Быстрый метод одновременной дискриминации микроводорослей и определения их биохимического состава на основе вибрационной спектроскопии
Изучали вариации спектральных данных четырех представителей микроводорослей. Обнаружены существенные различия в составе их основных макромолекул. Scenedesmus obliquus (Turpin) Kütz. имеет сильные пики в областях липидов и белковых спектров, у Chlorella vulgaris Beij., Ch. pyrenedosa Chick и Euglena...
Saved in:
| Published in: | Альгология |
|---|---|
| Date: | 2017 |
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України
2017
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/140270 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Быстрый метод одновременной дискриминации микроводорослей и определения их биохимического состава на основе вибрационной спектроскопии / П. Сурешкумар, Дж. Томас, Дж. Субраманян // Альгология. — 2017. — Т. 27, № 4. — С. 403-414. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859995582304616448 |
|---|---|
| author | Сурешкумар, П. Томас, Дж. Субраманян, Дж. |
| author_facet | Сурешкумар, П. Томас, Дж. Субраманян, Дж. |
| citation_txt | Быстрый метод одновременной дискриминации микроводорослей и определения их биохимического состава на основе вибрационной спектроскопии / П. Сурешкумар, Дж. Томас, Дж. Субраманян // Альгология. — 2017. — Т. 27, № 4. — С. 403-414. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Альгология |
| description | Изучали вариации спектральных данных четырех представителей микроводорослей. Обнаружены существенные различия в составе их основных макромолекул. Scenedesmus obliquus (Turpin) Kütz. имеет сильные пики в областях липидов и белковых спектров, у Chlorella vulgaris Beij., Ch. pyrenedosa Chick и Euglena gracilis Klebs наблюдались умеренные и менее интенсивные пики во всех пяти спектральных областях. Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (ИК-ПФ) представляет собой спектроскопический метод высокого разрешения, способный выявить особенности макромолекулярного спектра в интактных клетках, что позволяет различать, классифицировать и идентифицировать микроорганизмы, поскольку состав их макромолекул специфичен. Иерархический кластерный анализ с использованием ИК-ПФ-спектров позволяет получить дендрограмму, отражающую четкие различия между исследуемыми штаммами в соответствии с вариациями их фенотипа. Проведен филогенетический анализ с использованием 16S рДНК этих микроагрегатных штаммов. Полученная филограмма показала ту же структуру кластеров, что и дендрограммы на основе ИК-ПФ. Сочетание филогенетического анализа и ИК-ПФ-спектров обеспечивает эффективный способ распознавания вида, а также преимущество одновременного определения биохимического состава видов.
Fourier-transform infrared (FT-IR) spectroscopy is a high-resolution spectroscopic method used in whole-organism molecular fingerprinting. This analysis helps for the characteristic determination of macromolecular spectrum in intact cells. Spectral analysis can discriminate, classify, and identify the microorganisms as composition of macromolecules is different between strains of the same species. In the present investigation, four different microalgae were studied for their variations in spectral data, which showed striking differences on their major macromolecules. Scenedesmus obliquus (Turp.) Kütz. have intense peaks in the lipids and protein spectral regions when compared to the other species. Chlorella vulgaris Beij., Ch. pyrenedosa Chick and Euglena gracilis Klebs possessed moderate and less intense peaks in sub sequential order in all the five spectral regions. Using FT-IR spectra, hierarchical clustering analyses resulted in a dendrogram with clear discrimination between species according to their phenotype variations. To support this, phylogenetic analysis using 16S rDNA microbial barcode sequences of these microalgal strains was evaluated and the resulting phylogram showed the same cluster pattern as revealed by FT-IR based dendrogram. Hence, this study concludes that the combination of phylogenetic analysis and the FT-IR spectra provides an effective way of distinguishing the species as well as the advantage of simultaneous determination of biochemical composition of the species.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:34:02Z |
| format | Article |
| fulltext |
Быстрый метод одновременной дискриминации
403
ISSN 0868-854 (Print)
ISSN 2413-5984 (Online). Аlgologia. 2017, 27(4): 403—414
СУРЕШКУМАР П.1, ТОМАС Дж.1, СУБРАМАНЯН Дж.2
1Лаборатория исследования водорослевой биомассы,
Отделение биологических наук и технологий,
Карунский университет, Каруня Нагар, Коимбаторе 641114, Индия
2Отделение физики, Колледж Мадуры,
Мадурай 625011 Тамил Наду, Индия
jibuthomas.t@gmail.com
БЫСТРЫЙ МЕТОД ОДНОВРЕМЕННОЙ ДИСКРИМИНАЦИИ
МИКРОВОДОРОСЛЕЙ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ
БИОХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА НА ОСНОВЕ ВИБРАЦИОННОЙ
СПЕКТРОСКОПИИ
Изучали вариации спектральных данных четырех представителей микроводорослей.
Обнаружены существенные различия в составе их основных макромолекул.
