds with
phospholipid heads. Under freezing conditions
cryoprotectant should be bound with lipid bilayer for
maintaining its integrity. However it is not clear which
of two mentioned interactions is more resistant and
important under cryoprotective conditions [8].
According to existing notions, polymers are sorbed on
cell surface, by changing glycocalyx packing. Effects
on lipid bilayer can be mediated by decreasing dielectric
constant, by strengthening cell surface hydrophobicity
and phospholipid dehydration [7, 11]. In this connection
permeability increase for Ca2+ and fusion of liposomes
and erythrocytes at PEG presence occur by the same
mechanism as a result of dehydration and formation
of membrane local damages [7]. Change in poly-
morphous state of bilayer is supposed to be a reason
for PEG antilytic effect on liposomes at melittin
presence [16].
According to the data [13, 14] the used in freezing
media dextran concentrations are within the range of
а а б b
1
2
1
2
626ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №4
0
10
20
30
40
50
0 15 30 45 60
0
10
20
30
40
50
0 15 30 45 60
Рис. 2. Лизис размороженных эритроцитов после замораживания в присутствии 20%-го ПЭГ (а) или 20%-го декстрана (б)
после ресуспендирования в изотонических средах: 1– 0,15 М NaCl; 2 – 0,1 М Na2SO4; 3 – 0,1 М Na-цитрат; 4 – 0,3 М
сахарозы.
Fig. 2. Lysis of frozen-thawed erythrocytes at the presence of of 20% PEG (a) or 20% dextran (b) after resuspending in
isotonic media: 1 – with 0.15 M NaCl; 2 – 0.1 M Na2SO4; 3 – 0.1 M sodium citrate; 4 – 0.3 M sucrose.
Время, мин
Time, min
Время, мин
Time, min
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
выявляются только при ресуспендировании. Из
этого следует, что ПЭГ обладает повреждающим
действием при его десорбции от поверхности
клетки вследствие ресуспендирования эритро-
цитов.
Криопротекторы взаимодействуют с мемб-
ранами за счет гидрофобных контактов или
водородных связей с головками фосфолипидов. В
условиях замораживания криопротектор должен
оставаться связанным с липидным бислоем,
чтобы поддерживать его целостность. Однако
неясно, какое из двух указанных взаимодействий
устойчивее и важнее в условиях криопротекции [8].
По сложившимся представлениям, полимеры
сорбируются на поверхности клетки, изменяя
упаковку гликокаликса. Воздействия на липидный
бислой могут быть опосредованы снижением
диэлектрической константы, усилением гидрофоб-
ности поверхности клеток и дегидратацией
фосфолипидов [7, 11]. В связи с этим повышение
проницаемости для Са2+ и слияние липосом и
эритроцитов в присутствии ПЭГ происходят по
одному механизму вследствие дегидратации и
образования локальных повреждений мембран [7].
Полагают, что изменение полиморфного состояния
бислоя является причиной антилитического
действия ПЭГ на липосомы в присутствии
меллитина [16].
Согласно данным [13, 14], используемые
концентрации декстрана в средах замораживания
находятся в интервале 5-40%, но его оптимальное
количество остаётся под вопросом. Использование
высоких концентраций декстрана нежелательно
из-за дополнительного приращения осмотического
5-40%, but its optimal amount remains unclear.
However the usage of high dextran concentrations is
unwanted due to an additional increment of osmotic
gradient [14]. Erythrocytes, frozen in 30% dextran-
contained medium have satisfactory morphological
index, but the behavior of osmotic fragility curve
considerably deviates of the normal one [13]. A
decrease in osmotic resistance of erythrocytes at salt
concentrations, close to isotonic ones, indicates to
membrane and cytoskeletal damages.
The question arises if the disorders in cytoskeleton
similar to those, formed during erythrocyte modification
by hemin or IAA+PCMB, can occur during freezing.
