Антигемолитическая эффективность хлорпромазина в условиях постгипертонического шока и при удалении глицерина из эритроцитов после размораживания
В работе проведено сравнительное исследование влияния хлорпромазина на чувствительность эритроцитов человека к действию постгипертонического шока и на их устойчивость в процессе удаления глицерина из клеток, подвергнутых замораживанию-отогреву. Показано, что в условиях постгипертонического шока эр...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Datum: | 2017 |
| Hauptverfasser: | , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2017
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/139895 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Антигемолитическая эффективность хлорпромазина в условиях постгипертонического шока и при удалении глицерина из эритроцитов после размораживания / Е.А. Семионова, Н.Г. Землянских, Н.В. Орлова, Н.М. Шпакова // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2017. — Т. 27, № 1. — С. 51–60. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-139895 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Семионова, Е.А. Землянских, Н.Г. Орлова, Н.В. Шпакова, Н.М. 2018-06-21T13:16:00Z 2018-06-21T13:16:00Z 2017 Антигемолитическая эффективность хлорпромазина в условиях постгипертонического шока и при удалении глицерина из эритроцитов после размораживания / Е.А. Семионова, Н.Г. Землянских, Н.В. Орлова, Н.М. Шпакова // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2017. — Т. 27, № 1. — С. 51–60. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/139895 57.043:615.21/.26:547.426.1:612.111 В работе проведено сравнительное исследование влияния хлорпромазина на чувствительность эритроцитов человека к действию постгипертонического шока и на их устойчивость в процессе удаления глицерина из клеток, подвергнутых замораживанию-отогреву. Показано, что в условиях постгипертонического шока эритроцитов (0°С) хлорпромазин снижает уровень гемолиза в 3,7 раза, при этом в концентрации 600 мкмоль/л его максимальная антигемолитическая активность составляет (73 ± 6)%. Применение хлорпромазина при удалении глицерина из размороженных эритроцитов позволяет снизить повреждение клеток в 2,5–3 раза. Значения антигемолитической активности хлорпромазина в обоих случаях находятся в одном диапазоне. Результаты исследования эффективности хлорпромазина в модельном эксперименте и реальных условиях замораживания-отогрева эритроцитов (при удалении глицерина из клеток) позволяют сделать вывод о целесообразности использования указанной модели (постгипертонический шок) в дальнейших исследованиях. У роботі проведено порівняльне дослідження впливу хлорпромазину на чутливість еритроцитів людини до дії постгіпертонічного шоку і на їх стійкість у процесі видалення гліцерину з клітин, які були піддані заморожуванню-відігріванню. Показано, що в умовах постгіпертонічного шоку еритроцитів (0°С) хлорпромазин знижує рівень гемолізу в 3,7 рази, при цьому в концентрації 600 мкмоль/л його максимальна антигемолітична активність становить (73 ± 6)%. Застосування хлорпромазину при видаленні гліцерину із розморожених еритроцитів доволяє знизити пошкодження клітин у 2,5–3 рази. Значення антигемолітичної активності хлорпромазину в обох випадках знаходяться в одному діапазоні. Результати дослідження ефективності хлорпромазину в модельному експерименті і реальних умовах заморожування-відігрівання еритроцитів (при видаленні гліцерину з клітин) дозволяють зробити висновок про доцільність використання зазначеної моделі (постгіпертонічний шок) в подальших дослідженнях. The chlorpromazine effect on sensitivity of human erythrocytes to the action of posthypertonic shock and their resistance at glycerol removal from the cells exposed to freeze-thawing has been studied in our research. It has been shown that under conditions of posthypertonic shock of erythrocytes (at 0°C) the chlorpromazine reduced a hemolysis level in 3.7 times, and in case of 600 µmol/L concentration its maximum antihemolytic activity was (73 ± 6)%. The application of chlorpromazine during removal of glycerol from frozen-thawed erythrocytes enabled to reduce the cell damage by 2.5–3 times. The values of antihemolytic activity of chlorpromazine in both cases were quite similar. Results of the investigation of chlorpromazine efficiency in the model experiment and under the real conditions of erythrocyte freeze-thawing (under glycerol removal from the cells) allow to conclude about the applicability of this model (posthypertonic shock) in the further studies. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Антигемолитическая эффективность хлорпромазина в условиях постгипертонического шока и при удалении глицерина из эритроцитов после размораживания Antihemolytic efficiency of chlorpromazine under posthypertonic shock and glycerol removal from erythrocytes after thawing Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Антигемолитическая эффективность хлорпромазина в условиях постгипертонического шока и при удалении глицерина из эритроцитов после размораживания |
| spellingShingle |
Антигемолитическая эффективность хлорпромазина в условиях постгипертонического шока и при удалении глицерина из эритроцитов после размораживания Семионова, Е.А. Землянских, Н.Г. Орлова, Н.В. Шпакова, Н.М. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title_short |
Антигемолитическая эффективность хлорпромазина в условиях постгипертонического шока и при удалении глицерина из эритроцитов после размораживания |
| title_full |
Антигемолитическая эффективность хлорпромазина в условиях постгипертонического шока и при удалении глицерина из эритроцитов после размораживания |
| title_fullStr |
Антигемолитическая эффективность хлорпромазина в условиях постгипертонического шока и при удалении глицерина из эритроцитов после размораживания |
| title_full_unstemmed |
Антигемолитическая эффективность хлорпромазина в условиях постгипертонического шока и при удалении глицерина из эритроцитов после размораживания |
| title_sort |
антигемолитическая эффективность хлорпромазина в условиях постгипертонического шока и при удалении глицерина из эритроцитов после размораживания |
| author |
Семионова, Е.А. Землянских, Н.Г. Орлова, Н.В. Шпакова, Н.М. |
| author_facet |
Семионова, Е.А. Землянских, Н.Г. Орлова, Н.В. Шпакова, Н.М. |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| publishDate |
2017 |
| language |
Russian |
| container_title |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Antihemolytic efficiency of chlorpromazine under posthypertonic shock and glycerol removal from erythrocytes after thawing |
| description |
В работе проведено сравнительное исследование влияния хлорпромазина на чувствительность эритроцитов
человека к действию постгипертонического шока и на их устойчивость в процессе удаления глицерина из клеток, подвергнутых
замораживанию-отогреву. Показано, что в условиях постгипертонического шока эритроцитов (0°С) хлорпромазин
снижает уровень гемолиза в 3,7 раза, при этом в концентрации 600 мкмоль/л его максимальная антигемолитическая активность
составляет (73 ± 6)%. Применение хлорпромазина при удалении глицерина из размороженных эритроцитов позволяет
снизить повреждение клеток в 2,5–3 раза. Значения антигемолитической активности хлорпромазина в обоих случаях
находятся в одном диапазоне. Результаты исследования эффективности хлорпромазина в модельном эксперименте и
реальных условиях замораживания-отогрева эритроцитов (при удалении глицерина из клеток) позволяют сделать вывод
о целесообразности использования указанной модели (постгипертонический шок) в дальнейших исследованиях.
У роботі проведено порівняльне дослідження впливу хлорпромазину на чутливість еритроцитів людини до дії
постгіпертонічного шоку і на їх стійкість у процесі видалення гліцерину з клітин, які були піддані заморожуванню-відігріванню.
Показано, що в умовах постгіпертонічного шоку еритроцитів (0°С) хлорпромазин знижує рівень гемолізу в 3,7 рази, при
цьому в концентрації 600 мкмоль/л його максимальна антигемолітична активність становить (73 ± 6)%. Застосування
хлорпромазину при видаленні гліцерину із розморожених еритроцитів доволяє знизити пошкодження клітин у 2,5–3 рази.