Scenedesmus obliquus (Turpin) Kütz. имеет сильные пики в областях липидов и
белковых спектров, у Chlorella vulgaris Beij., Ch. pyrenedosa Chick и Euglena gracilis
Klebs наблюдались умеренные и менее интенсивные пики во всех пяти спектральных
областях. Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (ИК-ПФ)
представляет собой спектроскопический метод высокого разрешения, способный
выявить особенности макромолекулярного спектра в интактных клетках, что
позволяет различать, классифицировать и идентифицировать микроорганизмы,
поскольку состав их макромолекул специфичен. Иерархический кластерный анализ с
использованием ИК-ПФ-спектров позволяет получить дендрограмму, отражающую
четкие различия между исследуемыми штаммами в соответствии с вариациями их
фенотипа. Проведен филогенетический анализ с использованием 16S рДНК этих
микроагрегатных штаммов. Полученная филограмма показала ту же структуру
кластеров, что и дендрограммы на основе ИК-ПФ. Сочетание филогенетического
анализа и ИК-ПФ-спектров обеспечивает эффективный способ распознавания вида,
а также преимущество одновременного определения биохимического состава видов.
К л ю ч е в ы е с л о в а : ИК-ПФ, микроводоросли, кластерный анализ, филогене-
тический анализ, дискриминация видов, фингерпринтинг, биохимический состав
Введение
Микроводоросли являются перспективным биотехнологическим
ресурсом, обеспечивающим значительную экономическую прибыль и не
наносящим ущерб окружающей среде (Driver et al., 2014). В настоящее
время содержание основных биомолекулярных соединений (липиды,
белки и углеводы) в клетках микроводорослей, как правило, изучают,
используя традиционные стандартные методы, такие как химическая
© Сурешкумар П., Томас Дж., Субраманян Дж., 2017
Сурешкумар П. и др.
404
экстракция с последующим гравиметрическим определением,
спектрофотометрия или масс-спектроскопия. Однако эти методы
требуют затрат, занимают много времени и в них используются опасные
реагенты. Поскольку это многоступенчатые процедуры, они неизбежно
сопровождаются ошибками, что приводит к несоответствиям в
полученных результатах. Особенно часто такое случается, если
макромолекулы различных соединений изучают изолированно. Это не
позволяет выявлять качественные и количественные изменения в
биохимическом составе клеток при длительном культивировании
штаммов микроводорослей в питательной среде и давать им оценку. В
данном случае целесообразно использовать метод инфракрасной
спектроскопии с преобразованием Фурье (ИК-ПФ).
При анализе интактных клеток микроводорослей метод ИК-ПФ
более эффективен с точки зрения затрат средств и времени. Он
позволяет получать подробные молекулярные спектры с углубленной
биохимической информацией. Анализ элементарного состава, формы
пиков и интенсивности поглощения при конкретных волновых числах
позволяет получить информацию о функциональных группах и
структуре молекул. Эти данные могут быть использованы для
дискриминации штаммов на основе различий в их биохимическом
составе.
Для идентифицикации и классификации микроводорослей
используют различные показатели: особенности морфологического
строения, биохимические маркеры (состав липидов, каротиноидов и
фикобилипротеинов), молекулярные методы (электрофорез белков и
анализ последовательности ДНК и 18S рРНК). Хотя для идентификации
видов можно использовать метод молекулярного штрихкодирования,
сведения о нуклеотидных последовательностях таксонов в онлайн-базах
данных неполные, что затрудняет поиск совпадений. Использование
методов молекулярно-генетического анализа также имеет определенные
технические ограничения, среди которых сложность стандартизации
молекулярно-биологических протоколов, специфический дизайн и
синтез праймеров ПЦР, точечные мутации и стоимость реагентов
молекулярного класса. А.Р. Dean et al. (2010) успешно использовали
ИК-ПФ-спектроскопию в сочетании со статистическими методами
распознавания и идентификации микроводорослей. ИК-ПФ-спектро-
скопия требует минимальной подготовки проб без использования
каких-либо реагентов, характеризуется быстротой, минимальными
материальными затратами и предоставляет данные как о качественных,
так и количественных параметрах биологических соединений.
Цель нашего исследования — с использованием ИК-ПФ-спектров
определить основные биомолекулы четырех видов эвкариотических
микроводорослей, а также получить данные о видоспецифических
метаболических показателях для дискриминации видов с
фенотипическими вариациями на генотипическом уровне.
Быстрый метод одновременной дискриминации
405
Материалы и методы
Культуры микроводорослей и условия их содержания. В работе
использовали штаммы микроводорослей Scenedesmus obliquus, Chlorella
vulgaris, Ch. pyrenedoisa и Euglena gracilis из Национальной коллекции
промышленных микроорганизмов (National Collection of Industrial
Microorganisms, NCIM) в Пуне (Индия). Для их выращивания
использовали ряд питательных сред: обычную и модифицированные
среды Фогга (Fogg’s), Bold basal и Euglena media. Культуры в литровых
колбах выращивали 15 сут в стерильных условиях, с чередованием
световой и темновой фаз 16 : 8, интенсивностью освещения ~1500 лк
при температуре 28±2 ºС.