Hemin easily penetrates through erythrocyte
membrane, binds with cytoskeletal proteins (band 4.1,
actin, spectrin), that results in their dissociation and
following membrane destruction. If bonds in
cytoskeleton are partially modified, cytoskeleton is
capable to maintain membrane structure, however such
cytoskeleton-membrane complex is mechanically
slightly stable [17]. Hemin treatment results in an
increase in osmotic fragility, considerable loss of
erythrocyte sensitivity to cold and hypertonic shock
[4], an increase in sensitivity to post-hypertonic lysis
[3]. At the same time IAA+PCMB erythrocyte
treatment slightly increases sensitivity to cold and
hypertonic shock [5] and does not change it to post-
hypertonic lysis [3]. This treatment eliminates DIDS
effect on cold and hypertonic shock. This enables to
suppose that the inhibitor effect is mediated by band 3
protein-cytoskeleton bond [5, 6]. At the mentioned
modification PCMB is bound in a hydrophobic
fragment of band 3 protein inside a membrane, at the
same time there is a change in conformation of
а а б b
1
2
3
4
1
2
3
4
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60
627ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №4
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Время, мин
Time, min
Время, мин
Time, min
градиента [14]. Эритроциты, замороженные в
среде, содержащей 30% декстрана, имеют
удовлетворительный морфологический показатель,
но поведение кривой осмотической хрупкости
существенно отклоняется от нормального [13].
Снижение осмотической устойчивости эритроцитов
при концентрациях соли, близких к изотоническим,
указывает на повреждения мембраны и цито-
скелета.
Возникает вопрос, могут ли при замораживании
происходить нарушения в цитоскелете, подобные
тем, которые образуются при модификации
эритроцитов гемином или ЙAA+ПХМБ. Гемин
свободно проникает через мембрану эритроцитов,
связывается с белками цитоскелета (полоса 4.1,
актин, спектрин), что приводит к диссоциации их и
последующей деструкции мембраны. Если связи
в цитоскелете модифицируются частично, то
цитоскелет способен поддерживать структуру
мембраны, однако такой цитоскелет-мембранный
комплекс является механически слабо стабиль-
ным [17]. Обработка гемином приводит к
повышению осмотической хрупкости, значительной
потере чувствительности эритроцитов к холодо-
вому и гипертоническому шоку [4], повышению
чувствительности к постгипертоническому лизису
[3]. В то же время обработка эритроцитов
ЙAA+ПХМБ несколько увеличивает чувстви-
тельность к холодовому и гипертоническому шоку
[5] и не изменяет к постгипертоническому лизису
[3]. Данная обработка снимает действие ДИДС
на холодовой и гипертонический шок. Это
позволило предположить, что действие ингибитора
опосредуется связью белок полосы 3-цитоскелет
[5,6]. При указанной модификации ПХМБ связы-
вается в гидрофобном фрагменте белка полосы 3
внутри мембраны, при этом изменяется конфор-
мация цитоплазматической части данного белка,
который теряет способность связываться с
анкирином [10]. Длительная обработка с ПХМБ
приводит к везикуляции мембраны [10,15]. Данные
[1, 13, 18] свидетельствуют о том, что при
замораживании изменяются морфологические и
реологические свойства, связанные с модифи-
кацией структуры цитоскелета и потерей части его
белков. При модификации гемином мембраны
эритроцитов также теряют некоторые белки, тогда
как при обработке ЙАА+ПХМБ, они не только
удерживают все основные белки, но и приобретают
свойства сорбировать дополнительные из цитоплаз-
мы [6]. Поскольку мембрана и цитоскелет
являются основной мишенью повреждений при
замораживании, то, очевидно, места взаимодейст-
вия цитоскелета с мембраной будут наиболее
уязвимыми точками влияния повреждающих
факторов [3-6].
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60
Рис. 3. Влияние обработки гемином на лизис ресус-
пендированных эритроцитов. Обозначения те же, что и
на рис. 2.
Fig. 3. Effect of hemin treatment on lysis of resuspended
erythrocytes. The same legends as in Fig. 2.
cytoplasmic part of this protein, which loses the
property to be bound with ankyrin [10]. Long-term
PCMB treatment results in membrane vesiculation [10,
15]. Data in the papers [1, 13, 18] testify to the fact
that during freezing there are the changes in
morphological and rheologic properties, related to
modification of cytoskeletal structure and a loss of its
proteins part. Under hemin modification erythrocyte
membranes lose also some proteins, meanwhile during
IAA+PCMB treatment they not only retain all main
proteins but get the properties to sorb additional ones
from cytoplasm [6]. Since membrane and cytoskeleton
are the main target of damages during freezing [1, 13,
18], evidently, the places of interaction of cytoskeleton
а а
б b
1
2
3
4
1
2
3
4
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №4
628
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Время, мин
Time, min
Время, мин
Time, min
Рис. 4. Влияние обработки ЙАА+ПХМБ на лизис ресуспендированных эритроцитов. Обозначения те же, что и на
рис. 2.
Fig. 4. Effect of IAA+PCMB treatment on lysis of resuspended erythrocytes. The same legends as in Fig. 2.
