Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования
Исследовали влияние глицерина (ГЛ) и этиленгликоля (ЭГ) на выживаемость сперматозоидов собак (СС) после замораживания-оттаивания в зависимости от концентрации криопротекторов, режимов охлаждения и времени эквилибрации, а также изменение клеточного объема СС после введения в суспензию растворов крио...
Збережено в:
| Дата: | 2004 |
|---|---|
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2004
|
| Назва видання: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/139850 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования / М.И. Егоров, Е.Ф. Копейка, Т.П. Линник, И.Н. Кучков // Проблемы криобиологии. — 2004. — № 4. — С. 13–20. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-139850 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-1398502025-02-09T14:11:04Z Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования Effect of Glycerol, Ethylene Glycol on Morphofunctional Characteristics of Dogs’ Spermatozoa at Different Cryopreservation Stages Егоров, М.И. Копейка, Е.Ф. Линник, Т.П. Кучков, И.Н. Теоретическая и экспериментальная криобиология Исследовали влияние глицерина (ГЛ) и этиленгликоля (ЭГ) на выживаемость сперматозоидов собак (СС) после замораживания-оттаивания в зависимости от концентрации криопротекторов, режимов охлаждения и времени эквилибрации, а также изменение клеточного объема СС после введения в суспензию растворов криопротекторов турбидиметрическим методом. Выявлено, что наилучшая подвижность СС наблюдалась после криоконсервирования под защитой ЭГ в конечной 7%-й концентрации при замораживании на первом этапе со скоростью 3°С/мин без предварительной эквилибрации. Показано, что 7%-й ЭГ вызывает значительно меньшие изменения клеточного объема в сравнении с глицерином. Досліджували вплив гліцерину та етиленгліколю на рухливість сперматозоїдів собак (СС) після заморожування-відтавання в залежності від їхньої концентрації, режимів охолодження і часу еквілібрації, а також якісну зміну клітинного об’єму СС після введення в суспензію розчинів кріопротекторів за допомогою турбідиметричного методу. Виявлено, що найкраща рухливість СС спостерігалася після кріоконсервування під захистом етиленгліколю в 7%-й кінцевій концентрації при заморожуванні на першому етапі зі швидкістю 3°С/хв без попередньої еквілібрації. Показано, що 7%-й етиленгліколь викликає значно менші зміни клітинного об’єму в порівнянні з гліцерином тієї ж концентрації. There has been studied the effect of glycerol and ethylene glycol (EG) on survival of dogs’ spermatozoa (DS) after freeze-thawing depending on the concentration of cryoprotectants, cooling regimens and equilibration time, as well as the change in DS cell volume after the cryoprotectants being introduced into suspension by means of turbidimetric method. The highest motility of DS was revealed after cryopreservation under EG protection with final concentration of 7% when being frozen at the first stage with the rate of 3°C/min with no preliminary equilibration. It has been shown that 7% EG causes quite less alterations in cell volume if compared to glycerol. 2004 Article Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования / М.И. Егоров, Е.Ф. Копейка, Т.П. Линник, И.Н. Кучков // Проблемы криобиологии. — 2004. — № 4. — С. 13–20. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/139850 57. 043.:577.95; 575; 592/599 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Егоров, М.И. Копейка, Е.Ф. Линник, Т.П. Кучков, И.Н. Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
Исследовали влияние глицерина (ГЛ) и этиленгликоля (ЭГ) на выживаемость сперматозоидов собак (СС) после замораживания-оттаивания в зависимости от концентрации криопротекторов, режимов охлаждения и времени эквилибрации, а также изменение клеточного объема СС после введения в суспензию растворов криопротекторов турбидиметрическим методом. Выявлено, что наилучшая подвижность СС наблюдалась после криоконсервирования под защитой ЭГ в конечной 7%-й концентрации при замораживании на первом этапе со скоростью 3°С/мин без предварительной эквилибрации. Показано, что 7%-й ЭГ вызывает значительно меньшие изменения клеточного объема в сравнении с глицерином. |
| format |
Article |
| author |
Егоров, М.И. Копейка, Е.Ф. Линник, Т.П. Кучков, И.Н. |
| author_facet |
Егоров, М.И. Копейка, Е.Ф. Линник, Т.П. Кучков, И.Н. |
| author_sort |
Егоров, М.И. |
| title |
Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования |
| title_short |
Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования |
| title_full |
Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования |
| title_fullStr |
Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования |
| title_full_unstemmed |
Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования |
| title_sort |
влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2004 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/139850 |
| citation_txt |
Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные характеристики сперматозоидов собак на разных этапах криоконсервирования / М.И. Егоров, Е.Ф. Копейка, Т.П. Линник, И.Н. Кучков // Проблемы криобиологии. — 2004. — № 4. — С. 13–20. — Бібліогр.: 15 назв. — рос. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT egorovmi vliânieglicerinaétilenglikolânamorfofunkcionalʹnyeharakteristikispermatozoidovsobaknaraznyhétapahkriokonservirovaniâ AT kopejkaef vliânieglicerinaétilenglikolânamorfofunkcionalʹnyeharakteristikispermatozoidovsobaknaraznyhétapahkriokonservirovaniâ AT linniktp vliânieglicerinaétilenglikolânamorfofunkcionalʹnyeharakteristikispermatozoidovsobaknaraznyhétapahkriokonservirovaniâ AT kučkovin vliânieglicerinaétilenglikolânamorfofunkcionalʹnyeharakteristikispermatozoidovsobaknaraznyhétapahkriokonservirovaniâ AT egorovmi effectofglycerolethyleneglycolonmorphofunctionalcharacteristicsofdogsspermatozoaatdifferentcryopreservationstages AT kopejkaef effectofglycerolethyleneglycolonmorphofunctionalcharacteristicsofdogsspermatozoaatdifferentcryopreservationstages AT linniktp effectofglycerolethyleneglycolonmorphofunctionalcharacteristicsofdogsspermatozoaatdifferentcryopreservationstages AT kučkovin effectofglycerolethyleneglycolonmorphofunctionalcharacteristicsofdogsspermatozoaatdifferentcryopreservationstages |
