Производные гетерозидов – эффективные добавки к криозащитным средам
Исследовали влияние производных гетерозидов на активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и динамику синтеза и потребления фруктозы в сперматозоидах быка в условиях нормо-, гипотермии и криоконсервирования. Полученные данные свидетельствуют о том, что...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Datum: | 2004 |
| Hauptverfasser: | , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2004
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/139143 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Производные гетерозидов – эффективные добавки к криозащитным средам / В.И. Кабачный, Н.И. Горбунова // Проблемы криобиологии. — 2004. — № 2. — С. 28–35. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-139143 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Кабачный, В.И. Горбунова, Н.И. 2018-06-19T19:26:32Z 2018-06-19T19:26:32Z 2004 Производные гетерозидов – эффективные добавки к криозащитным средам / В.И. Кабачный, Н.И. Горбунова // Проблемы криобиологии. — 2004. — № 2. — С. 28–35. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/139143 577.112.384:591.044 Исследовали влияние производных гетерозидов на активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и динамику синтеза и потребления фруктозы в сперматозоидах быка в условиях нормо-, гипотермии и криоконсервирования. Полученные данные свидетельствуют о том, что криопротекторный эффект гетерозидов обусловлен активацией энергопродуцирующих ферментов. Кроме того, гетерозиды обладают способностью восстанавливать активность ферментов, поврежденных при охлаждении. Дослідили вплив похідних гетерозидів на активність сукцинатдегідрогенази, малатдегідрогенази, лактатдегідрогенази та динаміку синтезу і споживання фруктози в сперматозоїдах бугая за умов нормо-, гіпотермії та кріоконсервування. Одержані дані свідчать про те, що кріопротекторний ефект гетерозидів обумовлений активацією енергозабезпечуючих ферментів. Крім того, гетерозиди мають здатність відновлювати активність ферментів, ушкоджених при охолодженні. We have investigated the effect of heteroside derivatives on succinate dehydrogenase (SDG), malate dehydrogenase (MDG), lactate dehydrogenase (LDG) activity and dynamics of fructose synthesis and uptake in bovine spermatozoa under normo-, hypothermia and cryopreservation conditions. The data obtained testify to the fact, that heteroside cryoprotective effect is stipulated by the activation of energy-producing enzymes. In addition, heterosides recover the activity of enzymes, damaged during cooling. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Производные гетерозидов – эффективные добавки к криозащитным средам Heterozide Derivatives as Effective Additives to Cryoprotective Media Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Производные гетерозидов – эффективные добавки к криозащитным средам |
| spellingShingle |
Производные гетерозидов – эффективные добавки к криозащитным средам Кабачный, В.И. Горбунова, Н.И. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title_short |
Производные гетерозидов – эффективные добавки к криозащитным средам |
| title_full |
Производные гетерозидов – эффективные добавки к криозащитным средам |
| title_fullStr |
Производные гетерозидов – эффективные добавки к криозащитным средам |
| title_full_unstemmed |
Производные гетерозидов – эффективные добавки к криозащитным средам |
| title_sort |
производные гетерозидов – эффективные добавки к криозащитным средам |
| author |
Кабачный, В.И. Горбунова, Н.И. |
| author_facet |
Кабачный, В.И. Горбунова, Н.И. |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| publishDate |
2004 |
| language |
Russian |
| container_title |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Heterozide Derivatives as Effective Additives to Cryoprotective Media |
| description |
Исследовали влияние производных гетерозидов на активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и динамику синтеза и потребления фруктозы в сперматозоидах быка в условиях нормо-, гипотермии и криоконсервирования. Полученные данные свидетельствуют о том, что криопротекторный эффект гетерозидов обусловлен активацией энергопродуцирующих ферментов. Кроме того, гетерозиды обладают способностью восстанавливать активность ферментов, поврежденных при охлаждении.
Дослідили вплив похідних гетерозидів на активність сукцинатдегідрогенази, малатдегідрогенази, лактатдегідрогенази та динаміку синтезу і споживання фруктози в сперматозоїдах бугая за умов нормо-, гіпотермії та кріоконсервування. Одержані дані свідчать про те, що кріопротекторний ефект гетерозидів обумовлений активацією енергозабезпечуючих ферментів. Крім того, гетерозиди мають здатність відновлювати активність ферментів, ушкоджених при охолодженні.
We have investigated the effect of heteroside derivatives on succinate dehydrogenase (SDG), malate dehydrogenase (MDG), lactate dehydrogenase (LDG) activity and dynamics of fructose synthesis and uptake in bovine spermatozoa under normo-, hypothermia and cryopreservation conditions. The data obtained testify to the fact, that heteroside cryoprotective effect is stipulated by the activation of energy-producing enzymes. In addition, heterosides recover the activity of enzymes, damaged during cooling.
|
| issn |
0233-7673 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/139143 |
| citation_txt |
Производные гетерозидов – эффективные добавки к криозащитным средам / В.И. Кабачный, Н.И. Горбунова // Проблемы криобиологии. — 2004. — № 2. — С. 28–35. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT kabačnyivi proizvodnyegeterozidovéffektivnyedobavkikkriozaŝitnymsredam AT gorbunovani proizvodnyegeterozidovéffektivnyedobavkikkriozaŝitnymsredam AT kabačnyivi heterozidederivativesaseffectiveadditivestocryoprotectivemedia AT gorbunovani heterozidederivativesaseffectiveadditivestocryoprotectivemedia |
| first_indexed |
2025-11-24T02:35:13Z |
| last_indexed |
2025-11-24T02:35:13Z |
| _version_ |
1850836933692882944 |
| fulltext |
28ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
УДК 577.112.384:591.044
Производные гетерозидов – эффективные добавки
к криозащитным средам
В.И. КАБАЧНЫЙ, Н.И. ГОРБУНОВА
Национальный фармацевтический университет, г. Харьков
Heterozide Derivatives as Effective Additives to Cryoprotective Media
V.I. KABACHNY, N.I. GORBUNOVA
National Pharmaceutical Univercity, Kharkov
Исследовали влияние производных гетерозидов на активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ), малатдегидрогеназы (МДГ),
лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и динамику синтеза и потребления фруктозы в сперматозоидах быка в условиях нормо-, гипотермии
и криоконсервирования. Полученные данные свидетельствуют о том, что криопротекторный эффект гетерозидов обусловлен
активацией энергопродуцирующих ферментов. Кроме того, гетерозиды обладают способностью восстанавливать активность
ферментов, поврежденных при охлаждении.