Значення антигемолітичної активності хлорпромазину в обох випадках знаходяться в одному діапазоні. Результати дослідження
ефективності хлорпромазину в модельному експерименті і реальних умовах заморожування-відігрівання еритроцитів
(при видаленні гліцерину з клітин) дозволяють зробити висновок про доцільність використання зазначеної моделі
(постгіпертонічний шок) в подальших дослідженнях.
The chlorpromazine effect on sensitivity of human erythrocytes to the action of posthypertonic shock and their
resistance at glycerol removal from the cells exposed to freeze-thawing has been studied in our research. It has been shown that
under conditions of posthypertonic shock of erythrocytes (at 0°C) the chlorpromazine reduced a hemolysis level in 3.7 times, and in
case of 600 µmol/L concentration its maximum antihemolytic activity was (73 ± 6)%. The application of chlorpromazine during removal
of glycerol from frozen-thawed erythrocytes enabled to reduce the cell damage by 2.5–3 times. The values of antihemolytic activity
of chlorpromazine in both cases were quite similar. Results of the investigation of chlorpromazine efficiency in the model experiment
and under the real conditions of erythrocyte freeze-thawing (under glycerol removal from the cells) allow to conclude about the
applicability of this model (posthypertonic shock) in the further studies.
|
| issn |
0233-7673 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/139895 |
| citation_txt |
Антигемолитическая эффективность хлорпромазина в условиях постгипертонического шока и при удалении глицерина из эритроцитов после размораживания / Е.А. Семионова, Н.Г. Землянских, Н.В. Орлова, Н.М. Шпакова // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2017. — Т. 27, № 1. — С. 51–60. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT semionovaea antigemolitičeskaâéffektivnostʹhlorpromazinavusloviâhpostgipertoničeskogošokaipriudaleniiglicerinaizéritrocitovposlerazmoraživaniâ AT zemlânskihng antigemolitičeskaâéffektivnostʹhlorpromazinavusloviâhpostgipertoničeskogošokaipriudaleniiglicerinaizéritrocitovposlerazmoraživaniâ AT orlovanv antigemolitičeskaâéffektivnostʹhlorpromazinavusloviâhpostgipertoničeskogošokaipriudaleniiglicerinaizéritrocitovposlerazmoraživaniâ AT špakovanm antigemolitičeskaâéffektivnostʹhlorpromazinavusloviâhpostgipertoničeskogošokaipriudaleniiglicerinaizéritrocitovposlerazmoraživaniâ AT semionovaea antihemolyticefficiencyofchlorpromazineunderposthypertonicshockandglycerolremovalfromerythrocytesafterthawing AT zemlânskihng antihemolyticefficiencyofchlorpromazineunderposthypertonicshockandglycerolremovalfromerythrocytesafterthawing AT orlovanv antihemolyticefficiencyofchlorpromazineunderposthypertonicshockandglycerolremovalfromerythrocytesafterthawing AT špakovanm antihemolyticefficiencyofchlorpromazineunderposthypertonicshockandglycerolremovalfromerythrocytesafterthawing |
| first_indexed |
2025-11-25T23:07:46Z |
| last_indexed |
2025-11-25T23:07:46Z |
| _version_ |
1850578765418070016 |
| fulltext |
УДК 57.043:615.21/.26:547.426.1:612.111
Е.А. Семионова, Н.Г. Землянских, Н.В. Орлова, Н.М. Шпакова*
Антигемолитическая эффективность хлорпромазина в условиях
постгипертонического шока и при удалении глицерина
из эритроцитов после размораживания
UDC 57.043:615.21/.26:547.426.1:612.111
E.A. Semionova, N.G. Zemlyanskikh, N.V. Orlova, N.M. Shpakova*
Antihemolytic Efficiency of Chlorpromazine under
Posthypertonic Shock and Glycerol Removal
from Erythrocytes after Thawing
Реферат: В работе проведено сравнительное исследование влияния хлорпромазина на чувствительность эритроцитов
человека к действию постгипертонического шока и на их устойчивость в процессе удаления глицерина из клеток, под-
вергнутых замораживанию-отогреву. Показано, что в условиях постгипертонического шока эритроцитов (0°С) хлорпромазин
снижает уровень гемолиза в 3,7 раза, при этом в концентрации 600 мкмоль/л его максимальная антигемолитическая актив-
ность составляет (73 ± 6)%. Применение хлорпромазина при удалении глицерина из размороженных эритроцитов позволяет
снизить повреждение клеток в 2,5–3 раза. Значения антигемолитической активности хлорпромазина в обоих случаях
находятся в одном диапазоне. Результаты исследования эффективности хлорпромазина в модельном эксперименте и
реальных условиях замораживания-отогрева эритроцитов (при удалении глицерина из клеток) позволяют сделать вывод
о целесообразности использования указанной модели (постгипертонический шок) в дальнейших исследованиях.
Ключевые слова: эритроциты, человек, постгипертонический шок, криоконсервирование, удаление криопротектора,
глицерин, хлорпромазин.
Реферат: У роботі проведено порівняльне дослідження впливу хлорпромазину на чутливість еритроцитів людини до дії
постгіпертонічного шоку і на їх стійкість у процесі видалення гліцерину з клітин, які були піддані заморожуванню-відігріванню.
Показано, що в умовах постгіпертонічного шоку еритроцитів (0°С) хлорпромазин знижує рівень гемолізу в 3,7 рази, при
цьому в концентрації 600 мкмоль/л його максимальна антигемолітична активність становить (73 ± 6)%. Застосування
хлорпромазину при видаленні гліцерину із розморожених еритроцитів доволяє знизити пошкодження клітин у 2,5–3 рази.
Значення антигемолітичної активності хлорпромазину в обох випадках знаходяться в одному діапазоні. Результати дос-
лідження ефективності хлорпромазину в модельному експерименті і реальних умовах заморожування-відігрівання еритро-
цитів (при видаленні гліцерину з клітин) дозволяють зробити висновок про доцільність використання зазначеної моделі
(постгіпертонічний шок) в подальших дослідженнях.
Ключові слова: еритроцити, людина, постгіпертонічний шок, кріоконсервування, видалення кріопротектора, гліцерин,
хлорпромазин.
Abstract: The chlorpromazine effect on sensitivity of human erythrocytes to the action of posthypertonic shock and their
resistance at glycerol removal from the cells exposed to freeze-thawing has been studied in our research. It has been shown that
under conditions of posthypertonic shock of erythrocytes (at 0°C) the chlorpromazine reduced a hemolysis level in 3.7 times, and in
case of 600 µmol/L concentration its maximum antihemolytic activity was (73 ± 6)%. The application of chlorpromazine during removal
of glycerol from frozen-thawed erythrocytes enabled to reduce the cell damage by 2.5–3 times. The values of antihemolytic activity
of chlorpromazine in both cases were quite similar. Results of the investigation of chlorpromazine efficiency in the model experiment
and under the real conditions of erythrocyte freeze-thawing (under glycerol removal from the cells) allow to conclude about the
applicability of this model (posthypertonic shock) in the further studies.
Key words: erythrocytes, human, posthypertonic shock, cryopreservation, cryoprotectant removal, glycerol, chlorpromazine.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61016;
тел.: (+38 057) 373-74-35, факс: (+38 057) 373-59-52,
электронная почта: cryo@online.kharkov.ua
*To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkiv, Ukraine 61016;
tel.:+380 57 373 7435, fax: +380 57 373 5952,
e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Department of Cryocytoligy, Institute for Problems of Cryobiology
and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine,
Kharkiv, Ukraine
Отдел криоцитологии, Институт проблем криобиологии и крио-
медицины НАН Украины, г. Харьков
Поступила 15.11.2016
Принята в печать 06.12.2016
Received November, 15, 2016
Accepted December, 06, 2016
оригинальное исследование research article
Probl Cryobiol Cryomed 2017; 27(1): 51–60
https://doi.org/10.15407/cryo27.01.051
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0),
which permits unrestricted reuse, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
© 2017 E.A. Semionova et al., Published by the Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
Для криобиологии характерны исследования про-
цессов, протекающих на разных этапах низкотемпе-
ратурного консервирования биологических объектов
[12, 14, 19, 20]. Это связано с необходимостью разработ-
ки новых методов криоконсервирования с учетом
механизмов криоповреждения и криозащиты, в от-
личие от эмпирического подбора сред и условий
замораживания-отогрева биологического объекта.