| first_indexed |
2025-11-26T16:37:37Z |
| last_indexed |
2025-11-26T16:37:37Z |
| _version_ |
1849871629694271488 |
| fulltext |
13ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №4
УДК 57. 043.:577.95; 575; 592/599
Влияние глицерина, этиленгликоля на морфофункциональные
характеристики сперматозоидов собак на разных этапах
криоконсервирования
М.И. ЕГОРОВ, Е.Ф. КОПЕЙКА, Т.П. ЛИННИК, И. Н. КУЧКОВ
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Effect of Glycerol, Ethylene Glycol on Morphofunctional Characteristics
of Dogs’ Spermatozoa at Different Cryopreservation Stages
M.I. EGOROV, E.F. KOPEIKA, T.P. LINNIK, I.N. KUCHKOV
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy
of Sciences of the Ukraine, Kharkov
Исследовали влияние глицерина (ГЛ) и этиленгликоля (ЭГ) на выживаемость сперматозоидов собак (СС) после
замораживания-оттаивания в зависимости от концентрации криопротекторов, режимов охлаждения и времени эквилибрации,
а также изменение клеточного объема СС после введения в суспензию растворов криопротекторов турбидиметрическим
методом. Выявлено, что наилучшая подвижность СС наблюдалась после криоконсервирования под защитой ЭГ в конечной 7%-й
концентрации при замораживании на первом этапе со скоростью 3°С/мин без предварительной эквилибрации. Показано, что
7%-й ЭГ вызывает значительно меньшие изменения клеточного объема в сравнении с глицерином.
Ключевые слова: сперматозоиды, подвижность, эквилибрация, криоконсервирование, глицерин, этиленгликоль.
Досліджували вплив гліцерину та етиленгліколю на рухливість сперматозоїдів собак (СС) після заморожування-відтавання
в залежності від їхньої концентрації, режимів охолодження і часу еквілібрації, а також якісну зміну клітинного об’єму СС після
введення в суспензію розчинів кріопротекторів за допомогою турбідиметричного методу. Виявлено, що найкраща рухливість
СС спостерігалася після кріоконсервування під захистом етиленгліколю в 7%-й кінцевій концентрації при заморожуванні на
першому етапі зі швидкістю 3°С/хв без попередньої еквілібрації. Показано, що 7%-й етиленгліколь викликає значно менші
зміни клітинного об’єму в порівнянні з гліцерином тієї ж концентрації.
Ключові слова: сперматозоїди, рухливість, еквілібрація, кріоконсервування, гліцерин, етиленгліколь.
There has been studied the effect of glycerol and ethylene glycol (EG) on survival of dogs’ spermatozoa (DS) after freeze-thawing
depending on the concentration of cryoprotectants, cooling regimens and equilibration time, as well as the change in DS cell volume
after the cryoprotectants being introduced into suspension by means of turbidimetric method. The highest motility of DS was revealed
after cryopreservation under EG protection with final concentration of 7% when being frozen at the first stage with the rate of 3°C/min
with no preliminary equilibration. It has been shown that 7% EG causes quite less alterations in cell volume if compared to glycerol.
Key-words: spermatozoa, motility, equilibration, cryopreservation, glycerol, ethylene glycol.
UDC 57. 043.:577.95; 575; 592/599
Адрес для корреспонденции: Линник Т.П. Институт проблем
криобиологии и криомедицины НАН Украины, ул. Переяславская,
23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38 (057) 772-20-67, факс: +38
(057) 772-00-84, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Address for correspondence: Linnik T.P., Institute for Problems of
Cryobiology&Cryomedicine of the Natl. Acad. Sci. of Ukraine, 23,
Pereyaslavskaya str.,Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 772 2067,
fax: +380 57 772 0084, e-mail:cryo@online.kharkov.ua
Возросший интерес к проблеме криоконсер-
вирования спермы собак обусловлен, во-первых,
необходимостью сохранить генетический ма-
териал исчезающих пород собак; во-вторых,
криоконсервирование половых клеток позволяет
эффективно обмениваться генофондом ценных
производителей; в-третьих, по данным, получен-
ным за последние 5 лет, возникла целесообразность
накопления спермы собак в низкотемпературных
банках как модельного объекта для изучения нас-
ледственных заболеваний, которые идентичны
заболеваниям человека [13].
Данные литературы свидетельствуют о том,
что задача криоконсервирования СС до насто-
ящего времени остается нерешенной [3].
Успех низкотемпературного консервирования
практически всех биологических объектов,
включая и сперму, зависит от многих факторов, к
важнейшим из которых относится правильный
Growing interest to the problem of dogs’ sperm
cryopreservation is stipulated firstly by the necessity
to preserve genetic material of endangered dogs’
species, secondly, cryopreservation of sexual cells
allows an effective exchange of gene fond of valuable
sires; thirdly according to the data been obtained within
recent 5 years, there has been arisen the expediency
of accumulating the dog’s sperm in low temperature
banks as model objects to study inherent diseases,
which are identical to human ones [13].
Literature data testify to the fact that the task of
DS cryopreservation up to now has remained unsolved
[3].
The success of low-temperature preservation of
practically all biological objects, including sperm,
depends on many factors, to the most important of
them are referred as follows: correct choice of cryo-
protectant and its concentration, composition of
cryoprotective medium, cooling and freezing regimens.
14ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №4
выбор криопротектора и его концентрации, состава
криозащитной среды, режимов охлаждения и
замораживания.