Ключевые слова: гетерозиды, метилксантины, сперматозоиды, сукцинат-, малат-, лактат- дегидрогеназы, фруктоза,
гипотермия, криоконсервирование.
Дослідили вплив похідних гетерозидів на активність сукцинатдегідрогенази, малатдегідрогенази, лактатдегідрогенази та
динаміку синтезу і споживання фруктози в сперматозоїдах бугая за умов нормо-, гіпотермії та кріоконсервування. Одержані
дані свідчать про те, що кріопротекторний ефект гетерозидів обумовлений активацією енергозабезпечуючих ферментів. Крім
того, гетерозиди мають здатність відновлювати активність ферментів, ушкоджених при охолодженні.
Ключові слова: гетерозиди, метилксантини, сперматозоїди, сукцинат-, малат-, лактатдегідрогенази, фруктоза, гіпотермія,
кріоконсервування.
We have investigated the effect of heteroside derivatives on succinate dehydrogenase (SDG), malate dehydrogenase (MDG),
lactate dehydrogenase (LDG) activity and dynamics of fructose synthesis and uptake in bovine spermatozoa under normo-, hypothermia
and cryopreservation conditions. The data obtained testify to the fact, that heteroside cryoprotective effect is stipulated by the
activation of energy-producing enzymes. In addition, heterosides recover the activity of enzymes, damaged during cooling.
Key-words: heterosides, methylxanthines, spermatozoa, succinate-, malate- and lactate dehydrogenase, fructose, hypothermia,
cryopreservation.
UDC 577.112.384:591.044
Адрес для корреспонденции: Кабачный В.И., Национальный
фармацевтический университет, ул. Блюхера, 4, г. Харьков, Украина
61002; тел.:+38 (0572) 67-98-38, e-mail: kabachny@ukrfa.ua
Address for correspondence: Kabachny V.I., National Pharmaceutical
Univercity, 4, Blukhera str., Kharkov, Ukraine 61002; tel.:+38 (0572)
679838, e-mail: kabachny@ukrfa.ua
Создание банков спермы человека и животных
является повседневной практикой в медицине,
сельском хозяйстве и биотехнологии. Вместе с тем
современные технологии консервирования далеки
от совершенства, поскольку позволяют сохранить
оплодотворяющую способность деконсервирован-
ных сперматозоидов на уровне 30-70%, что связано
с повреждением клеток. Существует мнение, что
уже на этапе разбавления спермы и инкубации с
криопротектором происходит ингибирование
жизненно важных метаболических процессов в
клетке [16], что требует дополнительной обработ-
ки деконсервированного биообъекта для восста-
новления его функциональных показателей. В
связи с этим оптимизация процесса криоконсерви-
рования не утратила своей актуальности.
С нашей точки зрения, наименее изученным, но
наиболее перспективным направлением при
разработке криозащитных сред является поиск
биологически активных веществ (БАВ), обеспечи-
вающих полноценное функциональное состояние
клетки после отогрева. Об использовании БАВ как
добавки к криозащитным средам известно
несколько десятилетий, однако алгоритм их
The establishing of banks for human and animal
sperm is a routine practice in medicine, agriculture and
biotechnology. However the current cryopreservation
technologies are hardly perfect, since they allow to
preserve frozen-thawed spermatozoa fertility at the
level of 30-70%, that is related to cell damaging. The
inhibition of vitally important metabolic processes in a
cell is considered to occur even at the stage of sperm
dilution and incubation with a cryoprotectant [16], that
requires an additional treatment of frozen-thawed
bioobject for recovering its functional indices. In this
connection the optimisation of cryopreservation
process has still remained actual.
From our point of view one of the most perspective
ways when developing the cryoprotective media is the
search for biologically active substances (BAS),
providing an integral functional state of cell after
thawing. The BAS usage has been known for decades
as an additive to cryoprotective media, however the
algorithm for their application is practically absent due
to the specificity of biological material spices, different
nature of BAS and a system-free character of
investigations. In this respect a great attention is paid
to antioxidants and biological membrane stabilisers
29ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
применения практически отсутствует ввиду
видоспецифичности биологического материала и
разной природы БАВ, а исследования носят
бессистемный характер. Большее внимание в
этом отношении уделяется антиоксидантам и
стабилизаторам биологических мембран (витамин
Е, глутатион восстановленный, сывороточный
альбумин и др.), усиливающим устойчивость
клетки к эндо- и экзогенным факторам физико-
химического воздействия [9-11], в то время как
направленный поиск БАВ, повышающих способ-
ность клетки к самовосстановлению, не прово-
дится из-за отсутствия соответствующего
теоретического базиса.
В связи с этим разработка теоретических основ
направленного поиска БАВ, криопротекторное
действие которых обеспечивается влиянием на
защитно-восстановительные системы клетки,
является перспективным подходом к созданию
криозащитных сред.
Объектом исследования были выбраны произ-
водные гетерозидов, проявляющие криопротек-
торный эффект [2].
