Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией
Определены функциональные характеристики клеток костного мозга (КМ) здоровых животных и доноров с аутоиммунными заболеваниями (АИЗ) до и после криоконсервирования. Исследования показали, что независимо от вида аутоиммунной патологии максимальное количество кроветворных предшественников грануломоноци...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Datum: | 2004 |
| Hauptverfasser: | , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2004
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/139155 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией / Ю.А. Козлова, А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Т.М. Гурина // Проблемы криобиологии. — 2004. — № 2. — С. 76–83. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860269222511247360 |
|---|---|
| author | Козлова, Ю.А. Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Гурина, Т.М. |
| author_facet | Козлова, Ю.А. Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Гурина, Т.М. |
| citation_txt | Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией / Ю.А. Козлова, А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Т.М. Гурина // Проблемы криобиологии. — 2004. — № 2. — С. 76–83. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Определены функциональные характеристики клеток костного мозга (КМ) здоровых животных и доноров с аутоиммунными заболеваниями (АИЗ) до и после криоконсервирования. Исследования показали, что независимо от вида аутоиммунной патологии максимальное количество кроветворных предшественников грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ) сохраняется при криоконсервировании в КМ под защитой 7%-го диметилсульфоксида (ДМСО). Для клеток КМ интактных животных такой же степени сохранность КОЕ-ГМ была получена при использовании ДМСО в 10%-й концентрации.
Визначено, функціональні характеристики клітин кісткового мозку (КМ) здорових тварин і донорів з аутоімунними захворюваннями до і після кріоконсервування. Дослідження показали, що незалежно від виду аутоімунної патології максимальна кількість кровотворних попередників грануломоноцитопоезу (КУО-ГМ) зберігається при кріоконсервуванні в КМ під захистом 7%-го диметилсульфоксиду (ДМСО). Для клітин КМ інтактних тварин така ж цілість КУО-ГМ була одержана при використанні ДМСО в 10%-й концентрації.
There were determined the functional characteristics of bone marrow cells (BM) in healthy animals and donors with autoimmune diseases (AID) prior to and following cryopreservation. The studies demonstrated that independently on the type of autoimmune pathology, the maximum amount of hemopoietic precursors of granulomonocytopoesis (CFU-GM) in BM was reached during its cryopreservation under the protection of 7% DMSO. For BM cells of intact animals the same integrity of CFU-GM was obtained when using DMSO in 10% concentration.
|
| first_indexed | 2025-12-07T19:04:56Z |
| format | Article |
| fulltext |
76ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
УДК 615.361.018.46.014.41:59.085:616.72-002.7:616.832-004
Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования клеток
костного мозга животных с аутоиммунной патологией
Ю.А. КОЗЛОВА, А.Н. ГОЛЬЦЕВ, Т.Г. ДУБРАВА, Т.М. ГУРИНА
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Premises for Optimizing the Method of Bone Marrow Cryopreservation
in Animals with Autoimmune Pathologies
KOZLOVA YU. A., GOLTSEV A.N., DUBRAVA T.G., GURINA T.M.
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy
of Sciences of the Ukraine, Kharkov
Определены функциональные характеристики клеток костного мозга (КМ) здоровых животных и доноров с аутоиммунными
заболеваниями (АИЗ) до и после криоконсервирования. Исследования показали, что независимо от вида аутоиммунной патологии
максимальное количество кроветворных предшественников грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ) сохраняется при
криоконсервировании в КМ под защитой 7%-го диметилсульфоксида (ДМСО). Для клеток КМ интактных животных такой же
степени сохранность КОЕ-ГМ была получена при использовании ДМСО в 10%-й концентрации.
Ключевые слова: костный мозг, аутоиммунные заболевания, КОЕ-ГМ.
Визначено, функціональні характеристики клітин кісткового мозку (КМ) здорових тварин і донорів з аутоімунними
захворюваннями до і після кріоконсервування. Дослідження показали, що незалежно від виду аутоімунної патології максимальна
кількість кровотворних попередників грануломоноцитопоезу (КУО-ГМ) зберігається при кріоконсервуванні в КМ під
захистом 7%-го диметилсульфоксиду (ДМСО). Для клітин КМ інтактних тварин така ж цілість КУО-ГМ була одержана при
використанні ДМСО в 10%-й концентрації.
Ключові слова: кістковий мозок, аутоімунні захворювання, КУО-ГМ.
There were determined the functional characteristics of bone marrow cells (BM) in healthy animals and donors with autoimmune
diseases (AID) prior to and following cryopreservation. The studies demonstrated that independently on the type of autoimmune
pathology, the maximum amount of hemopoietic precursors of granulomonocytopoesis (CFU-GM) in BM was reached during its
cryopreservation under the protection of 7% DMSO. For BM cells of intact animals the same integrity of CFU-GM was obtained
when using DMSO in 10% concentration.
Key-words: bone marrow, autoimmune diseases, CFU-GM.
UDC 615.361.018.46.014.41:59.085:616.72-002.7:616.832-004
Адрес для корреспонденции: Козлова Ю.А., Институт проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины, ул. Переяславская,
23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38 (057) 772-01-04, факс: +38
(057) 772-00-84, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Address for correspondence: Kozlova Yu.A., Institute for Problems of
Cryobiology&Cryomedicine of the Natl. Acad. Sci. of Ukraine, 23,
Pereyaslavskaya str.,Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+38 (057) 7720104,
fax: +38 (057) 7720084, e-mail:cryo@online.kharkov.ua
К современным методам лечения АИЗ от-
носится трансплантация аутологичного КМ [12,
14]. Известно, что ее эффективность зависит от
ряда факторов, в том числе гемопоэтического по-
тенциала, который при пересадке аутологичных
миелокариоцитов определяется степенью пред-
шествующего влияния на организм лучевой и
химиотерапии. Немаловажным в определении
функционального статуса миелотрансплантата
является также способ его заготовки и хранения.