Биомассу микроводорослей из культур извлекали при помощи
вакуумной фильтрации (вакуумный стеклянный блок Ватмана) и
высушивали с получением гомогенного порошка для ИК-ПФ-анализа.
Спектральная обработка и анализ данных ИК-ПФ. Спектры ИК-ПФ
были получены с помощью ИК-ПФ спектрометра Nicolet-Avatar-360,
оснащенного ДТГС (дейтерированный триглицинсульфат) с воздушным
охлаждением и продувкой азотом. Спектры регистрировали в диапазоне
4000—400 см-1 при разрешении 4 см-1. Пробы образцов в 3-кратной
повторности спектрально анализировали в гомогенных условиях.
Полученные для каждой повторности данные были нормализованы и
оценены; всего получено и нормализовано 50 сканирований. Спектры
анализировали с использованием программного обеспечения ORIGIN
6.0 (OriginLab Corporation, Массачусетс, США). Исходные поправки
были применены ко всем спектрам как порог отрицания, чтобы свести
к минимуму различия между записанными спектрами из-за не-
избежного превышения базовых сдвигов с использованием алгоритма
базовой коррекции. Положение полос измеряли в соответствии с
центром тяжести. В процессе анализа данных поведение спектров было
нормализовано по отношению к конкретным полосам с использованием
вышеупомянутого программного обеспечения. После процесса
нормализации области затенения полосы были численно измерены
(Sivakumar et al., 2013).
Кластерный анализ. Для отображения сходства спектров на основе
иерархического кластерного анализа (HCA) были построены
дендрограммы с применением метода минимальной вариации (Ward,
1963) и программного обеспечения Minitab 17.0 (Minitab Inc., State
College, Пенсильвания, США). Если величина спектрального расстоя-
ния между образцами уменьшается, то, исходя из их спектральных
характеристик, это означает, что между ними больше сходства.
Результаты и обсуждение
Окна. Назначение полос в спектре микроводорослей. Две области в
диапазоне среднего инфракрасного диапазона (4000—400 cм-1) между
3000—2800 и 1800—900 cм-1 (Movasaghi et al., 2008), состоящие из
Сурешкумар П. и др.
406
многочисленных перекрывающихся пиков, содержат бóльшую часть
биохимической информации. Числа, изображенные на конкретных
полосах в ИК-ПФ-спектрах, соответствуют конкретным макромоле-
кулам и метаболитам микроводорослей. Репрезентативные ИК-спектры
видов микроводорослей приведены в табл. 1.
Таблица 1
Назначение полос для микроводорослей (Giordano et al., 2001; Murdock, Wetzel, 2009;
Mayers et al., 2013)
Волновое число, cм-1 Общее назначение полосы Функциональная группа
3387
N―H растяжение / O―H
растяжение
Белок, Амид A, вода
2960 CH3 асимметричное растяжение Липиды
2922 CH2 асимметричное растяжение Липиды
2854 CH2 асимметричное растяжение Липиды
1744 C―O растяжение
Триглицериды, сложные
эфиры холестерина
1651 C―O растяжение Амид I (белок)
1548
N―H сгибание, C―N
растяжение
Амид II (белок)
1458 CH2 сгибание Липиды
1056 C―O растяжение Полисахариды
В данном исследовании волновые числа были сгруппированы в пять
спектральных окон, которые рассматривались с точки зрения
конкретной информации и дискриминации на основе макромолекул
(Naumann et al., 1991). Спектральная область между 3800—3100 см-1
(область белков Амид А) представляет собой окно 1 (W1), что
соответствует N-H-валентному колебанию группы белковых остатков
Амид A и O-H-валентному колебанию окружающих молекул воды.
Спектральная область между 3000 и 2800 cм-1 (область жирных
кислот) обозначена как окно 2 (W2), где превалируют алифатические
-CH3, >CH и CH=-валентные колебания функциональных углеводо-
родных групп насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, обычно
присутствующих в различных мембранах клеток и органелл амфипа-
тической природы.
Спектральная область между 1800 и 1500 cм-1 (область амидов)
относится к окну 3 (W3) и состоит из белков и пептидных доменов
Амид I и Амид II. окно 4 (W4), спектральная область между 1500 и
1200 cм-1 представляет собой смешанный спектр, содержащий информа-
цию о белках, жирных кислотах и фосфатсодержащих соединениях, а
последняя часть спектра между 1200 и 900 cм-1 – это окно 5 (W5),
Быстрый метод одновременной дискриминации
407
представляющее область полисахаридов — сложных углеводов, содержа-
щихся в клеточной стенке. Их полосы поглощения уникальны как
отпечатки пальцев. Это имеет важное значение для идентификации
микроводорослей.