По данным [3-5, 7-15] для криоконсервирования
спермы собак в качестве криопротекторов
опробованы 3 соединения: глицерин, этиленгликоль
и диметилсульфоксид.
Широко используемый для замораживания
спермы собак ГЛ позволяет получить после оттаи-
вания жизнеспособные клетки, но подвижность
сперматозоидов по данным [4] варьирует в диапа-
зоне от 15 до 60%. Возможной причиной этого
является возникающий под воздействием ГЛ осмо-
тический шок [13]. Однако данная гипотеза тре-
бует дальнейшего изучения. Если она получит под-
тверждение, возникнет необходимость поэтапного
введения и выведения ГЛ, что значительно услож-
няет методику криоконсервирования. К тому же в
[5] отмечается, что ГЛ оказывает негативное воз-
действие на оплодотворяющую способность СС.
По мнению некоторых авторов [13], ЭГ более
перспективен по сравнению с ГЛ, так как не
оказывает выраженного цитотоксического дейст-
вия на СС. В работе [5] показано, что подвижность
клеток после прибавления ЭГ к суспензии на этапе
подготовки к замораживанию не снижается по
сравнению с контролем, в то время как с ГЛ падает
на 5-10%. По данным [12] количество сперма-
тозоидов с морфологическими повреждениями в
присутствии ГЛ достигает 35 % еще во время
экспозиции до замораживания, а с ЭГ не превышает
25%.
Результаты, полученные с ЭГ после замо-
раживания, достаточно противоречивы. Одни
авторы [12] отмечают, что подвижность СС после
замораживания-оттаивания с ЭГ при концентрации
0,5 М сохраняется на уровне 60% (при этом с ГЛ
не более 30% подвижных клеток), другие [5]
считают, что ГЛ проявляет более эффективную
криозащиту по сравнению с ЭГ, но сохранность
клеток после оттаивания находится на очень
низком уровне (не более 25 % подвижных клеток).
Значительные расхождения в полученных резуль-
татах, вероятно, объясняются использованием
различных режимов охлаждения и замораживания,
а также низким качеством исходной спермы.
Цель данной работы – сравнить влияние ГЛ и
ЭГ на выживаемость СС до и после замора-
живания по 2-м режимам охлаждения в зави-
симости от концентрации криопротекторов в
суспензии и времени экспозиции клеток с ними.
Предпринята попытка оценить изменение клеточ-
ного объема после введения криопротекторов в
суспензию для подтверждения гипотезы о влиянии
осмотического шока на СС.
According to the literature data [3-5, 7-15] for
cryopreservation of canine sperm as cryoprotectants
there were tested 3 compounds, glycerol, ethylene
glycol and dimethyl sulfoxide.
Widely used for freezing of canine sperm glycerol
allows the obtaining of viable cells after thawing, but
spermatozoa motility according to the data [4] varies
within the range from 15 to 60%. This is probably due
to appearing under the effect of glycerol osmotic shock
[13]. However this hypothesis requires further studying.
If it is confirmed there will appear the necessity of
step-wise introduction and removal of glycerol, that
makes cryopreservation methods quite complicated.
Moreover in the paper [5] there was noted that glycerol
negatively affected fertilizing ability of DS.
On some authors’opinion [13] EG is more promising
in comparison with glycerol, because it does not cause
marked cytotoxic effect on DS. In the paper [5] there
was shown that the motility of cells after adding EG to
suspension at the stage of preparing to freezing did
not reduce if compared with the control, whilst with
glycerol it fell by 5-10%. According to the data [12]
the number of morphologically damaged spermatozoa
in the presence of glycerol reaches 35% even during
exposure before freezing and with EG does not exceed
25%.
Results obtained with EG after freezing are quite
contradictory. Some authors [12] believe that the
motility of DS after freeze-thawing with 0.5 M EG is
kept at the level of 60% (meanwhile with glycerol not
more than 30% of motile cells), other authors [5]
believe that glycerol has more effective cryoprotective
properties, but cell survival after thawing is on very
low level (not more than 25% motile cells). Consi-
derable variations in the obtained results are likely
explained by the usage of different regimens of cooling
and freezing as well as by the low quality of initial
semen.
The aim of the work is to compare the effect of
glycerol and EG on the survival of DS before and after
freezing according to two cooling regimens depending
on the concentration of cryoprotectants in suspension
and the exposure time of cells with them. There was
made an attempt to assess the change in cell volume
after introduction of cryoprotectants into suspension
to confirm the hypothesis about the effect of osmotic
shock on DS.
Materials and methods
Sperm for research was obtained from 3 clinically
healthy dog males at room temperature (20°C) by
means of massage of prostate in the presence of
estrous female. Sperm ejaculate of the dogs consists
of 3 fractions, separately secreting with a short time
interval. This allows during an experiment to receive
15ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №4
Материалы и методы
Сперма для исследований была получена от 3-х
клинически здоровых кобелей при комнатной
температуре (20°С) с помощью массажа пред-
стательной железы в присутствии эстральной
самки. Эякулят спермы собак состоит из трех
фракций, выделяющихся раздельно с небольшим
временным интервалом. Это дает возможность в
эксперименте получить все фракции эякулята
отдельно. Данная процедура позволяет избежать
преждевременной активации СС под воздействием
3-й фракции, представляющей собой секрет
предстательной железы [3].
Для опытов были использованы 7 эякулятов,
состоящих из первой и второй фракций свеже-
полученной спермы. Третья фракция получена
отдельно. Концентрацию сперматозоидов в эяку-
лятах оценивали фотометрическим методом.
Процент подвижных сперматозоидов определяли
визуально под микроскопом “Биолар” (×250).
Для определения переживаемости клеток после
оттаивания сперматозоиды в криозащитных средах
были помещены в термостат при температуре
38°С. Оценка подвижности сперматозоидов произ-
водилась через каждые 10 мин.