Выводы
Анализ литературных данных позволяет
сделать некоторые предположения относительно
различий в криопротекторных и повреждающих
действиях ПЭГ и декстрана на мембрану при
замораживании эритроцитов. Кажущееся более
выраженное протекторное действие ПЭГ по
сравнению с декстраном в цикле замораживания-
оттаивания определяется существованием особой
интерфазы в условиях дегидратации, повышения
гидрофобности и изменения полиморфного
состояния липидов мембраны. В этой ситуации
адсорбированный слой ПЭГ образует с мембраной
комплекс, более устойчивый к низким темпе-
ратурам, чем с декстраном. Однако при замора-
живании-оттаивании такой комплекс ПЭГ с
мембраной приобретает свойство единого образо-
вания, а десорбция полимера при ресуспенди-
ровании становится повреждающей процедурой.
Менее выраженное развитие повреждений при
ресуспендировании модифицированных эритроци-
тов, замороженных с декстраном, по сравнению с
ПЭГ, свидетельствует о том, что декстран в
большей степени способен предупреждать
развитие повреждений как от нарушений взаимо-
действий между белками цитоскелета (обработка
гемином), так и от модификации взаимодействия
цитоскелета с мембраной (обработка ЙАА+
ПХМБ).
with membrane will be the most vulnerable points for
damaging factor effect [3-6].
Conclusions
Analysis of literature data enables assuming about
differences in PEG and dextran cryoprotective and
damaging effects on membrane during erythrocyte
freezing. Apparent more manifested protective effect
of PEG in comparison with dextran in freeze-thawing
cycle is determined by the presence of special
interphase under dehydration conditions, an increase
in hydrophobicity and change in polymorphous state
of membrane lipids. In this situation PEG adsorbed
layer forms with membrane more resistant complex
to low temperatures than in case with dextran.
However during freeze-thawing such PEG-membrane
complex gets the property of integrated formation, and
polymer desorption at resuspension becomes a
damaging procedure. Less manifested development of
damages when resuspending modified erythrocyte,
frozen with dextran, in comparison with PEG testifies
to the fact, that dextran in a greater extent is capable
to prevent damages development, proceeding from
disorder in interactions between cytoskeletal proteins
(hemin treatment), as well as from modification of
cytoskeletal interaction with membrane (IAA+PCMB
treatment).
а а б b
1 2
3 4 1
2
3
4
Литература
Бабийчук Л.А. Землянских Н.Г. Влияние полиэтилен-
оксида-1500 и температуры на особенности моди-
References
Babijchuk L.A., Zemlyanskikh N.G. Effect of polyethylene
oxide-1500 and temperature on modification peculiarities of
erythrocyte membranes // Problems of Cryobiology.– 1996.–
N4.– P. 32-38.
1.
1.
Olejnik O.A., Abu Al Asal F., Ramazanov V.V., Bondaren-
ko V.A. Effect of various anions on post-hypertonic lysis of
erythrocytes // Problems of Cryobiology.– 2003.– N2.–
P. 22-31.
Olejnik O.A., Ramazanov V.V., Bondarenko V.A. Post-
hypertonic lysis of modified erythrocytes in citrate medium //
Problems of Cryobiology.– 2003.– N3.– P. 21-30.
Ramazanov V.V., Bondarenko V.A. Hemin and DIDS effect on
cold and hypertonic shock of erythrocytes // Problems of
Cryobiology.– 1996.– N2.– P. 13-17.
Ramazanov V.V., Bondarenko V.A. Comparative study of cold
and hypertonic shock of erythrocytes in NaCl solution //
Problems of Cryobiology.– 1996.– N1.– P. 34-37.
Ramazanov V.V., Semenchenko A.Yu., Volovelskaya E.L. et
al. Effect of stability of peripheric protein bond with
membranes on erythrocyte hypertonic shock // Problems of
Cryobiology.– 1996.– N3.– P. 8-12.
Aldwinckle T.J., Ahkong Q.F., Bangham A.D. et al. Effect of
poly(ethylene glycol) on liposomes and erythrocytes.
Permeability changes and membrane fusion // Biochim.
Biophys. Acta.– 1982.– Vol. 689, N3.– P. 548-560.
Anchordoguy T.J, Rudolph A.S, Carpenter J.F, Crowe J.H.
Modes of interaction of cryoprotectants with membrane
phospholipids during freezing // Cryobiology.– 1987.– Vol. 24,
N4.– P. 324-331.