Studying the processes occurring at different stages
of low-temperature preservation of biological objects
is typical for cryobiology [2, 8, 13, 15]. This is because
of a need in considering the mechanisms of cryoinjury
and cryoprotection when developing new cryopreser-
vation methods, in contrast to an empirical selection
of the media, freezing and thawing conditions for
a biological object.
Несмотря на значительные достижения в изу-
чении причин криоповреждения [13, 21], вопрос
об основных факторах, которые влияют на жизне-
способность биологического объекта, подвергнутого
замораживанию-отогреву, изучен недостаточно.
Это обусловлено тем, что в замораживаемом био-
логическом материале различные процессы про-
текают фактически одновременно, поэтому в
реальных условиях достаточно сложно исключить
действие одних факторов криоповреждения с
целью изучения других. Для определения вклада
каждого из факторов в общее криоповреждение
клеток используют следующие модели: гиперто-
нический шок, гипертонический криогемолиз, гипо-
тонический лизис, постгипертонический шок [8,
10, 22]. С помощью гипертонического шока и ги-
пертонического криогемолиза изучают действие
факторов криоповреждения, которое реализуется
на этапе замораживания эритроцитов. В указанных
модельных условиях амфифильные соединения, в
частности хлорпромазин, защищают эритроциты
от повреждения и проявляют высокую антигемо-
литическую активность [4, 5].
При размораживании криоконсервированных
эритроцитов по мере таяния льда внеклеточная
гипертоническая среда сменяется на изотоничес-
кую, вследствие чего развивается постгипертони-
ческий лизис эритроцитов [14]. Для моделирования
факторов криоповреждения, которые действуют на
этапе размораживания эритроцитов, а также при
перенесении в кровеносное русло клеток, криокон-
сервированных под защитой проникающего крио-
протектора, используют постгипертонический шок
эритроцитов [8].
В отличие от гипертонического шока и гипер-
тонического криогемолиза эритроцитов млекопи-
тающих, исследованию которых посвящены много-
численные работы [2–4], явление постгипер-
тонического шока эритроцитов млекопитающих
изучено в меньшей степени, при этом результаты
единичны и разрознены [6, 19].
Постгипертонический шок (ПГШ), как и любая
другая модель, дает приближенное описание реаль-
ного процесса. Несмотря на то, что эта модель ис-
пользуется в течение длительного времени [6, 8],
представляет интерес выяснить, в какой степени
связаны между собой модель и реальное явление
(постгипертоническое повреждение клеток при
размораживании и удалении проникающего крио-
протектора из них) и насколько возможен перенос
выводов, полученных с помощью модели, на дей-
ствительность.
Оценка соответствия (адекватности) модели
существующей системе проводится посредст-
вом сравнения результатов, полученных в обоих
Despite the convincing achievements made during
investigation of the cryoinjury causes [4, 16], the main
factors affecting the viability of a biological object,
exposed to freeze-thawing, are not completely clear.
This is due to the fact that freezing of biological spe-
cimens is accompanied with almost simultaneous
occurrence of several processes, thus in reality it is
quite difficult to separate the effects of certain factors
of cryoinjury to study others. To determine the contri-
bution of each factor into a cell cryodamage the follo-
wing models could be used: hypertonic shock, hyper-
tonic cryohemolysis, hypotonic lysis, posthypertonic
shock [18–20]. The action of cryodamage factors
occurring at the freezing stage of erythrocytes was
studied by means of hypertonic shock and cryohe-
molysis. Amphiphilic compounds, in particular, chlor-
promazine, protect erythrocytes from a damage under
these conditions and exhibit a high antihemolytic
activity [5, 10].
Thawing of cryopreserved erythrocytes results in
an alternation of extracellular hypertonic medium to
isotonic one and in such way in the development of
hypertonic lysis of erythrocytes [8]. Simulation of the
cryodamage factors existing during thawing of ery-
throcytes as well as following the transfer into bloods-
tream of cells cryopreserved under protection of pe-
netrating cryoprotectant, could be provided by the
posthypertonic shock of erythrocytes [18].
Unlike hypertonic shock and hypertonic cryo-
hemolysis of mammalian erythrocytes described
elsewhere [3, 5, 6] the phenomenon of posthypertonic
shock of mammalian erythrocytes has not been comp-
letely studied yet, and the results are single and di-
verse [13, 14].
Like any other model, the posthypertonic shock
(PHS), provides only approximate description of a real
process. This model has been used for a long time [14,
18], nevertheless it is interesting to find out to what
extent the model and a real phenomenon (posthy-
pertonic cell damage during freeze-thawing and remo-
val of penetrating cryoprotectant from them) are related
and how to extrapolate precisely the model-based
conclusions into reality.
The evaluation of an adequacy of the model to real
situations could be assessed by comparing the results
obtained in both cases. Antihemolytic agent chlor-
promazine (CP) was chosen as an indicator of the cell
state. Based on the stated above it is expedient to study
the effects of CP under PHS conditions as well as
during freeze-thawing of cells and removal of pene-
trating cryoprotectant. However, it is not possible to
check the effectiveness of CP during thawing of ery-
throcytes due to the technical complexity of the sub-
stance administration directly at this stage. Therefore,
we can study and compare the effect of this compound
52 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 27, №/issue 1, 2017
случаях. Для этого в качестве детектора состоя-
ния клеток был выбран антигемолитический агент
хлорпромазин (ХПР). Исходя из вышеизложенного
следует изучить эффекты ХПР в условиях ПГШ,
а также на этапах размораживания клеток и удале-
ния из них проникающего криопротектора. Однако
проверить эффективность ХПР при отогреве эрит-
роцитов невозможно из-за технической сложности
введения вещества непосредственно на этом этапе.
Поэтому мы можем изучить и сопоставить влия-
ние данного соединения на клетки в условиях ПГШ
и на этапе удаления криопротектора из разморо-
женных эритроцитов. В качестве проникающего
криопротектора был выбран глицерин, который
широко используется для криоконсервирования
эритроцитов человека [1, 14, 15, 17, 18] и который
необходимо удалять из размороженных клеток для
предотвращения их повреждения при трансфузии.
Исходя из вышеизложенного целью работы
было сравнительное изучение влияния хлорпро-
мазина на устойчивость эритроцитов человека в
условиях постгипертонического шока и на этапе уда-
ления глицерина из клеток, подвергнутых замора-
живанию-отогреву.
Материалы и методы
Для исследования использовали эритроциты,
полученные из донорской крови человека, заготов-
ленной на гемоконсерванте «Глюгицир» («Биофар-
ма», Украина).
После удаления плазмы эритромассу трижды
центрифугировали при 3000 об/мин (центрифу-
га «ОПн-3У4.2», Кыргызстан) в течение 3 мин в
10-кратном объеме физиологического раствора
(NaCl 0,15 моль/л; фосфатный буфер 0,01 моль/л,
pH 7,4). Лейкоцитарную пленку и супернатант
удаляли аспирацией. Эритроциты хранили в ви-
де плотного осадка не более 4 ч при температуре
0°С. Все используемые в работе среды готовили
на 0,01 моль/л фосфатном буфере, рН 7,4. В работе
использовали реактивы отечественного произ-
водства квалификации «хч» и «чда».