Цель исследования – изучение влияния иссле-
дуемых веществ на активность ферментов цикла
Кребса (СДГ и МДГ), гликолиза (ЛДГ) и динамику
синтеза и потребления фруктозы в сперматозоидах
быка в условиях нормо-, гипотермии и криокон-
сервирования.
Материалы и методы
Исследования проводили на сперме быка.
Эякулят одного животного (количество образцов
n=7) разбавляли стандартной глюкозо-цитратно-
желточной средой, содержащей 5%-й глицерин как
криопротектор. Концентрация сперматозоидов
составляла 20 млн клеток/мл суспензии. Иссле-
дуемые образцы охлаждали до 4°С и хранили при
этой температуре в течение 3 ч, после чего
замораживали по известной технологии [8].
Подвижность нативных и деконсервированных
сперматозоидов определяли как отношение
прямолинейно и поступательно движущихся клеток
к общему их количеству и выражали в процентах.
Исследование подвижности оценивали микроскопи-
чески (“Axiovert”, Германия) при увеличении ×400.
В качестве сравниваемых веществ были
выбраны пентоксифиллин (ПФ) в концентрации
3,5×10-3 моль/л и кофеин (КФ) – 6,0×10-3 моль/л,
являющиеся стимуляторами гликолиза [4].
Метилксантины и исследуемые 10-8 моль/л
7-метил-N-малеогетерозид (К321) и 10-7 моль/л
N-малеогетерозид (К322) добавляли в суспензию
отогретых клеток, хранившихся в условиях
3-часовой гипотермии, и деконсервированных
клеток, после чего инкубировали при 37°С в
(vitamin E, recovered glutathione, serum albumin etc.),
strengthening a cell resistance to endo- and exogenous
factors of physical and chemical effects [9-11],
whereas a targeted search for BAS, increasing a cell
capability to recovery itself, is not carried-out because
of the absence of proper theoretical base.
In this connection the development of theoretical
bases for BAS targeted search, which cryoprotective
effect is provided by the effect on protective and
recovery cell systems, is a perspective approach to
creation of cryoprotective media.
As the investigation object we have selected
heteroside derivatives, manifesting a cryoprotective
effect [2].
The investigation aim was to study the effect of
studied substances on the Krebs’ cycle enzyme activity
of SDG, MDG, LDG glycolysis and fructose synthesis
and consumption dynamics in bovine spermatozoa
under normo-, hypothermia and cryopreservation
conditions.
Materials and methods
The investigations were carried-out in bovine sperm.
The ejaculate of one animal (number of samples, n=7)
was diluted with a standard glucose-citrate-yolk
medium, containing 5% glycerol as a cryoprotectant.
The spermatozoa concentration made 20 million
cells/ml of suspension. The studied samples were cooled
down to 4°C and stored under this temperature for 3
hrs, then cryopreserved according to the technology
[8]. The motility of native and frozen-thawed
spermatozoa was determined as the ratio of cells with
rectilinear and translational movement to their total
number and shown in percentage. The motility was
evaluated with the microscope (“Axiovert”, Germany)
with ×400 magnification.
Pentoxifylline (PF) in 3.5×10-3 mol/l and caffeine
(CF) in 6.0×10-3 mol/l concentrations as glycolysis
stimulators were selected to compare the substances
[4]. Methylxanthines and studied 10-8 mol/l 7-methyl-
N-maleoheteroside (K321) and 10-7 mol/l N-maleo-
heteroside (K322) were added into the suspension of
warmed cells, stored under 3 hrs hypothermia
conditions, and frozen-thawed cells, then incubated
under 37°C for 30 min. The control samples did not
contain the studied substances. Spermatozoa were
isolated using the method of differential centrifuging,
washed and resuspended in Tyrode’s medium (pH 7.2).
Mitochondria were isolated using the method of
differential centrifuging [1]. The activity of SDG [7],
MDG [5] in mitochondria, LDG [6] in spermatozoa
was measured with a calorimetric method. Fructose
content in spermatozoa suspension was estimated
according to the paper [4], and by the standard “Agat”
sets (Russia) for protein in the samples. The activity
of all studied enzymes and fructose content were
30ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
течение 30 мин. Контрольные образцы не содер-
жали исследуемых веществ. Сперматозоиды
выделяли методом дифференциального центри-
фугирования, отмывали и ресуспендировали в
буфере Тироде (рН 7,2). Митохондрии выделяли
методом дифференциального центрифугирования
[1]. Активность СДГ [7], МДГ [5] в митохондриях,
ЛДГ [6] в сперматозоидах измеряли по калори-
метрическому методу. Содержание фруктозы в
суспензии сперматозоидов оценивали по [4], белок
в образцах – по стандартным наборам “Агат”
(Россия). Активность всех исследуемых фермен-
тов и содержание фруктозы определяли до и после
гипотермии и криоконсервирования. Статисти-
ческую обработку результатов проводили по
методу Фишера.
Результаты и обсуждение
Известно, что процессы энергообеспечения
являются основой любых биохимических реакций
в клетке. В связи с этим на начальном этапе
эксперимента была исследована активность СДГ,
МДГ и ЛДГ (табл. 1). Сопоставление активностей
исследуемых ферментов указывает на то, что в
условиях in vitro в сперматозоидах быка выработка
энергии осуществляется преимущественно
аэробным путем, о чем свидетельствует значи-
тельное (в 1000 раз) превалирование активности
СДГ и МДГ над ЛДГ, что согласуется с иссле-
дованиями [12], в которых изучалась активность
ферментов гликолиза.
Для установления влияния охлаждения на
энергопродуцирующие ферменты в сперматозои-
дах были определены активность СДГ, МДГ, ЛДГ
и содержание фруктозы в образцах, отогретых
после 3-часовой гипотермии. Результаты, приве-
денные в табл. 1, свидетельствуют о том, что
гипотермия инактивирует СДГ на 87,2, МДГ – на
82,7 и ЛДГ – на 63,5%, а содержание фруктозы
снизилось на 74,2% по отношению к исходному.