Разработаны режимы криоконсервирования
миелокариоцитов здоровых доноров [6]. При АИЗ
имеет место нарушение кроветворения, которое
обусловлено как внутренним дефектом стволовых
кроветворных клеток, так и функциональным
нарушением стромального микроокружения, т.е.
изменением интегральных характеристик
структурно-функциональных параметров КМ
[12,14]. Цель данной работы – сравнительное
изучение характера влияния определенных
режимов криоконсервирования на структурные и
функциональные характеристики клеток КМ
Transplantation of autologous BM is related to
modern methods for AID treatment [12, 14]. Its
efficacy is known to depend on the series of the factors,
and hemopoietic potential as well, which is determined
by the degree of the preceding effect on an organism
of X-ray and chemotherapy when transplanting the
autologous myelocaryocytes.The way of a myelo-
transplant preparing and storage is of great importance
too while determining its functional status. There were
elaborated cryopreservation regimens for healthy
donors’ myelokaryocytes [6]. During AID the
hemopoiesis impairment is known to occur, that may
be caused both by an inner defect of hemopoietic stem
cells and a functional failure of a stromal micro-
environment, that is by the change of integral cha-
racteristics of structural and functional BM parameters
[12, 14]. Comparative study of the effect character of
certain cryopreservation regimens on structural and
functional characteristics of BM cells in control
(healthy) animals and those with AID: either adjuvant
arthritis (AA) or experimental allergic encepha-
lomyelitis (EAE) was the aim of the work.
77ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
контрольных (здоровых) животных и животных с
АИЗ: адъювантным артритом (АА) и экспе-
риментальным аллергическим энцефаломиелитом
(ЭАЭ).
Материалы и методы
Исследования были выполнены на белых
беспородных 5-6-месячных крысах-самцах массой
160-180 г. Все манипуляции с животными про-
ведены согласно Международным принципам
Европейской конвенции о защите позвоночных
животных (Страсбург, 1985г.). Объектом ис-
следования был КМ, взятый у животных в период
клинической манифестации ЭАЭ (21-е сутки),
инициированного по методу Давыдовой [3], и АА
(14-е сутки), инициированного субплантарным
введением полного адъюванта Фрейнда. Контро-
лем служил КМ здоровых животных. Миелокарио-
циты вымывали из бедренных костей средой 199
с добавлением 10%-й эмбриональной телячьей
сыворотки и 2%-го цитрата натрия, криокон-
сервировали в той же среде под защитой 5-, 7-,
10%-го ДМСО (в конечной концентрации) по
программе медленного замораживания до – 40°С
со скоростью 1°С/мин с последующим погру-
жением в жидкий азот в пластиковых крио-
контейнерах фирмы Nunc. Количество клеток КМ
всех групп животных доведено до одинаковой
концентрации. Изучение влияния больших кон-
центраций ДМСО на клетки КМ не входило в
задачу данного исследования, поскольку согласно
[7] они оказывают токсическое действие на их
морфофункциональные свойства. Оттаивание
суспензии проводили на водяной бане при темпе-
ратуре 41°С. Для интегральной оценки структурно-
функционального потенциала деконсервированных
миелокариоцитов были выбраны методы ад-
гезивной и фагоцитарной активности (ФА) клеток
КМ [3]. Количество сохранных клеток в суспензии
определяли с помощью суправитального красителя
трипанового синего.
Для количественной оценки содержания КОЕ-ГМ
использовали метод культивирования клеток КМ в
полужидком агаре в концентрации 1×105 клеток/мл
[11]. Культуру термостатировали при температуре
37°С в атмосфере с 5% СО2 и 95% воздуха. Ре-
зультаты учитывали на 14-е сутки культивирования,
поскольку в [6] этот срок был обоснован как наиболее
оптимальный для оценки функции КОЕ-ГМ, у
которых наблюдается временная ингибиция
пролиферативной активности под действием
криоконсервирования. Препараты учитывали под
инвертированным микроскопом (увеличение ×40).
Эффективность колониеобразования (ЭКО) клеток
КМ оценивали по общему количеству сформи-
рованных кластеров и колоний на 105 эксплан-
тированных клеток. Полученные эксперимен-
Materials and methods
Investigations were performed in white mongrel 5-
6months’ male rats with 160-180g mass. All the
manipulations with animals were accomplished
according to the International Principles of the
European Convention on Vertebrates’ Protection
(Strasbourg, 1985). BM procured from animals at the
period of EAE clinical manifestation (the 21st day)
initiated by Davydova’s method [3], and AA (the 14th
day), initiated by subplantary injection of complete
Freund’s adjuvant served as the object under study.
BM of healthy animals served as the control.
Myelokaryocytes were washed-out from thighbones
with 199 medium using 10% embryonic calf serum
and 2% sodium citrate, cryopreserved in the same
medium under the protection of 5, 7, 10% DMSO
(under final concentration) according to the program
of slow freezing down to -40°C with the rate of 1°C/min
with further immersion into liquid nitrogen in Nunc
plastic cryocontainers. The amount of BM cells in all
groups of animals was an equal concentration. We did
not study the effect of higher DMSO concentrations
on BM cells, as according to the data [7] they are
known to affect toxically their morphofunctional
properties. The suspension thawing was done in water
bath at the temperature of 41°C. For the integral
estimation of structural and functional potential of
frozen-thawed myelokaryocytes there were chosen the
methods of adhesive and phagocytic activity (PhA) of
BM cells [3]. The amount of survived cells in suspension
was determined using trypan blue supravital dye.
For a quantitative evaluation of the content of CFU-
GM we used the method for BM cell culturing in semi-
liquid agar in the concentration of 1×10 5 cells/ml [11].