Исходную суспензию эритроцитов получали
добавлением осадка клеток к физиологическому
раствору в отношении 1:10.
Постгипертонический шок осуществляли пере-
несением эритроцитов из гипертонического раст-
вора (среда дегидратации) в изотонический (среда
регидратации) при 37 или 0°С. Концентрация NaCl
в среде дегидратации составляла 1,75 моль/л, в
среде регидратации – 0,15 моль/л. Эритроциты ин-
кубировали в среде дегидратации в течение 20 мин,
в среде регидратации – 5 мин. Конечный гема-
токрит – 0,4%. Хлорпромазин находился в среде
регидратации перед внесением эритроцитов.
on cells under PHS and at stage of cryoprotectant re-
moval from frozen-thawed erythrocytes. Glycerol was
chosen as a penetrating cryoprotectant; it is used wi-
dely for the cryopreservation of human erythrocytes
[1, 7, 8, 11, 12] and has to be removed from the thawed
cells to prevent their damage during transfusion.
Based on the abovementioned, the research aim
was a study of chlorpromazine effect on resistance of
human erythrocytes under posthypertonic shock and
at the stage of glycerol removal from the cells exposed
to freeze-thawing.
Materials and methods
The research was conducted in erythrocytes from
human blood, preserved with Glugicir hemopreser-
vative (Biofarma, Ukraine). After the plasma removal
the erythrocytes were thrice washed by centrifugation
(centrifuge OPN-3U4.2, Kyrgyzstan) at 3000 rpm for
3 min in a 10-fold volume of physiological solution
(0.15 mol/L NaCl; 0.01 mol/L phosphate buffer, pH 7.4).
Buffy coat layer and supernatant were aspirated. Ery-
throcytes were stored as a dense sediment not longer
as 4 hrs under 0°C. All the media were prepared with
0.01 mol/L phosphate buffer, pH 7.4. In the research
we used the home-produced reagents of ‘chemically
pure’ and ‘chemically pure for analysis’ grades.
The initial suspension of erythrocytes was obtained
by addition of the cell sediment to physiological saline
in the ratio of 1:10.
Posthypertonic shock was initiated by transferring
the erythrocytes from hypertonic solution (dehydration
media) into isotonic one (rehydration medium) at 37 or
0°C. The concentration of NaCl in the dehydration
medium was 1.75 mol/L and in rehydration medium
did 0.15 mol/L. Erythrocytes were incubated in dehyd-
ration medium for 20 min and in rehydration solution
they were held for 5 min. The final hematocrit was
0.4%. Chlorpromazine was in rehydration medium prior
to mixing with erythrocytes.
Freezing was done with erythrocytes obtained from
blood of three donors. Cryopreservative solution was
added to erythromass in the ratio of 1:1, thereafter the
suspension was incubated for 20 min at room tem-
perature (22°C). The composition of cryopreservative
consisted of glycerol (30%), mannitol (4%), NaCl
(150 µmol/L), phosphate buffer (10 µmol/L), pH 7.4
[1]. The cell suspension was frozen in 2.0 ml vials
(Eppendorf, USA) down to –196°C by rapid plunging
into liquid nitrogen, thawed in a water bath (42°C)
with a constant shaking until the solid phase disap-
pearance.
Thawed cell suspension was centrifuged and the
supernatant was removed. Glycerol was removed from
erythrocytes according to the following protocol [17,
22]: the 1st stage represented washing with an equal
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 27, №/issue 1, 2017
53
Для замораживания использовали эритроциты,
полученные из крови трех доноров. Раствор крио-
консерванта добавляли к эритромассе в отношении
1 : 1, после чего суспензию инкубировали в течение
20 мин при комнатной температуре (22°С). В сос-
тав криоконсерванта входили глицерин (30%),
маннитол (4%), NaCl (150 ммоль/л), фосфатный
буфер (10 ммоль/л), рН 7,4 [1]. Клеточную суспен-
зию замораживали в пробирках емкостью 2,0 мл
(«Eppendorf», США) до температуры –196°С путем
быстрого погружения в жидкий азот, разморажи-
вали в водяной бане (42°С) при постоянном пока-
чивании пробирок до исчезновения твердой фазы.
Размороженную клеточную суспензию цент-
рифугировали и убирали надосадок. Глицерин из
эритроцитов удаляли по следующей схеме [7,
23]: этап 1 – отмывка равным объемом раство-
ра NaCl (600 ммоль/л); этапы 2 и 3 – отмывка
равными объемами изотонического раствора NaCl
(150 ммоль/л; рН 7,4).
Хлорпромазин добавляли в отмывочные сре-
ды перед внесением клеток (гематокрит – 0,4 %).
Контролем служили эритроциты в соответствую-
щих отмывочных средах, не содержащих ХПР.
Уровень гемолиза эритроцитов в надосадочной
жидкости определяли спектрофотометрическим
методом при длине волны 543 нм. За 100% прини-
мали поглощение пробы, в которую добавляли три-
тон Х-100 («Merсk», Германия) в концентрации 0,1%.
Зависимости постгипертонического гемолиза
эритроцитов от концентрации ХПР в среде полу-
чали при 37 и 0°С. Из них определяли размеры «пла-
то» концентраций вещества, значение эффективной
концентрации и рассчитывали величину макси-
мальной антигемолитической активности ХПР.
«Плато» – это диапазон концентраций ХПР, при
которых наблюдается минимальный уровень ге-
молиза эритроцитов. Эффективная концентрация
вещества соответствовала середине указанного
«плато».
Значение максимальной антигемолитической
активности амфифильного соединения рассчи-
тывали по формуле
,
где к – величина гемолиза эритроцитов при от-
сутствии амфифильного вещества; a – минималь-
ная величина гемолиза эритроцитов в присутствии
амфифильного вещества.
Статистическую обработку полученных экспе-
риментальных результатов проводили с помощью
программы «Statistica 6.0» («StatSoft Inc.», США).
Для проверки нормальности распределения исполь-
зовали критерий Шапиро-Уилка. Значимость раз-
volume of NaCl solution (600 µmol/L); the 2nd and
the 3rd stages involved washing with equal volumes
of NaCl isotonic solution (150 µmol/L; pH 7.4).
Chlorpromazine was added to washing media
before introducing the cells (hematocrit was 0.4%).
The control erythrocytes were treated by the same
washing media but without CP.
Erythrocyte hemolysis level in supernatant was
spectrophotometrically measured at 543 nm. Ab-
sorption of erythrocytes sample mixed with 0.1% triton
X-100 (Merck, Germany) was assumed as 100% he-
molysis.
Dependencies of erythrocyte posthypertonic hemo-
lysis vs. CP concentrations in the media were obtained
at 37 and 0°C. They were used to determine the sizes
of substance concentrations ‘plateau’, the value of
effective concentration and value of maximum antihe-
molytic activity of CP. ‘Plateau’ was considered as a
range of CP concentrations, associated with the mini-
mum level of erythrocyte hemolysis. Effective concent-
ration of the substance corresponds to the mid-point
of this ‘plateau’.
A value of maximum antihemolytic activity of
amphiphilic compound was calculated by the formula
AHmax ,
where k was the value of erythrocyte hemolysis with-
out amphiphilic substance; a was the minimum va-
lue of erythrocyte hemolysis with amphiphilic subs-
tance.
The obtained data were statistically processed using
Statistica 6.0 software (StatSoft Inc., USA). The nor-
mality of distribution was tested using Shapiro-Wilk
criterion. The significance of differences between
the samples was evaluated by the parametric method
using Student’s t-test. The experimental data were
presented as the mean value of quantitative indices
(M) ± standard error of the arithmetic mean (m).