В первой серии экспериментов полученный
материал (первая и вторая фракции спермы) раз-
делили на 4 аликвоты по 1 мл, их отцентри-
фугировали в пластиковых ампулах объемом 1 мл
при 400 g в течение 3 мин. Надосадок удалили.
Осадок сперматозоидов ресуспендировали средой,
содержащей 0,2 М Трис-буфера (“Trizma pH 7,2”,
“Sigma”), 0,05 М фруктозы, 20% (v/v) желтка
куриных яиц в соотношении 1:1. Осмотичность
среды 320 мОсмоль, рН 7,2.
После охлаждения суспензии сперматозоидов
в течение 10 мин до температуры 4°С в аликвоты
была добавлена в соотношении 1:1 вышеуказанная
среда с ГЛ или ЭГ, также предварительно охлаж-
дённая до 4°С. Были исследованы конечные кон-
центрации ГЛ и ЭГ в суспензии сперматозоидов 3
и 7%. Часть образцов замораживали без экви-
либрации сперматозоидов с криопротекторами,
другую – выдерживали в течение 1 ч при темпе-
ратуре 4°С и только затем замораживали.
Для замораживания спермы использовали
пластиковые соломинки типа “СЖ” объемом 0,33 см3.
Подготовленные образцы сперматозоидов были
расфасованы в соломинки по 200 мкл, одну поло-
вину соломинок помещали в теплоизолирующую
рубашку, вторая оставалась открытой. Контроль
снижения температуры проводили при помощи
медь-константановой термопары и по полученной
термограмме определяли скорость охлаждения.
all the fractions of ejaculate separately. This procedure
permits to avoid untimely activation of DS under the
effect of the third fraction, which is prostate secretion
[3].
For the experiments there were used 7 ejaculates,
consisting of the first and second fractions of freshly
isolated sperm. The third fraction is obtained separately.
The spermatozoa concentration in ejaculates was
assessed photometrically. The percentage of motile
spermatozoa was visually determined under “Biolar”
microscope (×250 magnification).
To determine the cell survival after thawing the
spermatozoa in cryoprotective media were placed into
thermostat at 38°C. The estimation of spermatozoa
motility was made in every 10 min.
In the first session of experiments the obtained
material (first and second sperm fractions) were divided
into 4 aliquots by 1 ml, they were centrifuged in 1 ml
plastic ampoules at 400g for 3 min. Supernatant was
removed. Spermatozoa sediment was re-suspended
with the medium, containing 0.2M tris-buffer (“Trizma
pH 7.2”, “Sigma”), 0.05M fructose, 20% (v/v)
chicken’s egg yolk in the 1:1 ratio. Medium osmolality
was 320 mOsm, pH 7.2.
After cooling the suspension of spermatozoa for
10 min down to the temperature of 4°C into aliquots
there was added under the 1:1 ratio the mentioned
above medium with glycerol of EG, also preliminarily
cooled down to 4°C. There were studied final
concentrations of glycerol and EG in the suspension
of spermatozoa of 3 and 7%. The part of samples were
frozen without equilibration of spermatozoa with
cryoprotectants, another part was maintained for 1 hour
at 4°C and only afterwards was frozen.
To freeze the sperm there were used 0.33 cm3
plastic straws. Prepared samples of spermatozoa were
packed into the straws by 200 µl, one part of the straws
was removed into heat-insulating jacket, another one
remained open. The control of temperature reduction
was made using copper-constantan thermocouple and
on the thermogram me obtained cooling rate was
found.
Freezing of DS with glycerol and EG according to
literature data [3-5, 7-15] in the majority of the methods
is performed as two stages: at the first stage from 5°C
to –15°C with cooling rate of 2-10°C/min, at the second
stage from –15° down to –70°C with cooling rate of
10-20°C/min.
Taking into account mentioned above freezing of
DS in plastic straws was performed by means of
laboratory device according to two regimens: the first
one was from 5° to –15°C with cooling rate of 3°C/min,
from –15° down to –100°C with the rate with the rate
of 10°C/min and later immersion into liquid nitrogen;
16ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №4
Замораживание СС с ГЛ и ЭГ по литературным
данным [3-5, 7-15] в большинстве методов
производится в два этапа: на первом этапе – от 5
до –15°С со скоростью охлаждения 2-10°С/мин, на
втором этапе от –15 до –70°С со скоростью охлаж-
дения 10–20°С/мин.
Учитывая вышесказанное, замораживание СС
в пластиковых соломинках было проведено на
лабораторной установке по двум режимам:
первый – от 5 до –15°С со скоростью охлаждения
3°С/мин, от –15 до –100°С со скоростью 10°С/мин,
далее погружение в жидкий азот; второй – от 5 до
–15°С со скоростью охлаждения 6°С/мин, от – 15
до –100°С со скоростью 15°С/мин, далее погру-
жение в жидкий азот.
Оттаивание производили на водяной бане при
температуре 40°С до появления жидкой фазы (не
более 3-5 с).
Для статистической обработки полученных
результатов использовали метод Стьюдента.
Во второй серии экспериментов оценивали
динамику изменения объема СС после введения в
суспензию растворов криопротекторов. Исполь-
зовали ГЛ и ЭГ в 7%-й концентрации. Иссле-
дования проводили турбидиметрическим мето-
дом, основанном на том, что при прохождении
падающего света через суспензию, содержащую
клетки, поглощение практически отсутствует и
ослабление интенсивности падающего света равно
полной интенсивности света, рассеянного клетками
во всех направлениях. Описание метода и его
теоретическое обоснование приведены в [2].
Учитывая, что зависимость объема клеток от
поглощения света является нелинейной функцией,
а интенсивность прошедшего света значительно
зависит от соотношения размера клеток и длины
волны падающего света, говорить об измерении
абсолютных значений объемов клеток, исходя из
наших данных, невозможно. Однако качественно
описать динамику изменения объема клеток
можно. При проведении эксперимента оценивали
фотоэлектродвижущую силу во времени.