The culture was thermostated under the temperature
of 37°C in the atmosphere of 5% CO2 and 95% air.
The results were calculated to the 14th day of culturing,
as earlier [6] this term was proved to be the optimum
for CFU-GM estimation, in which there was observed
a temporary inhibition of proliferative activity under
cryopreservation effect. Preparations were calculated
using an inverted microscope (×40 magnification).
Colony forming efficacy (CFE) of BM cells was
evaluated on the total amount of clusters and colonies
formed per 105 explanted cells. Experimental data
obtained were statistically processed using “Microsoft
Excel 2000” electron tables.
Results and discussion
The data presented in Table 1 testify to the fact
that BM cells of AID animals are characterized by an
increased initial permeability for supravital dye
comparing to BM cells of healthy animals. Following
cryopreservation the maximum BM cell integrity of
healthy animals, which did not significantly differ on
the initial level, was noted when using 10% DMSO.
Amount of BM cells in this group independently on
78ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
МКиктелК
хынтовиж
fosllecMB
slamina
ьлетазакоП
xednI
оД
-ивреснокоирк
яинавор
otroirP
noitavreserpoyrc
МКкотелкяинаворивреснокоиркелсоП
ОСМДс
htiwsllecMBnoitavreserpoyrcehtgniwolloF
OSMD
м-%5 м-%7 м-%01
хывородЗ
)ьлортнок(
yhtlaehfO
slamina
)lortnoc(
%,ьтсоннархоС
%,ytirgetnI 70,3±43,59 76,2±24,37
5,1 01,4±50,28 4,1 82,3±54,09 4
овтсечилоК
котелк × 01 6 ,лм/
sllecfotnuomA
× 01 6 lm/
03,0±53,6 81,1±00,6 91,1±46,5 86,0±68,5
ААC
ААhtiW
%,ьтсоннархоС
%,ytirgetnI 63,2±12,18
2 46,2±36,86 5,2,1 43,2±03,57 4,1 75,3±32,17 2,1
овтсечилоК
котелк × 01 6 ,лм/
sllecfotnuomA
× 01 6 lm/
32,0±43,6 67,0±35,3 1 56,0±52,5 32,0±52,3 5,1
ЭАЭC
EAEhtiW
%,ьтсоннархоС
%,ytirgetnI 52,3±31,08
2 35,2±67,46 3,2,1 78,3±52,67 4 05,2±43,27 2,1
овтсечилоК
котелк × 01 6 ,лм/
sllecfotnuomA
× 01 6 lm/
23,0±73,6 31,0±35,5 3,1 23,0±57,5 11,0±34,5 1
Таблица 1. Сохранность и количество ядерных клеток КМ животных с АИЗ
до и после криоконсервирования
Table 1. Integrity and number of BM nucleated cells in AID animals prior to and
following cryopreservation
тальные данные статистически обрабатывались
в электронных таблицах “Microsoft Excel 2000”.
Результаты и обсуждение
Представленные в табл.1 данные свиде-
тельствуют о том, что клетки КМ животных с АИЗ
имели повышенную исходную проницаемость для
суправитального красителя по сравнению с
клетками КМ здоровых животных. После криокон-
сервирования максимальная сохранность клеток
КМ здоровых животных, которая достоверно не
отличалась от исходного уровня, отмечалась при
использовании 10%-го ДМСО. Количество клеток
КМ в этой группе, независимо от концентрации
ДМСО, после криоконсервирования достоверно не
отличалось от исходного уровня.В то же время
максимальная сохранность клеток КМ доноров с
АА и ЭАЭ была при использовании 7%-го ДМСО
и составляла 75,30±2,34 и 76,25±3,87% соот-
ветственно. Та же тенденция наблюдалась при
учете количества клеток КМ животных с данными
патологиями.
Таким образом, уже на первом этапе оценки
состояния КМ по данным суправитального
окрашивания и количественного содержания ядер-
ных клеток в исследуемых образцах, независимо от
Примечания: Различия статистически достоверны (р<0,05) по сравнению: 1– с данными
до криоконсервирования; 2– с контролем; 3 – с АА; 4 – с 5%-м ДМСО в данной группе; 5 –
с 7%-м ДМСО в данной группе.
Notes: statistically siginificant differences (p<0.05) comparing to: 1 – the data prior to cryopreservation;
2 – the control; 3 – with AA; 4 – with 5% DMSO in this group; 5 – with 7% DMSO in this group.
вида аутоиммунной па-
тологии, установлено, что
для криоконсервирования
такого КМ оптимальной
является 7%-я концент-
рация ДМСО.
Клетки макрофагально-
фагоцитарной системы
(МФС) активно участ-
вуют в каскадно разви-
вающемся воспалитель-
ном процессе [10]. Поэто-
му следующим этапом
наших исследований было
изучение ФА клеток КМ
при АИЗ.
Необходимо отметить,
что клетки КМ при ис-
следуемых патологиях
обладали различной ФА
(табл.2). Так, при АА
наблюдалось увеличение
фагоцитарного индекса
(ФИ) миелокариоцитов и
снижение их фагоцитарного
числа (ФЧ) по сравнению
с контролем. Создается
впечатление, что недоста-
ющая способность клеток
КМ фагоцитировать
DMSO concentration after cryopreservation did not
differ on the initial level. At the same time the maximum
integrity of BM cells in AA and EAE donors was while
using 7% DMSO and made 75.3±2.34 and
76.25±3.87%, cor-respondingly. The same tendency
was observed when counting the number of BM cells
in animals with these pathologies.
Thus even at the 1st stage of BM state evaluation
according to the data of supravital staining and
quantitative content of nucleated cells in the samples
under study independently upon the type of autoimmune
pathology the 7% DMSO concentration was found to
be optimum for such a type of BM cryopreservation.