Results and discussion
Thawing the erythrocytes is accompanied with a
sharp decrease in environmental osmolality which
renders a damaging effect on the cells. The effect of
this factor can be simulated by transferring cells
from hypertonic into isotonic conditions at positive
temperatures.
When describing the factors affecting the cells both
at the stage of warming and removal of penetrating
cryoprotectant, one uses the terms ‘posthypertonic
shock’, ‘posthypertonic hemolysis’, ‘posthypertonic
lysis’. The last one appears most often in scientific
publications [13, 14], and it is used by the researchers
both to indicate the effects on cells and to describe
the result of this influence, that certainly complicates
%100×−=
к
акАГ макс
%100×−=
к
ак
54 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 27, №/issue 1, 2017
личий между полученными выборками оценивали
параметрическим методом с помощью t-критерия
Стьюдента. Экспериментальные данные представ-
ляли как среднее арифметическое значение коли-
чественных показателей (М) ± стандартная ошиб-
ка среднего арифметического (m).
Результаты и обсуждение
В процессе размораживания эритроцитов пов-
реждающее действие на клетки оказывает резкое
снижение осмоляльности окружающей среды. Влия-
ние указанного фактора на клетки можно моде-
лировать их перенесением из гипертонических
условий в изотонические при положительных тем-
пературах.
При описании факторов, действующих на клет-
ки как на этапе отогрева, так и при удалении из
них проникающего криопротектора, используют
термины: «постгипертонический шок», «постгипер-
тонический лизис», «постгипертонический гемо-
лиз». Чаще всего в научной литературе встречает-
ся термин «постгипертонический лизис» [6, 19],
причем исследователи применяют его как для обоз-
начения собственно воздействия на клетки, так и
для описания результата этого воздействия, что,
несомненно, усложняет восприятие эксперименталь-
ного материала. В нашей работе для обозначения
действия на клетки резкого снижения осмоляль-
ности среды от гипертонических до изотоничес-
ких значений мы использовали термин «постги-
пертонический шок», а для описания повреждения
эритроцитов в результате действия ПГШ – «пост-
гипертонический лизис» или «постгипертони-
ческий гемолиз».
Для развития постгипертонического лизиса
(ПГЛ) эритроцитов необходимы два последова-
тельных этапа: дегидратация и регидратация кле-
ток. С целью выполнения данного условия эритро-
циты переносили из среды 1,75 моль/л NaCl (этап
дегидратации) в среду 0,15 моль/л NaCl (этап
регидратации) при 37 или 0°С. Хлорпромазин в
разных концентрациях вносили в среду регид-
ратации.
На рис. 1 представлены зависимости уровня
ПГЛ эритроцитов от концентрации ХПР при 37 и
0°С. Видно, что при 0°С уровень гемолиза эритро-
цитов в отсутствии ХПР составляет 88%. Добав-
ление ХПР в среду регидратации позволило сни-
зить уровень ПГЛ клеток (максимально в 3,7 раза).
Однако такой защитный эффект ХПР наблюдался
только при температуре 0°С.
Эффективность ХПР оценивали, используя полу-
ченную концентрационную зависимость постги-
пертонического гемолиза эритроцитов при 0°С
(рис. 1). Для этого определяли величину макси-
the understanding of described experiments. In our
research we used the term ‘posthypertonic shock’ to
define the action of a sharp decrease in medium
osmolality from hypertonic to isotonic values on the
cells; and with the term ‘posthypertonic lysis’ or
‘posthypertonic hemolysis’ we described the erythro-
cyte injury as a result of PHS.
Development of posthypertonic lysis (PHL) of
erythrocytes requires two consequent stages: cell
dehydration and rehydration. To do this the erythrocytes
were transferred from 1.75 mol/L NaCl medium
(dehydration stage) into 0.15 mol/L NaCl solution
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Хлорпромазин, мкмоль/л
Chlorpromazine, µmol/L
Рис. 1. Влияние хлорпромазина на уровень гемолиза
эритроцитов человека, перенесенных из 1,75 моль/л в
0,15 моль/л NaCl при температуре 0 (А) и 37°С (B).
Fig. 1. Chlorpromazine effect on hemolysis level of human
erythrocytes transferred from 1.75 mol/L to 0.15 mol/L NaCl
at 0 (A) and 37°C (B).
Хлорпромазин, мкмоль/л
Chlorpromazine, µmol/L
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 27, №/issue 1, 2017
55
0
20
40
60
80
100
0 200 400 600 800 1000 1200
0
20
40
60
80
100
0 200 400 600 800 1000 1200
A
B
мальной антигемолитической активности и зна-
чение эффективной концентрации ХПР. Так, в ус-
ловиях ПГШ эритроцитов (0°С) максимальная ан-
тигемолитическая активность данного вещества в
эффективной концентрации (600 мкмоль/л) дос-
тигала (73 ± 6)%, а в концентрации 180 мкмоль/л
(при которой еще сохраняется барьерная функция
мембраны по отношению к ионам феррицианида
[9]) – (49 ± 4)%.
Для длительного хранения эритроцитов чело-
века широко используется криоконсервирование
под защитой глицерина, который является прони-
кающим криопротектором. Перед трансфузией
размороженных эритроцитов необходим этап от-
мывки клеток от глицерина [16]. Это связано с тем,
что при перенесении эритроцитов, насыщенных
глицерином, в кровеносное русло реципиента или
изотоническую среду (0,15 моль/л NaCl), клетки
будут разрушаться. Поскольку скорость входа
воды выше, чем скорость выхода глицерина из
клетки, эритроциты набухают и при достижении
критического гемолитического объема лизируют.
По своей сути многоступенчатая отмывка эритро-
цитов от глицерина является «инструментом» для
снижения уровня ПГЛ эритроцитов.
Исходя из того, что ХПР проявлял эффектив-
ность в условиях модельного эксперимента (ПГШ),
для проверки адекватности модели мы исследова-
ли влияние вещества на размороженные эритроци-
ты в условиях удаления из них криопротектора. Для
этого важно выяснить, будет ли на этапе отмывки
клеток от глицерина проявляться защитный эффект
ХПР, установленный с использованием модельного
подхода (рис. 1), и при наличии положительного
результата необходимо сравнить эффективность
ХПР в обоих случаях.
Удаление глицерина из клеток происходит
поэтапно [1, 7, 23]. Сначала размороженные и
осажденные эритроциты переносят в среду, со-
держащую 0,6 моль/л NaCl, затем их подвергают
последовательному двукратному отмыванию фи-
зиологическим раствором. В данной работе ХПР
в концентрациях 180 и 600 мкмоль/л присутствовал
на каждом этапе отмывания клеток от глицерина,
причем эритроциты вносили в среды, которые уже
содержали амфифильное вещество.
На рис. 2 представлены результаты применения
ХПР на этапах удаления глицерина из суспензии
эритроцитов, подвергнутых замораживанию-отог-
реву. В работе использовали эритроциты, полу-
ченные от трех доноров.
После размораживания клеток уровень гемоли-
за не превышал 7%. При использовании на этапе 1
гипертонического раствора (0,6 моль/л NaCl) уро-
вень гемолиза составлял 1–2%. Применение фи-
(rehydration stage) at 37 or 0°C. Chlorpromazine at
various concentrations was added to the rehydration
medium.
Fig. 1 demonstrates the dependences of PHL level
of erythrocyte concentrations at 37 and 0°C. It can be
seen that the haemolysis level of erythrocytes without
PHL made 88% at 0°C. Addition of the CP to rehyd-
ration medium enabled to reduce the PHL level of cells
(up to 3.7 times). However, this protective effect of
CP was observed only at 0°C.
Efficiency of chlorpromazine was evaluated using
the obtained concentration dependence of posthy-
pertonic erythrocyte hemolysis at 0°C (Fig. 1).