Результаты и обсуждение
Анализ результатов показывает, что еще до
замораживания после эквилибрации сперма-
тозоидов с криопротекторами в течение 1 ч наблю-
далось существенное снижение подвижности СС
(рис. 1) в присутствии ЭГ и ГЛ независимо от их
концентрации. Но следует отметить, что ЭГ оказы-
вал меньшее цитотоксическое действие на СС как
через 2-5 мин после прибавления криопротекторов,
так и после 1 ч эквилибрации клеток с ним. Полу-
ченные результаты о более низкой цитотоксич-
ности ЭГ в сравнении с ГЛ согласуются с данными
[12, 13]. Кроме этого, выявлено, что при увеличе-
the second one from 5°C down to –15°C with cooling
rate of 6°C/min. From –15°C down to –100°C with
the rate of 15°C/min and then immersion into liquid
nitrogen.
Thawing was conducted in water bath at 40°C up
to appearance of liquid phase (not more than 3-5
seconds).
For statistical processing of the obtained results the
Student’s test was used.
In the second session of experiments there was
estimated the dynamics of volume changes for DS
after introduction into suspension of cryoprotectants’
solutions. There were used glycerol and EG under 7%
concentration. The studies were performed with
turbidimetric method, based on the passing of falling
light via the suspension, containing the cells, the absorp-
tion is practically absent and weakening of intensity of
falling light is equal to a total intensity of light, scattered
by cells in all directions. The method description and
its theoretical substantiation are reported elsewhere
[2]. Taking into account that the dependence of cell
volume on light adsorption is non-linear function and
the intensity of passed light significantly depends on
the ratio of cell size and wave length of falling light, it
is impossible to speak about measuring the absolute
values of cell volumes, proceeding from our data.
However it is possible to describe qualitatively the
dynamics of cell volume change. When performing
the experiment there was evaluated photoelectromotive
force in time.
Results and discussion
Analysis of the results shows that even before
freezing after equilibration of spermatozoa with
cryoprotectants for 1 hour there was observed
considerable reduction of DS motility (Fig. 1) in the
presence of EG and glycerol not depending on their
concentration. But it should be noted that EG caused
less cytotoxic effect on DS both in 2-5 min after
cryoprotectant adding and in an hour of cell equilibration
with it. Obtained results about lower cytotoxicity of
EG in comparison with glycerol are in accordance with
the data [12, 13]. In addition, it has been revealed that
with an increase in glycerol concentration from 3 to
7% the motility of spermatozoa reduces much bigger
than when glycerol concentration is getting higher. This
may testify to glycerol stronger osmotic effect on
spermatozoa, that causes the death of cells. The
correctness of such a conclusion is indirectly confirmed
by the dynamics of volume change for spermatozoa
under the effect of EG and glycerol. As Figure 2 shows
even during the first seconds of cells’ contact with
cryoprotectans their strong shrinking takes place.
Afterwards gradual rise in cell volume is observed up
to the levels exceeding initial one. These cell changes
are more manifested in the solution of glycerol than in
17ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №4
that of EG. In human spermatozoa it has been de-
monstrated [6] that permeability coefficient for EG via
their membranes three times higher than for glycerol
(7.9×10-3 and 2.1×10-3 cm/min, correspondingly). One
can suppose that glycerol penetrates through DS
membranes slower too, than EG and therefore causes
significant osmotic effect on cells. Namely this likely
leads to the death of main part of spermatozoa with
glycerol even before freezing and also increases the
DS sensitivity to damaging factors during freeze-
thawing process.
The results of DS survival testify to the same after
thawing. Figure 3 shows that after freeze-thawing not
depending on the use cooling regimen a big number of
cells is preserved under EG protection. In this case
the cell survival is higher in the 7% EG solutions. With
the increase in time of sperm equilibration in the media
with cryoprotectnats up to 1 hour the number of motile
cells statistically and significantly reduced both before
and after freezing (p≤0.05).
Increase in cooling rate of sperm during freezing
(second regimen) both with glycerol and EG (Fig. 3)
resulted in even more death of cells. Each cryoprotectant
is known to manifest its potential cryoprotective activity
at optimal cooling rate, depending on its capability to
penetrate inside the cells, and more important on the
effect of cryoprotectants on permeability of membranes
for water. EG has been shown to reduce the permea-
bility of human spermatozoa membranes for water
almost in 2.5 times (without cryoprotectant Lp=1.84,
with EG it is equal to 0.74 µm×min-1×atm-1). There
are findings [15] that permeability of DS membranes
нии концентрации ГЛ с 3 до 7%-й подвижность
сперматозоидов снижается значительно больше,
чем при повышении концентрации ЭГ. Это может
свидетельствовать о более сильном осмотическом
воздействии ГЛ на сперматозоиды, которое и
вызывает гибель клеток. Правильность подобного
вывода косвенно подтверждается динамикой
изменения объема сперматозоидов под воздейст-
вием ЭГ и ГЛ. Как видно из рис. 2, уже в первые
секунды контакта клеток с криопротекторами
происходит сильное их сжатие. Затем наблюдается
постепенное увеличение объема клеток до уровня,
превышающего исходный. Эти изменения клеток
более выражены в растворе с ГЛ, чем с ЭГ. На
сперматозоидах человека было показано [6], что
коэффициент проницаемости ЭГ через их мембра-
ны в 3 раза выше, чем у ГЛ (7,9×10-3 и 2,1×10-3 см/мин
соответственно). Можно предположить, что ГЛ и
через мембраны СС проникает более медленно,
чем ЭГ и поэтому оказывает существенное осмо-
тическое воздействие на клетки. Вероятно, именно
это вызывает гибель основной части спермато-
зоидов с ГЛ еще до замораживания, а также повы-
шает чувстви-тельность СС к повреждающим
факторам в процессе замораживания-оттаивания.