ьтсонвиткА
ytivitcA
ГДС
GDS
ГДМ
GDM
ГДЛ
GDL
еинажредоС
,ызоткурф
л/ьломм
esotcurF
,tnetnoc
l/lomm
аклебг/ьломм × ним
etunimrepnietorpfogreplomm
яаньлачаН
yramirP 91,1±93,5 44,1±56,7 44,0±43,0 20,2±17,41
С°4одяинеджалхоелсоП
C°4otnwodgniloocretfA 62,0±96,0 05,0±23,1 * 90,0±22,0 * 19,0±08,3 *
Таблица 1. Влияние охлаждения до 4°С на активность СДГ, МДГ,
ЛДГ и содержание фруктозы в сперматозоидах быка
Table 1. Effect of cooling down to 4°С on activity of SDG, MDG, LDG
and fructose content in bovine spermatozoa
Примечание: * – различия достоверны по отношению к контролю (р<0,01).
Note: * – statistically significant differences comparing to the control (p<0.01).
Сравнение степени гипотермической
инактивации исследуемых ферментных
систем согласуется с предположением,
что охлаждение в большей мере влияет
на состояние митохондриальных фермен-
тов по сравнению с цитозольными [13].
Еще большее снижение активности
отмечается после проведения цикла за-
мораживания-оттаивания. На примере
СДГ установлено, что активность фер-
мента после криоконсервации снизилась
на 88,7% (0,61±0,04 ммоль/ мг бел-
ка×мин в деконсервированных сперма-
тозоидах против 5,39±1,19 ммоль/мг
белка×мин в нативном контроле). Сопо-
ставление степени инактивации фер-
мента после гипотермии и криоконсер-
determined before and after hypothermia and
cryopreservation. Statistical processing of the results
was performed using the Fisher’s method.
Results and discussion
The energy supply processes are known to be the
base for any biochemical reactions in a cell. In this
connection at an initial stage of the experiment we
have studied the SDG, MDG and LDG activity
(Table 1). The comparison of studied enzyme activities
points to the fact, that in bovine spermatozoa under in vitro
conditions the energy production is mostly realised via
aerobic way, that is testified by a considerable (in 1000
times) prevalence of SDG and MDG activity over
LDG, that correlates with the investigations [12], where
one studied the glycolysis enzyme activity.
In order to reveal the cooling effect on energy-
producing enzymes in spermatozoa there were
determined SDG, MDG, LDG activity and fructose
content in the samples, thawed after 3hrs’ hypothermia.
The results, shown in the Table 1 testify to the fact,
that hypothermia inactivates SDG by 87.2, MDG by
82.7 and LDG by 63.5%, but fructose content
decreased by 74.2% in respect of the initial one. The
comparison of hypothermic inactivation degree of
studied enzyme systems correlates with the supposition
about the fact, that cooling affects in a greater extent
the state of mitochondrial enzymes in comparison with
cytosol ones [13].
Bigger activity decrease is observed after freeze-
thawing cycle performing.
With SGD example it was established that the
enzyme activity after cryopreservation decreased by
88.7% (0.61±0.04 mM/mg of protein per min in frozen-
thawed spermatozoa vs 5.39±1.19 mM/mg of protein
per min in the native control). The comparison of the
enzyme inactivation degree after hypothermia and
cryopreservation (87.2 and 88.7%) points to the fact,
that a part of a cryogenic (irreversible) enzyme
destruction is insignificant and makes about 1.5%.
31ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
вирования (87,2 и 88,7%) указывает на то, что доля
криогенной (необратимой) деструкции фермента
незначительна и составляет около 1,5%.
Таким образом, уже охлаждение до субнуле-
вых температур приводит не только к термокинети-
ческому (обратимому) снижению скорости фер-
ментативных реакций, но и более глубокому, воз-
можно необратимому ингибированию активности
самих ферментов, развивающемуся энергодефи-
циту и, вероятно, снижению скорости ведущих
биохимических процессов, обеспечивающих нор-
мальное функционирование клетки.
Из вышесказанного можно предположить, что
БАВ, способные защитить или восстановить фермен-
тативную активность, утраченную при охлаждении,
должны, прежде всего, активировать энергообес-
печивающие системы, которым отведена опреде-
ляющая роль в жизнедеятельности клетки.
Для выяснения вопроса об обратимости про-
цесса термической инактивации ферментов и воз-
можных путях их восстановления суспензию
сперматозоидов, хранившихся в условиях субнуле-
вых температур, инкубировали с производными
метилксантина и исследуемыми гетерозидами
(табл.2). После инкубации клеток с ПФ, КФ, К321
и К322 наблюдалось значительное восстановление
активности всех изучаемых ферментов. Наиболее
выражено влияние веществ на СДГ и МДГ в
сравнении с ЛДГ: активность ферментов возросла
соответственно в 2,3; 2,8 и 1,2 раза в среде,
содержащей ПФ, и в 3,4; 2,9 и 1,6 раза – в среде с
КФ. Аналогичные результаты получены при
воздействии производных гетерозидов (табл.2).
После инкубации клеток с К321 и К322 активность
СДГ увеличилась в 4,6 и 5,3 раза, МДГ – в 4,0 и 3,6
раза, ЛДГ – в 1,6 и 1,7 раза соответственно.