Интерпретация данных отображаемых спектров показала, что
назначение окон помогает выделить химические различия, возникаю-
щие между видами. Детальный спектральный анализ был выполнен в
трех областях: 3800—2600, 1800—1400 и 1300—700 cм-1, включая все
спектральные окна, указанные выше, что позволило найти сходство в
спектральных характеристиках (рис. 1). Область спектра в диапазоне
2600—1800 cм-1 была исключена из спектрального анализа, так как эта
часть содержит мало биологической информации, а поглощение маски-
руется атмосферным CO2 (Giordano et al., 2009).
Рис. 1. Общие спектры (4000—400 см-1) для микроводорослей с соответ-
ствующими спектральными окнами
ИК-ПФ фингерпринтинг для видоспецифичной стратегии. ИК-ПФ-
спектры, полученные для исследованных микроводорослей, свидетель-
ствуют о том, что каждый из них имеет специфический спектральный
фингерпринт, который отражает присущие им фенотипические
различия, по которым их относят к разным видам. Так, наблюдались
четкие отличия в форме и площади пиков спектров микроводорослей,
что отражает изменения молярных концентраций биомолекул и их
пространственного объема. Наиболее значительны различия в
спектральных окнах W1, W2, W3 и W5, содержащих спектры
поглощения белков, липидов и полисахаридов. Получены хорошо
различимые и близкие между собой спектры с незначительными
различиями в интенсивности полос. ИК-ПФ-спектры биомолекул
S. obliquus и E. gracilis показали четкие отличия этих микроводорослей
от Ch. vulgaris и Ch. pyrenedoisa.
Спектральная область W1 представляет колебания белков домена
Амид A и асимметричное растяжение липидов CH2. Наиболее сущест-
венные различия наблюдаются в области Амид А: спектр S. obliquus
четко отличается от спектров остальных трех видов микроводорослей,
Сурешкумар П. и др.
408
тогда как E. gracilis проявляется только на базовом уровне этой области
спектра. Абсорбция в этой области соответствует режимам растяжения
N-H и O-H в воде, белках и полисахаридах (Cakmak et al., 2006).
Поскольку вода полностью удаляется во время подготовки образца, ее
вкладом в эту полосу можно пренебречь, и мы полагаем, что
поглощение может быть обусловлено только белками. Другая крупная
спектральная вариация наблюдалась в окне 3, которое соответствует
белкам. Здесь преобладали вибрации структурных белковых групп Амид
I и Амид II (Mayers et al., 2013). Значительную полосу при 1651 cм-1 мы
отнесли к Амид I из-за режима растяжения С-О белка, а при 1548 cм-1 –
к Амид II за счет поглощения изгибной вибрации N-Н-полосы.
Scenedesmus obliquus показал более сильную абсорбцию в области Амид
I, чем другие микроводоросли, тогда как в области Амид II ни один из
видов микроводорослей не давал заметного пика. Область охвата и
морфология полосы были удивительно сходными с белками Амид А.
В нашем исследовании спектры белковой области имели более
выраженные пики, чем таковые у других макромолекул.
Липиды имеют характерные полосы поглощения в областях W2 и
W3. Это спектральная область около 1744 cм-1 (W3), представляющая
собой вибрацию растяжения сложного эфира C=O, и область 3000–
2800 cм-1 (W2), представляющая вибрацию растяжения C-H в ацильных
цепях (Giordano et al., 2001). Полоса при 1744 cм-1 соответствует эфирам
жирных кислот, имеющим важное значение для идентификации
микроводорослей — потенциальных источников биотоплива. В нашем
исследовании штамм Е. gracilis показал интенсивную полосу в этой
области. Установлено, что стерическое асимметричное растяжение
метиленовой группы липидной части имеет более высокое поглощение
липидного содержания, чем колебательное растяжение сложноэфирных
связей. Как видно из рис. 1, E. gracilis демонстрировала более заметный
пик в этой области с высокой интенсивностью, чем другие виды.
Спектральная вариация асимметричного растяжения метиленовой
группы аналогична вариации спектров всех изученных видов, наблю-
даемой в области Амид А, но с более низкими полосами поглощения,
что непосредственно отражает концентрацию биомолекул. Микроводо-
росли, культивируемые на средах с различным составом питательных
веществ или подвергнутые азотному или фосфорному голоданию,
показали значительное отклонение в спектрах, причем в пределах
одного и того же вида. Изменение спектров в части, отражающей
область хранения биомолекул, вызывалось физиологическими реак-
циями на изменение условий поглощения питательных веществ (de
Moraes and Vieira, 2014).
Среднеинфракрасные спектры глюкозы и гидролизата крахмала
показывали поглощения, состоящие из сложных перекрывающихся и
сходящихся полос между 1200 и 1000 cм-1 (Pistorius et al., 2009). В этой
же области обнаружены и другие биомолекулярные остаточные
спектральные компоненты. Она содержит полосы, связанные с РО2-
Быстрый метод одновременной дискриминации
409
симметричным растяжением фосфолипидов и спиральной основы ДНК,
а также с вкладом неродственного неорганического Si-O-валентного
колебания при 1075 см-1. Сложно скомбинировать разрешение
углеводной C-O-растягивающей колебательной связи, однако в нашем
исследовании было обнаружено, что ярко выраженный характерный
пик при 1056 см-1 хорошо коррелирует с содержанием углеводов в
образцах биомассы (Wagner et al., 2010).