Macrophage-phagocyte system cells (MPhS)
participate actively in a cascade-like inflammatory
process [10]. The next step therefore was studying
the PhA in BM cells at AID.
It should be noted that BM cells at the pathologies
studied possessed different PhA. At AA we observed
the increase of a phagocyte index (PhI) in myelo-
karyocytes and the decrease of phagocyte number
comparing to the control. It looks like the lack of BM
cell capability of phagocyting the staphylococci was
compensated by the rise of the amount of phagocyting
cells. Due to this fact the absolute index of
myelokaryocytes’ phagocyte activity (AIMPhA) did
79ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
not differ significantly comparing to the control. At
EAE the different picture was observed: all indices
under study were lower than the control level. As a
result AIMPhA decreased by more than 12 times
comparing to the control.
Such changes are supposed to be caused by a
cytokine profile specificity at AID. BM cells produce
the group of myelopeptides possessing immu-
noregulatory properties, which stimulate the macro-
phage phagocyting activity [1]. Phagocyte activation
by various agents is related as a rule to the rise of cell
calcium content, which is known to increase for
example in neutrophil granulocytes under IL-8 effect
and along with GM-CSF, IL-1 and TNF-a make the
cytokine background, activating phagocytes [8]. An
increased production of mentioned above cytokines is
known to be observed at AA, which promote the
stimulation of the indices under study, while at EAE
the inhibiting effect on the adhesion molecule and PhA
expression may be manifested by the production of
another kind of cytokine, that is transforming growth
factor β [4].
Cryopreservation being a powerful physical and
chemical factor, which affects in a way different cells
хынтовижМКиктелК
slaminafosllecMB
ьлетазакоП
xednI
яинаворивреснокоиркоД
noitavreserpoyrcotroirP
ОСМДcМКкотелкяинаворивреснокоиркелсоП
OSMDhtiwsllecMBnoitavreserpoyrcehtgniwolloF
м-%5 м-%7 м-%01
хывородЗ
)ьлортнок(
slaminayhtlaehfO
)lortnoc(
ИФ
IhP 19,3±25,25 78,0±32,03
5,1 25,1±78,33 4,1 82,2±65,04 5,4,1
ЧФ
AhP 25,1±57,8 37,0±57,5
5,1 494,0±76,7 63,1±68,9 5,4
01,МАФПА 7
01,AhPMIA 7 87,41±11,492 65,5±52,111
5,1 79,9±62,661 4,1 97,21±59,552 5,4,1
%,КА
%,CA 88,1±51,72 36,2±62,55
5,1 11,3±85,73 4,1 76,1±97,53 4,1
ААC
ААhtiW
ИФ
IhP 33,2±31,37
2 63,2±44,23 1 43,3±71,03 1 75,3±62,43 1
ЧФ
AhP 32,0±73,6
2 15,2±51,21 2,1 23,2±57,8 76,2±34,8
01,МАФПА
01,AhPMIA 7 23,61±54,703 96,02±36,762
2 55,01±50,013 2 34,31±60,291 5,4,2,1
%,КА
%,CA 256,4±33,36 23,5±90,17
5,2 10,3±93,55 4,2 87,2±42,84 5,4,1
ЭАЭC
EAEhtiW
ИФ
IhP 73,1±57,21
3,2 35,2±23,55 3,2,1 78,1±65,06 3,2,1 05,1±45,16 4,3,2,1
ЧФ
AhP 03,0±12,4
3,2 49,0±33,11 5,3,1 4,3,161,1±02,6 43,2±35,7 1
01,МАФПА 7
01,AhPMIA 7 81,1±80,32
3,2 87,41±15,962 5,2,1 78,9±70,551 4,3,1 36,7±62,991 4,2,1
%,КА
%,CA 43,1±44,41
3,2 63,2±21,66 5,2,1 30,2±20,72 4,3,1 42,1±96,53 5,4,3,1
Таблица 2. Фагоцитарная активность и адгезивный потенциал клеток КМ животных с АИЗ
до и после криоконсервирования
Table 2. Phagocyte activity and BM cell adhesive potential in AID animals prior to and following the cryopreservation
Примечания: Различия статистически достоверны (р<0,05) по сравнению: 1– с данными до криоконсервирования; 2– с
контролем; 3 – с АА; 4 – с 5%-м ДМСО в данной группе; 5 – с 7%-м ДМСО в данной группе.
Notes: statistically significant differences (p<0.05) comparing to: 1 – the data prior to cryopreservation; 2 – the control; 3 – with AA;
4 – with 5% DMSO in this group; 5 – with 7% DMSO in this group.
стафилококки компенсировалась увеличением коли-
чества фагоцитирующих клеток – ФИ. За счет этого
абсолютный показатель фагоцитарной активности
миелокариоцитов (АПФАМ) достоверно не
отличался от контроля. При ЭАЭ наблюдалась
иная картина: все исследуемые показатели были
ниже контрольного уровня. Вследствие этого
АПФАМ уменьшался более чем в 12 раз по срав-
нению с контролем.
Можно предположить, что подобного рода
изменения обусловлены спецификой цитокинового
профиля при АИЗ. Клетки КМ вырабатывают
группу миелопептидов, обладающих иммуно-
регуляторными свойствами, в том числе и
стимулирующих ФА макрофагов [1]. Активация
фагоцитов различными агентами связана, как
правило, с повышением содержания клеточного
кальция, которое, например в нейтрофильных
гранулоцитах, увеличивается под действием ИЛ-8 и
вместе с ГМ-КСФ, ИЛ-1 и ФНО-α составляет
цитокиновый фон, активизирующий фагоциты [8].
Известно, что при АА наблюдается повышенная
продукция описанных выше цитокинов [16],
способствующая стимуляции исследуемых
80ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
характеристик, в то время как при ЭАЭ инги-
бирующее действие на экспрессию молекул
адгезии и ФА может оказывать повышенная
продукция другого цитокина – трансформирующего
ростового фактора β [4].