аклебгм/ьломм,тнемреФ × ним
nietorpfogmreplomm,emyznE
nimrep
К ьлортно
lortnoC
ФП
PP
КФ
PK К 123 К 223
01,ГДЛ 3-
01,GDL 3- 40,0±22,0 50,0±72,0 * 20,0±43,0 * 60,0±53,0 * 80,0±83,0 *
ГДС
GDS 92,0±96,0 16,0±16,1 88,0±43,2 67,0±71,3 57,0±17,3
ГДМ
GDM 05,0±23,1 13,1±66,3 15,1±18,3 15,1±14,5 74,1±67,4
Таблица 2. Влияние производных метилксантина (ПФ и КФ) и гетерозидов (К321 и
К322) на активность ЛДГ, СДГ и МДГ в сперматозоидах быка, хранившихся в
условиях гипотермии
Table 2. Effect of methyl xantine derivatives (PF and KF) and heterosides (K321 and
K322) on activity of LDG, SDG and MDG in bovine spermatozoa, stored
under hypothermia conditions
Примечание: * – различия достоверны по отношению к контролю (р<0,05).
Note: * – statistically significant differences comparing to the control (p<0.05).
Thus, even cooling down to subzero temperatures
results not only in a thermokinetic (reversible) decrease
in the enzyme reaction rate, but in deeper, possibly,
irreversible activity inhibition of enzymes themselves,
in a developing energy deficient, and, probably, a
decrease in the leading biochemical process rate,
providing normal cell functioning.
In view of the aforesaid the BAS, capable to protect
or recover an enzyme activity, lost during cooling, can
be assumed to have activate first of all the energy
supply systems, which role is determinant in cell vital
activity.
To elucidate the question about the reversibility of
enzyme thermal inactivation process and possible ways
for their recovery, the suspension of spermatozoa,
stored under subzero conditions, was incubated with
methylxanthine derivatives and the studied heterosides
(Table 2). After cell incubation with PF, CF, K321 and
K322 there was observed a considerable recovery in
all studied enzymes activity. The substances effect on
SDG and MDG in comparison with LDG was most
manifested: the enzyme activity increased, correspon-
dingly in 2.3; 2.8 and 1,2 times in the medium with PF,
and in 3.4; 2.9 and 1.6 times in CF-medium. The similar
results were obtained under the effect of heteroside
derivatives (Table 2). After cell incubation with K321
and K322 the SDG activity increased in 4.6 and 5.3
times, in 4.0 and 3.6 times for MDG and in 1.6 and 1.7
times for LDG, correspondingly.
The Table 3 shows the study of substances effect
on fructolysis in spermatozoa after hypothermic
storage. Cell incubation with methylxanthines resulted
in the augmentation of fructose content in respect of
the control sample in 1.5 times, moreover the similar
effect was observed for PF and CF. In 2 hrs of
incubation the fructose content reduced by 0.1 mM in
the control, and by 0.35 and
0.40 mMol in PF and CF-
containing samples, cor-
respondingly.
Under K321 and K322
effect the fructose content
in cell suspension increased
in 2.9 times. In this case as
for methylxanthines the
similar action of substances
was observed. Following
cell incubation during 2 hrs
with K321 and R322 resul-
ted in a decrease in fructose
content by 0.79 and 0.71
mM, correspondingly. At
the same time there were
no statistically significant
changes in fructose con-
32ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
Исследование влияния ве-
ществ на фруктолиз в сперма-
тозоидах после гипотерми-
ческого хранения представлено
в табл. 3. Инкубация клеток с
метилксантинами привела к
повышению содержания фрук-
тозы по отношению к конт-
рольной пробе в 1,5 раза,
причем для ПФ и КФ наблю-
дали одинаковый эффект. Через
2 ч инкубации содержание
фруктозы в контроле уменьши-
лось на 0,1 ммоль, а в образцах,
содержащих ПФ и КФ, – на 0,35
и 0,40 ммоль соответственно.
При воздействии К321 и
К322 содержание фруктозы в
суспензии клеток возросло в
2,9 раза. В этом случае, как и
ьлетазакоП
xednI
К ьлортно
lortnoC
ФП
PP
КФ
PK К 123 К 223
еинажредоС
,ызоткурф
л/ьломм
esotcurF
,tnetnoc
l/lomm
ним03зереч
иицабукни
nim03retfa
noitabucni
19,0±08,3 10,1±55,5 2 78,0±77,5 2 18,1±38,01 2 51,2±10,11 1
ч2зереч
иицабукни
srh2retfa
noitabucni
19,0±17,3 89,0±02,5 2 58,0±73,5 2 98,1±40,01 1 81,2±03,01 1
л/ьломм,aзилоткурФ × ч2
l/lomm,sisylotcurF × srh2 01,0 53,0 04,0 97,0 17,0
Таблица 3. Динамика потребления фруктозы в суспензии сперматозоидов
быка при воздействии производных метилксантина (ПФ и КФ) и гетерозидов
(К321 и К322) после гипотермии
Table 3. Dynamics of fructose uptake in bovine spermatozoa suspension under
the effect of methylxanthine derivatives (PF and KF) and heterosides (K321 and
K322) after hypothermia
Примечание: 1 – различия достоверны по отношению к контролю, р<0,01; 2 – p<0,05.
Note: 1 – statistically significant differences comparing to the control (p<0.05); 2 – p<0.05.
для метилксантинов, наблюдали одинаковое
действие веществ. Дальнейшая инкубация клеток в
течение 2 ч с K321 и R322 привела к снижению
содержания фруктозы на 0,79 и 0,71 ммоль
соответственно. При этом потребление фруктозы,
как и в случае с метилксантинами, достоверно не
изменилось (табл.3).
Разность между расщеплением фруктозы на
первом и втором этапах инкубации, вероятно,
отражает возрастание скорости утилизации фрук-
тозы по отношению к ее накоплению. Причиной
этого может быть повышение содержания
фруктозы, являющейся индуктором ауторегуля-
торного процесса, ограничивающего ее накопление,
или усиленное потребление энергии, расходуемой
на восстановление обменных процессов в клетке
после гипотермического хранения.