Arakawa T., Carpenter J.F., Kita Y.A, Crowe J.H. The basis
for toxicity of certain cryoprotectants: a hypothesis //
Cryobiology.– 1990.– Vol. 27, N4.– P. 401-415.
Clark S.J., Ralston G. B. The dissociation of peripheral
proteins from erythrocyte membrane brought about by p-
mercuribenzenesulfonate // Biochim. Biophys. Acta.– 1990.–
Vol. 1021, N2.– P. 141-147
Herrmann A.,Pratsch L.,Arnold H., Lassmann G. Effect of
poly(ethylene glycole) on the polarity of aqueous solutions
and on the structure of vesicle membranes// Biochim.
Biophys. Acta.– 1983.– Vol. 733, N1.– P. 87-94.
Neu B, Meiselman H.J. Depletion-mediated red blood cell
aggregation in polymer solutions // Biophys. J.– 2002.– Vol. 83,
N5.– P. 2482-2490.
Pellerin-Mendes C., Million L., Marchand-Arvier M. et al. In
vitro study of the protective effect of trehalose and dextran
during freezing of human red blood cells in liquid nitrogen //
Cryobiology.– 1997.– Vol. 35, N2.– P. 173-86.
Pribor D.B., Pribor. H.C. Studies with dextran 40 in
cryopreservation of blood // Cryobiology.– 1973.– Vol.10, N2.–
P.93-103.
Ralston G. B., Crisp E.A. The action of organic mercurials on
the erythrocyte membrane // Biochim. Biophys. Acta.– 1981.–
Vol. 649, N1.– P. 98-104.
Rex S., Bian J., Silvius J.R., Lafleur M. The presence of
PEG-lipids in liposomes does not reduce melittin binding but
decreases melittin-induced leakage // Biochim. Biophys.
Acta.– 2002.– Vol. 1558, N2.– P. 211-221.
Shaklai N., Avissar N., Rabizaden E., Shaklai M.
Disintegration of red cell membrane cytoskeleton by hemin //
Biochem. Internat.– 1986.– Vol. 3, N3.– P. 467-477.
Singbartl K., Langer R., Henrich A. Altered membrane
skeleton of hydroxyethylstarch-cryopreserved human
erythrocytes // Cryobiology.– 1998.– Vol. 36, N2.– P.115-123.
Williams R.J. The surface activity of PVP and other polymers
and their antihemolytic capacity // Cryobiology.– 1983.–
Vol. 20, N5.– P. 521-526.
Accepted in 30.11.2004
фикации мембран эритроцитов // Пробл. криобиологии.–
1996.– №4.– С.32-38.
Олейник О.А., Абу Аль Асаль Ф., Рамазанов В.В. ,
Бондаренко В.А. Влияние различных анионов на
постгипертонический лизис эритроцитов // Пробл.
криобиологии.– 2003.– №2.– С. 22-31.
Олейник О.А., Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Пост-
гипертонический лизис модифицированных эритроцитов
в цитратной среде // Пробл. криобиологии.– 2003.– №3.–
С. 21-30.
Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Действие геминa и
ДИДС на холодовой и гипертонический шок эритроци-
тов // Пробл. криобиологии.– 1996.– №2.– С. 13-17.
Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Сравнительное
исследование холодового и гипертонического шока
эритроцитов в растворе NaCl // Пробл. криобиологии.–
1996.– №1.– С. 34-37.
Рамазанов В.В., Семенченко А.Ю., Воловельская Е.Л. и
др. Влияние прочности связи периферических белков с
мембранами на гипертонический шок эритроцитов //
Пробл. криобиологии.–1996.– №3.– С.8-12.
Aldwinckle T.J., Ahkong Q.F., Bangham A.D. et al. Effect of
poly(ethylene glycol) on liposomes and erythrocytes.
Permeability changes and membrane fusion // Biochim.
Biophys. Acta.– 1982.– Vol. 689, N3.– P. 548-560.
Anchordoguy T.J, Rudolph A.S, Carpenter J.F, Crowe J.H.
Modes of interaction of cryoprotectants with membrane
phospholipids during freezing // Cryobiology.– 1987.– Vol. 24,
N4.– P. 324-331.
Arakawa T., Carpenter J.F., Kita Y.A, Crowe J.H. The basis
for toxicity of certain cryoprotectants: a hypothesis //
Cryobiology.– 1990.– Vol. 27, N4.– P. 401-415.