For this purpose the maximum antihemolytic acti-
vity and the effective concentration of CP were deter-
mined. It was found that under PHS conditions in
erythrocytes (at 0°C) the maximum antihemolytic
activity of this substance in effective concentration
(600 µmol/L) reached (73 ± 6)% and in concentration
of 180 µmol/L (the membrane barrier function to the
ferricyanide ions is still present at this concentration
[23]) it was (49 ± 4)%.
Long-term storage of human erythrocytes widely
involves the cryopreservation under protection of a
penetrating cryoprotectant glycerol. Washing the cells
from glycerol should be performed prior to transfusion
of the thawed erythrocytes [9]. This is due to the
fact that transfer of the erythrocytes saturated with
glycerol into the recipient’s bloodstream or isotonic
medium (0.15 mol/L NaCl) will result in destruction
of the cells. Water influx rate is higher than that of
glycerol exiting out of cell, so erythrocytes swell and
lyse after reaching the critical hemolytic volume.
Thus, a multistage cell removal of glycerol is a ‘tool’
to reduce the PHL level of erythrocytes.
Considering the fact that CP demonstrated the
efficiency in a model experiment (PHS), we have che-
cked an adequacy of the model assessing the substance
effect on thawed erythrocytes during removal of cryo-
protectant. In this regard it is important to determine
whether a protective effect, revealed using the model
approach, would be manifested at the stage of cell wa-
shing of glycerol (Fig. 1), and, in case of a positive out-
come, to compare the effectiveness of CP in both cases.
Removal of glycerol from cells occurs stepwise
[1, 17, 22]. Firstly, thawed and sedimented eryth-
rocytes are transferred into the medium containing
0.6 mol/L NaCl, and then they are exposed to double
washing with physiological solution. In our research,
the CP at concentrations of 600 and 180 µmol/L was
present at each stage of cell washing of glycerol, the
erythrocytes were transferred into the media which
already comprised the amphiphilic substance.
Fig. 2 presents the results of CP application at the
stages of glycerol removal from erythrocyte suspension
56 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 27, №/issue 1, 2017
зиологического раствора на этапе 2 приводило к
значительному повреждению клеток. Установлено,
что уровень гемолиза эритроцитов двух доноров
составлял примерно 20% (рис. 2, A, B), а третьего
донора – 38% (рис. 2, C). По-видимому, это обус-
ловлено индивидуальными особенностями клеток
крови доноров. Применение физиологического
раствора на этапе 3 сопровождалось незначитель-
ным повреждением клеток (до 5%).
Присутствие ХПР на этапах удаления крио-
протектора не приводило к дополнительному
гемолитическому повреждению эритроцитов
(рис. 2). Напротив, в том случае, когда наблю-
далось значительное повреждение контрольных
клеток (этап 2), ХПР снижал уровень гемолиза
эритроцитов всех доноров в 2,5–3 раза (рис. 2,
столбик 2). Следует отметить, что степень умень-
шения гемолитического повреждения эритроцитов
одного из доноров не зависела от используемой
концентрации ХПР (рис. 2, B), в то время как для
exposed to freeze-thawing. We used the erythrocytes
obtained from three donors. Hemolysis level did not
exceed 7% after cell thawing. When using a hypertonic
solution (0.6 mol/L NaCl) at the 1st stage the hemo-
lysis level was 1–2%. Application of physiological solu-
tion at the 2nd stage led to a significant cell damage.
The level of erythrocyte hemolysis in two donors was
approximately 20% (Fig. 2A, B) and in the 3rd donor it
was 38% (Fig. 2C). This was likely due to the indi-
vidual characteristics of donors’ blood cell. The use of
physiological solution at the 3rd stage resulted in a da-
mage of small cell fraction (up to 5%).
The presence of CP at the stages of cryoprotectant
removal did not result in additional damage of hemo-
lytic erythrocytes (Fig. 2). In contrast, when there was
a significant damage of the control cells (the 2nd stage),
CP reduced the hemolysis level of erythrocytes for all
the donors in 2.5–3 times (Fig. 2, column 2). It should
be noted that the level of hemolytic damage reduction
in erythrocytes of one donor did not depend on the
used CP concentrations (Fig. 2, B), while the cells of
other two donors (Fig. 2; A, C) showed a tendency to
decrease the hemolysis level at a high concentration
of the substance. The found values of CP antihemo-
lytic activity (at concentrations of 180 and 600 µmol/L)
at the stage of cryoprotectant removal from the cells
at the 2nd stage are presented in the Table. An analysis
of the results (see Fig. 1, Table) showed that the values
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Рис. 2. Влияние хлорпромазина на уровень гемолиза
эритроцитов трех разных доноров (А, B, C) при удалении
глицерина из размороженных клеток с использова-
нием отмывочных сред: 1 – 0,6 моль/л NaCl; 2 и 3 –
0,15 моль/л NaCl.
Fig. 2. Chlorpromazine effect on erythrocyte hemolysis of
three different donors (A, B, C) at glycerol removal from
thawed cells with washing media: the 1 is 0.6 mol/L NaCl,
2 and 3 are 0.15 mol/L NaCl.
A
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 27, №/issue 1, 2017
57
0
10
20
30
40
0
10
20
30
40
180 600
Концентрация хлорпромазина, мкмоль/л
Chlorpromazine concentration, µmol/L
0
10
20
30
40
0
Концентрация хлорпромазина, мкмоль/л
Chlorpromazine concentration, µmol/L
Концентрация хлорпромазина, мкмоль/л
Chlorpromazine concentration, µmol/L
180 6000 180 6000
1
2
31
2
3
1
2
3
A B
C
клеток двух других доноров (рис. 2, А, С) была ха-
рактерна тенденция к снижению уровня гемолиза
при высокой концентрации вещества. Рассчитан-
ные величины антигемолитической активности
ХПР (в концентрациях 180 и 600 мкмоль/л) при
удалении криопротектора из клеток на этапе 2 пред-
ставлены в таблице. Сравнительный анализ резуль-
татов (см. рис. 1, таблица) показал, что значения
антигемолитической активности ХПР в условиях
модельного эксперимента (ПГШ) находятся в диа-
пазоне величин, полученных при удалении крио-
протектора из размороженных клеток трех доноров
(этап 2).
Несмотря на то, что влияние ХПР в концентра-
циях 180 и 600 мкмоль/л на барьерную функцию
мембран эритроцитов (в физиологической среде)
различное [9], в данных экспериментальных усло-
виях ХПР в обеих концентрациях проявляет высо-
кую эффективность (таблица).
Следует отметить, что концентрация ХПР, при
которой наблюдался его максимальный защитный
эффект в условиях ПГШ эритроцитов и регистри-
ровался высокий уровень антигемолитической
активности при отмывании глицерина (таблица),
гораздо выше эффективных концентраций ХПР,
установленных в условиях гипертонического шока,
гипертонического криогемолиза и гипотоническо-
го лизиса эритроцитов [4, 5, 22]. Вероятно, размер
мембранных дефектов, образующихся в последнем
случае, меньше, и достаточно небольшого коли-
чества амфифильного соединения для предотвра-
щения их развития до гемолитических пор. Сов-
падение параметров эффективности ХПР (величи-
ны максимальной антигемолитической активности
и концентраций) в условиях ПГШ и при отмывании
от глицерина эритроцитов, подвергнутых криокон-
сервированию, позволяет предположить, что меха-
низмы действия амфифила в указанных условиях
имеют общие черты.
Таким образом, ХПР проявляет эффективность
при криоконсервировании эритроцитов под защитой
глицерина за счет уменьшения потери клеток на
этапе удаления глицерина. Поскольку защитный
эффект ХПР, выявленный в модельном экспери-
менте (действие ПГШ на клетку при 0°С), показан
и в реальных условиях замораживания-отогрева
эритроцитов, можно говорить о высокой степени
соответствия используемой модели и целесооб-
разности ее применения для изучения механизма
действия факторов криоповреждения на клетки.