Кластерный анализ для дискриминации видов. Иерархический
кластерный анализ (ИКА) представляет собой хемометрический метод,
в котором спектральные данные были использованы для классификации
спектров на основе их предсказанной гомологии и родства между
видами, проанализированными с коэффициентом корреляции, изобра-
женным при помощи алгоритма Уорда (Ward, 1963). E. gracilis
демонстрировала большие спектральные расстояния (0.167229) по
отношению к трем другим видам микроводорослей. Неожиданно
представители рода Chlorella – Ch. pyrenedosa и Ch. vulgaris, оказались в
разных кладах, тогда как Ch. pyrenedosa и S. obliquus показали очень
близкое сходство (98,96%) и попали в одну кладу (рис. 2). Это, очевидно
связано с физиологической реакцией на состав питательных веществ,
что также показало филогенетическое дерево, полученное с использо-
ванием молекулярного маркера 16S рДНК.
Рис. 2. Иерархическая кластерная дендрограмма, построенная по ИК-ПФ-
спектральным данным видов микроводорослей
При сопоставлении микроводорослей для их идентификации
оказалось, что различия в спектрах ИК-ПФ и последовательностях
16S рДНК у каждого из изученных видов проявляются по-своему
(рис. 3). На филогенетическом дереве Ch. pyrenedosa и S. obliquus имели
тесную связь, тогда как образцы E. gracilis четко отличались от всех
других микроводорослей. Наше исследование показало способность
спектрального анализа идентифицировать микроводоросли без
использования каких-либо молекулярных маркеров. Однако есть
Сурешкумар П. и др.
410
ограничение для культур, подвергшихся фенотипическим изменениям
из-за недостатка питательных веществ. Это вызывает метаболические
изменения, особенно в областях углеводов и липидов. Разрешение этих
спектральных областей заметно изменится, что повлияет на структуру
кластера.
Рис. 3. Филогенетический анализ последовательностей 16S рДНК видов
микроводорослей по Neighbour Joining method (значение бутстрэп — 1000
репликонов)
Определение биохимического состава клеток методом ИК-ПФ
В данном исследовании получена информация о биохимическом
составе клеток микроводорослей с использованием ИК-ПФ. Сдвиги в
положении пиков, изменение ширины полосы, интенсивности и
величины площади инфракрасных полос используются для получения
ценной структурной и функциональной информации об области полос
поглощения, непосредственно связанных с концентрацией молекул.
Спектральная количественная оценка на основе молекулярных
колебаний микроводорослей приведена в табл. 2.
Для оценки состава липидов обычно рассматривают две области
спектра: метильной и метиленовой групп при 2800—3000 cм-1 и область
колебательного растяжения сложноэфирных связей при 1740 cм-1. В
нашем исследовании обнаружено лишь CH2-несимметричное
растяжение липидов. Площадь пика липидов у E. gracilis составляла
0,97, что выше, чем у S. obliquus, Ch.vulgaris и Ch. pyrenedosa.
Белковые пики были более выраженными, чем пики других
макромолекул. Площади пиков группы Амид A у S. obliquus (138,7),
Ch. vulgaris (83,09), Ch. pyrenedosa (85,64) и E. gracilis (34,06) отражают
более высокое поглощение S. obliquus по сравнению с другими видами
микроводорослей, что непосредственно отражает более высокую
концентрацию и интенсивность компонента Амид А в клетках этого
вида. Группы Амид A, Амид I и Амид II считаются наиболее надежным
регионом для количественного определения содержания белков в
Быстрый метод одновременной дискриминации
411
биологических системах (Mayers et al., 2013). Сильные полосы
поглощения при 3387 cм-1 и 1651 cм-1 доминируют в спектрах S. obliquus
из других образцов (см. табл. 2). Эти регионы соответствуют белковым
группам Амид А и Амид I. Площадь пика, имеющая отношение к
соответствующей области полос поглощения, коррелирует с
концентрацией молекул.
Таблица 2
Спектральные наблюдения, предполагающие количественное определение молекулярных
колебаний (площадь пика) во всех видах микроводорослей
Интенсивность полос
Волновое
число, cм-1
Молекулярные
колебания Scenedesmus
obliquus
Chlorella
pyrenedosa
Chlorella
vulgaris
Euglena gracilis
3387 Амид A 138,17 85,64 83,09 34,06
2922
CH2
асимметричное
растяжение
липидов
0,55 0,87 0,80 0,97
1651
Амид I
(C-O растяжение
белков)
11,66 7,24 6,43 2,77
1548
Амид II (N-H
сгибание, C-N
растяжение)
0,97 1,66 0,50 0,80
1056
C-O растяжение
углеводов
152,10 59,05 19,42 2,54
Таблица 3
Общее содержание белка в биомассе микроводорослей, определенное методом
Брэдфорда и по ИК-ПФ-спектрам
Микроводоросль
Общий белок по методу
Брэдфорда, мкг/мг сухой
биомассы
Общий белок по площади
спектральных пиков ИК-ПФ
Scenedesmus obliquus 1827 150,8
Chlorella pyrenedosa 1810 94,54
Ch. vulgaris 1051 90,02
Euglena gracilis 706 37,63
Плотность белков, определенная по ИК-ПФ-спектрам, отражает
линейную зависимость от содержания белка в биомассе, рассчитанную
методу М.М. Брэдфорда (Bradford, 1976), тем самым подтверждая
результаты, полученные из ИК-ПФ (табл. 3).