Криоконсервирование, являясь мощным физико-
химическим фактором, в той или иной степени
воздействующим на разные клетки гетерогенной
популяции КМ, существенно изменяет его ста-
бильное функциональное состояние. После
криоконсервирования ФИ клеток КМ здоровых
животных при использовании 5%-го ДМСО
снижался в 1,7, 7%-го – в 1,6, 10%-го – в 1,3 раза
по сравнению с исходным показателем. Для
миелокариоцитов животных с АА минимальное
снижение ФИ наблюдалось при использовании
7%-го ДМСО, в то время как при ЭАЭ отмечалось
достоверное увеличение ФИ более чем в 4 раза
во всех исследуемых группах независимо от
of BM heterogenous population, was found to change
dramatically its stable functional state. Following
cryopreservation the PhI of BM cells in healthy animals
decreased by 1.7 times when using 5% DMSO, with
7% DMSO by 1.6 times, and 10% by 1.3 times
comparing to the initial index. For myelokaryocytes of
AA animals the minimum PhI was observed when
using 7% DMSO, while at EAE there was noted a
statistically true PhI increase by more than in 4 times
in all the studied groups independently on the
cryoprotectant’s concentration comparing to the initial
index. At both of the pathologies the phagocyte number
increased following the cryopreservation, while in the
control no statistically significant changes were
observed, and only during freezing with 5% DMSO
this index was found to decrease significantly.
AIMPhA of the control group after cryopreservation
with 10% DMSO approached to the initial index (prior
to cryo), for BM cells with AA the proper one was
found to be the 7% DMSO concentration. The slightest
deviation of AIMPhA at EAE from the initial index
was also noted while using 7% DMSO.
As the Table 2 shows at AA the increase of
phagocyting cells (PhI) percentage in BM correlated
to a more than twice rise of adhesive cells (AC) content
in it. At the same time EAE development induced a
sharp decrease of PhI accompanied by nearly twice
fall of AC in BM. It worth to be noted that at EAE all
the studied characteristics of PhA cells in BM were
significantly lower than the control values that points
to “stronger” changes of an inner organism state during
the pathology. Interestingly that following the
cryopreservation independently on the cryoprotectant
concentration there were noted mono-directed changes
0
20
40
60
80
100
120
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0
20
40
60
80
100
120
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0
20
40
60
80
100
120
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Контроль
Control
5%-й 7%-й 10%-й
ДМСО
5% 7% 10%
DMSO
a a
Эффективность колониеобразования ЭКО и КОЕ/КлОЕ КМ контрольных животных (а), с АА (б), с ЭАЭ (с) до и
после криоконсервирования с различными концентрациями ДМСО: – ЭКО; ◆ – КОЕ/КлОЕ.
Colony forming efficiency (CFE) and CFU/ClFU in BM of control animals (a), with AA (b), with EAE (c) prior to and
following the cryopreservation with various DMSO concentrations: – CFЕ; ◆ –CFU/ClFU.
Контроль
Control
AА 5%-й 7%-й 10%-й
ДМСО
AА 5% 7% 10%
DMSO
ЭАЭ 5%-й 7%-й 10%-й
ДМСО
ЕАЕ 5% 7% 10%
DMSO
Контроль
Controlб b в с
Э
КО
, %
C
FE
, %
Э
КО
, %
C
FE
, %
Э
КО
, %
C
FE
, %
КО
Е/
Кл
О
Е
C
FU
/C
lF
U
КО
Е/
Кл
О
Е
C
FU
/C
lF
U
КО
Е/
Кл
О
Е
C
FU
/C
lF
U
81ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
in PhA characteristics of pathological BM: at EAE on
the background of AC the percent rise the PhI
increased as well. At AA on the background of the
AC percent fall the PhI was found to decrease too. In
the control the AC amount increased but PhI reduced.
Thus the same cryopreservation regimens may induce
an increased expansion of adhesion molecules on BM
cells related to MPS during some pathological states
and inhibit at other ones.
As the Figure demonstrates the CFE index was
significantly lower than the control and made 57% at
AA, 51% at EAE, which is supposed to be related
to the decrease in colony stimulating factors
concentration during these types of AID [2]. Thus the
differences between the AID groups were less
manifested. Differentiated analysis of CFE
compounds, that is CFU and ClFU is of interest too as
the CFU/ClFU ratio pointing to a degree distribution
of the differentiation of hematopoietic precursors in
animal BM. If one compares the two pathologies, it
should be noted that the amount of ClFU decreased if
compared to control during AA in a greater extent
than at EAE, which is pointed by a higher CFU/ClFU
value (1.73 and 2.93, respectively), that is during EAE
hematopoietic precursors with higher proliferative
potential are preserved better. CFU/ClFU index during
the both of pathologies was significantly higher than
the control. Therefore at different AID types, both
AA and EAE the state of not only hematopoietic “place
d’armes” in the whole, but of hematopoietic precursors’
compartments of a various commitment level being
the part of it, was noted to be modified in a different
way. Such changes may be supposed to be caused by
specificity of a cytokine profile change at one or another
AID type, when a certain deviation from the physio-
logical cytokine content with the immune modulating
and hematopoietic activity determines the change
character of hematopoietic profile in the whole
organism. Estimation of the state of hematopoietic
precursors demonstrated the integrity of CFU-GM in
healthy BM (Figure) to the rise along with the DMSO
concentration increase, reaching the control level while
cryopreserving myelokaryocytes under the protection
of 10% DMSO. The maximum integrity of CFU-GM
in donor BM with AA and EAE was noted when using
7% DMSO, while the functional potential of CFU-GM
approached in a maximum way to the initial level (prior
to cryopreservation). It is of interest as well that the
CFU/ClFU ratio independently on the type of AID was
higher at BM cryopreservation at 5% DMSO, that
testifies to the integrity of less differentiated precursors
(CFU) at this cryopreservation regimen.