Об этом также свидетельствуют результаты
выживаемости СС после оттаивания. Из рис.3
Ф
от
оэ
ле
кт
ро
дв
иж
ущ
ая
с
ил
а
Ph
ot
oe
le
ct
ro
m
ot
iv
e
f
or
se
Рис 2. Динамика изменения объема СС под воздей-
ствием криопротекторов. 1 – ГЛ; 2 – ЭГ.
Fig. 2. Dynamics of volume changes for DS under the effect
of cryoprotectants. 1 – glycerol; 2 – EG.
Рис.1. Переживаемость СС в присутствии крио-
протекторов ГЛ и ЭГ в 3- и 7%-й концентрации до
замораживания: 1– подвижность без криопротектора;
2 – подвижность через 2-5 мин после введения крио-
протекторов; 3 – подвижность через 60 мин после
введения криопротекторов. – 3%-й ЭГ; – 7%-й
ЭГ; ▲ – 3%-й ГЛ; – 7%-й ГЛ.
Fig. 1. Survival of DS in the presence of glycerol and EG
cryoprotectants under concentration of 2 and 7% before
freezing: 1- motility without cryoprotectant; 2 – that in 2-5
min after cryoprotectants’ introduction; 3 – that in 60 min
after cryoprotectants’ introduction. – 3% EG; – 7%
EG; ▲ – 3% glycerol; – 7% glycerol;
П
од
ви
ж
но
ст
ь
сп
ер
м
ат
оз
ои
до
в,
%
Sp
er
m
at
oz
oa
m
ot
ili
ty
, %
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1 2 3
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 2,4 2,8
Время, с Time, s
1
2
18ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №4
видно, что после замораживания-оттаивания
независимо от использованного режима охлаж-
дения большее количество клеток сохраняется под
защитой ЭГ. При этом выживаемость клеток выше
в растворах ЭГ с 7%-й концентрацией. С уве-
личением времени эквилибрации спермы в средах
с криопротекторами до 1-го часа количество под-
вижных клеток достоверно уменьшалось, как до,
так и после замораживания (р≤0,05).
Увеличение скорости охлаждения спермы при
замораживании (второй режим) как с ГЛ, так и с
ЭГ (рис.3) приводило к еще большей гибели
клеток. Известно, что каждый криопротектор
проявляет свою потенциальную криопротекторную
активность при оптимальной скорости охлаждения,
которая зависит от его способности проникать
внутрь клеток, а главное от влияния криопро-
текторов на проницаемость мембран для воды.
Показано [6] , что ЭГ снижает проницаемость
мембран сперматозоидов человека для воды
почти в 2,5 раза (без криопротектора Lp равен 1,84,
с этиленгликолем – 0,74 мкм×мин -1×атм-1 ).
Получены данные [15], что проницаемость мем-
бран СС для воды чрезвычайно низкая, коэффици-
ент проницаемости равен 0,0029 мкм×мин -1×атм-1.
Этим можно объяснить, почему применение
медленных скоростей охлаждения с ЭГ приводит
к более высокой сохранности клеток после замо-
раживания. Как показали результаты проведенных
исследований, максимальная выживаемость СС
после оттаивания наблюдается в присутствии ЭГ
в 7%-й концентрации при замораживании по
первому режиму, который предусматривает
использование более медленных скоростей охлаж-
дения на первом и на втором этапах (р≤0,05).
Известно, что переживаемость сперматозоидов
в большей степени коррелирует с их оплодотво-
ряющей способностью, чем просто подвижность.
Поэтому была проведена оценка переживамости
СС, замороженных по первому режиму охлажде-
ния, без предварительной эквилибрации клеток с
криопротекторами. Из рис. 4 видно, что макси-
мальная переживаемость наблюдалась у СС,
криоконсервированных в присутствии ЭГ в 7%-й
концентрации. После 30 мин хранения спермы при
температуре 38°С, соответствующей физиологи-
ческой норме собак, подвижными оставались око-
ло 25% сперматозоидов, в то время как в осталь-
ных вариантах наблюдалась подвижность на
уровне не выше 15%, разница достоверна (р≤0,05).
Полученные результаты подтверждают пер-
спективность использования ЭГ в качестве крио-
протектора для криоконсервирования спермы со-
бак. Этиленгликоль, вероятно, более эффективный
криопротектор для СС по сравнению с ГЛ, так как
вызывает минимальное отклонение клеточного
for water is quite low, permeability coefficient is equal
to 0.0029 µm×min-1×atm-1. This may explain why the
application of slow cooling rates with EG results in
higher integrity of cells after freezing. The results of
conducted studies demonstrate that maximum survival
of DS after thawing is observed in the presence of
7% EG during freezing according to the first regimen,
which foresees the usage of lower cooling rates at the
first and second stages.
Spermatozoa survival is known to correlate in bigger
extent with their fertilizing ability, than just motility.
Therefore there was assessed the survival of DS fro-
zen according to the first cooling regimen without
preliminary equilibration of cells with cryoprotectants.
Figure 4 demonstrates that maximum survival was
found in DS cryopreserved in the presence of 7% EG.
After 30-min’s sperm storage at 38°C, which is
physiological norm for dogs, about 25% of spermatozoa
remained motile, meanwhile the rest showed the
motility at the level not higher than 15%, the difference
is statistically significant (p≤0.05).
The obtained results confirm the perceptiveness of
EG usage as cryoprotectant to cryopreserve canine
sperm. Ethylene glycol is probably more effective
cryoprotectant for DS if compared with glycerol, since
it causes minimum deviation of cell volume from
isotonic one during freeze-thawing, stipulated by its
high penetrating ability via cell membranes [6].