О правомерности использования модельного под-
хода свидетельствуют и ранее полученные резуль-
таты [11]. Так, с целью скрининга условий добав-
ления непроникающего криопротектора на этапе,
предшествующем замораживанию клеток, был
of CP antihemolytic activity in a model experiment
(PHS) were within the range, obtained when the cryo-
protectant was removed from the thawed cells of three
donors (the 2nd stage).
Despite the fact that effect of CP in concentrations
of 180 and 600 µmol/L on the barrier function of ery-
throcyte membranes (in physiological medium) was
different [23], in our experimental conditions both
concentrations of CP were highly efficient (Table).
It should be noted that concentration of CP pos-
sessing the maximum protective effect under PHS of
erythrocytes and providing a high level of antihemolytic
activity during glycerol removal (Table) was much
higher than the effective CP concentrations in case of
hypertonic shock, hypertonic cryohemolysis and hy-
potonic lysis of erythrocytes [5, 10, 19]. Probably, the
size of membrane defects formed in the latter case
was smaller and that amount of amphiphilic com-
pounds was sufficient to prevent their transformation
in hemolytic pores. Coincidence in CP efficiency pa-
rameters (the values of maximum antihemolytic acti-
vity and concentrations) both for PHS and removing
of glycerol from the frozen-thawed erythrocytes sug-
gested that mechanisms of amphiphile action under
given conditions have common features.
Thus, CP is efficient during cryopreservation of
erythrocytes under glycerol protection in terms of re-
duced the cell loss at the stage of cryoprotectant remo-
val. Whereas the protective effect of CP, revealed in
the model experiment (PHS in cell suspension at 0°C),
was also found under real conditions of erythrocyte
freeze-thawing, it was possible to suggest a high
adequacy of the used model and its applicability to
study the effect of cryoinjury factors on cells. The
previously obtained results testify the possible ap-
plication of the model approach as well [21]. In par-
ticular, screening of the better conditions for adding
Значения антигемолитической активности хлорпро-
мазина при удалении глицерина из криоконсерви-
рованных эритроцитов с использованием среды,
содержащей 0,15 моль/л NaCl (этап 2)
The values of chlorpromazine antihemolytic activity during
glycerol removal from cryopreserved erythrocytes using
the medium, containing 0.15 mol/l NaCl (the 2nd stage)
яицартнецноK
,анизаморпролх
л/ьломкм
enizamorprolhC
,noitartnecnoc
l/lomµ
%,ьтсонвиткаяаксечитиломегитнА
%,ytivitcacitylomehitnA
1роноД
1ronoD
2роноД
1ronoD
3роноД
1ronoD
081 86 85 74
006 77 85 85
58 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 27, №/issue 1, 2017
использован гипертонический шок эритроцитов.
Модельный подход позволил определить оптималь-
ную комбинацию условий, которая была успешно
применена при низкотемпературном консервиро-
вании эритроцитов млекопитающих [11].
В результате проведенной экспериментальной
работы установлено, что в условиях ПГШ эрит-
роцитов и при удалении глицерина из отогретых
клеток ХПР проявлял высокую эффективность
(определяемую по величинам антигемолитической
активности и значениям эффективных концентра-
ций). Поскольку данное вещество является пред-
ставителем большого класса амфифильных соеди-
нений, можно допустить, что указанный модель-
ный подход (ПГШ) позволит выявить из обширного
ряда веществ, характеризующихся дифильностью,
и другие высоко эффективные соединения при уда-
лении криопротектора из клеток, подвергнутых
криоконсервированию.
Выводы
Показана высокая эффективность ХПР в усло-
виях ПГШ эритроцитов и на этапе удаления глице-
рина из размороженных клеток. При этом антиге-
молитическая активность ХПР (600 мкмоль/л) в
условиях ПГШ эритроцитов составляет (73 ± 6)%
и находится в диапазоне величин, полученных при
удалении глицерина из размороженных клеток
(58–77%). Аналогичная ситуация выявлена и при
использовании ХПР в концентрации 180 мкмоль/л:
значение антигемолитической активности ХПР в
условиях ПГШ составляет (49 ± 4)% и находится
в диапазоне величин (47–68%), полученных при
удалении криопротектора.
Литература
1. Аграненко В.А., Виноград-Финкель Ф.Р., Федорова Л.И. и др.
Методы долгострочного хранения в замороженном сос-
тоянии эритроцитов, предназначенных для трансфузии:
Метод. рекомендации. – М.: МЗ СССР, 1980. – 47 с.
2. Белоус А.М., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Замораживание
и криопротекция. – М.: Высш. шк., 1987. – 81 с.
3. Гордієнко Є.О., Товстяк В.В. Фізика біомембран: підручник. –
К.: Наук. думка, 2009. – 272 с.
4. Дунаевская О.Н., Панталер Е.Р., Шпакова Н.М., Бондарен-
ко В.А. Некоторые возможности повышения устойчивости
эритроцитов к холодовому и гиперосмотическому воз-
действию при использовании катионных амфипатов //
Проблемы криобиологии. – 1995. – № 1. – С. 21–27.
5. Єршов С.С., Писаренко Н.А., Орлова Н.В., Шпакова Н.М.
Вплив катіонних та аніонних амфіфільних сполук на гіпер-
тонічний кріогемоліз еритроцитів ссавців // Фізіолог. жур-
нал. – 2007. – Т. 53, №6. – С. 78–84.
6. Пателарос С.В., Сынчикова О.П. Осмотическое поведение
эритроцитов при постгипертоническом лизисе // Проб-
лемы криобиологии. – 1994. – №3. – С. 35–40.
References
1. Agranenko V.A., Vinograd-Finkel F.R., Fedorova L.I. et al. Methods
of a long-term storage in frozen state for erythrocytes to be
transfused [method. recommendations] Moscow: Ministry of
Health Care of USSR; 1980.
2. Baust J.G., Gao D., Baust J.M. Cryopreservation. An emerging
paradigm change. Organogenesis 2009; 5(3): 90–96.
3. Belous A.M., Gordienko E.A., Rozanov L.F. Freezing and
cryoprotection. Moscow: Vysshaya Shkola; 1987.
4. Chian R.C. Chapter 1: Cryobiology: an overview. In: Chian R.C.,
Quinn P., editors. Fertility Cryopreservation. Cambridge: Cambridge
University Press, 2010. p. 1–9.
5. Dunayevskaya O.N., Pantaler E.R., Shpakova N.M., Bondaren-
ko V.A. Some possible methods of increasing red blood cell
stability to the action of cold and osmotic effects after application
of cation amphipates. Probl Cryobiol 1995; (1): 21–26.
6. Gordienko E.A., Tovstyak V.V. Physics of biological membranes:
a tutorial. Кyiv: Nauk Dumka; 2009.
7. Greer N. Freezing under pressure: a new method for cryo-
preservation. Cryobiology 2015; 70(1): 66–70.
8. Fuller B.J., Lane N., Benson E.E., editors. Life in the frozen state.
Boca Raton, London, New York, Washington, D.C.: CRC Press;
2004.
9. Holey A., Marks D.C., Johnson L. et al. Frozen blood products:
clinically effective and potentially ideal for remote Australia.
Anaesth Intensive Care 2013; 41(1): 10–19.
10.Iershov S.S., Pysarenko N.A., Orlova N.V., Shpakova N.M. Effect
of cationic and anionic amphiphilic compounds on hypertonic
the non-penetrating cryoprotectant before cell free-
zing was performed using hypertonic shock of ery-
throcytes. The model approach allowed to determine
the optimal combination of conditions, that has been
successfully used during low-temperature preserva-
tion of mammalian erythrocytes [21].