Сурешкумар П. и др.
412
Хорошо выраженный пик при 1056 cм-1 отражает углеводный состав
микроводорослей. Поглощение соответствует области C-O колебатель-
ного растяжения полосы (Giordano et al., 2001; Murdock, Wetzel, 2009).
Образцы S. obliquus, Ch. vulgaris и Ch. pyrenedosa имели хорошо
выраженные пики с разной площадью полосы. Площадь пика углеводов
для S. obliquus была 152,10, что выше, чем у других видов.
Интенсивность полосы S. obliquusis обусловлена лимитированным
содержанием фосфора при культивировании (Murdock, Wetzel, 2009).
Метод ИК-ПФ позволяет использовать минимальное количество
материала для анализа. Так, 3–5 мг сухой биомассы достаточно для
получения соответствующих спектров. При использовании тради-
ционных «влажных» методов определения биохимического состава
требуется не менее 50–100 мг. Наше исследование подтвердило, что
метод ИК-ПФ обладает высокой воспроизводимостью и
специфичностью для точной дифференциации близкородственных
микроводорослей.
Заключение
ИК-ПФ-спектроскопия может быть использована для молекулярной
идентификации микроводорослей с различными спектральными
сигнатурами. Как ИК-ПФ-спектры, так и филогенетическое дерево по
16S рДНК показали аналогичный результат, подтверждающий, что по
ИК-ПФ-спектрам можно различать виды водорослей. Внутривидовая
изменчивость интенсивности полосы свидетельствует о том, что
концентрации макромолекулярных соединений могут отличаться у
различных штаммов. При сравнении образцов различных
микроводорослей наибольшие спектральные изменения наблюдались в
положении полос Амид А, Амид I, жирных кислот и полисахаридов.
Виды отличались между собой также интенсивностью полос, которая
была разной у полос, связанных с белками (Амид А и Амид I). Эти же
количественные различия выявлены при определении белков
традиционным биохимическим методом. Наши результаты показали,
что спектры основных макромолекул могут использоваться для быстрой
и точной дискриминации и идентификации микроводорослей.
Авторы благодарят Научно-исследовательский совет Департамента
науки и техники при правительстве Индии за финансовую поддержку
(грант SO:No/SB/FT/LS-389/2012) и Университет Карунья за
предоставление условий для исследований. Также авторы хотели бы
поблагодарить доцента Т. Р. Барат Кумара за критические замечания при
подготовке рукописи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities
of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976. 72: 248.
Быстрый метод одновременной дискриминации
413
Cakmak G., Togan I., Severcan F. 17-Estradiol induced compositional, structural and
functional changes in rainbow trout liver, revealed by FT-IR spectroscopy: A
comparative study with nonylphenol. Aquat.Toxicol. 2006. 77: 53—63.
de Moraes G.P., Vieira A.A.H. Fourier Transform Infrared with Attenuated Total
Reflectance Applied to the Discrimination of Freshwater Planktonic Coccoid Green
Microalgae. PloS One. 2014. 9(12): 1—21.
Dean A.P., Martin M.C., Sigee D.C. Resolution of codominant phytoplankton species in a
eutrophic lake using synchrotron-based Fourier transform infrared spectroscopy.
Phycologia. 2007. 46: 151—159.
Dean A.P., Sigee D.C., Estrada B., Pittman J.K. Using FT-IR spectroscopy for rapid
determination of lipid accumulation in response to nitrogen limitation in freshwater
microalgae. Biores. Technol. 2010. 101: 4499—4507.
Driver T., Bajhaiya A., Pittman, J.K. Potential of bioenergy production from microalgae.
Curr. Syst. Renew. Energy Rep. 2014. 1: 94—103.
Giordano M., Kansiz M., Heraud P., Beardall J., Wood B., McNaughton D. Fourier
transform infrared spectroscopy as a novel tool to investigate changes in intracellular
macromolecular pools in the marine microalga Chaetocerosmuellerii (Bacillariophyceae).
J. Phycol. 2001. 37: 271—279.
Giordano M., Ratti S., Domenighini A., Vogt F. Spectroscopic classification of 14 different
microalga species: first steps towards spectroscopic measurement of phytoplankton
biodiversity. Plant. Ecol. Divers. 2009. 2: 155—164.