П
од
ви
ж
но
ст
ь
сп
ер
м
ат
оз
ои
до
в,
%
Sp
er
m
at
oz
oa
m
ot
ili
ty
, %
Рис. 3. Подвижность СС после оттаивания в зависимости
от концентрации криопротекторов ГЛ и ЭГ по первому
и второму режимам замораживания: 1,2 – без эквили-
брации с криопротекторами; 3,4 – с предварительной
эквилибрацией с криопротекторами. – 3%-й ГЛ; –
7%-й ГЛ; – 3%-й ЭГ;
123
123
123 – 7%-й ЭГ.
Fig. 3. Motility of DS after thawing depending on
concentration of cryoprotectants, glycerol and EG
according to the first and second freezing regimens: 1,2 –
without equilibration with cryoprotectants; 3,4 – equili-
bration with cryoprotectants. – 3% glycerol; – 7%
glycerol; – 3% EG;
123
123 – 7% EG.
1 2 3 4
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
������
�����
�����
�����
�����
�����
�����
�����
�����
�����
�����0
5
10
15
20
25
30
35
40
0
5
10
15
20
25
30
35
40
10 20 30 40 50 60 70 80 90
19ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №4
Thus the obtained data testify to higher cytotoxicity
of glycerol in respect of DS, that is stipulated by its
lower capability to penetrate inside cells in comparison
with EG. Sharp changes of cell volume in the medium
with glycerol may be the cause of DS osmotic shock
and the rise in their sensitivity to damaging factors
during cryopreservation and low cell integrity after
freeze-thawing.
Conclusions
1. The prospects of EG application as a cryo-
protectant in 7% concentration have been proved in
comparison with glycerol when cryopreserving the
dogs’ sperm.
2. It has been established the equilibration of DS
with cryoprotectants at the stage of preparing to
freezing during an hour negatively affects their survival
after thawing.
3. High integrity of DS has been noted after
thawing when freezing at the first cryopreservation
stage with the rate of 3°C/min and 10°C/min at the
second one.
4. During DS equilibration in glycerol media the
bigger changes in cell volume have been found to occur
than in those with EG, likely, because of low perme-
ability of membranes of these cells for glycerol, that
may serve as the cause of osmotic shock appearance
and increase in cell sensitivity to damaging factors in
cryopreservation cycle.
объема от изотонического в процессе замора-
живания и оттаивания, обусловленное его высокой
проникающей способностью через мембраны
клеток [6].
Таким образом, полученные данные свидетель-
ствуют о более высокой цитотоксичности ГЛ в
отношении СС, обусловленной более низкой его
способностью проникать внутрь клеток в срав-
нении с ЭГ. Резкие изменения объема клеток в
среде с ГЛ могут быть причиной осмотического
шока СС и повышения их чувствительности к
повреждающим факторам в процессе крио-
консервирования и низкой сохранности клеток
после замораживания-оттаивания.
Выводы
1. Доказана перспективность применения ЭГ
как криопротектора в 7%-й концентрации в сравне-
нии с ГЛ при криоконсервировании спермы собак.
2. Установлено, что эквилибрация СС с крио-
протекторами на этапе подготовки к заморажива-
нию в течение часа отрицательно влияет на их
выживаемость после оттаивания.
3. Отмечена более высокая сохранность СС
после оттаивания при замораживании на первом
этапе криоконсервирования со скоростью 3°С/мин,
на втором – 10°С/мин.
4. Установлено, что при эквилибрации СС в
средах с ГЛ происходят большие изменения объе-
ма клеток, чем в средах с ЭГ, возможно, из-за
более низкой проницаемости мембран этих клеток
для ГЛ, что может служить причиной возникно-
вения осмотического шока и повышения чувстви-
тельности клеток к повреждающим факторам в
цикле криоконсервирования.
Литература
Манк В. В., Лебовка Н. И. Спектроскопия ядерного
магнитного резонанса воды в гетерогенных системах.–
Киев: Наук. думка, 1988.– 202 с.
Новиков А. Н., Пресяжнюк В. А. Прибор для изучения
процесса коагуляции коллоидных систем // Коллоидный
журн.– 1962.– Т. 31, №4.– C. 559 – 563.
Boucher J.H., Foote R.H., Kirk R.W. The evaluation of semen
quality in the dog and the effects of frequency of ejaculation
upon semen quality, libido, and depletion of sperm reserves //
Cornell Vet.– 1959.– Vol.– 47.– P. 67-89.
England G. C. W. Cryopreservation of dog semen: a review //
J. Reprod Fertil. Suppl.– 1993.– Vol.47.– P. 243-255.
Fahrig B.M. Cryopreservation by pellet freezing of epididymal
and ejaculated spermatozoa from male dog: B.S. Thesis.–
Louisiana State University, 2003.– 312 p.
Gilmore J. A., Mc Gann L. E., Lui J. K. Effect of Cryoprotectant
Solutes on Water Permeability Of Human Spermatozoa // Biol.
Reprod.– 1995.– Vol. 53.– P. 985-995.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Рис. 4. Переживаемость СС после оттаивания, заморо-
женных по первому режиму без эквилибрации с крио-
протекторами. 1– 3%-й ГЛ; 2 – 7%-й ГЛ; 3 – 3%-й ЭГ; 4 –
7%-й ЭГ.
Fig. 4. Survival of DS after thawing, the one frozen according
to the first regimen without equilibration with cryoprotectants.
1 – 3% glycerol; 2 – 7% glycerol; 3 – 3% EG; 4 – 7% EG.