Сопоставляя порядок применяемых концен-
траций гетерозидов (10-7-10-8 моль/л) и порядок
повышения содержания фруктозы в суспензии
сперматозоидов (10-3 моль/л), можно утверждать,
что данные вещества не являются субстратами
ферментов фруктолиза (как и других энергообеспе-
чивающих ферментов), а скорее всего выполняют
регуляторную функцию.
Таким образом, полученные результаты сви-
детельствуют о том, что все исследуемые ве-
щества являются мощными активаторами энерго-
продуцирующих ферментов, причем действие
гетерозидов более выражено, чем метилксан-
тинов. Восстановление активности ферментов
после гипотермии посредством БАВ подтверж-
дает обратимость термической инактивации фер-
ментов. Исходя из [3] и принимая во внимание
полученные результаты, мы предположили, что
определяющим звеном сохранности сперма-
sumption as well as in case of methylxanthine
(Table 3).
The difference between fructose disintegration at
the first and second incubation stages probably reflects
an increase in fructose utilisation rate in respect to its
accumulation. The cause of that may be the aug-
mentation of fructose content, being an inductor of
autoregulatory process, limiting its accumulation or a
strengthened consumption of energy, spent for
metabolic processes recovery in a cell after hypo-
thermic storage.
When comparing the order of applied heteroside
concentrations (10-7-10-8 mol/l) and that for the
augmentation of fructose content in spermatozoa
suspension (10-3 mol/l), these substances can be
affirmed not to be the substrates of fructolysis enzymes
(as well as other energy-supplying enzymes), and most
likely they accomplish a regulatory function.
Thus, the results obtained testify to the fact that all
studied substances are strong activators of energy-
producing enzymes, moreover heteroside action is more
manifested, than methylxanthine one. The recovery
of enzyme activity after hypothermia using BAS
confirms the reversibility of thermal inactivation of
enzymes. Proceeding from the paper [3] and taking
into consideration the results obtained we assumed that
a determinant link of spermatozoa integrity under
conditions of low temperature storage could be the
energy supply to cells on the stage of preparation to
cooling, that would allow to increase their resistance.
In this connection in order to find out cryoprotective
properties of studied BAS there was performed a
biological screening in the model of spermatozoa
cryopreservation. The results of study of frozen-
thawed cell motility testify to the fact, that in the sample
with PF in a cryoprotective media the cell motility after
33ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
тозоидов в условиях низкотемпературного хранения
может быть обеспечение клеток энергией на этапе
подготовки к охлаждению, что позволит повысить
их резистентность.
В связи с этим для обнаружения криопротектор-
ных свойств исследуемых БАВ был проведен
биологический скрининг на модели криоконсерви-
рования сперматозоидов. Результаты исследова-
ния подвижности деконсервированных клеток
свидетельствуют, что в образце, содержащем ПФ
в криозащитной среде, подвижность клеток после
отогрева понизилась на 28,8% (25,20±1,32), тогда
как К321 (47,3±2,15) и К322 (51,2±2,43) проявили
криозащитное действие, сохранив подвижность на
уровне, соответственно на 33,3 и 47,8% превышаю-
щем деконсервированный контроль (35,40±1,77).
Так как ПФ не обладает криозащитным дейст-
вием, что полностью согласуется с результатами
работ [14, 15], исследования влияния вещества на
ферментные системы энергообеспечения после
криоконсервирования не проводили, а К321 с
конечными концентрациями 10-7, 10-8 и 10-9 моль/л
был добавлен в стандартную криозащитную среду,
используемую для замораживания спермато-
зоидов. После отогрева в деконсервированных
клетках зафиксирована сохранность активности
СДГ, которая для указанных концентраций
соответственно в 2,8; 4,6 и 2,6 раза была выше,
чем в контрольном образце. При этом максималь-
ный эффект наблюдался при оптимальной концент-
рации вещества 10-8 моль/л (рисунок).
Аналогичная зависимость прослеживалась и
после добавления веществ в суспензию деконсер-
вированных клеток с последующей 30-минутной
инкубацией при 37°С (табл. 4). Однако активность
фермента после воздействия веществ была
приблизительно в 1,4 раза ниже, чем в предыдущем
опыте, что, вероятно, обусловлено участием крио-
Зависимость активности СДГ от концентрации К321,
содержащегося в криозащитной среде.
Dependence of SDG activity vs. concentration of K321 in
cryoprotective medium.
0
1
2
3
ьлетазакоП
xednI
К ьлортно
lortnoC
КФ
PK К 123 К 223
гм/ьломм,ьтсонвиткА
аклеб × ним
fogm/lomm,ytivitcA
ietorp n× nim
40,0±16,0 71,0±73,3 1 90,0±88,1 2 01,0±68,1 2
)зарnв(атнемрефяицавиткА
)semitn(noitavitcaemyznE - 5,5 2,3 0,3
Таблица 4. Восстановление активности СДГ в деконсервированных спермато-
зоидах после инкубации суспензии клеток с метилксантинами и гетерозидами
Table 4. Recovery of SDG activity in frozen-thawed spermatozoa after cell suspen-
sion incubation with methylxanthine and heterosides
Примечание: 1 – различия достоверны по отношению к контролю, р<0,01; 2 – p<0,05.
Note: 1 – statistically significant differences comparing to the control (p<0.05); 2 – p<0.05.
thawing reduced by 28.8% (25.20±1.32), whereas
K321 (47.3±2.15) and K322 (51.2±2.43) manifested
a cryoprotective effect with keeping motility at the level,
exceeding the frozen-thawed control (35.40±1.77) by
33.6 and 44.6%, correspondingly.