Conclusions
Autoimmune diseases, and namely adjuvant arthritis
and experimental allergic encephalomyelitis, are
accompanied with the changes in phagocytic and
концентрации криопротектора по сравнению с
исходным показателем. При обеих патологиях
после криоконсервирования ФЧ повышалось, в
контроле достоверных изменений не наблюдалось,
и только при замораживании с 5%-м ДМСО этот
показатель достоверно снижался. АПФАМ
контрольной группы после криоконсервирования с
10%-м ДМСО приближался к исходному (до крио)
показателю, для клеток КМ с АА наиболее
приемлемой являлась 7%-я концентрация ДМСО.
В наименьшей степени АПФАМ при ЭАЭ от-
клонялся от исходного показателя также при
использовании 7%-го ДМСО.
Как видно из представленных в табл.2 данных,
при АА повышение процента фагоцитирующих
клеток – (ФИ) в КМ коррелировало с более чем
двукратным увеличением в нем содержания
адгезивных клеток (АК). В то же время развитие
ЭАЭ индуцировало резкое снижение ФИ, которое
сопровождалось почти двукратным снижением
содержания АК в КМ. Важно отметить, что при
ЭАЭ все изученные характеристики состояния ФА
клеток КМ были существенно ниже контрольных
величин, что подчеркивает более “жесткие”
изменения внутреннего состояния организма при
данной патологии. Интересно, что после крио-
консервирования, независимо от концентрации
криопротектора, отмечались однонаправленные
изменения характеристик ФА патологического КМ:
при ЭАЭ на фоне увеличения процента АК
увеличивался и ФИ, при АА на фоне уменьшения
процента АК уменьшался и ФИ. В контроле
количество АК увеличивалось, а ФИ снижался.
Таким образом, одни и те же режимы крио-
консервирования могут индуцировать повышенную
экспансию молекул адгезии на относящихся к
МФС клетках КМ при одних патологических
состояниях и ингибировать при других.
Как видно из рисунка, показатель ЭКО был
достоверно ниже контроля и составлял: при АА –
57, при ЭАЭ – 51%, что может быть связано с
уменьшением концентрации колониестимули-
рующих факторов при данных АИЗ [2]. Таким
образом, различия между группами с АИЗ были
менее выраженными. Интерес представляет
дифференцированный анализ составляющих ЭКО,
т.е. КОЕ и КлОЕ как отношение КОЕ/КлОЕ,
указывающее на распределение разной степени
дифференцировки кроветворных предшественников
в КМ животных. Если сравнивать две патологии,
то следует отметить, что при АА больше, чем при
ЭАЭ, снижается количество КлОЕ по сравнению
с контролем, о чем свидетельствует большая
величина КОЕ/КлОЕ (1,73 и 2,93 соответственно),
т.е. при ЭАЭ в большей степени сохраняются
гемопоэтические предшественники с более
высоким пролиферативным потенциалом. Индекс
82ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
КОЕ/КлОЕ при обеих патологиях был достоверно
выше контроля. Следовательно, при различных
АИЗ, а именно АА и ЭАЭ, в различной степени
модифицируется состояние не только гемопоэти-
ческого плацдарма в целом, но и входящих в него
компартментов кроветворных предшественников
разного уровня коммитированности. Можно
предположить, что подобного рода изменения
обусловлены спецификой изменения цитокинового
профиля при том или ином АИЗ, когда конкретное
отклонение от физиологического содержания
цитокинов с иммуномодулирующей и гемо-
поэтической активностью определяет характер
изменения состояния гемопоэтического профиля
организма в целом.
Оценка состояния кроветворных предшес-
твенников после криоконсервирования показала,
что сохранность КОЕ-ГМ здорового КМ (рисунок)
увеличивается по мере повышения концентрации
димексида, достигая контрольного уровня при
криоконсервировании миелокариоцитов под
защитой 10%-го ДМСО. Максимум сохранности
КОЕ-ГМ костного мозга доноров с АА и ЭАЭ
был отмечен при использовании 7%-го ДМСО, при
этом функциональный потенциал КОЕ-ГМ макси-
мально приближался к исходному (до крио) уровню.
Интересно отметить, что отношение КОЕ/КлОЕ,
независимо от АИЗ, было больше при крио-
консервировании КМ под защитой 5%-го ДМСО,
что указывает на сохранность менее дифферен-
цированных предшественников (КОЕ) при данном
режиме криоконсервирования.
Выводы
При АИЗ, а именно АА и ЭАЭ, происходят
изменения фагоцитарного и адгезивного потен-
циалов клеток КМ, причем при ЭАЭ эти изменения
более выражены.
Показано, что один и тот же режим криокон-
сервирования индуцирует повышенную экспансию
молекул адгезии и ФА клеток КМ при ЭАЭ и
ингибирует при АА по сравнению с их исходным
состоянием.
Развитие АИЗ вызывает изменение гемопоэти-
ческого потенциала кроветворных предшест-
венников, что подтверждается фактом снижения
КОЕ-ГМ, причем при ЭАЭ в большей степени.
После криоконсервирования КМ животных с
ЭАЭ с 7%-м ДМСО КОЕ-ГМ сохранялись в
меньшей степени, чем при АА, однако КОЕ-ГМ
костного мозга с этой патологией обладали
большим пролиферативным потенциалом.
По совокупности изученных показателей для
КМ животных с АИЗ предпочтительным, но не
оптимальным является режим с использованием
7%-го ДМСО, для КМ контрольных животных –
10%-го.
adhesive state of BM cells potential, moreover at EAE
these changes are most manifested.
It has been shown that the same cryopreservation
regimen induces an increased expansion of adhesion
molecules and phagocyte activity of BM cells at EAE
as well as inhibits at AA in comparison with their initial
state.