Mayers J.J., Flynn K.J., Shields R.J. Rapid determination of bulk microalgal biochemical
composition by Fourier-Transform Infrared spectroscopy. Biores. Technol. 2013. 148:
215—220.
Movasaghi Z., Rehman S., Rehmen I.U. Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopy
of biological tissues. Appl. Spectroscop. Rev. 2008. 43: 134—179.
Murdock J.H., Wetzel D.L. FT-IR microspectroscopy enhances biological and ecological
analysis of algae. Appl. Spectrosc. Rev. 2009. 44: 335—361.
Naumann D., Labischinski H., Giesbrecht P. The characterization of microorganisms by
Fourier Transform Infrared Spectroscopy. In: Modern techniques for Rapid
Microbiological Analysis. Weinheim; New York: VCH Verlag Chemie, 1991. P. 43—96.
Pistorius M., DeGrip W.J., Egorova-Zachernyuk T.A. Monitoring of biomass composition
from microbiological sources by means of FT-IR spectroscopy. Biotechnol. Bioeng.
2009. 103(1): 123—129.
Sivakumar S., Sivasubramanian J., Chandra Prasad Khatiwada, Manivannan J., Raja B.
Aluminium induced metabolic changes in kidney and heart tissue of mice: a Fourier
transform infrared spectroscopy study. RSC Advanc. 2013. 3: 20896—20904.
Wagner H., Liu Z., Langner U., Stehfest K., Wilhelm C. The use of FT-IR spectroscopy to
assess quantitative changes in the biochemical composition of microalgae. J. Biophoton.
2010. 3: 557—566.
Ward J.H. Hierarchial grouping to optimize an objective function. J. Amer. Stat. Assoc.
1963. 58: 236—244.
Поступила 29 июня 2017 г.
Подписал в печать С.П. Вассер
Сурешкумар П. и др.
414
ISSN 0868-854 (Print)
ISSN 2413-5984 (Online). Аlgologia. 2017, 27(4): 403—414
Sureshkumar P.1, Thomas J.1, Sivasubramanian J.2
1Algae Biomass Research Laboratory, Department of Biosciences & Technology,
Karunya University, Karunya Nagar, Coimbatore 641114, India
2Assistant Professor, Department of Physics, The Madura College,
Madurai 625011 Tamil Nadu, India
RAPID METHOD FOR SIMULTANEOUS DISCRIMINATION OF MICROALGAE
AND DETERMINATION ON BIOCHEMICAL COMPOSITION BASED ON
VIBRATIONAL SPECTROSCOPY
Fourier-transform infrared (FT-IR) spectroscopy is a high-resolution spectroscopic method
used in whole-organism molecular fingerprinting. This analysis helps for the characteristic
determination of macromolecular spectrum in intact cells. Spectral analysis can
discriminate, classify, and identify the microorganisms as composition of macromolecules is
different between strains of the same species. In the present investigation, four different
microalgae were studied for their variations in spectral data, which showed striking
differences on their major macromolecules. Scenedesmus obliquus (Turp.) Kütz. have intense
peaks in the lipids and protein spectral regions when compared to the other species.
Chlorella vulgaris Beij., Ch. pyrenedosa Chick and Euglena gracilis Klebs possessed moderate
and less intense peaks in sub sequential order in all the five spectral regions. Using FT-IR
spectra, hierarchical clustering analyses resulted in a dendrogram with clear discrimination
between species according to their phenotype variations. To support this, phylogenetic
analysis using 16S rDNA microbial barcode sequences of these microalgal strains was
evaluated and the resulting phylogram showed the same cluster pattern as revealed by FT-
IR based dendrogram. Hence, this study concludes that the combination of phylogenetic
analysis and the FT-IR spectra provides an effective way of distinguishing the species as
well as the advantage of simultaneous determination of biochemical composition of the
species.