П
од
ви
ж
но
ст
ь
сп
ер
м
ат
оз
ои
до
в,
%
Sp
er
m
at
oz
oa
m
ot
ili
ty
, %
1 2
3
4
Время, мин Time, min
20ПРОБЛЕМЫ
КРИОБИОЛОГИИ
2004, №4
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
2004, №4
References
Mank V.V., Lebovka N.I. Spectroscopy of nuclear magnetic
resonance of water in heterogenous systems.– Kiev: Naukova
Dumka, 1988.– 202 p.
Novikov A.N., Presyazhnyuk V.A. Device for studying the
process of coagulation of colloid systems// Kolloidny zhurnal.–
1962.– Vol. 31, N4.– P. 559-563.
Boucher J.H., Foote R.H., Kirk R.W. The evaluation of semen
quality in the dog and the effects of frequency of ejaculation
upon semen quality, libido, and depletion of sperm reserves //
Cornell Vet.– 1959.– Vol.– 47.– P. 67-89.
England G. C. W. Cryopreservation of dog semen: a review //
J. Reprod Fertil. Suppl.– 1993.– Vol.47.– P. 243-255.
Fahrig B.M. Cryopreservation by pellet freezing of epididymal
and ejaculated spermatozoa from male dog: B.S. Thesis.–
Louisiana State University, 2003.– 312 p.
Gilmore J. A., Mc Gann L. E., Lui J. K. Effect of Cryoprotectant
Solutes on Water Permeability Of Human Spermatozoa // Biol.
Reprod.– 1995.– Vol. 53.– P. 985-995.
Koutsarova N., Todorov P., Koutsarov G. Effect of pentoxi-
fylline on motility and longevity of fresh and thawed dog
spermatozoa // J. Reprod. Fertil.– 1997.– Vol. 51.– P.117-121.
Olar T. T., Bower R. A., Pickett B. W. Influence of extender
cryopreservation and seminal processing procedures on
postthaw motility of canine spermatozoa frozen in straws //
Theriogenology.– 1988.– Vol. 31, N2.– P. 134-142.
Pena A., Linde-Forsberg C. Effect of equex, one- or two
step dilution, and two freezing and thawing rates on post-
thaw survival of dog spermatozoa // Theriogenology.– 2000.–
Vol. 54.– P. 859-875.
Pena A., Linde-Forsberg C. Effect of spermatozoal
concentration and post-thaw dilution rate on survival after
thawing of dog spermatozoa // Theriogenology.– 2000.–
Vol. 54.– P. 703-718.
Pena A., Lopez-Lugilde L., Barrio M. et al. Studies on the
Intracellular Ca2+ concentracion of frozen-thawed dog
spermatozoa influence of equex from different sources, two
thawing diluents and post-thaw incubation in capacitating
condition // Reprod. Domest. Anim.– 2003.– Vol. 38.– P. 27-35.
Solares M. P., Rossi C.A.R., Mezzalaira A., Cecim M.
Ethylene glycol on canine semen cryopreservation // Ciencia
Rural, Santa Maria.– 2002.– Vol. 32, N4.– P. 649-655.
Songsasen N., Yu I., Murton S. et al. Osmotic sensitivity of
canine spermatozoa // Cryobiology.– 2002.– Vol. 44.– P. 79-90.
Songsasen N., Godke R. A., Leibo S. P. Differences among
dogs in response of their spermatozoa to cryopreservation
using various cooling and warming rates // Cryobiology.–
2002.– Vol. 44.– P. 62-78.
Thirumata S., Ferrer M.S., Al-Jarrah A. et al. Cryopreser-
vation of canine spermatozoa: theoretical prediction of optimal
cooling rates in the presence and absence of cryoprotective
agent // Cryobiology.– 2003.– Vol. 47.– P. 109-124.
Accepted in 23.03.2004
Koutsarova N., Todorov P., Koutsarov G. Effect of pentoxi-
fylline on motility and longevity of fresh and thawed dog
spermatozoa // J. Reprod. Fertil.– 1997.– Vol. 51.– P.117-121.
Olar T. T., Bower R. A., Pickett B. W. Influence of extender
cryopreservation and seminal processing procedures on
postthaw motility of canine spermatozoa frozen in straws //
Theriogenology.– 1988.– Vol. 31, N2.– P. 134-142.
Pena A., Linde-Forsberg C. Effect of equex, one- or two
step dilution, and two freezing and thawing rates on post-
thaw survival of dog spermatozoa // Theriogenology.– 2000.–
Vol. 54.– P. 859-875.
Pena A., Linde-Forsberg C. Effect of spermatozoal
concentration and post-thaw dilution rate on survival after
thawing of dog spermatozoa // Theriogenology.– 2000.–
Vol. 54.– P. 703-718.
Pena A., Lopez-Lugilde L., Barrio M. et al. Studies on the
Intracellular Ca2+ concentracion of frozen-thawed dog
spermatozoa influence of equex from different sources, two
thawing diluents and post-thaw incubation in capacitating
condition // Reprod. Domest. Anim.– 2003.– Vol. 38.– P. 27-35.
Solares M. P., Rossi C.A.R., Mezzalaira A., Cecim M.
Ethylene glycol on canine semen cryopreservation // Ciencia
Rural, Santa Maria.– 2002.– Vol. 32, N4.– P. 649-655.
Songsasen N., Yu I., Murton S. et al. Osmotic sensitivity of
canine spermatozoa // Cryobiology.– 2002.– Vol. 44.– P. 79-90.
Songsasen N., Godke R. A., Leibo S. P. Differences among
dogs in response of their spermatozoa to cryopreservation
using various cooling and warming rates // Cryobiology.–
2002.– Vol. 44.– P. 62-78.
Thirumata S., Ferrer M.S., Al-Jarrah A. et al. Cryopreser-
vation of canine spermatozoa: theoretical prediction of optimal
cooling rates in the presence and absence of cryoprotective
agent // Cryobiology.– 2003.– Vol. 47.– P. 109-124.
Поступила 23.03.2004
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
|