AIDs development causes the change in hemo-
poietic potential of hemopoietic precursors, that is
confirmed by the reduction in CFU-GM, and for EAE
in a greater extent.
After BM cryopreservation of the animals with
EAE under 7% DMSO protection the CFU-GM
preserved in less extent than at AA, however CFU-
GM of BM with this pathology had higher proliferative
potential.
According to all studied indices for BM of animals
with AIDs the regimen when using 7% DMSO is
preferable, but not optimal, meanwhile for BM of the
control animals is the one with 10% DMSO.
References
Belevskaya tR.G., Mikhaylova A.A., Fonina L.A. et al.
Myelopeptide-3 as bone marrow mediator, which stimulates
phagocyte activity in macrophages//Reports of the Academy
of Sciences.– 1998.– Vol.358, N6.– P. 847-849.
Hembitsky E.V., Mazurov V.I., Lila A.M. et al. Change of
functional activity of granulomonocytopoiesis in rheumatoid
arthritis patients // Klin. Meditsina.– 1991.– Vol.69, N3.– P.51-54.
Goltsev A.N., Kozlova Yu.A., Babenko N.N. et al. Peculiarities
of the change of immunological and biochemical indices of
rat organism with experimental allergic encephalomyelitis //
Problems of Cryobiology.– 2004.– N1.– P. 41-49.
Davydova G.S. Application of adjuvant with different content
of BCG to induce EAE in rats // Acute encephalomyelitis in
experiment and clinics.– Minsk: Nauka i tekhnika, 1969.–
P. 32-37.
Demina T.L., Gusev E.I., Boyko A.N. et al. Cytokines in
immunopathogenesis of disseminated sclerosis // Zhurnal.
Neuropatologii i psikhiatrii im. Korsakova.– 1997.– Vol.97, N5.–
P. 68-73.
Dubrava T.G. Efficiency of hemopoietic cells cryopreservation
depending on their initial properties: Author’s thesis abstract for
candidate’s degree obtaining (biology).– Kharkov, 1986.– 14 p.
Cell suspension cryopreservation / Ed. by Tsutsaeva A.A.–
Kiev: Naukova Dumka, 1983.– P. 175-186.
Lymphocytes: A practical approach. Transl. From English /
Ed. by G.G. Klaus.– M.: Mir.– 1990.– 396 p.
Nesterova I.V., Kolesnikova N.V. Cytokine regulation and
functional system of neutrophile granulocytes // Hematologia
and transfusiologia.– 1999.– Vol.44, N2.– P. 43-47.
Khaitov R.M. Current approaches for the estimation of main
stages of a phagocyte process // Kharkov Medical Journal.–
1995.– N2.– P. 8-12.
Shereshkov S.I. Hematopoietic cell culturing on semi-solid
nutritive media // Lab. delo.– 1974.– N3.– P. 146-150.
Bekkum D.W. Experimental basis for the treatment of
autoimmune diseases with autologous hematopoietic stem
cell transplantation // Bone Marrow Transplant.– 2003.–
Vol.32, №1.– P. 37-39.
Ikehara S., Inaba M., Yasumizu R., et. al. Autoimmune
diseases as stem cell disorders // Tohoku J. Exp. Med.– 1994.–
Vol.173, №1.– P. 141-155.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
83ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №2
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №2
Полученные данные подчеркивают необхо-
димость учета исходного морфофункционального
состояния патологически измененного КМ для
поиска оптимального режима его криоконсер-
вирования.
Литература
Белевская Р.Г., Михайлова А.А., Фонина Л.А. и др.
Миелопептид-3 – костномозговой медиатор, стиму-
лирующий фагоцитарную активность макрофагов // Докл.
академии наук.– 1998.– Т. 358, №6.– С. 847-849.
Гембицкий Е.В., Мазуров В.И., Лила А.М. и др. Изменение
функциональной активности грануломоноцитопоэза у
больных ревматоидным артритом // Клин. медицина.–
1991.– Т. 69.– №3.– С. 51-54.
Гольцев А.Н., Козлова Ю.А., Бабенко Н.Н. и др. Осо-
бенности изменения иммунологических и биохимических
показателей организма крыс с экспериментальным
аллергическим энцефаломиелитом // Пробл. крио-
биологии.– 2004.– №1.– С. 41-49.
Давыдова Г.С. Применение адъюванта с различным
количеством БЦЖ для воспроизведения ЭАЭ у крыс //
Острый энцефаломиелит в эксперименте и клинике.–
Минск: Наука и техника. 1969.– С. 32-37.
Демина Т.Л., Гусев Е.И., Бойко А.Н. и др. Цитокины в
иммунопатогенезе рассеянного склероза // Журнал
невропатологии и психиатрии им. Корсакова.– 1997.–
Т. 97, №5.– С. 68-73.
Дубрава Т.Г. Эффективность криоконсервирования
кроветворных клеток в зависимости от их исходных
свойств: Автореф. дис... канд. биол. наук.– Харьков,
1986.– 14 с.
Криоконсервирование клеточных суспензий // Под ред.
А.А. Цуцаевой.– Киев: Наук. думка, 1983.– С. 175-186.
Лимфоциты: Методы. Пер. c англ. / Под ред. Дж.
Клауса.– М.: Мир,– 1990.– 396 с.
Нестерова И.В., Колесникова Н.В. Цитокиновая регу-
ляция и функционирующая система нейтрофильных
гранулоцитов // Гематология и трансфузиология.– 1999.–
Т.44, №2.– С. 43-47.
Хаитов Р.М. Современные подходы к оценке основных
этапов фагоцитарного процесса // Харьков. мед. журн.–
1995.– №2.– С. 8-12.
Шерешков С.И. Культивирование гемопоэтических
клеток на полутвердых питательных средах // Лаб.