Clark S.J., Ralston G. B. The dissociation of peripheral
proteins from erythrocyte membrane brought about by p-
mercuribenzenesulfonate // Biochim. Biophys. Acta.– 1990.–
Vol. 1021, N2.– P. 141-147
Herrmann A.,Pratsch L.,Arnold H., Lassmann G. Effect of
poly(ethylene glycole) on the polarity of aqueous solutions
and on the structure of vesicle membranes // Biochim.
Biophys. Acta.– 1983.– Vol. 733, N1.– P. 87-94.
Neu B, Meiselman H.J. Depletion-mediated red blood cell
aggregation in polymer solutions // Biophys. J.– 2002.– Vol. 83,
N5.– P. 2482-2490.
Pellerin-Mendes C., Million L., Marchand-Arvier M. et al. In
vitro study of the protective effect of trehalose and dextran
during freezing of human red blood cells in liquid nitrogen //
Cryobiology.– 1997.– Vol. 35, N2.– P. 173-86.
Pribor D.B., Pribor. H.C. Studies with dextran 40 in
cryopreservation of blood // Cryobiology.– 1973.– Vol.10, N2.–
P.93-103.
Ralston G. B., Crisp E.A. The action of organic mercurials on
the erythrocyte membrane // Biochim. Biophys. Acta.– 1981.–
Vol. 649, N1.– P. 98-104.
Rex S., Bian J., Silvius J.R., Lafleur M. The presence of
PEG-lipids in liposomes does not reduce melittin binding but
decreases melittin-induced leakage // Biochim. Biophys.
Acta.– 2002.– Vol. 1558, N2.– P. 211-221.
Shaklai N., Avissar N., Rabizaden E., Shaklai M.
Disintegration of red cell membrane cytoskeleton by hemin //
Biochem. Internat.– 1986.– Vol. 3, N3.– P. 467-477.
Singbartl K., Langer R., Henrich A. Altered membrane
skeleton of hydroxyethylstarch-cryopreserved human
erythrocytes // Cryobiology.– 1998.– Vol. 36, N2.– P.115-123.
Williams R.J. The surface activity of PVP and other polymers
and their antihemolytic capacity // Cryobiology.– 1983.–
Vol. 20, N5.– P. 521-526.
Поступила 30.11.2004
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
Т. 15, 2005, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 15, 2005, №4
629
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-138514 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:37:23Z |
| publishDate | 2005 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Рамазанов, В.В. Олейник, О.А. Бондаренко, В.А. 2018-06-19T08:29:22Z 2018-06-19T08:29:22Z 2005 Криопротекция полиэтиленгликолем и декстраном модифицированных эритроцитов / В.В. Рамазанов, О.А. Олейник, В.А. Бондаренко // Проблемы криобиологии. — 2005. — Т. 15, № 4. — С. 622-629. — Бібліогр.: 19 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138514 57.043:612.111:547.422 ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Криопротекция полиэтиленгликолем и декстраном модифицированных эритроцитов Cryoprotection of Modified Erythrocytes with Polyethylene Glycol and Dextran Article published earlier |
| spellingShingle | Криопротекция полиэтиленгликолем и декстраном модифицированных эритроцитов Рамазанов, В.В. Олейник, О.А. Бондаренко, В.А. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Криопротекция полиэтиленгликолем и декстраном модифицированных эритроцитов |
| title_alt | Cryoprotection of Modified Erythrocytes with Polyethylene Glycol and Dextran |
| title_full | Криопротекция полиэтиленгликолем и декстраном модифицированных эритроцитов |
| title_fullStr | Криопротекция полиэтиленгликолем и декстраном модифицированных эритроцитов |
| title_full_unstemmed | Криопротекция полиэтиленгликолем и декстраном модифицированных эритроцитов |
| title_short | Криопротекция полиэтиленгликолем и декстраном модифицированных эритроцитов |
| title_sort | криопротекция полиэтиленгликолем и декстраном модифицированных эритроцитов |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/138514 |
| work_keys_str_mv | AT ramazanovvv krioprotekciâpoliétilenglikolemidekstranommodificirovannyhéritrocitov AT oleinikoa krioprotekciâpoliétilenglikolemidekstranommodificirovannyhéritrocitov AT bondarenkova krioprotekciâpoliétilenglikolemidekstranommodificirovannyhéritrocitov AT ramazanovvv cryoprotectionofmodifiederythrocyteswithpolyethyleneglycolanddextran AT oleinikoa cryoprotectionofmodifiederythrocyteswithpolyethyleneglycolanddextran AT bondarenkova cryoprotectionofmodifiederythrocyteswithpolyethyleneglycolanddextran |