As PF has no protective effect, that is completely
correlated with the results of papers [14, 15], no inves-
tigation of substance effect on the enzyme systems
for energy supply after freeze-thawing was performed,
and K321 with 10-7, 10-8, 10-9 M/l final concentrations
was added into the standard glucose-citrate cryopro-
tective medium, used for spermatozoa freezing. In
frozen-thawed cells after thawing there was fixed the
preservation of SDG activity, which was in 2.8; 4.6
and 2.6 times higher for the mentioned concentrations,
correspondingly, than in the control sample. At the same
time the maximum effect was
observed under optimal sub-
stance concentration of
10-8 mol/l (Figure).
Similar dependency was
also traced after substance
addition into the frozen-thaw-
ed cell suspension with follow-
ing 30-min incubation under
37°C (Table 4). However the
enzyme activity after substan-
ce effect was approximately
in 1.4 times lower, than in pre-
vious experiment, that is pro-
bably stipulated by the partici-
pation of cryodestructive
factor in an irreversible (me-
chanical) enzyme inactivation.
А
кт
ив
но
ст
ь
ф
ер
м
ен
та
,
м
м
ол
ь/
м
г
бе
лк
а×
м
ин
En
zy
m
e
ac
tiv
ity
, m
m
ol
p
er
m
g
of
p
ro
te
in
p
er
m
in
ut
e
Концентрация К321, моль/л
K321 concentration, mol/l
Контроль
Control
10-7
10-8
10-9
34ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
деструктивного фактора в необратимой (механи-
ческой) инактивации фермента.
Таким образом, производные гетерозидов не
только восстанавливают, но и сохраняют актив-
ность энергопродуцирующих ферментов в усло-
виях криоконсервирования клеток, т.е. проявляют
выраженный криозащитный эффект.
Выводы
В условиях нормо-, гипотермии и криоконсерви-
рования изучена динамика изменения активности
СДГ, МДГ и ЛДГ и содержания фруктозы в
сперматозоидах быка в присутствии БАВ, в
результате чего экспериментально установлено и
подтверждено следующее:
– охлаждение до субнулевых температур
сопровождалось не только термокинетическим
снижением скорости ферментативных процессов,
но и более глубокими (частично необратимыми)
изменениями ферментов;
– гипотермическая инактивация ферментов
имела в значительной степени обратимый характер
в присутствии БАВ;
– БАВ, способные восстанавливать активность
энергопродуцирующих ферментов, повышали
функциональную активность отогретых после
гипотермии и криоконсервирования спермато-
зоидов;
– производные гетерозидов не являются
субстратами ферментов, а выполняют регулятор-
ную функцию.
Расширены теоретические основы направлен-
ного поиска БАВ, повышающих устойчивость
клетки к воздействию охлаждения путем актива-
ции энергообеспечивающих ферментных систем.
Производные гетерозидов, являющиеся активато-
рами энергетического метаболизма клетки, могут
быть рекомендованы как добавки к криозащитным
средам. Установлены оптимальные режимы их
применения.
Литература
Биологические мембраны. Методы / Под ред. Д. Финдлея,
У. Эванза.– М.: Мир, 1990.- С. 27-28.
Кабачний В.І., Горбунова Н.І., Лабузова Я.А. Кріозахисна
та репаративна активність антиоксидантів // Вісник
фармації.– 2001.– №3 (27).– С. 169.
Кабачный В.И., Горбунова Н.И., Грицан Л.Д. Влияние
производных метилксантина на показатели, характе-
ризующие фертилизационный потенциал деконсервиро-
ванных сперматозоидов быка // Матеріали II Міжнародної
науково-практичної конф. “Динаміка наукових дослі-
джень – 2003”.– Дніпропетровськ, 2003.– Т.5.– С. 55-56.
Лучко Н.А., Кучков И.Н. Влияние кофеина и пентоксифил-
лина на гликолитическую функцию сперматозоидов
человека, криоконсервированных в условиях сверх-
быстрых скоростей охлаждения // Пробл. криобиологии.–
1999.– №4.– С. 8-13.
1.
2.
3.
4.
Thus, the heteroside derivatives not only recover
but preserve the activity of energy-producing enzymes
under conditions of cell cryopreservation, i.e. show a
manifested cryoprotective effect.
Conclusions
Thus, under normo-, hypothermia and cryopreser-
vation there was studied the dynamics of activity
change in SDG, MDG and LDG and fructose content
in bovine spermatozoa at BAS presence, which
experimentally revealed and confirmed as follows:
– cooling down to subzero temperatures was
accompanied with not only thermokinetic decrease in
the enzyme process rate, but deeper (partially
irreversible) enzyme changes;
– hypothermic enzyme inactivation was reversible
in a considerable extent at BAS presence;
– BAS, capable to recover the energy-producing
enzyme activity, augmented a functional activity of
frozen-thawed after hypothermia and cryopreservation
spermatozoa;
– heteroside derivatives are not enzyme substrates,
but realise a regulatory function.
There were extended the theoretical bases for
targeted BAS search, increasing cell resistance to
cooling effect by means of activation of energy-supp-
lying enzyme systems. Heteroside derivatives, being
the activators of cell energetic metabolism, may be
recommended as the additives to cryoprotective media.
There were established the optimal regimens for their
application.
References
Biological membranes. Methods / Edited by Findley D.,
Evans W.– Moscow: Mir, 1990.– P. 277-279.
Kabachny V.I., Gorbunova N.I., Labuzova Ya.A. Cryoprotec-
tive and reparative activity of antioxidants // Visnyk farmatsii.–
2001.– N3 (27).– P. 169.
Kabachny V.I., Gorbunova N.I., Gritsan L.D. Effect of methyl-
xanthine derivatives on the indices, characterising fertilization
potential of frozen-thawed bovine spermatozoa // Proceedings
of II International scientific practical conference “Dynamics
of scientific investigations – 2003” – Dnepropetrovsk, 2003.–
Vol. 5.– P. 55-56.