Thus, the results of our experiments demonstrated
a high efficiency of CP during PHS of erythrocytes
and glycerol removal from thawed cells (determined
by antihemolytic activity and effective concentrations).
Since this substance belongs to a large class of amphi-
philic compounds, the model (PHS) could be capable
of revealing other highly-effective compounds for using
at cryoprotectant removal from the cryopreserved cells
among a broad range of diphilic substances.
Conclusions
A high efficiency of CP under PHS of erythrocytes
at the stage of glycerol removal from the thawed cells
has been shown. Antihemolytic activity of CP (in con-
centration of 600 µmol/L) in the conditions of erythro-
cyte PHS made (73 ± 6)% and was within the range
of the values, obtained during glycerol removal from
the thawed cells (58–77%). The same was found when
using CP at concentration of 180 µmol/L: antihemolytic
activity value of CP under PHS made (49 ± 4)% and
was within the range of the values (47–68%), obtained
at the cryoprotectant removal.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 27, №/issue 1, 2017
59
7. Семенова Н.В., Федорова Л.И., Виноградов В.Л. и др. Сравни-
тельное изучение криоконсервированных эритроконцент-
ратов при различных способах их отмывания // Гемато-
логия и трансфузиология. – 1986. – №10. – С. 42–52.
8. Семионова Е.А., Ершова Н.А., Ершов С.С. и др. Особенности
проявления постгипертонического лизиса эритроцитов
некоторых млекопитающих // Проблемы криобиологии и
криомедицины. – 2016. – Т. 26, №1. – С. 73–83.
9. Цымбал Л.В., Орлова Н.В., Шпакова Н.М. Модификация
хлорпромазином структурно-функционального состояния
мембран эритроцитов // Биолог. мембраны. – 2005. – Т. 22,
№4. – С. 327–335.
10.Шпакова Н.М., Орлова Н.В., Ніпот О.Є., Александрова Д.І.
Порівняльне вивчення дії механічного стресу на еритро-
цити людини і тварин // Фізіолог. журнал. – 2015. – Т. 61,
№3. – С. 75–80.
11.Пат. № 50069, Україна, МПК 8 G 01 N 33/48. Спосіб визна-
чення температурних умов інкубування еритроцитів з
ПЕО-1500 / Н.М. Шпакова, Н.В. Орлова, Д.І. Александрова,
О.М. Денисова: № u 2009 11892; заявл. 20.11.2009;
опубл. 25.05.2010, Бюл. №10.
12.Baust J.G., Gao D., Baust J.M. Cryopreservation. An emerging
paradigm change // Organogenesis.– 2009. – Vol. 5, №3. –
P. 90–96.
13.Chian R.C. Cryobiology: an overview. In: Fertility Cryopreser-
vation / Ed. by R.C. Chian, P. Quinn. – Cambridge: Cambridge
University Press, 2010. – P. 1–9.
14.Fuller B.J., Lane N., Benson E.E. Life in the frozen state. –
Boca Raton, London, New York, Washington: CRC Press,
2004. – 672 p.
15.Greer N. Freezing under pressure: a new method for cryopre-
servation // Cryobiology. – 2015. – Vol. 70, №1. – P. 66–70.
16.Holey A., Marks D.C., Johnson L. et al. Frozen blood products:
clinically effective and potentially ideal for remote Australia //
Anaesth. Intensive Care. – 2013. – Vol. 41, №1. – P. 10–19.
17.Lelkens C.C., de Korte D., Lagerberg J.W. Prolonged post-
thaw shelf life of red cells frozen without prefreeze removal
of excess glycerol // Vox Sang. – 2015. – Vol. 108, №3. –
P. 219–225.
18.Lusianti R.E., Benson J.D., Acker J.P., Higgins A.Z. Rapid remo-
val of glycerol from frozen-thawed red blood cells // Biotechnol.
Prog. – 2013. – Vol. 29, №3. – P. 609–620.
19.Muldrew K. The salting-in hypothesis of post-hypertonic lysis //
Cryobiology. – 2008. – Vol. 57, №3. – P. 251–256.
20.Pegg D.E. The relevance of ice crystal formation for the cryo-
preservation of tissues and organs // Cryobiology. – 2010. –
Vol. 60, №3 (Suppl). – P. S36–S44.
21.Scott K.L., Lecak J., Acker J.P. Biopreservation of red blood
cells: past, present, and future // Transfus. Med. Rev. – 2005. –
Vol. 19, №2. – P. 127–142.
22.Semionova E.A., Iershova N.A., Orlova N.V., Shpakova N.M.
Hypotonic lysis of mammalian erythrocytes in chlorpromazine
presence // EESJ. – 2016. – №2. – P. 7–17.
23.Sumida S. Cryopreservation, cryosurgery, cryovaccination
and cryoimmunology, transfusion, transplantation, cell and
tissue culture, and basis of regenerative therapy // Low Tempe-
rature Medicine. – 2014. – Vol. 40, №4. – P. 69–130.
cryohemolysis of mammalian red blood cells. Fiziol Zh. 2007;
53(6): 78–84.
11.Lelkens C.C., de Korte D., Lagerberg J.W. Prolonged post-thaw
shelf life of red cells frozen without prefreeze removal of excess
glycerol. Vox Sang 2015; 108(3): 219–225.
12.Lusianti R.E., Benson J.D., Acker J.P., Higgins A.Z. Rapid removal
of glycerol from frozen-thawed red blood cells. Biotechnol Prog
201; 29(3): 609–620.
13.Muldrew K. The salting-in hypothesis of post-hypertonic lysis.
Cryobiology 2008; 57(3): 251–256.
14.Pаtelaros S.V., Synchikova O.P. Osmotic behavior of red blood
cells during posthypertonic lysis. Probl Cryobiol 1994; (3): 35–
40.
15.Pegg D.E. The relevance of ice crystal formation for the cryo-
preservation of tissues and organs. Cryobiology 2010; 60(3)
(Suppl): S36–S44.
16.Scott K.L. Lecak J., Acker J.P. Biopreservation of red blood cells:
past, present, and future. Transfus Med Rev 2005; 19(2): 127–
142.
17.Semenova N.V., Fedorova L.I., Vinogradov V.L. et al. Comparative
study of cryopreserved erythroconcetrates at different ways
of washing. Hematologiya i Transfuziologiya 1986; (10): 42–52.
18.Semionova E.A., Yershova N.A., Yershov S.S. et al. Peculiarities
of posthypertonic lysis in erythrocytes of several mammals.
Probl Cryobiol Cryomed 2016; 26(1): 73–83.
19.Semionova E.A., Iershova N.A., Orlova N.V., Shpakova N.M.
Hypotonic lysis of mammalian erythrocytes in chlorpromazine
presence. EESJ 2016; (2): 7–17.
20.Shpakova N.M., Orlova N.V., Nipot E.E., Aleksandrova D.I.
Comparative study of mechanical stress effect on human and
animal erythrocytes. Fiziol Zh 2015; 61(3): 75–80.
21.Shpakova N.M., Orlova N.V., Aleksandrova D.I., Denisova O.M.,
inventors. Method for determining temperature conditions of
erythrocytes incubating with PEO-1500. Patent of Ukraine 50069.
2010 May 25.
22.Sumida S. Cryopreservation, cryosurgery, cryovaccination and
cryoimmunology, transfusion, transplantation, cell and tissue
culture, and basis of regenerative therapy. Low Temperature
Medicine 2014; 40(4): 69–130.
23.Tsymbal L.V., Orlova N.V., Shpakova N.M. Modification of the
structure-functional state of erythrocyte membranes by chlorpro-
mazine. Biochemistry (Moscow) Supplement. Series A: Memb-
rane and Cell Biology 2005; 22(4): 327–335.
60 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 27, №/issue 1, 2017
|