дело.– 1974.– № 3.– С. 146-150.
Bekkum D.W. Experimental basis for the treatment of
autoimmune diseases with autologous hematopoietic stem
cell transplantation // Bone Marrow Transplant.– 2003.–
Vol.32, №1.– P. 37-39.
Ikehara S., Inaba M., Yasumizu R., et. al. Autoimmune
diseases as stem cell disorders // Tohoku J. Exp. Med.– 1994.–
Vol.173, №1.– P. 141-155.
Marmont A.M. Stem cell transplantation for severe autoimmune
disorders, with special reference to rheumatic diseases. // J
Rheumatol Suppl.– 1997.– Vol.48, №4.– P. 13-18.
Suzuki Y., Kim K.J., Kotake S., et al. Stromal cell activity in
bone marrow from the tibia and iliac crest of patients with
rheumatoid arthritis // J. Bone Miner. Metab.– 2001.– Vol.19,
№1.– P. 56-60.
Voulgari P.V., Kolios G., Papadopoulos G.K., et. al. Role of
cytokines in the pathogenesis of anemia of chronic disease
in rheumatoid arthritis // Clin Immunol.– 1999.– Vol.92,№2.–
P. 153-160.
Поступила 20.04.2004
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Marmont A.M. Stem cell transplantation for severe autoimmune
disorders, with special reference to rheumatic diseases. // J
Rheumatol. Suppl.– 1997.– Vol.48, №4.– P. 13-18.
Suzuki Y., Kim K.J., Kotake S., et al. Stromal cell activity in
bone marrow from the tibia and iliac crest of patients with
rheumatoid arthritis // J. Bone Miner. Metab.– 2001.– Vol.19,
№1.– P. 56-60.
Voulgari P.V., Kolios G., Papadopoulos G.K., et. al. Role of
cytokines in the pathogenesis of anemia of chronic disease
in rheumatoid arthritis // Clin Immunol.– 1999.– Vol.92,№2.–
P. 153-160.
Accepted in 20.04.2004
14.
15.
16.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-139155 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T19:04:56Z |
| publishDate | 2004 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Козлова, Ю.А. Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Гурина, Т.М. 2018-06-19T19:45:21Z 2018-06-19T19:45:21Z 2004 Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией / Ю.А. Козлова, А.Н. Гольцев, Т.Г. Дубрава, Т.М. Гурина // Проблемы криобиологии. — 2004. — № 2. — С. 76–83. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/139155 615.361.018.46.014.41:59.085:616.72-002.7:616.832-004 Определены функциональные характеристики клеток костного мозга (КМ) здоровых животных и доноров с аутоиммунными заболеваниями (АИЗ) до и после криоконсервирования. Исследования показали, что независимо от вида аутоиммунной патологии максимальное количество кроветворных предшественников грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ) сохраняется при криоконсервировании в КМ под защитой 7%-го диметилсульфоксида (ДМСО). Для клеток КМ интактных животных такой же степени сохранность КОЕ-ГМ была получена при использовании ДМСО в 10%-й концентрации. Визначено, функціональні характеристики клітин кісткового мозку (КМ) здорових тварин і донорів з аутоімунними захворюваннями до і після кріоконсервування. Дослідження показали, що незалежно від виду аутоімунної патології максимальна кількість кровотворних попередників грануломоноцитопоезу (КУО-ГМ) зберігається при кріоконсервуванні в КМ під захистом 7%-го диметилсульфоксиду (ДМСО). Для клітин КМ інтактних тварин така ж цілість КУО-ГМ була одержана при використанні ДМСО в 10%-й концентрації. There were determined the functional characteristics of bone marrow cells (BM) in healthy animals and donors with autoimmune diseases (AID) prior to and following cryopreservation. The studies demonstrated that independently on the type of autoimmune pathology, the maximum amount of hemopoietic precursors of granulomonocytopoesis (CFU-GM) in BM was reached during its cryopreservation under the protection of 7% DMSO. For BM cells of intact animals the same integrity of CFU-GM was obtained when using DMSO in 10% concentration. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией Premises for optimizing the method of bone marrow cryopreservation in animals with autoimmune pathologies Article published earlier |
| spellingShingle | Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией Козлова, Ю.А. Гольцев, А.Н. Дубрава, Т.Г. Гурина, Т.М. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией |
| title_alt | Premises for optimizing the method of bone marrow cryopreservation in animals with autoimmune pathologies |
| title_full | Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией |
| title_fullStr | Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией |
| title_full_unstemmed | Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией |
| title_short | Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией |
| title_sort | предпосылки оптимизации метода криоконсервирования клеток костного мозга животных с аутоиммунной патологией |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/139155 |
| work_keys_str_mv | AT kozlovaûa predposylkioptimizaciimetodakriokonservirovaniâkletokkostnogomozgaživotnyhsautoimmunnoipatologiei AT golʹcevan predposylkioptimizaciimetodakriokonservirovaniâkletokkostnogomozgaživotnyhsautoimmunnoipatologiei AT dubravatg predposylkioptimizaciimetodakriokonservirovaniâkletokkostnogomozgaživotnyhsautoimmunnoipatologiei AT gurinatm predposylkioptimizaciimetodakriokonservirovaniâkletokkostnogomozgaživotnyhsautoimmunnoipatologiei AT kozlovaûa premisesforoptimizingthemethodofbonemarrowcryopreservationinanimalswithautoimmunepathologies AT golʹcevan premisesforoptimizingthemethodofbonemarrowcryopreservationinanimalswithautoimmunepathologies AT dubravatg premisesforoptimizingthemethodofbonemarrowcryopreservationinanimalswithautoimmunepathologies AT gurinatm premisesforoptimizingthemethodofbonemarrowcryopreservationinanimalswithautoimmunepathologies |