Luchko N.A., Kuchkov I.N. Caffeine and pentoxifylline effect
on glycolytic function of human spermatozoa cryopreserved
under conditions of ultrarapid cooling rates // Problems of
cryobiology.– 1999.– N4.– P. 8-13.
Methodical instructions on studying mineral metabolism in
agricultural animals.– Borovsk, 1988.– 104 p.
Moroz L.G., Shapiev I.Sh., Smirnova L.A. Determination of
total activity of lactate dehydrogenase in spermatozoa and
semen plasm of different agricultural animals: Methodical
instructions on studying sperm physiology and biochemistry.–
Leningrad, 1974.– P. 4-12.
Current methods in biochemistry / Edited by Orekhovich V.N.–
Moscow: Meditsina, 1977.– P. 46-47.
Kharkov technology of aseptic procurement and cryopreser-
vation of stud bulls’ sperm: Methodical recommendations /
Edited by Ostashko F.I.– Kharkov, 1990.– 47 p.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Patent of Ukraine N10894 A61D19/02. Medium for bull sperm
dilution and freezing / Burkat V.P., Begma L.O., Begma A.A.,
Tkachuk S.S., Ivanchenko M.I.– Filed 27.02.96. Published
29.12.00.– Bull. N8.
Carrol J., Wood M.J., Whittinham D.G. Normal fertilization
and development of frozеn-thawed mouse oocytes:
protective action of certain macromolecules // Biol. Reprod.–
1993.– Vol. 48.– P. 606-612.
Dalvit G.C., Cetica P.D., Beconi M.T. Effect of alpha-
tocopherol and ascorbic acid on bovine sperm in vitro
fertilization // Theriogenology.– 1988.– Vol. 49.– N3.– P. 619-627.
Gandhi K.K., Anand S.R. Regulation of glycolysis/fructolysis
in buffalo spermatozoa // J. Reprod Fertil.– 1982.– Vol.64.–
N1.– P. 145-150.
Guerin J.F., Menezo Y., Czyba J.C. Enzyme comparative
study of spermatozoa and seminal plasma in normal and
subfertile man // Arch. Androl.– 1979.– Vol.3.– N3.– P. 251-257.
Gradvil C.M., Ball B.A. The use of pentoxifylline to improve
motility of cryopreserved equine spermatozoa // Therio-
genology.–2000.– Vol.54.– N7.– P. 1041-1047.
Stanic P., Sonicki Z., Sustanek E. Effect of pentoxifylline on
motility and membrane integrity of cryopreserved human
spermatozoa // Int. J. Androl.– 2002.– Vol.25.– N30.– P.118-190.
Tsekova E., Spasov Kh., Angelova M., Georgiev G.Kh. Effect
of cryopreservation on the acrosomal enzyme activity of the
spermatozoa of rams // Vet. Med. Nauki.– 1986.– Vol.23.–
N1.– P. 73-76.
Accepted in 19.12.2003.
35ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
Методические указания по изучению минерального
обмена у сельскохозяйственных животных.- Боровск,
1988.– 104 с.
Мороз Л.Г., Шапиев И.Ш., Смирнова Л.А. Определение
общей активности лактатдегидрогеназы в сперма-
тозоидах и плазме семени различных сельскохозяйст-
венных животных: Метод. указания по исследованию
физиологии и биохимии спермы. – Л., 1974.– С. 4-12.
Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Орехо-
вича.– М.: Медицина, 1977.– С.46-47.
Харьковская технология асептического взятия и
криоконсервации спермы быков-производителей: Метод.
рекомендации / Под ред. Ф.И. Осташко.– Харьков, 1990.–
47 с.
Пат. України №10894 А61Д19/02. Середовище для
розбавлення і заморожування сперми бугаїв / В.П. Буркат,
Л.О. Бегма, А.А. Бегма, С.С. Ткачук, М.І. Іванченко.
Заявлено 27.02.96. Опубл. 29.12.99. Бюл. №8.
Carrol J., Wood M.J., Whittinham D.G. Normal fertilization
and development of frozеn-thawed mouse oocytes:
protective action of certain macromolecules // Biol. Reprod.–
1993.– Vol. 48.– P. 606-612.
Dalvit G.C., Cetica P.D., Beconi M.T. Effect of alpha-
tocopherol and ascorbic acid on bovine sperm in vitro
fertilization // Theriogenology.– 1988.– Vol. 49.– N3.– P. 619-627.
Gandhi K.K., Anand S.R. Regulation of glycolysis/fructolysis
in buffalo spermatozoa // J. Reprod Fertil.– 1982.– Vol.64.–
N1.– P. 145-150.
Guerin J.F., Menezo Y., Czyba J.C. Enzyme comparative
study of spermatozoa and seminal plasma in normal and
subfertile man // Arch. Androl.– 1979.– Vol.3.– N3.– P. 251-257.
Gradvil C.M., Ball B.A. The use of pentoxifylline to improve
motility of cryopreserved equine spermatozoa // Therio-
genology.–2000.– Vol.54.– N7.– P. 1041-1047.
Stanic P., Sonicki Z., Sustanek E. Effect of pentoxifylline on
motility and membrane integrity of cryopreserved human
spermatozoa // Int. J. Androl.– 2002.– Vol.25.– N30.– P.118-190.
Tsekova E., Spasov Kh., Angelova M., Georgiev G.Kh. Effect
of cryopreservation on the acrosomal enzyme activity of the
spermatozoa of rams // Vet. Med. Nauki.– 1986.– Vol.23.–
N1.– P. 73-76.
Поступила 19.12.2003.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
9.
10.
11
12.
13.
14.
15.
16.
|