K e y w o r d s : FT-IR, microalgae, cluster analysis, phylogenetic analysis, species
discrimination, fingerprint, biochemical composition
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-140270 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0868-8540 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:34:02Z |
| publishDate | 2017 |
| publisher | Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Сурешкумар, П. Томас, Дж. Субраманян, Дж. 2018-07-03T12:09:26Z 2018-07-03T12:09:26Z 2017 Быстрый метод одновременной дискриминации микроводорослей и определения их биохимического состава на основе вибрационной спектроскопии / П. Сурешкумар, Дж. Томас, Дж. Субраманян // Альгология. — 2017. — Т. 27, № 4. — С. 403-414. — Бібліогр.: 16 назв. — рос. 0868-8540 DOI: 10.15407/alg27.04.403 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/140270 Изучали вариации спектральных данных четырех представителей микроводорослей. Обнаружены существенные различия в составе их основных макромолекул. Scenedesmus obliquus (Turpin) Kütz. имеет сильные пики в областях липидов и белковых спектров, у Chlorella vulgaris Beij., Ch. pyrenedosa Chick и Euglena gracilis Klebs наблюдались умеренные и менее интенсивные пики во всех пяти спектральных областях. Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (ИК-ПФ) представляет собой спектроскопический метод высокого разрешения, способный выявить особенности макромолекулярного спектра в интактных клетках, что позволяет различать, классифицировать и идентифицировать микроорганизмы, поскольку состав их макромолекул специфичен. Иерархический кластерный анализ с использованием ИК-ПФ-спектров позволяет получить дендрограмму, отражающую четкие различия между исследуемыми штаммами в соответствии с вариациями их фенотипа. Проведен филогенетический анализ с использованием 16S рДНК этих микроагрегатных штаммов. Полученная филограмма показала ту же структуру кластеров, что и дендрограммы на основе ИК-ПФ. Сочетание филогенетического анализа и ИК-ПФ-спектров обеспечивает эффективный способ распознавания вида, а также преимущество одновременного определения биохимического состава видов. Fourier-transform infrared (FT-IR) spectroscopy is a high-resolution spectroscopic method used in whole-organism molecular fingerprinting. This analysis helps for the characteristic determination of macromolecular spectrum in intact cells. Spectral analysis can discriminate, classify, and identify the microorganisms as composition of macromolecules is different between strains of the same species. In the present investigation, four different microalgae were studied for their variations in spectral data, which showed striking differences on their major macromolecules. Scenedesmus obliquus (Turp.) Kütz. have intense peaks in the lipids and protein spectral regions when compared to the other species. Chlorella vulgaris Beij., Ch. pyrenedosa Chick and Euglena gracilis Klebs possessed moderate and less intense peaks in sub sequential order in all the five spectral regions. Using FT-IR spectra, hierarchical clustering analyses resulted in a dendrogram with clear discrimination between species according to their phenotype variations. To support this, phylogenetic analysis using 16S rDNA microbial barcode sequences of these microalgal strains was evaluated and the resulting phylogram showed the same cluster pattern as revealed by FT-IR based dendrogram. Hence, this study concludes that the combination of phylogenetic analysis and the FT-IR spectra provides an effective way of distinguishing the species as well as the advantage of simultaneous determination of biochemical composition of the species. Авторы благодарят Научно-исследовательский совет Департамента науки и техники при правительстве Индии за финансовую поддержку (грант SO:No/SB/FT/LS-389/2012) и Университет Карунья за предоставление условий для исследований. Также авторы хотели бы поблагодарить доцента Т. Р. Барат Кумара за критические замечания при подготовке рукописи. ru Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України Альгология Физиология, биохимия, биофизика Быстрый метод одновременной дискриминации микроводорослей и определения их биохимического состава на основе вибрационной спектроскопии Rapid method for simultaneous discrimination of microalgae and determination on biochemical composition based on vibrational spectroscopy Article published earlier |
| spellingShingle | Быстрый метод одновременной дискриминации микроводорослей и определения их биохимического состава на основе вибрационной спектроскопии Сурешкумар, П. Томас, Дж. Субраманян, Дж. Физиология, биохимия, биофизика |
| title | Быстрый метод одновременной дискриминации микроводорослей и определения их биохимического состава на основе вибрационной спектроскопии |
| title_alt | Rapid method for simultaneous discrimination of microalgae and determination on biochemical composition based on vibrational spectroscopy |
| title_full | Быстрый метод одновременной дискриминации микроводорослей и определения их биохимического состава на основе вибрационной спектроскопии |
| title_fullStr | Быстрый метод одновременной дискриминации микроводорослей и определения их биохимического состава на основе вибрационной спектроскопии |
| title_full_unstemmed | Быстрый метод одновременной дискриминации микроводорослей и определения их биохимического состава на основе вибрационной спектроскопии |
| title_short | Быстрый метод одновременной дискриминации микроводорослей и определения их биохимического состава на основе вибрационной спектроскопии |
| title_sort | быстрый метод одновременной дискриминации микроводорослей и определения их биохимического состава на основе вибрационной спектроскопии |
| topic | Физиология, биохимия, биофизика |
| topic_facet | Физиология, биохимия, биофизика |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/140270 |
| work_keys_str_mv | AT sureškumarp bystryimetododnovremennoidiskriminaciimikrovodorosleiiopredeleniâihbiohimičeskogosostavanaosnovevibracionnoispektroskopii AT tomasdž bystryimetododnovremennoidiskriminaciimikrovodorosleiiopredeleniâihbiohimičeskogosostavanaosnovevibracionnoispektroskopii AT subramanândž bystryimetododnovremennoidiskriminaciimikrovodorosleiiopredeleniâihbiohimičeskogosostavanaosnovevibracionnoispektroskopii AT sureškumarp rapidmethodforsimultaneousdiscriminationofmicroalgaeanddeterminationonbiochemicalcompositionbasedonvibrationalspectroscopy AT tomasdž rapidmethodforsimultaneousdiscriminationofmicroalgaeanddeterminationonbiochemicalcompositionbasedonvibrationalspectroscopy AT subramanândž rapidmethodforsimultaneousdiscriminationofmicroalgaeanddeterminationonbiochemicalcompositionbasedonvibrationalspectroscopy |